CN108949902A - 一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血清小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)检测技术领域，特别涉及一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，试剂R1中含有MOPS缓冲液pH7.0、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、鞘磷脂酶、过氧化氢酶、聚乙二醇3‑苄氧基苯基醚、JJ70L、TOOS、4‑甲基苯硼酸(4‑FPBA)、D‑海藻糖、氯化锂，试剂R2中含有MOPS缓冲液pH7.0、过氧化物酶、TritonX‑100、4‑AA、氯化锂，该试剂适合与各种全自动生化分析仪配套使用，准确度和抗干扰能力良好，且具有良好的热稳定性。

Description

一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒
技术领域
本发明涉及血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测技术领域，特别涉及一种适合全自动生化分析仪的血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂。
背景技术
1.背景
小而密低密度脂蛋白胆固醇(sd LDL)是低密度脂蛋白胆固醇(LDL)的亚组分之一。LDL分为3个组分，包括：LDL，分子半径为30-80nm；L LDL，分子半径为25.5-28.0nm；sdLDL：分子半径为22.0-25.5nm。sd LDL是高密度的LDL。2.临床意义
在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展中，脂蛋白在动脉管壁沉积是一系列的过程，它首先存留于管壁一定部位，然后被单核巨噬细胞或平滑肌细胞摄取。血管内膜细胞外基质含有硫酸软骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPG)，可与脂蛋白结合形成复合物，从而延长脂蛋白滞留与血管内膜下的时间。体外实验表明这种与CSPG结合的LDL容易被单核巨噬细胞摄取，使脂类聚集而转变为泡沫细胞。血浆sLDL水平超过2.6mmol·L-1或者低于2.6mmol·L-1者形成的CSPG-LDL复合物明显增多多。sLDL的这种特性可能在致AS过程中起重要作用。
近年来对LDL亚组分与冠心病的关系进行了深入的研究，认为sLDL在AS的发生中起重要作用，是冠心病的危险因子。大量流行病学及临床研究(如Framingham研究,Helsinki心脏研究等)已肯定了血浆甘油三酯升高是冠心病的独立危险因素，基础研究也肯定了富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-rich lipoproteins,TRL)的致AS作用。血浆甘油三酯升高改变了LDL、高密度脂蛋白的代谢，促进LDL与高密度脂蛋白之间的甘油三酯和胆固醇酯交换，引起致AS作用更强的sLDL增多而高密度脂蛋白减少。临床上表现为血浆甘油三酯升高、高密度脂蛋白-C降低和小而密LDL升高。
流行病学研究、临床观察和有关TRL代谢和实验研究，均表明sLDL与AS的发生、发展关系密切。我国人民以高碳水化合物饮为主，高甘油三酯血症较为常见，通过检测sd LDL这个动脉粥样硬化高危因素，预防AS性疾病的发生具有重要的社会和经济意义。
3.检测方法
目前小而密低密度脂蛋白胆固醇测定使用的方法有梯度密度超速离心法、化学沉淀法、核磁共振光谱法及过氧化物酶法。
(1)梯度密度超速离心法
原理：梯度密度超速离心法是将血清样本加入到事先用溴化钾(配制好的不同密度梯度的分离液中，在10℃以下使用超速离心机以离心力200000r离心23h后，血清中脂蛋白中的不同组分将根据各自的密度转移到相同密度的分离液中，从而达到分离纯化各组分脂蛋白的目的。虽然这种方法可以一次性将血清中各种组分的脂蛋白区分开。因此，密度梯度超速离心法具有一定的局限性，对实验室条件和实验操作人员的能力要求都比较高。
评价：该方法缺点是离心时间很长，操作步骤繁琐，也很难将各组分脂蛋白完全分离开。
(2)化学沉淀法
原理：化学沉淀法是使用聚阴离子与二价阳离子或一价阳离子聚合在一起，使血清中的Ib-LDL、VLDL以及CM聚集沉淀，通过超速离心法将沉淀与液体分离，再采用过滤器过滤除去聚集物，然后将含有sd-LDL和HDL的滤过液收集起来，将滤液样本用LDL试剂盒在全自动生化仪定量检测sd-LDL浓度的方法。
评价：化学沉淀法虽然检测样本比较快速、简单，但第一步沉淀容易不完全，造成后面用试剂盒检测LDL的测定值不准确。
(3)核磁共振光谱法
原理：核磁共振(NMR)光谱法根据在磁共振扫描下，血架脂蛋白外壳的磷脂信号强度测定各个脂蛋白的直径；依据各个脂蛋白的内核胆固醇脂和TG上的甲基团的数目多少测定各组分脂蛋白的浓度。NMR光谱法的优点在于能够同时迅速测定各组分脂蛋白颗粒的大小及其亚型浓度，大约可以测定16种脂蛋白亚型。
评价：该法具有检测分析样本迅速、精确度高以及操作简单等优点，但需要核磁共振仪这种特殊并且贵重的实验设备，所以NMR光谱法不能在实验室被普遍推广应用。
(4)过氧化物酶法
原理：过氧化物酶法分为两步：
1.消除sd LDL以外的脂蛋白中的胆固醇
通过A,B两种表面活性剂及磷脂酶的作用，破坏LDL的外部结构，同时，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶的作用下消除LDL、L LDL的干扰。
2.测定sd LDL
在表面活性剂C的存在下，sd LDL的外部结构被破坏，在胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶和过氧化氢酶的催化作用下生成紫色物质，吸光度的变化与sd LDL的含量呈正比。
评价：该方法具有检测速度快、结果准确及适用于全自动生化分析仪的优点。
发明内容
针对于血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测，本发明提供了一种适合全自动生化分析仪的血清小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)检测试剂盒，该试剂盒具有良好的稳定性、准确度和线性范围，且使用简单、方便，有利于试剂在临床上的推广应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，包括试剂R1，R2，所述试剂R1，R2的组成如下：
1.一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，由试剂R1，R2组成，具体组分如下：
R2：
2.一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，其特征在于，所述试剂在使用时R1：R2＝3:1,R1用量为300μl。
本发明的有益效果是：
(1)本发明使用了氯化锂、D-海藻糖和4-甲基苯硼酸作为酶稳定剂，保证了试剂中的酶在37℃条件下能够稳定12d以上。
(2)本发明使用了聚乙二醇3-苄氧基苯基醚和JJ70L两种表面活性剂选择性的解离除sd-LDL外的其他脂蛋白胆固醇，从而保证了加入R2后仅有sd-LDL与显色剂反应，保证了检测结果的准确性。
附图说明
图1实施例1试剂与对照组试剂的相关性曲线图；
图2实施例1试剂与对照组试剂热稳定性检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
(1)实施例1
R2：
(2)本实施例试剂的使用方法：
本实施例描述的血清小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)检测试剂，在使用时采用全自动生化分析仪，如日立7180全自动分析仪等，利用终点法进行测定。将样本和试剂R1、R2比例设定为3：300：100，检测波长为600nm，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：
表1实施例1试剂检测方法
血清小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量(mmol/L)＝(样品ΔA)/(标准ΔA)×标准浓度。
实施例2
干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成5等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例1所得试剂，与市场常见并认可的血清小而密低密度脂蛋白胆固醇试剂同时对比测定血清小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量,对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(％)＝(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100％。
表2实施例试剂抗干扰性能比较
由表2可以看出，实施例1试剂在胆红素≤300μmol/L、肌酐≤200μmol/L、血红蛋白≤200mg/L、甘油三酯≤2.5mmol/L、胆固醇≤50μmol/L对测试结果没有明显干扰。与对照结果相比，本发明试剂抗干扰能力较好，说明实施例1的试剂在准确度和抗干扰能力上达标。
实施例3
相关性实验：利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的某公司的小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了两种试剂的相关性曲线(如图1所示)，通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.999，说明了两者有极大的相关性。
表3实施例1试剂与对照组试剂盒对比检测结果
试验所用校准品和质控品分别为：
校准品：血清小而密低密度脂蛋白胆固醇的含量为1.43mmol/L。
质控品：血清小而密低密度脂蛋白胆固醇的靶值为1.41mmol/L，靶值范围：1.20-1.62mmol/L。
实施例4
试剂稳定性验证试验：将本发明实施例1试剂作为试验组，取一种市售血清小而密低密度脂蛋白胆固醇(过氧化物酶法)检测试剂盒作为对照组，试验组与对照组试剂每组各自取相同的两份，一份做15天开瓶稳定性试验，将试剂开瓶放置在仪器的2-8℃冷藏箱中(15天不取出)，作为15天开瓶稳定性检测；另一份做37℃热稳定性检测试验，封闭放置在37℃恒温水浴锅中(每天仅在检测的时候取出，检测完毕后，依然封口放回37℃水浴锅中，连续12天)，作为37℃热稳定性验证。将试剂同时在日立7180全自动生化分析仪器上，按照如下表1方法进行检测，并在仪器上建立标准曲线。取冻干粉质控品，溶解均匀后，平均分成15份，-20℃储存，每天质控一个，并且跟踪检测结果，其热稳定性跟踪监测趋势如图2。

Claims (4)

1.一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，由试剂R1、R2组成，具体组成组分：
R1：MOPS缓冲液 pH7.0 50mmol/L
胆固醇酯酶 600U/L
胆固醇氧化酶 500U/L
鞘磷脂酶 2700U/L
过氧化氢酶 1200KUL
聚乙二醇3-苄氧基苯基醚 1g/L
JJ70L 0.3g/L
TOOS 0.5mmol/L
4-甲基苯硼酸(4-FPBA) 0.01%
D-海藻糖 5g/L
氯化锂 5mmol/L
R2：
MOPS缓冲液 pH7.0 50mmol/L
过氧化物酶 5ku/L
TritonX-100 1g/L
4-AA 1mmol/L
氯化锂 5mmol/L。
2.根据权利要求1所述的一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，试剂在使用时R1：R2= 3:1,R1用量为300μl。
3.根据权利要求1所述的一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，使用了氯化锂、D-海藻糖和4-甲基苯硼酸作为酶稳定剂，保证了试剂中的酶在37℃条件下能够稳定12d以上。
4.根据权利要求1所述的一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，本发明使用了聚乙二醇3-苄氧基苯基醚和JJ70L两种表面活性剂选择性的解离除sd-LDL外的其他脂蛋白胆固醇，从而保证了加入R2后仅有sd-LDL与显色剂反应，保证了检测结果的准确性。
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