JPH04501003A - 血漿中のシアル酸を測定するための改良された方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血　のシアル　を　るための　された　゛光１１と１１一 本発明は、血漿又は血清中のシアル酸を測定するための改良された方法に係わる 。この方法は従来の方法より所要時間が短く、コストが低く、試料毎の変動が小 さく、且つ検査する人間の技術及び経験に対する依存度が小さい。

被験者の血液血清中のシアル酸含量が高い場合には癌の疑いがあるということを 証明する研究は、これまでにも多くなされたきた０例えば、Ｄａｖｉｄｓｏｎら の米国特許第４，１４６゜８０３号には、シアル酸含量が高いという事実が癌を 特異的に決定する要因の１つであることを立証する、かなり複雑な一連の方法が 開示されている。

ＭａｃＢｅｔｈ及びＢｅｋｅｓ　ｉはＣａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、２２：１１７０− １１７８（１９８２＞で、血漿中の糖タンパク質を測定したところ、乳癌の場合 にはガラクトース及びマンノースの値が急変しないことを発見したと述べている 。　ＫｌｏｐｐｅｌらはＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃ、７４：３０１１ −３０１３（１９７７）で、可移植性乳癌腫を有するマウスでは血清シアル酸糖 脂質の量が２．５倍に増え、ヒト癌腫患者では２倍に増えると報告している。こ の方法はガングリオシドをカラムクロマトグラフィーで分離する操作を含み、最 低１ｍｌの全血を必要とする。Ｋｌｏｐｐｅｌらはまた、＾ｓ＋、ＪＪｅｔ。

Ｒｅｓ、３９：１３７７−１３８０（１９７８）で、２４匹のイヌの９２％にシ アル酸の増加が見られたが、別の障害をもつイヌについて多くの疑似陽性が観察 されたと報告している。　ＬｅｎｇｌｅはＪ、Ｎａｔｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、６２：１５６５−１５６７（１９７９）で、白血病へ ＫＲ／Ｊマウスでは血漿及び胸腺リンパ球の脂質結合シアル酸が増加することを 発見したと述べている。脂質結合シアル酸の量は黒色腫をもつヒトの血漿及び赤 血球でも増加することが判明した。　Ｐｏｒｔｏｕｋａｌｉａｎら　、Ｂｉｏｅ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍ−ｕｎ、８５：９１６−９２０（１９ ７８）　、クロマトグラフィーでの分離及びカラムでの精製に次いで、クロマト プレートでの評価が行われた。

５ｉｌｖｅｒらはＣａｎｃｅｒ　４１：１４９７−１４９９（１９７８）；Ｃａ ｎｃｒｒ　Ｒｅｓ、３９：５０３６−５０４２（１９７９）で、黒色腫患者の血 清シアル酸の量が腫瘍に大きく関連して増加すると報告している。但し、腫瘍が 観察された患者の３６％は血清シアル酸の増加を示さなかった。　Ｈｏｇａｎ− ＲｙａｎらはＢｒ、Ｊ、Ｃａｎｅｅｒ　４１：５８７−５９２（１９８０）で、 乳癌患者の総結合血清シアル酸について、腫瘍の段階に対応した増加が見られる と報告している。

本発明で改良する特定の方法の１つは、Ｋａｔｏｐｏｄｉｓらにより＾ｍｅｒｉ ｅａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 ＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇＰｒｏｃｅｅｄｉＢｓ　Ｖｏｌ　２１．　Ｍａｒｃ ｈ　１９８０に＾ｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ。

７２８として記載されている。要約すれば、この方法は１００ｕｌの血漿試料（ ５０，１に減少）を６ｍｌのクロロホルム／メタノール混合物（容量比２：１） で抽出する操作を必要とする８次いで、得られた脂質抽出物を０．２倍容の水を 用いて分配する。水相を蒸発乾固させ、残留物を水に再溶解する。その後、脂質 結合シアル酸をトリクロロ酢酸−リンタングステン酸沈澱によって精製し、得ら れた沈澱物から上清を分離した後で、沈澱物を５ｖｅｎｎｅｒｈｏ　Ｉ−及びＨ ｉｅｔｔｉｅｎの方法（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ。

Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ １ｄ、、、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ　２４．ｐｐ、６０４−６１１（１９５７））により 測定する。

本発明で改良する別の特定の方法は、１９８２年８月３日に交付されたＫａｔｏ ｐｏｄｉｓ及び５ｔｏｃｋの米国特許第４，３４２，５６７号に開示されている 。この方法は前記した方法と類似しているが、試料を１００．１ではなく５０μ ｍしか必要としない。また、乾燥ステップが省略され、トリクロロ酢酸も不要で あり、リンタングステン酸だけが使用される。

これらの特定の方法には、下記のような多くの欠点がある：正確に規定した４４ ．７λ出発試料を必要とする；管を逆さにするステップで脂質結合シアル酸を損 失するため、最終値が小さくなる；リンタングステン酸による脂質結合シアル酸 の沈澱が完全ではないため、特に該シアル酸の量が正常値を少ししか上回らない （例えば、筋発生の初期）試料を検査する場合に問題が生じる；リンタングステ ン酸の添加の後に５分間の待機時間があるため検査速度が制限され、検査コスト も余り低くない。

本発明で改良する他の特定の方法は、１９８７年１０月２０日に交付された米国 特許第４，７０１，４１８号（Ｋａｔｏｐｏｄｉｓ）及び１９８８年５月３１日 に交付された米国特許第４．７４８，１２８号（Ｋ亀ｔｏｐｏｄｉｓ）に記載さ れている。これらの方法では、試料中に存在するシアル酸の量を測定すべく、先 ずヒト全血もしくは血漿試料を希釈し、次いで塩素化低級アルキル炭化水素、例 えばクロロホルムと、低級アルキルアルコール、例えばメタノールとの混合物を 加え、得られた溶液を混合し、遠心にかけて、実質的に透明な上方層を形成する 。その後、所定量の上方層にタンパク質沈澱剤を加えて脂質結合シアル酸を沈澱 させる。これらの方法で使用されるタンパク質沈澱剤はリンタングステン酸であ る。上清から沈澱物を分離し、この沈澱物を水に懸濁させ、レゾルシノール試薬 と酢酸ブチル及びｎ−ブタノールの混合物とを加え、得られた溶液の５８Ｏｎ− での吸光度を測定することによって、脂質結合シアル酸の量を計算する。

本発明は、血漿もしくは血清中に存在するシアル酸の量を測定するための改良さ れた方法を提供する０本発明の方法は、成る実施態様では従来の方法より定性的 且つ定量的に高い感度を示し、別の実施態様では少なくとも従来の方法と同じ程 度の、感度を示す、また、本発明の方法は従来の方法より経済的であり、時間効 率が高く、自動化が容易であり、且つ労働力及び化学的試薬の必要量が少ない６ 本発明の方法は、タンパク質沈澱剤の必要がなく、シアル酸の抽出に使用される 混合物の低級アルキルアルコール及び塩素化低級アルキル炭化水素の比を逆にし たという点で、従来の方法とは大きく異なる。前記先行特許の方法では、塩素化 炭化水素、通常はクロロホルムがアルキルアルコールより多い混合物が使用され る。その容量比は２：１である。

これに対し、本発明ではアルコール対塩素化炭化水素の比が約７０　：　３０〜 約８５：１５の混合物を使用する０本発明では、実施態様によっては、腐食性で 取扱いの難しい酢酸ブチル／ｎ−ブタノール混合物の使用も不要である０表１は 、米国特許第４，３４２，５６７号の方法を用いて本出願人以外の手によって得 られた結果をまとめたものであり、健常被験者からの試料を検査した場合の結果 にばらつきがあることを示している。

轟−一り 、　４３４２５６７　の　゛　いて　しｔ・　ムの叉９１］Ｕ１久藍１− 止Ｊｌ貝− （１）　にａｔｏｐｏｄｉｓ及び５ｔｏｃｋ、米国特許第４，３４２，５６７号 （３）　＾０Ｍ、Ｄｎｉｓｔｒｉａｎら　、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅ＋＊、η ７（１０）　１９８１（４）　Ｓ、Ｋａｋａｒｉら、＾ｎｔｉｅｉｎｃｅｒ　Ｒ ｅｓ、４，５ｕｐｐ１．１：３−６．１９８４（５）　Ｌ、Ｓａｎｔｉｗａｒｉ ａら　、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｅ　ＥｎｖｉｒＪｏｌ、１ζ、１９８４（６） 　＾、Ｍ、Ｄｎｉｓｔｒｉａｎら、＾＾ＣＲＶｏｌ、２３，６０９．１９８２（ ７）　Ｐ、Ｋｏｓｍｉｄｉｓら　、＾ＳＣＯ，Ｖｏ１．２．Ｃ−１，１９８３（ ８）　Ｄ、Ｍｕｏｊａｌら、ＦＥＤ、　Ｐｒｏｃ、、Ｖｏｌ、４２（３）、１９ ８３年３月（９）　Ｋ、Ｍ、Ｅｒｂｉｌら、ＣＩ　、Ｃｈｅｍ、２９．Ｖｏｌ　 、６（１９４）、１９８３（１０）　Ｃｈｅｎ　５ｈｕ−Ｐａｎら、Ｃｈｉｎ、 Ｊ、０ｂｓｔｅｔ、＆　Ｃｙｎ、、１８（４）：２３５−３８．１９８３ （１１）　Ｌ、Ｓａｌｖａｇｎｏら　、１３　１ｎｔ１．Ｃｏｎｇ、ｏｆ　Ｃｈ ｅｍｏ、、１９８３（Ｖｉｅｎｎａ）（１２）　Ｌ、Ｓａｌｖａｇｏｏら、１． ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１９８３（１３）　＾、に、Ｂｈａｒ ｇａｖａら、＾ＳＣＯ，Ｖｏ１．６．Ｎｏ、２．１９８４（１４）　Ｓ、Ｋａｋ ａｒｉら、Ｉｎｔｌ、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ、５ａｌｏｎｉｅａ、Ｇｒｅｅｃｅ、１ ９８２（１５）　ＴＪｕｓｔｒｏｗ、Ｇｅｒｍａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｏｎｇｒ ｅｓｓ、２５／６　ＧＬ　１９８３光」［ユ鷹！ 本発明は、血液の血漿もしくは血清試料からシアル酸を抽出し、試料中に存在す るシアル酸の量を測定する方法を提供する。

この方法は、 （ａ）試料に低級アルキルアルコールと塩素化低級アルキル炭化水素との混合物 を加えて、低級アルキルアルコール対塩素化低級アルキル炭化水素の容量比が約 ７０：３０〜約８５＝１５の混合物を形成する操作、 （ｂ）得られた混合物を、試料中に存在するシアル酸を溶解するのに十分な時間 にわたって混合する操作、（ｃ）回収し得る実質的に透明なシアル酸含有上方相 を形成すべく前記混合物を処理する操作、 （ｄ）形成された透明な上方相から所定量の上方相を別個に採取する操作、並び に （ｅ）所定量の上方相中に存在するシアル酸の量を測定し、それによって試料中 に存在するシアル酸の量を計算する操作を含む。

本発明は、別の目的として、ヒト被験者の癌を診断する方法にも係わる。この診 断方法は、被験者の血漿もしくは血清試料中のシアル酸量を本発明の測定方法で 測定し、測定した量を癌にかかっていることがわかっている被験者の測定値と比 較するか、又は測定した量を同一被験者の一定期間にわたる測定値と比較するこ とからなる。

本発明は、被験者の癌の進行をモニターする方法も提供する。この方法は、被験 者の体液試料中のシアル酸量を本発明の測定方法により一定の時間間隔で測定し 、測定した量を同一被験者に関してそれ以前に測定した量と比較することからな る。

本発明は更に、癌診断キットも提供する。このキットは、検査試料を収容するた めの適当な試料容器と、既知量の基準試料が入った試料容器と、低級アルキルア ルコール及び塩素化低級アルキル炭化水素の混合物（容量比７５：２５）が入っ た容器と、酵素溶液もしくはレゾルシノール試薬の容器と、安定剤Ｍ衝溶液もし くは酢酸ブチルとｎ−ブタノールとの混合物（容量比８５：１５）が入った容器 と、脱イオン蒸留水の容器とピペットとを含む。

゛　の　゛　ｔ＝ 第１図は、上清の抽出、最終色の濁り度、及び米国特許第４，７４８，１２８号 の方法で得られた値と測定値との合致性に関するＣｌＣ１，：ＣＨ，ＯＨの比の 比較を示すグラフである。

第２図は、本発明の方法で得られた結果と米国特許第４．７４８，１２８号の方 法で得られた結果とを比較して示すグラフである。

１凹Ｌ！！２ＪＬＩＬ 本発明は、血漿もしくは血清試料からシアル酸を抽出し、試料中に存在するシア ル酸の量を測定する方法を提供する。

この方法は、 （ａ）試料に低級アルキルアルコールと塩素化低級アルキル炭化水素との混合物 を加えて、低級アルキルアルコール対塩素化低級アルキル炭化水素の容量比が約 ７０：３０〜約８５＝１５の混合物を形成するステップ、 （ｂ）得られた混合物を、試料中に存在するシアル酸を溶解するのに十分な時間 にわたって混合するステップ、（ｃ）回収し得る実質的に透明なシアル酸含有上 方相を形成すべく前記混合物を処理するステップ、（ｄ）形成された透明な上方 相から所定量の上方相を別個に採取するステップ、並びに （ｅ）所定量の上方相中に存在するシアル酸の量を測定し、それによって試料中 に存在するシアル酸の量を計算するステップを含む。

血漿もしくは血清試料中のシアル酸の量は癌を診断するための指針の１つとして 使用し得る。試料は通常、被験者から採取した全血を後述の方法で処理して血漿 もしくは血清を回収することにより調製する。この血漿又は血清は直接使用し得 る。

ステップ（ａ）で添加するアルコール／塩素化炭化水素混合物の量は試料の量に ほぼ等しい０例えば、試料の初期量が１０ｈｌであれば、加える混合物の量も約 １００ｕ　ｌにする。

適当な塩素化炭化水素としては、クロロホルム、塩化メチレン、塩化エチレン、 塩化プロピレン及び四塩化炭素が挙げられる。現時点ではクロロホルムが好まし い、低級アルキルアルコールとしてはメタノール、エタノール、プロパツール、 ｎ−ブタノール、インプロパツール、イソブタノール又はイソアミルアルコール を使用し得る。但し、シアル酸の抽出に関しては、アルコールの炭素原子数が多 ければ多いほど、混合物の効果は減少する。従って、好ましいアルコールはメタ ノールである。

当業者に公知の方法で使用されるアルコール／塩素化炭化水素混合物とは異なり 、本発明で使用する混合物はアルコールの割合が塩素化炭化水素の割合より遥か に大きい。

本発明の実施で使用し得る低級アルキルアルコール対塩素化低級アルキル炭化水 素の比は８５：１５〜７０　：　３０である。現時点で最も好ましい実施態様で は、メタノール及びクロロホルムを約７５：２５の容量比で使用する０表２及び 第１図は、アルコール対塩素化炭化水素の種々の比が、上清の抽出、最終色の濁 り度、及び先行技術の方法で得られた値と測定値との合致性に及ぼす影響を示し ている。

Ｌユ ＣＨＣｌ　）　：ＣＨ＊ＯＨの比が上清（抽出物）の分離、最終色の濁り度及び 測定値に及ぼす影響 ステップ（ａ）で得た混合物は、試料中の物質がアルコール／塩素化炭化水素混 合物に溶解するまで適当な時間にわたって混和する。好ましくは、静かな断続的 渦状撹拌によって約１０秒間混和する。

次いで、回収可能な実質的に透明な上方相が形成されるように、前記混合物を処 理する。この処理は混合物を静置するか又は遠心分離にかけることによって実施 し得る。好ましくは、前記混合物を約２０００ｒｐｍ　（７５０ｘｇ）以上で少 なくとも約２分間遠心にかけて、実質的に透明な上方相を得るようにする。好ま しい実施態様では、遠心分離を約３０００ｒｐｍで約１０分間行う。

次いで、好ましくは上方相を上方相から分離し且つ後者を廃棄することによって 、形成された実質的に透明の上方相から所定量の上方相を分離採取する。採取す べき所定量は、試料の初期量と、所定量の上方相中に存在するシアル酸の量を測 定するためのステップ（ｅ）で使用する特定の方法とに依存する０例えば、試料 の初期量が約ｔｏｏｕ＋であれば、ステップ（ｅ）で酵素溶液を使用する場合に は別個に採取する上方相の量を約５０．　ｌにし、前記ステップでレゾルシノー ル試薬を使用する時は前記上方相の量を１ｏａｐ　ｌにする０分離採取すべき上 方相の所定量はまた、大量の上方相を管内の界面もしくは別の物質をかき乱すこ となく除去する上での容易さにも依存する。

採取した所定量の上方相中のシアル酸含量は幾つかの方法で測定し得る。成る実 施態様では、適当な酵素、例えばノイラミニダーゼ又はノイラミニダーゼを含む 酵素の組合わせを所定量の上方相に加えて混合物を形成する。添加する酵素の量 は、酵素の種類と上方相の所定量とに依存する。

好ましくは、酵素の量を上方相の所定量の２倍にする０次いで、前記混合物をイ ンキュベートする。このインキュベーションは通常３７℃で約２０分間行う、イ ンキュベーションが終わったら、前記混合物に安定剤緩衝溶液を加えて溶液を形 成する。この溶液を混和し、５５０ｎｍでの吸光度を測定する。測定した吸光度 を既知のシアル酸濃度の１つ又は複数の標準溶液の吸光度と比較することによっ て、試料中に存在するシアル酸の量をめる。

本発明を実施するのに使用される適当な安定剤緩衝溶液は、当業者には良く知ら れている。好ましい実施態様では、この＊Ｗ温溶液温度３７℃、ｐＨ７，５のリ ン酸塩及び水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の混合物からなる０、！Ｉの緩衝溶液 は、２．７２ｇのＫＨ，ＰＯ，を５００ｍ１の水に溶解し、ＩＯＮ水酸化ナトリ ウムを（通常２０〜３０滴）加えてｐＨを７．５に調整し、次いで該溶液の温度 を３７℃にすることによって調製し得る。得られたＩＩＷ溶液は０℃〜４℃で貯 蔵する。

別の実施態様では、所定量の上方相に適量のレゾルシノール試薬を加えることに よってシアル酸量を測定する。レゾルシノール試薬は通常、レゾルシノールと水 との混合物からなる。意外なことに、レゾルシノール試薬を形成するために本発 明の実施で使用し得るレゾルシノール対水の比は、約５３：４７〜約５７：４３ に制限されることが判明した。レゾルシノール対水の比を５５：４５にすると最 大の効果が得られた。このレゾルシノール試薬を上方相と混合しく上方相の所定 量が１００μｍの場合はレゾルシノール試薬の量を約０．５ｍｌにする）、得ら れた溶液を５分間沸騰させ、水浴で冷却し、その後前記適量のレゾルシノール試 薬（例えば約１ｍ１）の約２倍の量の酢酸ブチルとｎ−ブタノールとの混合物（ 容量比８５：１５）に加える。このようにして得られた、上方相、レゾルシノー ル試薬及び酢酸ブチル／ｎ−ブタノールの溶液を混和し、約２００Ｏｒｐｍ以上 の速度で約５分間遠心分離して有機層を形成する。この有機層を分離し、その吸 光度を５８０ｎｍで読取る０次いで、測定した吸光度を既知のシアル酸濃度を有 する１つ又は複数の標準溶液の吸光度と比較することによって、試料中に存在す るシアル酸の量を計算する。

これと類似の別の実施態様では、酢酸ブチルとｎ−ブタノールとの混合物ではな く、適量のレゾルシノール試薬とその２倍の量の蒸留水とを所定量の上方相に加 え、且つ５５０ａ■での吸光度を測定することによって、シアル酸量を測定し得 る。

試料中のシアル酸量の算出は、既知量のｎ−アセチルノイラミン酸（ＭＡＮ＾） を含む標準溶液との比較を行い、且つ試料の吸光度読取り値を前記標準溶液の吸 光度読取り値で補間することによって実施し得る。

本発明の種々の実施態様における試料の取扱い及び操作の種々のステップ、例え ば試薬の添加、混合、アリコートの採取、遠心分離等は、例えば適当にプログラ ム化した（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ）ロボット装置と操作に必要な適当な装置、例 えばシリンジ、プリパーチューブ、遠心分離器、渦状撹拌器（ｖｏｒＬｅｘｅｒ ）もしくは他の混合器等とをインタフェースで適当に接続して使用することによ り自動化し得る。また、−ｑレ シアル酸の存在に起因する吸光も、適当にプログラムした検出装置、例えばスペ クトロホトメータとロボット装置とをインタフェースで適当に接続して自動化し 得る。シアル酸の量も、適当にプログラム化したコンピュータ、例えばマイクロ コンピュータを検出装置と適当にインタフェース接続して、検出吸光度から直接 計算されるようにし得る。

測定方法を前述のごとく自動化すれば、アッセイ当たりのコストが低下し、アッ セイの変動係数も改善され得る。

本発明は、ヒト被験者の癌を診断する方法にも係わる。

この診断方法は、被験者の血液の血漿もしくは血清試料中のシアル酸量を前記測 定方法によって測定し、測定した量を癌にかかっていることがわかっている被験 者の測定値と比較するか、又は前記測定量を同じ被験者の一定期間の測定値と比 較することからなる９本発明はまた、被験者の癌の進行をモニターする方法も提 供する。この方法は、被験者の体液試料中のシアル酸量を本発明の測定方法によ って一定の時間間隔で測定し、測定した量を同一被験者についてそれ以前に測定 した量と比較することからなる。この方法は、療法に対する被験者の反応のモニ ター又は癌の再発のモニターにも使用し得る。この方法はまた、癌患者の治療プ ログラムの決定に使用することもできる。

本発明は更に、癌診断キットも提供する。このキットは検査試料を収容し得る適 当な容器と、既知量の基準試料及び／又はｎ−アセチルノイラミン酸標準溶液が 入った容器と、低級アルキルアルコール及び塩素化低級アルキル炭化水素の混合 物（容量比７５：２５）が入った容器と、酵素溶液もしくはレゾルシノール試薬 の容器と、必要であれば、安定剤Ｍ衝溶液もしくは酢酸ブチルとｎ−ブタノール との混合物（容量比８５：１５）が入った容器と、容器に入った脱イオン蒸留水 と、ピペットチップとを含む。

以下に実施例を挙げて、本発明をより詳細に説明する。

但し、これらの実施例は本発明を一切限定するものではない。

叉ｍ １１ｊＵ夏 液体ＥＤＴ＾を入れたバキュテイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）（パープルキャ ップ）（１５％ＥＤＴ＾を充填したＶｅｎｏｊｅｃｔラベンダーストッパーチュ ーブ）又はＥＤＴ＾コーティングビーズを入れたマイクロチイナー（ｍｉｃｒｏ ｔａｉｎｅｒ）に全血を採取する。管を何回か逆さにして中の物質を混合した後 、ベンチタイプ臨床遠心分離器（ＩＥＣ＃９５８８箇所ロータを備えたＩＥＣ） ＩＮ−Ｓ−ＩＩ遠心分離器、Ｄａｍｏｎ／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｑｕ ｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏ、）により２２００ｒｐｍで１０分間遠心分離する０分離し た血漿のアリコートは分析前に一２０℃で数箇月貯蔵するか、又はそのままの新 鮮な状態で分析する。

及１色よ ＥＩｔ　の５ 実施例１″ｉ！″調製した血漿試料１００，１を適当な管又は容器に入れる１次 いで、等容量（１００ｕｌ）のメタノール：クロロホルムを加える。クロロホル ム、メタノール及び他の溶媒はＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ　Ｉｎｃ、から＾ｎａ ｌｙｔｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ（＾Ｒ）グレードで入手した。前記混合物を１ ０秒間渦状に撹拌する（Ｖｏｒｔｅｘ−Ｇｅｎｉｅ・、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｅ、）、その後、試料を３０００〜４０００ｒｐｍ で１０分間遠心分離し、実質的に透明な上方相を形成する。

えＬｌ工 １００Ｉ　−のシ　ル　の・ ホウケイ酸塩培養管に、実施例２で得た透明上清５０，１をＨＬ＾ピペッタ−に よって注入し、これにノイラミニダーゼとＭ衝溶液とを含む酵素溶液をｔｏｏｕ ＋加える。この管を３７℃の水浴中に配置して２０分間インキュベートする。イ ンキュベーションが終わったら、１１の安定剤緩衝溶液を加える。

短時間混合した後、管を室温で１０分間靜１する。３０分以内に５５ｏｎ−での 吸光度を測定する。試料中に存在するシアル酸の量は、該試料の吸光度読取り値 を既知のノイラミニダーゼ濃度の溶液の吸光度読取り値で補間することによって 計算できる。

Ｋ１圧先 １００１；　のシアル　゛の　１″″ ホウケイ酸塩培養管に、実施例２で得た上清１００，１をＭＬ＾ピペッタ−によ って注入し、これに０．５ｅ＋ｌのレゾルシノール試薬を加える。得られた溶液 を渦状に撹拌し、次いで沸騰水中に５分間配置する。試料が沸騰したらすぐに氷 水洛中に入れて５分間放置する。その後、１．０ｍｌの酢酸ブチル及びブタノー ルの混合物（８５：１５　ｖ／ｖ）を加え、この試料を渦状に撹拌しさらに約２ ５００ｒｐ＋＊で５分間遠心分離する。有機相の吸光度を５８ｏｎ−で測定しく Ｍｏｄｅｌ　３４スペクトロホトメータ、ＢｅｃｋＩＩＩａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、）、前記した方法でシアル酸量を計算する。

九良隨１ １００１血　＝　のシアル　を゛　る　゛の　２″″乏ホウケイ酸塩培養管に、 実施例２で得た上清１０ｈｌをＭＬ＾ピペッタ−によって注入し、これに０．５ １のレゾルシノール試薬を加える。得られた溶液を渦状に撹拌し、次いで沸騰水 中に５分間配置する。試料が沸騰したらすぐに氷水洛中に入れて５分間放置する 。その後、１．０ｍｌの水を加え、この試料を渦状に撹拌しさらに約２５００ｒ ｐ−で５分間遠心分離する。有機層の吸光度を５５Ｏｎ−で測定しくＭｏｄｅｌ 　３４スペクトロホトメータ、Ｂｅｃｋｓ＋ａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉ ｎｃ、）、前記した方法でシアル酸量を計算する。

え１１影 し゛ルシノール２・ １、レゾルシノール、２９／ １００１計量フラスコに２ｇのレゾルシノール（ＳＩにＨＡ　＃Ｒ−１０００） を秤取する。マークのレベルまで蒸留水を充填する。

この溶液を暗色場に入れて冷蔵する。

２　、０．ＩＭＰ　Ｃｕ５Ｏ−５ＨＯＭ＾ＬＬＩＮＣＫＲＯＤＴ　４８４４１０ ０ｍｌ計１１７５　ス：ｌ　４．１：２．４９７ｇｍ（７）　Ｃｕ５Ｏｎ　・５ Ｈ，０を秤取する。

マークのレベルまで蒸留水を充填する。

３、塩　ＦＩＳＨＥＲＣｏ、＃＾−１４４し゛ルシノール；′の＝ １００ｍｌ計量フラスコに下記の物質を導入する：ａ）　１０．０ｍｌの２％レ ゾルシノール原液、ｂ）　０．２５ｍ１の０．１Ｍ　Ｃｕ５Ｏ，（混合する）、 ｅ）　９．７５ｍ１の蒸留水（混合する）、ｄ）マークのレベルまで塩酸を充填 。

これらの物質を混合し、暗色容器に移して０〜５℃で貯蔵する。

火１１外１− ０　のシ　ル　゛　のう Ａ）既知のシアル酸濃度の試料を１つ用いる場合：既知量のシアル酸を含む試料 （ＰＯＯＬ）を未知量のシアル酸を含む試料と同じ条件で分析する。既知の試料 が光学密度（０，Ｄ、）“Ａ”を示し、未知の試料が０．Ｄ、“Ｂ”を示せば、 未知の試料のシアル酸濃度は下記の式に従って計算される：例えば、既知の試料 の０．Ｄ、Ａ　＝　、０８４未知の試料の０．０．Ｂ　＝　、１１９既知の試料 の濃度　＝　１８．８　Ｂｓ％となる。

Ｂ）シアル酸濃度が既知の試料を３つ又は４つ使用する場合ニ シアル酸濃度が既知である３つ又は４つの試料（ＰＯＯＬ）を未知の試料と共に 分析する。既知の試料は直線状の標準曲線を示し、この標準曲線から未知の試料 のシアル酸濃度を読取ることができる。

え１１支 表３は、シアル酸濃度を米国特許第４，７４８，１２８号に記載の方法で測定し た場合の結果と、本発明の方法で測定した場合の結果とを比較して示している。

この表３から明らかなように、本発明の方法を使用した場合には標準偏差が先行 技術の方法の場合より遥かに改善されている。

第２図は、米国特許第４，７４８，１２８号の方法及び本発明の方法を用いて、 活動性癌（ａｅｔｉｖｅ　ｃａｎｃｅｒ）疾患を有する患者、良性疾患を有する 患者及び健常者の試料から夫々測定したシアル酸Ｉの比較を示している。この図 から明らかなように、本発明の方法で得られた値は、臨床的に活動性疾患をもつ 患者に対する相関度が、米国特許第４，７４８，１２８号の方法によって得られ た値より高かった。

表−１ ゛　、−４７４８１２８の　′　び　日の　ゞで・　したシアル　の１、米国特 許第４，７４８，１２８号 ２、実施例３の方法 手続補正書力式 ％式％ ２、発明の名称　血漿中のシアル酸を測定するための改良された方法３、補正を する者 事件との関係　特許出願人 名　称　ダイアノン・システムズ・インコーホレイテッド４、代　理　人　東京 都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正命令の日付　平成３年１１月 ５日６、補正の対象　図面 ７、補正の内容 （１））図面の翻訳文の浄書を別紙の通り補充する。（内容に変更なし）国際調 査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．血漿もしくは血清試料からシアル酸を抽出し、試料中に存在するシアル酸の 量を測定する方法であって、（ａ）試料に低級アルキルアルコールと塩素化低級 アルキル炭化水素との混合物を加えて、低級アルキルアルコール対塩素化低級ア ルキル炭化水素の容量比が約７０：３０〜約８５：１５の混合物を形成するステ ップ、 （ｂ）待られた混合物を、試料中に存在するシアル酸を溶解するのに十分な時間 にわたって混和するステップ、（ｃ）回収し得る実質的に透明なシアル酸含有上 方相を形成すべく前記混合物を処理するステップ、（ｄ）形成された透明な上方 相から所定量の上方相を分離採取するステップ、並びに （ｅ）所定量の上方相中に存在するシアル酸の量を測定し、それによって試料中 に存在するシアル酸の量を計算するステップを含む方法。
2. ２．低級アルキルアルコールがメタノール、エタノール、アロパノール、ｎ−ブ タノール、イソプロパノール、イソブタノール又はイソアミルアルコールである 請求項１に記載の方法。
3. ３．塩素化低級アルキル炭化水素がクロロホルム、塩化メチレン、塩化エチレン 、塩化プロピレン又は四塩化炭素である請求項１に記載の方法。
4. ４．低級アルキルアルコールがメタノールであり、塩素化低級アルキル炭化水素 がクロロホルムである請求項１に記載の方法。
5. ５．メタノール対クロロホルムの容量比が約７５：２５である請求項４に記載の 方法。
6. ６．ステップ（ｂ）の混和操作が約１０秒間の渦状撹拌からなる請求項１に記載 の方法。
7. ７．ステップ（ｃ）の処理が約３０００ｒｐｍ以上で少なくとも１０分間の遠心 分離からなる請求項１に記載の方法。
8. ８．ステップ（ｄ）での分離採取が、下方相から上方相を除去することからなる 請求項１に記載の方法。
9. ９．ステップ（ｅ）で所定量の上方相中のシアル酸量を測定する操作が、所定量 の上方相に適当な酵素を加えて混合物を形成し、この混合物を適当な時間にわた ってインキユベートし、この混合物に安定剤緩衝溶液を加えて溶液を形成し、こ の溶液を混和し、この溶液の吸光度を５５０ｎｍで測定し、測定した吸光度を既 知のシアル酸濃度を有する１つ又は複数の標準溶液の吸光度と比較して試料中の シアル酸量を計算することにより実施される請求項１に記載の方法。
10. １０．酵素がノイラミニダーゼ及び緩衝溶液を含む請求項９に記載の方法。
11. １１．酵素の量が上方相の所定量の２倍である請求項１０に記載の方法。
12. １２．安定剤緩衝溶液がリン酸塩と水酸化ナトリウムとを含む請求項９に記載の 方法。
13. １３．安定剤緩衝溶液が、ＫＨ２ＰＯ４を水に溶解し且つ水酸化ナトリウムを加 えることによって調製される請求項１２に記載の方法。
14. １４．ステップ（ｅ）で所定量の上方相中のシアル酸量を測定する操作が、適量 のレゾルシノール試薬を加えて溶液を形成し、この溶液を混和し、この溶液を５ 分間沸騰させ、この溶液を氷浴で冷却し、この溶液に容量比約８５：１５の酢酸 ブチル及びｎ−ブタノールの混合物を前記適量のレゾルシノール試薬の約２倍の 量で加え、得られた溶液を混和し、この溶液を約２０００ｒｐｍ以上の速度で約 ５分間遠心分離にかけて有機層を形成し、この有機層を分離し、該有機層の５８ ０ｎｍでの吸光度を読取り、測定した吸光度を既知のシアル酸濃度を有する１つ 又は複数の標準溶液の吸光度と比較して試料中のシアル酸量を計算することによ り実施される請求項１に記載の方法。
15. １５．ステップ（ｅ）で所定量の上方相中のシアル酸量を測定する操作が、適量 のレゾルシノール試薬を加えて溶液を形成し、この溶液を混和し、この溶液を５ 分間沸騰させ、この溶液を氷浴で冷却し、前記適量のレゾルシノール試薬の約２ 倍の量の水を加え、得られた溶液を混和し、この溶液を約２０００ｒｐｍ以上の 速度で約５分間遠心分離にかけ、得られた溶液の吸光度を５８０ｎｍで読取り、 測定した吸光度を既知のシアル酸濃度を有する１つ又は複数の標準溶液の吸光度 と比較して試料中のシアル酸量を計算することにより実施される請求項１に記載 の方法。
16. １６．レゾルシノール試薬のレゾルシノール対水の容量比が５５：４５である請 求項１４又は１５に記載の方法。
17. １７．レゾルシノール試薬の適量が約０．５ｍｌである請求項１４又は１５に記 載の方法。
18. １８．ヒト被験者の癌を診断する方法であって、被験者の体液試料中のシアル酸 量を請求項１に記載の方法で測定し、測定した量を癌にかかっていることがわか っている被験者について得られた値と比較することからなる方法。
19. １９．ヒト被験者の癌を診断する方法であって、被験者の体液試料中のシアル酸 量を請求項１に記載の方法により一定の時間間隔で測定し、測定した量を同一被 験者についてそれ以前に得られた量と比較することからなる方法。
20. ２０．被験者の癌の進行をモニターする方法であって、被験者の体液試料中のシ アル酸量を請求項１に記載の方法により一定の時間間隔で測定し、測定した量を 同一被験者についてそれ以前に得られた量と比較することからなる方法。
21. ２１．被験者の癌の進行をモニターする方法であって、被験者の体液試料中のシ アル酸量を請求項９に記載の方法により一定の時間間隔で測定し、測定した量を 同一被験者についてそれ以前に得られた量と比較することからなる方法。
22. ２２．検査試料を収容するための適当な試料容器と、既知量の基準試料が入った 試料容器と、低級アルキルアルコール及び塩素化低級アルキル炭化水素の混合物 （容量比７５：２５）が入った容器と、ノイラミニダーゼを含む酵素溶液の容器 と、安定剤緩衝溶液の容器と、ピペットチップとを含む癌診断キット。
23. ２３．検査試料を収容するための適当な試料容器と、既知量の基準試料及びｎ− アセチルノイラミン酸標準溶液が入った試料容器と、低級アルキルアルコール及 び塩素化低級アルキル炭化水素の混合物（容量比７５：２５）が入った容器と、 レゾルシノール試薬の容器と、酢酸ブチルとｎ−ブタノールとの混合物（容量比 ８５：１５）が入った容器と、脱イオン蒸留水の容器と、ピペットチップとを含 む癌診断キット。
24. ２４．検査試料を収容するための適当な試料容器と、既知量の基準試料及びｎ− アセチルノイラミン酸標準溶液が入った試料容器と、低級アルキルアルコールと 塩素化低級アルキル炭化水素との混合物（容量比７５：２５）が入った容器と、 レゾルシノール試薬の容器と、脱イオン蒸留水の容器と、ピペットチップとを含 む癌診断キット。
25. ２５．適当にプログラム化したロボット装置を用いて自動的に実施される請求項 １に記載の方法。
26. ２６．適当にプログラム化したロボット装置を用いて自動的に実施される請求項 ９に記載の方法。