CN111398607A - 一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，所述检测试剂包括第一试剂和第二试剂，本发明中，在无机盐离子、稳定剂、缓冲液和过氧化物酶等组合下，本发明的试剂盒开瓶稳定性好，另外试剂抗干扰能力较强，能够有效排除胆红素、血红蛋白、乳糜和英脱利匹特的干扰。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术领域，具体涉及一种小而密低密度脂蛋白胆固醇测定试剂。
背景技术
血脂异常是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)重要的独立危险因素，2016年《中国成人血脂异常防治指南》修订版指出，中国成人血脂异常总体患病率高达40.4％；儿童青少年高胆固醇血症患病率明显升高；提示未来中国人群血脂异常患病及相关疾病的负担将继续加重。早期检测出血脂异常个体，监测其血脂水平的变化，对高脂血症和异常脂蛋白血症的诊断、治疗以及动脉粥样硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovasculardisease,ASCVD)的防控和危险评估均具有重要意义。
血液中脂蛋白主要是由脂质和蛋白质以疏水作用、范德华力和静电引力等非共价键结合而成的一种复合物。根据密度大小不同可以将人体血液中存在的各种脂蛋白分为髙密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白以及乳糜微粒4类。其中，低密度脂蛋白(LDL)具有异质性，由一系列大小、密度和化学组成各异的颗粒组成，一般将LDL亚组份中颗粒较小密度较大的LDL称小而密LDL(small dense Low-Density Lipoprotein，sdLDL)；将颗粒较大、密度较小的LDL称大而轻LDL；介于二者之间的亚组份为中密度LDL。近来研究显示，sdLDL更易于氧化，且清除缓慢、更易进入动脉管壁，促进泡沫细胞的形成，因此，sdLDL被认为是LDL促AS发生、发展的主要亚型。大量病例对照研究和前瞻性研究均发现：体内高sdLDL或sdLDL胆固醇(sdLDL cholesterol,sdLDL－C)水平与ASCVD的发生风险密切相关；sdLDL或sdLDL-C水平作为预测和评估ASCVD危险的指标比LDL胆固醇更为敏感。
使用总胆固醇，总甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白A1、载脂蛋白B等。其中被认为与动脉粥样硬化形成紧密相关的低密度脂蛋白胆固醇被频繁地测定。Austin等将低密度脂蛋白胆固醇根据密度分为两个亚型，颗粒较大、密度接近1.02g/ml的A型，和颗粒较小，密度接近1.06g/ml的B型，即为小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)，很多人尽管低密度脂蛋白胆固醇不高，但也具有动脉粥样硬化病变。也有报道称，在动脉粥样硬化病症中，小而密低密度脂蛋白胆固醇升高。
近年来，小而密低密度脂蛋白和小而密低密度脂蛋白胆固醇浓度的测定方法不断被报道，目前对其浓度进行的方法主要包括梯度密度超速离心法、梯度凝胶电泳法、化学沉淀法、分子色谱分析法、毛细管电泳法、核磁共振光谱法、指标评估法、动态光散射法、均相法等。但是传统方法存在操作较繁琐、分辨率和特异性均不高、时间较长等缺点，其中均相法方法相对简单快捷，但是目前已有的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒开瓶稳定性、抗干扰能力差。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种试剂开瓶稳定性好、抗干扰能力强的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂。
本发明提供一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，该检测试剂包括第一试剂，所述第一试剂包括如下组分：
缓冲液 40～300mmol/L
无机盐离子 1-50mmol/L
稳定剂 10～30g/L
过氧化物酶 100-1000U/L
胆固醇脂酶 500-3000U/L
胆固醇氧化酶 500-2000U/L
Trinder色源物质 0.1-2.5g/L
防腐剂 0.1～2.5g/L
进一步的，该第一试剂包括如下组分：
缓冲液 80～200mmol/L
无机盐离子 10mmol/L
稳定剂 10～20g/L
过氧化物酶 250-1000U/L
胆固醇脂酶 500-2000U/L
胆固醇氧化酶 500-1500U/L
Trinder色源物质 0.1-1.0g/L
防腐剂 0.1～1.5g/L
更进一步的，所述第一试剂包括如下组分：
缓冲液 110mmol/L
无机盐离子 10mmol/L
稳定剂 10g/L
过氧化物酶 600U/L
胆固醇脂酶 800U/L
胆固醇氧化酶 600U/L
Trinder色源物质 0.24g/L
防腐剂 1.0g/L
进一步的，所述无机盐离子选自锰离子、镁离子、亚铁离子、钠离子，钾离子、钙离子、锂离子中的一种或几种；
进一步的，所述无机盐离子选自钠离子、镁离子、亚铁离子中的一种或几种；
进一步的，所述无机盐离子为亚铁离子；
进一步的，所述稳定剂选自蔗糖、BSA、谷氨酸钠、海藻糖、丙三醇、甘露醇中的一种或几种；
进一步的，所述稳定剂选自蔗糖、BSA、谷氨酸钠、海藻糖中的一种或几种；
进一步的，所述稳定剂为蔗糖、BSA和谷氨酸钠的混合物。
进一步的，所述检测试剂还包括第二试剂，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液 40～300mmol/L
过氧化物酶 100-4000U/L
4-氨基安替比林 0.1～5.0g/L
曲拉通 5-50g/L
防腐剂 0.1～2.5g/L
进一步的，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液 50～200mmol/L
过氧化物酶 100-2000U/L
4-氨基安替比林 0.1～2.5/L
曲拉通 5-30g/L
防腐剂 0.1～1.5g/L
进一步的，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液 110mmol/L
过氧化物酶 2000U/L
4-氨基安替比林 0.82g/L
曲拉通 25g/L
防腐剂 1.0g/L
本发明还提供一种包括第一试剂盒第二试剂的小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，所述第一试剂和第二试剂包括如下组分：
第一试剂：
缓冲液 40～300mmol/L
过氧化物酶 100-1000U/L
胆固醇脂酶 500-3000U/L
胆固醇氧化酶 500-2000U/L
Trinder色源物质 0.1-2.5g/L
防腐剂 0.1～2.5g/L
第二试剂：
缓冲液 40～300mmol/L
过氧化物酶 100-1000U/L
4-氨基安替比林 0.1～5.0g/L
曲拉通 5-50g/L
防腐剂 0.1～2.5g/L
进一步的，本发明中的缓冲液选自哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸缓冲液、3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液、N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液中的一种或几种；
进一步的，所述缓冲液选自哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)缓冲液、3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液中的一种或几种；
进一步的，所述缓冲液为哌嗪-N和N-双(2-乙磺酸)缓冲液中的一种或两种；
进一步的，本发明中的防腐剂为叠氮钠；
本发明中小而密低密度脂蛋白胆固醇含量的计算公式为：
样本中小而密低密度脂蛋白胆固醇(sdLDL-C)含量(mg/dL)＝CS×ΔAT/ΔAS(mg/dL)
式中：ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值，ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值，CS校准液中sdLDL-C的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：本发明中，在无机盐离子、稳定剂、缓冲液和过氧化物酶等组合协作下，本发明的试剂盒开瓶稳定性好，另外试剂抗干扰能力较强，能够有效排除胆红素、血红蛋白、乳糜和英脱利匹特的干扰。
根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为试剂8的定标曲线；
图2为试剂9的定标曲线；
图3为试剂10的定标曲线；
图4为试剂11的定标曲线；
图5为试剂12的定标曲线；
图6为对比试剂的定标曲线。
具体实施方式
实施例1第一试剂中无机盐离子的筛选
一、采用的试剂
注：对比试剂的厂家为在售产品某生产厂家
试剂1：
试剂2：
试剂3：
试剂4
试剂5
试剂6
试剂7
二、检测过程
1)检测仪器：全自动生化分析仪。
2)待测样本：空腹采血，新鲜血清，样本不能反复冻融。
3)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
4)检测方法：
三、实验结果与分析
1)干扰验证：不同离子的加入可对试剂的干扰能力造成影响，通过对干扰试剂的检测，筛选适用于本发明的离子种类，实验结果见下表。
试剂1干扰验证数据
试剂2干扰验证数据
试剂3干扰验证数据
试剂4干扰验证数据
试剂5干扰验证数据
试剂6干扰验证数据
试剂7干扰验证数据
比对试剂干扰验证数据
实验结果分析：
与对比试剂的干扰数据相比，加入镁离子、亚铁离子、钠离子的试剂干扰明显优于其它几种离子。再结合与对比试剂的情况，相比之下，亚铁离子最适用与本试剂。
实施例2Trinder色源物质与4-氨基安替比林的比例筛选
一、采用的试剂
注：对比试剂厂家为在售产品某生产厂家
试剂8
试剂9
试剂10
试剂11
试剂12
二、实验过程
1)实验目的：
Trinder色源物质与4-氨基安替比林的比例不同会影响试剂的定标曲线，从而对试剂性能造成影响，通过用同样的校准品和仪器，同时间对含有不同比例的Trinder色源物质与4-氨基安替比林试剂定标，观察不同比例的Trinder色源物质与4-氨基安替比林试剂对定标的影响。
2)具体实验过程
21)检测仪器：全自动生化分析仪。
22)待测样本：试剂配套校准品。
23)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
24)检测方法：
三、实验结果与分析
1、实验结果：见下表与图1-图6
2、实验结果分析：
从不同Trinder色源物质与4-氨基安替比林试剂定标曲线来看，试剂8和试剂9反应曲线一直升高，试剂在规定的反应时间内无法反应完全，试剂10和试剂11反应过程中定标曲线发生下降，只有试剂12的反应曲线与对比试剂一致，因此只有在试剂12中的Trinder色源物质与4-氨基安替比林最适用于本发明的小而密检测。
实施例3第一试剂中稳定剂的筛选
一、试剂
注：对比试剂的厂家为在售产品某生产厂家
试剂13：
试剂14：
| 试剂R1： | 试剂R2： |
| 嗪哌-N 110mmol/L | N-双(2-乙磺酸)110mmol/L |
| 亚铁离子10mmol/L | 过氧化物酶2000U/L |
| BSA 10g/L | 4-氨基安替比林0.82g/L |
| 过氧化物酶600U/L | 曲拉通25g/L |
| 胆固醇脂酶800U/L | 叠氮钠1.0g/L |
| 胆固醇氧化酶600U/L | 其溶剂为纯化水 |
| Trinder色源物质0.24g/L | |
| 叠氮钠1.0g/L | |
| 其溶剂为纯化水 |
试剂15：
二、实验过程
1)检测仪器：全自动生化分析仪。
2)待测样本：空腹采血，新鲜血清，样本不能反复冻融。
3)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
4)检测方法：
三、实验结果与分析
1)实验结果：见表2-表5
表2、试剂13开瓶稳定性验证数据
表3、试剂14开瓶稳定性验证数据
表4、试剂15开瓶稳定性验证数据
表5、对比试剂开瓶稳定性验证数据
2)实验结果分析：
不同的稳定剂加入对试剂稳定性有着明显影响，试剂13和试剂14在稳定性上都优于在售试剂，但是在开瓶到一定期限后试剂开瓶稳定性仍然会有差异，以开瓶两个月为判断标准，试剂15稳定性最好，开瓶时间63天，并且试剂质控准确度仍然符合要求。
实施例4一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂
试剂16
二、实验过程
1)检测仪器：全自动生化分析仪。
2)待测样本：质控品和空腹采血，新鲜血清，并且样本不能反复冻融。
3)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
4)检测方法：
4)准确性测定：
用同一质控品重复测定3次，取平均值，与质控靶值相对偏差小于10％。
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂干扰验证结果见下表
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂开瓶2个月检测结果见下表
三、实验结果与分析
1、抗干扰数据
2、稳定性结果：
实施例5一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂试剂17：
二、实验过程
1)检测仪器：全自动生化分析仪。
2)待测样本：质控品和空腹采血，新鲜血清，并且样本不能反复冻融。
3)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
4)检测方法：
4)准确性测定：
用同一质控品重复测定3次，取平均值，与质控靶值相对偏差小于10％。
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂干扰验证结果见下表
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂开瓶2个月检测结果见下表
三、实验结果
1、抗干扰数据
2、稳定性数据
实施例6一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂试剂18：
二、实验过程
1)检测仪器：全自动生化分析仪。
2)待测样本：质控品和空腹采血，新鲜血清，并且样本不能反复冻融。
3)基本参数：
样本量：3ul R1使用量：150ul R2使用量：50ul
主波长：600nm 副波长：700nm 方法学：END
反应方向：+ 定标模式：Y＝AX+B
R1+样本孵育时间：300sec 加R2后反应时间：300sec
4)检测方法：
4)准确性测定：
用同一质控品重复测定3次，取平均值，与质控靶值相对偏差小于10％。
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂干扰验证结果见下表
对比试剂与本发明所述试剂盒试剂开瓶2个月检测结果见下表
三、实验结果
1、抗干扰数据
2、稳定性数据
Claims (9)
1.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括第一试剂，所述第一试剂包括如下组分：
缓冲液40～300mmol/L
无机盐离子1-50mmol/L
稳定剂10～30g/L
过氧化物酶100-1000U/L
胆固醇脂酶500-3000U/L
胆固醇氧化酶500-2000U/L
Trinder色源物质0.1-2.5g/L
防腐剂0.1～2.5g/L
优选的，所述第一试剂包括如下组分：
缓冲液80～200mmol/L
无机盐离子10mmol/L
稳定剂10～20g/L
过氧化物酶250-1000U/L
胆固醇脂酶500-2000U/L
胆固醇氧化酶500-1500U/L
Trinder色源物质0.1-1.0g/L
防腐剂0.1～1.5g/L
更优选的，所述第一试剂包括如下组分：
缓冲液110mmol/L
无机盐离子10mmol/L
稳定剂10g/L
过氧化物酶600U/L
胆固醇脂酶800U/L
胆固醇氧化酶600U/L
Trinder色源物质0.24g/L
防腐剂1.0g/L。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述无机盐离子选自锰离子、镁离子、亚铁离子、钠离子，钾离子、钙离子、锂离子中的一种或几种，优选的，所述无机盐离子选自钠离子、镁离子和亚铁离子中的一种或几种，更优选的，所述无机盐离子为亚铁离子。
3.如权利要求1-2所述的检测试剂，其特征在于：所述稳定剂选自蔗糖、BSA、谷氨酸钠、海藻糖、丙三醇、甘露醇中的一种或几种，优选的，所述稳定剂选自蔗糖、BSA、谷氨酸钠、海藻糖中的一种或几种，更优选的，所述稳定剂为蔗糖、BSA和谷氨酸钠的混合物。
4.如权利要求1-3任意一项所述的检测试剂，其特征在于：所述检测试剂还包括第二试剂，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液40～300mmol/L
过氧化物酶100-4000U/L
4-氨基安替比林0.1～5.0g/L
曲拉通5-50g/L
防腐剂0.1～2.5g/L
优选的，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液50～200mmol/L
过氧化物酶100-2000U/L
4-氨基安替比林0.1～2.5/L
曲拉通5-30g/L
防腐剂0.1～1.5g/L
更优选的，所述第二试剂包括如下组分：
缓冲液110mmol/L
过氧化物酶2000U/L
4-氨基安替比林0.82g/L
曲拉通25g/L
防腐剂1.0g/L。
5.一种小而密低密度脂蛋白胆固醇检测试剂，其特征在于：所述检测试剂包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂和第二试剂包括如下组分：
第一试剂：
缓冲液40～300mmol/L
锰离子1-50mmol/L
蔗糖10-30g/L
过氧化物酶100-1000U/L
胆固醇脂酶500-3000U/L
胆固醇氧化酶500-2000U/L
Trinder色源物质0.1-2.5g/L
防腐剂0.1～2.5g/L
第二试剂：
缓冲液40～300mmol/L
过氧化物酶100-1000U/L
4-氨基安替比林0.1～5.0g/L
曲拉通5-50g/L
防腐剂0.1～2.5g/L。
6.如权利要求1-5任意一项所述的检测试剂，其特征在于：所述缓冲液选自哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)缓冲液、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸缓冲液、3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液、
N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙烷磺酸缓冲液中的一种或几种。
7.如权利要求6所述的检测试剂，其特征在于：所述缓冲液选自哌嗪-N，N-双(2-乙磺酸)缓冲液、3-(N-玛琳代)丙磺酸缓冲液中的一种或几种。
8.如权利要求7所述的检测试剂，其特征在于：所述缓冲液为哌嗪-N和N-双(2-乙磺酸)缓冲液中的一种或两种。
9.如权利要求1-8任意一项所述的检测试剂，其特征在于：所述防腐剂为叠氮钠。
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