CN109837325A - 一种基于修饰鞘磷脂酶优化的hdl3比色法检测试剂盒及其制备使用方法 - Google Patents

一种基于修饰鞘磷脂酶优化的hdl3比色法检测试剂盒及其制备使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，试剂R1：Tris‑HCl、PEG6000、BSA、Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative等；试剂R2：Tris‑HCl、PEG6000、mPEG‑SMASE2、Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether等。本发明还提供了一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒的制备与使用方法。本发明试剂盒可用于全自动生化分析仪分析，其成本低廉、自动化高，能大大节省检测时间；并且，相比同类产品，稳定性和灵敏度更高。

Description

一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒及其制 备使用方法
技术领域
本发明涉及生化测定分析领域，尤其涉及一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒及其制备使用方法。
背景技术
高密度脂蛋白3(High-density lipoprotein 3，HDL3)是高密度脂蛋白(High-density lipoprotein，HDL)的亚组分之一。HDL是血浆中主要脂蛋白之一，其密度最高，颗粒直径最小，蛋白组成以载脂蛋白为主。HDL与磷脂、载脂蛋白、胆固醇和少量脂肪酸组成高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)，HDL上结合胆固醇的量的不同形成了HDL1-C、HDL2-C和HDL3-C三种亚型，对应HDL1、HDL2和HDL3三种脂蛋白亚型，两者之间有特定的比例关系，因而可以通过测定HDL-C的量来反应HDL的量。人HDL-C的颗粒大小为7.2～12.9nm，密度介于(1.063～1.210)g/mL之间，相对分子质量为200～400kD。HDL2-C的密度为1.063～1.125g/mL，HDL3-C的密度为1.125～1.210g/mL。
HDL的重要生理功能是介导胆固醇逆转运，具有抗动脉粥样硬化和血管保护作用，可减少心血管疾病的发生。流行病学调查显示，血浆HDL水平与动脉粥样硬化等心血管疾病的危险性呈高度负相关。HDL可对抗由血脂代谢紊乱引起的心血管疾病，升高HDL可能成为冠心病防治的有效措施。且有报道动物实验证明，HDL中起作用的亚组分为HDL3，HDL1和HDL2在调节血脂(及逆向胆固醇转运)方面并没有可观测到的作用。所以，HDL3可以用作心血管疾病的治疗剂，也可以用于心血管疾病、糖尿病、肾脏疾病的检测标志物。
目前，关于高密度脂蛋白亚组分的测定方法有：超速离心法、高效液相色谱(HPLC)法、沉淀法、核磁共振波谱(NMR)法等。其中，超速离心法通过离心，利用脂蛋白的比重之差来进行分型；其缺点在于：操作技术要求高，成本高，耗时长。HPLC的方法也存在上述问题。沉淀法的缺点则在于：作业需熟练，需要手工操作，有时需要检样的前处理操作，耗时过长，且并非通用。NMR法为通过磁共振来测定脂蛋白的颗粒数，为非一般性的方法，需要有特定的设备和相应的技术人员。
据此，目前急需一种操作简易、使用方便、成本低廉、耗时短，且自动化高的HDL3比色法检测试剂盒及其制备使用方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简易、使用方便、成本低廉、耗时短，且自动化高的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒及其制备使用方法。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
作为本发明的优选方式之一，还包括HDL3校准品，包括的成分及相应含量为：
作为本发明的优选方式之一，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl etherderivative由一种或几种HBL值13.0～14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成。
作为本发明的优选方式之一，所述HBL值13.0～14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品EMULGEN B-66、EMULGEN A-90或日光化学公司产品NIKKOL BC-10。
作为本发明的优选方式之一，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether由一种或几种HBL值15.0～15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。
作为本发明的优选方式之一，所述HBL值15.0～15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V或NIKKOL BD-10。
作为本发明的优选方式之一，所述mPEG-SMASE2的获取方法如下：
①重组二联体鞘磷脂酶的制备：
a.于GENBANK获取鞘磷脂酶全部CDS，取(GS)6作为柔性linker，并于首尾分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点，即得目标序列-重组二联体鞘磷脂酶的核苷酸序列，具体如SEQ IDNO.1所示；
b.得到目标序列后，送基因公司合成；
c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；
d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；
e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；
②重组二联体鞘磷脂酶的mPEG化：
a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO3 10g、5A分子筛5g以及mPEG-5000 50g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；
b.离心去除Na2CO3、5A分子筛悬浮物，用600mL乙醚沉淀，再用400mL无水苯溶解沉淀，如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；
c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组二联体鞘磷脂酶，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液(40mM，pH 7.4)，于摇床室温反应3～6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-SMASE2。
作为本发明的优选方式之一，所述HDL3-C的获取方法如下：
①HDL-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 49g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 315g、NaN3 250mg，并用90mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL(来自于健康捐献者)，加HDL-C分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加HDL3分离液2mL，混匀；室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3-C产物。
一种基于上述修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)人HDL3-C的制备
①HDL-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 49g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 315g、NaN3 250mg，并用90mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL(来自于健康捐献者)，加HDL-C分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加HDL3分离液2mL，混匀；室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3-C产物；
(2)mPEG化重组二联体鞘磷脂酶的制备
①重组二联体鞘磷脂酶的制备：
a.于GENBANK获取鞘磷脂酶全部CDS，取(GS)6(即，6个-(甘氨酸-丝氨酸)-，串联)作为柔性linker，并于首尾分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点，即得目标序列-重组二联体鞘磷脂酶的核苷酸序列，具体如SEQ ID NO.1所示；
b.得到目标序列后，送基因公司合成；
c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；
d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；
e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；
②重组二联体鞘磷脂酶的mPEG化：
a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO3 10g、5A分子筛5g以及mPEG-5000 50g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；
b.离心去除Na2CO3、5A分子筛悬浮物，用600mL乙醚沉淀，再用400mL无水苯溶解沉淀，如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；
c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组二联体鞘磷脂酶，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液(40mM，pH 7.4)，于摇床室温反应3～6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-SMASE2；
(3)HDL3-C比色试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的mPEG-SMASE2以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
③配制HDL3校准品：
HDL3校准品的相应成分及相应含量如下：
按照试剂上述HDL3校准品的组分含量，将步骤(1)制得的HDL3-C以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得HDL3校准品。
一种基于上述修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒的使用方法，包括如下具体步骤：
(1)吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
(3)5min后读取吸光值A；
(4)定标方法为2点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、30μg/mL；依据定标值，根据A测算样本中HDL3-C含量。
作为本发明的优选方式之一，所述全自动生化分析仪具体为贝克曼AU680全自动生化分析仪。
检测原理：
本发明提供了一种通过检测HDL3-C中胆固醇的量来间接反应HDL3含量的方法。本发明首先通过表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)与HDL3-C结合成胶束结构屏蔽HDL3-C，试剂R1释放其他脂蛋白胆固醇中的胆固醇酯和游离胆固醇并与之反应消除表面活性剂1保护之外的所有胆固醇；在加入试剂R2后，试剂R2所含的增溶剂(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)可以解除表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)与HDL3-C所形成的胶束，释放HDL3-C；因HDL3-C低密度区与HDL2-C高密度区有部分重合，试剂R2中含有的改造的鞘磷脂酶(mPEG-SMASE2)与上述释放的HDL3-C低密度区及HDL2-C高密度区结合聚沉，且试剂R2与剩余的HDL3-C中的胆固醇反应，测得剩余HDL3-C浓度；经与标准品比照并进行数据转换，最终获得待检样本中所有HDL3浓度。本试剂盒基于比色法，适用于各类全自动生化分析仪分析，便于临床应用。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明的HDL3比色法检测试剂盒由经改造的鞘磷脂酶与表面活性剂、缓冲液、防腐剂、增溶剂、蛋白保护剂等构成，具体特点如下：
(1)本试剂中的表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl etherderivative)和表面活性剂2(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)形成了一对HDL3-C的隔离系统，能够有效的对HDL3-C进行保护性隔离和释放；
(2)本试剂中的经改造的鞘磷脂酶(mPEG-SMASE2)是对表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)和表面活性剂2(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)隔离系统的补充，能进一步提高检测的特异性；
(3)本试剂可用于各类全自动生化分析仪分析，成本低廉，自动化高，能大大节省检测时间；相比其他方法，本发明方法更为快速、简易；并且，相比同类产品，本发明试剂盒的稳定性更佳。
附图说明
图1是实施例6中本发明试剂检测结果与离心法检测结果线性关系曲线图；
图2是实施例6中本发明试剂检测结果转换后与离心法检测结果线性关系曲线图；
图3是实施例6中本发明试剂盒线性范围线性回归图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例的一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为花王公司产品EMULGEN B-66。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15。
实施例2
本实施例的一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-10。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BD-10。
实施例3
本实施例的一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
试剂R2：
此外，所述试剂盒中还附带有HDL3校准品，该校准品包括的成分及相应含量如下：
进一步地，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative具体为花王公司产品EMULGEN A-90。
进一步地，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether具体为日光化学公司产品NIKKOL BO-15V。
实施例4
本实施例的一种上述实施例中HDL3比色法检测试剂盒的制备方法，包括如下具体步骤：
(1)人HDL3-C的制备
①HDL-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 49g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 315g、NaN3 250mg，并用90mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL(来自于健康捐献者)，加HDL-C分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加HDL3分离液2mL，混匀；室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3-C产物；
(2)mPEG化重组二联体鞘磷脂酶的制备
①重组二联体鞘磷脂酶的制备：
a.于GENBANK获取鞘磷脂酶全部CDS，取(GS)6作为柔性linker，并于首尾分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点，即得目标序列-重组二联体鞘磷脂酶的核苷酸序列，具体如SEQ IDNO.1所示；
b.得到目标序列后，送基因公司合成；
c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；
d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；
e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；
②重组二联体鞘磷脂酶的mPEG化：
a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO3 10g、5A分子筛5g以及mPEG-5000 50g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；
b.离心去除Na2CO3、5A分子筛悬浮物，用600mL乙醚沉淀，再用400mL无水苯溶解沉淀，如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；
c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组二联体鞘磷脂酶，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液(40mM，pH 7.4)，于摇床室温反应3～6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-SMASE2；
(3)HDL3-C比色试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的mPEG-SMASE2以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
③配制HDL3校准品：
按照试剂HDL3校准品的组分含量，将步骤(1)制得的HDL3-C以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得HDL3校准品。
另外，关于本发明试剂盒的组成物质，除去本实施例中特意强调“制备方法”的部分，其他物质均为国内外市场领域流通的常规试剂，直接购买即得。
实施例5
本实施例的一种上述实施例中HDL3比色法检测试剂盒的使用方法：
分析方法：终点法；
反应方向：上升反应；
校准方式：AB；
测定波长：600nm/700nm；
测定温度：37℃；
样本：试剂R1：试剂R2＝2：150：50(μL)
测试步骤：吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min；再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；5min后读取吸光值A。
定标方法：2点定标，采用贝克曼AU680全自动生化分析仪(或其他品牌型号)，进行检测，设置校准品浓度分别为：0、30μg/mL。
依据定标值，根据A测算样本中HDL3-C含量。
检测原理：
本发明提供了一种通过检测HDL3-C中胆固醇的量来间接反应HDL3含量的方法。本发明首先通过表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)与HDL3-C结合成胶束结构屏蔽HDL3-C，试剂R1释放其他脂蛋白胆固醇中的胆固醇酯和游离胆固醇并与之反应消除表面活性剂1保护之外的所有胆固醇；在加入试剂R2后，试剂R2所含的增溶剂(Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether)可以解除表面活性剂1(Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative)与HDL3-C所形成的胶束，释放HDL3-C；因HDL3-C低密度区与HDL2-C高密度区有部分重合，试剂R2中含有的改造的鞘磷脂酶(mPEG-SMASE2)与上述释放的HDL3-C低密度区及HDL2-C高密度区结合聚沉，且试剂R2与剩余的HDL3-C中的胆固醇反应，测得剩余HDL3-C浓度；经与标准品比照并进行数据转换，最终获得待检样本中所有HDL3浓度。本试剂盒基于比色法，适用于各类全自动生化分析仪分析，便于临床应用。
实施例6
本实施例用以评价上述实施例中HDL3比色法检测试剂盒：
(1)线性相关性验证：
利用实施例1-3配方配制试剂，与超速离心方法进行对照检测，检测30份临床血清样本，检测结果如表1所示，获得了本发明试剂盒与超速离心方法的相关性曲线(见图1)。通过检测结果显示，两方法的线性相关曲线为y＝3.0156+0.8216X，相关系数R2＝0.89737，说明两者具有相关性。
表1本发明试剂检测结果与离心法检测结果相关性比对值
序号 测试值 对照值 序号 测试值 对照值 序号 测试值 对照值
1 26.7 27.5 11 27.9 28.7 21 29.3 30.1
2 31.5 30.5 12 36.9 35.9 22 31.1 30.1
3 34.2 35.0 13 28.3 29.1 23 32.0 32.8
4 27.3 26.3 14 34.5 33.5 24 35.7 34.7
5 26.5 27.3 15 31.0 31.8 25 30.7 31.5
6 30.5 29.5 16 32.7 31.7 26 36.3 35.3
7 30.7 31.5 17 39.2 40.0 27 34.5 35.3
8 35.6 34.6 18 35.7 34.7 28 30.0 29.0
9 31.0 31.8 19 33.8 34.6 29 30.3 31.1
10 30.2 29.2 20 28.7 27.7 30 38.2 37.2
因预知HDL3-C低密度区与HDL2-C高密度区有部分重合，我们依据标准品对数据进行转换，转换后的结果见表2，获得了本发明试剂盒检测结果转换后与超速离心方法结果的相关性曲线(见图2)。通过检测结果显示，两方法的线性相关曲线为y＝2.3511+0.9619X，相关系数R2＝0.95859，说明两者具有较大的相关性。
表2本发明试剂检测结果转换后与离心法检测结果相关性比对值
(2)线性范围验证：
使用重组HDL3-C纯化品和生理盐水配制成浓度400mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L和0mg/L(生理盐水对照)的测试品，使用本发明试剂盒测定各测试品浓度，以稀释浓度为自变量，以测定结果为因变量求出线性回归方程(见图3)，计算测定结果的相对偏差。检测与计算结果如表3所示，结果显示，测定结果与稀释浓度之间的线性回归方程为方程:y＝-1.0552+0.99117X。相关系数R2＝0.99987，说明线性关系良好，线性范围可达0～400mg/L。
表3本发明试剂盒线性范围验证
(3)重复性验证：
由于该产品无质控血清，取具有溯源性的HDL-C高值血清质控和低值血清质控各一份，使用所述试剂盒对同一份血清样本连续检测10次，计算所述试剂盒的变异系数。检测数据如下表4，检测结果表明所述试剂盒在检测高值和低值样本时的变异系数较小分别为1.15％和4.47％，重复性较好。
表4所述试剂盒精密度(重复性)验证结果
检测值1 检测值2 检测值3 检测值4 检测值5
128.1 130.1 127.4 125.5 125.8
6.7 7.4 7.5 7.0 6.8
检测值6 检测值7 检测值8 检测值9 检测值10
126.0 127.8 126.7 128.2 129.5
6.6 7.2 7.4 6.8 7.5
检测均值 标准差 变异系数
127.5 1.5 1.15％
7.1 0.3 4.47％
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 安徽大千生物工程有限公司
<120> 一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒及其制备使用方法
<130> 2019
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3861
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccatga agaactggag tcagactata ttgctacttg caattctctt cattgctacc 60
acctatgcac attatgacag tcatgctgaa aagatagctc agaatccaga ctatcctcat 120
tatttagaga gattaaaagc tatcccaata tcatgtgctc tctgcactgt tggtgccgat 180
atattaagcg atcttttaca agtacgtagt cttgtcaacg acgattcgaa tcgggaattc 240
aaaaacacat tgaaatacaa tgaaaagaga gaaagagaaa gagaaagaga gagggaaatg 300
atcaacagta ctcaaaaaaa tgcatcaact accatagttg tcaatacaac cattgatttg 360
tgtattgctt tcaagattga attaccagat gtctgtcatg gagtaatgaa tacatttgta 420
ccaattattt gggatgtaat tgttacagac aatatcaatc caatgacatt gtgcgaactt 480
ttcagaatat gtcaaccaaa tagcactgcc actgaacaac ataaccaatt ccacaacaac 540
aacaataaca atatgaacac attttcaaat ttagatctcg tcaagacgtt ggaagagaag 600
cctgtccata cgtacccaga catttctgcc caaaagccca ttcgagaggg caacacaaca 660
ttcaagggca agggttactt tttgcagttg gccgacatcc atttcgacgc ctactatctt 720
gaaggatcca atccaaattg tggcaagcca ctctgttgcc gcgacggcac tggtgacgct 780
ggcttttatg gtcactacca atgcgacatt ccattggtca ctgtcaagac catgtttgag 840
cgtattgtag aactcactca gacactcccc atcgatctca tcctctggac gggcgactcg 900
cccccacacg atgtgtggat gcagaccgag gagaagcaga ccaccgccac acagacactc 960
accgagcttg tccacctctt cttcccagac acgatcgttt tcccagccat tggcaaccac 1020
gagtcgtacc cagccgacca gtttatccta ccagacaagc aatggctttt gaacgacctc 1080
tccacctttt gggcaccatt cctcggtggt gaacaactcg acactgtcca acaacaaggt 1140
tactacactc tgttgattca acaaggtcta cgtatcatct cgctcaacac tcaggacgcc 1200
gatttgatca atttctacaa cctcatgaac gaaagcaaca tgaacaagcc caacaaccaa 1260
accgagtggc tctccaacat gctcgctcaa tcggccagca actctgaaaa ggtcattatc 1320
attggacata tcccatgcac gctcaaggct gctgtcaacg atgtctggtg ctccatctat 1380
caacgtcttg tcgaacagta ctctggcact attgtcggcc agatctacgg tcacactcac 1440
gacgatcaat tggctatcct caccgacatg gagacctaca ccaagccaac tggtgtccaa 1500
ttcattgcac catcactcac cacctaccaa aaccacgagc caggcttccg tatctatgag 1560
tttgactatg acactaacca aatcaccgac tactaccaat accattgtaa tatcaccgag 1620
gccaacctta caggcaacct cactttttct ctcacctacc aagccaagga aatgtatggc 1680
ctctctgaca tgtctccaca atcgtggttc caagttgcca cccaaatgaa gacagactct 1740
accgttttta acaagtacta ctctcacttg tctagttcac caaatccact caaaccatgt 1800
gacgccgatt gtcaatattc tatggcttgt gaaatattta gtgttacctc tcatgctttt 1860
gataattgtg taaacattca aaagaataaa aaaggctcag gctcaggctc aggctcaggc 1920
tcaggctcag gctcaggctc aggctcaggc tcaggctcag gctcaatgaa gaactggagt 1980
cagactatat tgctacttgc aattctcttc attgctacca cctatgcaca ttatgacagt 2040
catgctgaaa agatagctca gaatccagac tatcctcatt atttagagag attaaaagct 2100
atcccaatat catgtgctct ctgcactgtt ggtgccgata tattaagcga tcttttacaa 2160
gtacgtagtc ttgtcaacga cgattcgaat cgggaattca aaaacacatt gaaatacaat 2220
gaaaagagag aaagagaaag agaaagagag agggaaatga tcaacagtac tcaaaaaaat 2280
gcatcaacta ccatagttgt caatacaacc attgatttgt gtattgcttt caagattgaa 2340
ttaccagatg tctgtcatgg agtaatgaat acatttgtac caattatttg ggatgtaatt 2400
gttacagaca atatcaatcc aatgacattg tgcgaacttt tcagaatatg tcaaccaaat 2460
agcactgcca ctgaacaaca taaccaattc cacaacaaca acaataacaa tatgaacaca 2520
ttttcaaatt tagatctcgt caagacgttg gaagagaagc ctgtccatac gtacccagac 2580
atttctgccc aaaagcccat tcgagagggc aacacaacat tcaagggcaa gggttacttt 2640
ttgcagttgg ccgacatcca tttcgacgcc tactatcttg aaggatccaa tccaaattgt 2700
ggcaagccac tctgttgccg cgacggcact ggtgacgctg gcttttatgg tcactaccaa 2760
tgcgacattc cattggtcac tgtcaagacc atgtttgagc gtattgtaga actcactcag 2820
acactcccca tcgatctcat cctctggacg ggcgactcgc ccccacacga tgtgtggatg 2880
cagaccgagg agaagcagac caccgccaca cagacactca ccgagcttgt ccacctcttc 2940
ttcccagaca cgatcgtttt cccagccatt ggcaaccacg agtcgtaccc agccgaccag 3000
tttatcctac cagacaagca atggcttttg aacgacctct ccaccttttg ggcaccattc 3060
ctcggtggtg aacaactcga cactgtccaa caacaaggtt actacactct gttgattcaa 3120
caaggtctac gtatcatctc gctcaacact caggacgccg atttgatcaa tttctacaac 3180
ctcatgaacg aaagcaacat gaacaagccc aacaaccaaa ccgagtggct ctccaacatg 3240
ctcgctcaat cggccagcaa ctctgaaaag gtcattatca ttggacatat cccatgcacg 3300
ctcaaggctg ctgtcaacga tgtctggtgc tccatctatc aacgtcttgt cgaacagtac 3360
tctggcacta ttgtcggcca gatctacggt cacactcacg acgatcaatt ggctatcctc 3420
accgacatgg agacctacac caagccaact ggtgtccaat tcattgcacc atcactcacc 3480
acctaccaaa accacgagcc aggcttccgt atctatgagt ttgactatga cactaaccaa 3540
atcaccgact actaccaata ccattgtaat atcaccgagg ccaaccttac aggcaacctc 3600
actttttctc tcacctacca agccaaggaa atgtatggcc tctctgacat gtctccacaa 3660
tcgtggttcc aagttgccac ccaaatgaag acagactcta ccgtttttaa caagtactac 3720
tctcacttgt ctagttcacc aaatccactc aaaccatgtg acgccgattg tcaatattct 3780
atggcttgtg aaatatttag tgttacctct catgcttttg ataattgtgt aaacattcaa 3840
aagaataaaa aataagaatt c 3861

Claims (10)

1.一种基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
其溶剂为纯化水；
试剂R2：
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，还包括HDL3校准品，包括的成分及相应含量为：
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述Polyoxyethylene styrenated phenyl ether derivative由一种或几种HBL值13.0～14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物构成。
4.根据权利要求3所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值13.0～14.0的聚氧乙烯苯乙烯化苯基醚衍生物具体为花王公司产品EMULGENB-66、EMULGEN A-90或日光化学公司产品NIKKOL BC-10。
5.根据权利要求1所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述Polyoxyethylene polycyclic phenyl ether由一种或几种HBL值15.0～15.6的聚氧乙烯多环苯基醚构成。
6.根据权利要求5所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述HBL值15.0～15.6的聚氧乙烯多环苯基醚具体为日光化学公司产品NIKKOL BC-15、NIKKOL BO-15V或NIKKOL BD-10。
7.根据权利要求1所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述mPEG-SMASE2的获取方法如下：
①重组二联体鞘磷脂酶的制备：
a.于GENBANK获取鞘磷脂酶全部CDS，取(GS)6作为柔性linker，并于首尾分别添加BamHⅠ及EcoR Ⅰ酶切位点，即得目标序列-重组二联体鞘磷脂酶的核苷酸序列，具体如SEQ IDNO.1所示；
b.得到目标序列后，送基因公司合成；
c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；
d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；
e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；
②重组二联体鞘磷脂酶的mPEG化：
a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO3 10g、5A分子筛5g以及mPEG-5000 50g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；
b.离心去除Na2CO3、5A分子筛悬浮物，用600mL乙醚沉淀，再用400mL无水苯溶解沉淀，如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；
c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组二联体鞘磷脂酶，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液，于摇床室温反应3～6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-SMASE2。
8.根据权利要求2所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒，其特征在于，所述HDL3-C的获取方法如下：
①HDL-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 49g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 315g、NaN3 250mg，并用90mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL，加HDL-C分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加HDL3分离液2mL，混匀；室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3-C产物。
9.一种如权利要求1-8任一所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)人HDL3-C的制备
①HDL-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 49g、NaN3 250mg，并用900mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH液调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
②HDL3-C分离液的配制：
称取分子量50000的硫酸葡聚糖9g、MgCl2 315g、NaN3 250mg，并用90mL蒸馏水溶解，然后用1mol/L NaOH调节pH至7.0，最后用蒸馏水加至1000mL，备用；
③分离：
吸取人血清50mL，加HDL-C分离液5mL，混匀；室温静置15min，然后于2000r/min条件下离心20min；取上清液20mL，并加HDL3分离液2mL，混匀；室温静置15min后，再于2000r/min条件下离心20min，此上清即为HDL3-C产物；
(2)mPEG化重组二联体鞘磷脂酶的制备
①重组二联体鞘磷脂酶的制备：
a.于GENBANK获取鞘磷脂酶全部CDS，取(GS)6作为柔性linker，并于首尾分别添加BamHⅠ及EcoR Ⅰ酶切位点，即得目标序列-重组二联体鞘磷脂酶的核苷酸序列，具体如SEQ IDNO.1所示；
b.得到目标序列后，送基因公司合成；
c.双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；
d.涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；
e.离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；
②重组二联体鞘磷脂酶的mPEG化：
a.将氰尿酰氯5.5g、无水Na2CO3 10g、5A分子筛5g以及mPEG-5000 50g溶于400mL的无水苯中，常温下搅拌反应12h；
b.离心去除Na2CO3、5A分子筛悬浮物，用600mL乙醚沉淀，再用400mL无水苯溶解沉淀，如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；
c.取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组二联体鞘磷脂酶，将二者溶解于10mL硼酸盐缓冲液，于摇床室温反应3～6h后，15kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-SMASE2；
(3)HDL3-C比色试剂盒的制备
①配制试剂R1：
按照试剂R1的组分含量，将步骤(2)制得的mPEG-SMASE2以及余下的其他组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
②配制试剂R2：
按照试剂R2的组分含量，将各组分物质于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R2；
③配制HDL3校准品：
HDL3校准品的相应成分及相应含量如下：
其溶剂为纯化水；
按照试剂上述HDL3校准品的组分含量，将步骤(1)制得的HDL3-C以及余下的其他组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得HDL3校准品。
10.一种如权利要求1-8任一所述的基于修饰鞘磷脂酶优化的HDL3比色法检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
(1)吸取2μL样本，加入150μL试剂R1，37℃孵育5min；
(2)再加入50μL试剂R2进行混合，并使其充分反应；
(3)5min后读取吸光值A；
(4)定标方法为2点定标，采用全自动生化分析仪进行检测，并设置校准品浓度分别为：0、30μg/mL；依据定标值，根据A测算样本中HDL3-C含量。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111551512A (zh) * 2020-06-11 2020-08-18 安徽大千生物工程有限公司 一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒及其制备使用方法
CN111926057A (zh) * 2020-08-14 2020-11-13 江西乐成生物医疗有限公司 高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法、测定试剂及制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103080332A (zh) * 2010-07-23 2013-05-01 电化生研株式会社 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法
CN105555963A (zh) * 2013-07-24 2016-05-04 电化生研株式会社 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法和定量试剂
CN108949902A (zh) * 2018-08-31 2018-12-07 山东博科生物产业有限公司 一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103080332A (zh) * 2010-07-23 2013-05-01 电化生研株式会社 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法
CN105555963A (zh) * 2013-07-24 2016-05-04 电化生研株式会社 高密度脂蛋白3中的胆固醇的定量方法和定量试剂
CN108949902A (zh) * 2018-08-31 2018-12-07 山东博科生物产业有限公司 一种血清小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. MATSUYAMA等: "Changes in Enzymatic and Membrane-adsorbing Activities of Sphingomyelinase from Bacillus cereus by modification with a polyethylene Glycol Derivative", 《CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN》 *
M. LU AND O. GURSKY: "Aggregation and fusion of low-density lipoproteins in vivo and in vitro", 《BIOMOL CONCEPTS》 *
Y. ITO等: "Development of a homogeneous assay for measurement of high-density lipoprotein-subclass cholesterol", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111551512A (zh) * 2020-06-11 2020-08-18 安徽大千生物工程有限公司 一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒及其制备使用方法
CN111551512B (zh) * 2020-06-11 2023-07-25 安徽大千生物工程有限公司 一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒及其制备使用方法
CN111926057A (zh) * 2020-08-14 2020-11-13 江西乐成生物医疗有限公司 高密度脂蛋白3胆固醇的定量方法、测定试剂及制备方法

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