JP4866724B2 - 非特異反応が抑制された免疫測定方法および試薬 - Google Patents

Description

本発明は、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法に関する。

測定対象物の免疫学的定量方法においては、しばしば非特異反応が起こることが確認されている。抗原抗体反応における非特異的反応としては様々な種類が知られているが、特に、ヒト抗マウス抗体（ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ、以下ＨＡＭＡと略記する）により生じる非特異反応が問題となっている。ＨＡＭＡには、ＨＡＭＡタイプＩとＨＡＭＡタイプＩＩの２種類が存在し、ＨＡＭＡタイプＩはマウスタンパク質に感作されたことのない人の血液に生じるものであり、ＨＡＭＡタイプＩＩは動物飼育者などのマウスに接触している人やマウス抗体などのマウスタンパク質の投与を受けた人に生成するものである。一般的に、ＨＡＭＡは免疫学的定量方法にマウス抗体を用いるときに問題となる非特異因子で、ＨＡＭＡにより測定系へ誤差を与え正確な値を測定することができなくなることが知られている。従って、試料中の測定対象物を定量する免疫測定方法で得られる測定対象物の定量値で病態等をモニターする際に誤った判断を与えかねず、正確な定量値を与える測定法の開発が求められている。

免疫学的定量方法におけるＨＡＭＡによる非特異的反応の抑制方法としては、免疫測定に用いる抗体と同一動物種における免疫グロブリンや重合化免疫グロブリン等が有効であることが知られている（特許文献１、特許文献２、非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３参照）。
また、抗原抗体反応における非特異的反応として、抗体の標識に用いる酵素に反応する抗体により生じる非特異反応もあり、測定系に不活性化した該酵素を共存させる非特異反応の抑制方法が報告されている（特許文献３参照）。

インターロイキン−２（以下、ＩＬ−２と記す）は１３３個のアミノ酸から構成されるサイトカインであり、主にＣＤ４^＋やＣＤ８^＋のＴ細胞より産生されるが、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）からも産生される。ＩＬ−２は、主に免疫系への活性化に関与し、様々な生理活性を有している。例えば、ＩＬ−２はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｌｌｅｒ細胞）、マクロファージ、好中球などに対し、細胞周期を進めるプログレッション因子として作用する。

ＩＬ−２の受容体（以下、ＩＬ−２Ｒと記す）はα鎖、β鎖、γ鎖から構成されているが、α鎖の一部が細胞上から遊離した可溶性インターロイキン−２受容体（以下、ｓＩＬ−２Ｒと記す）が血中に存在することが知られている。ｓＩＬ−２Ｒは活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞によって産生されるために、生体の免疫防御機構の活性化、Ｔ細胞系及びＢ細胞系などの活性化に伴い血中のｓＩＬ−２Ｒが上昇することが報告されている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの自己免疫疾患や、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などのウイルス感染症の患者で高値を示し、体内の活性化リンパ球の指標の１つとなることが報告されている。また腫瘍細胞がｓＩＬ−２Ｒを産生し、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）や非ホジキンリンパ腫の進行と血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度の変動が良く相関することが知られている。このように様々な免疫系の疾患や病態との関連が報告され、造血疾患のなかで有望な血液中のマーカーとなってきている。血清中のｓＩＬ−２Ｒ濃度は成人Ｔ細胞白血病においては病態モニタリングの指標など、非ホジキンリンパ腫においては治療効果の判定、寛解後のフォロー、再発の早期発見の指標などとして臨床的に有効活用されている。

これまでに、ｓＩＬ−２Ｒの測定法として、２つの抗ｓＩＬ−２Ｒ抗体を用いる免疫学的測定法が報告されており（特許文献４参照）、またｓＩＬ−２Ｒ測定用試薬として、酵素免疫測定法に対応した試薬、例えば、「セルフリーＩＬ−２Ｒ」（山之内製薬株式会社製）などが開発され、発売されている。
特開昭６１−６５１６２号公報 特開平１−２５４８６９号公報 特開平５−１８８０５５号公報 特開昭６２−７０７６１号公報 クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９９年，第４５巻，９４２−９５６頁 キャンサー・イムノロジカル・イムノセラピィ（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ），１９９１年，第３３巻，８０−８４頁 クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎａｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９０年，第３６巻，１０９３頁

本発明の目的は、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法を提供することにある。

本発明は、下記（１）〜（３５）に関する。
（１）水性媒体中、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量法において、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる行程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法。

（２）第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む（１）記載の免疫学的定量方法。
（３）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である（１）または（２）記載の免疫学的定量方法。

（４）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である（１）または（２）記載の免疫学的定量方法。
（５）第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である（１）〜（４）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
（６）非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。

（７）酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に、ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧを共存させる（１）〜（６）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
（８）非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である（１）〜（５）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。

（９）酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に、不活性化した該標識酵素を共存させる（１）〜（８）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
（１０）酵素がペルオキシダーゼである（１）〜（９）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
（１１）測定対象物が、可溶性インターロイキン−２受容体である（１）〜（１０）のいずれかに記載の免疫学的定量方法。

（１２）測定対象物に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体であって、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を含有することを特徴とする非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬。

（１３）第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を含有する（１２）記載の試薬。
（１４）酵素活性測定用試薬を含有する（１２）または（１３）記載の試薬。
（１５）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である（１２）〜（１４）のいずれかに記載の試薬。

（１６）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である（１２）〜（１４）のいずれかに記載の試薬。
（１７）第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である（１２）〜（１６）のいずれかに記載の試薬。
（１８）非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（１２）〜（１７）のいずれかに記載の試薬。

（１９）ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧを含む（１２）〜（１８）のいずれかに記載の試薬。
（２０）非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である（１２）〜（１７）のいずれかに記載の試薬。
（２１）抗体を標識している酵素を不活性化した酵素を含む（１２）〜（２０）のいずれかに記載の試薬。

（２２）酵素がペルオキシダーゼである（１２）〜（２１）のいずれかに記載の試薬。
（２３）測定対象物が、可溶性インターロイキン−２受容体である（１２）〜（２２）のいずれかに記載の試薬。
（２４）さらに、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質およびタンパク質安定化剤からなる群より選ばれる一つまたは複数の物質を含有する（１２）〜（２３）のいずれかに記載の試薬。

（２５）測定対象物に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量方法において、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法。

（２６）第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む（２５）記載の抑制方法。
（２７）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である（２５）または（２６）記載の抑制方法。

（２８）第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である（２５）または（２６）記載の抑制方法。
（２９）第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である（２５）〜（２８）のいずれかに記載の抑制方法。
（３０）非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（２５）〜（２９）のいずれかに記載の抑制方法。
（３１）酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に、ＩｇＧ重合体／またはＩｇＧを共存させる（２５）〜（３０）のいずれかに記載の抑制方法。

（３２）非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である（２５）〜（２９）のいずれかに記載の抑制方法。
（３３）酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に、不活性化した該標識酵素を共存させる（２５）〜（３２）のいずれかに記載の抑制方法。
（３４）酵素がペルオキシダーゼである（２５）〜（３３）のいずれかに記載の方法。
（３５）測定対象物が、可溶性インターロイキン−２受容体である（２５）〜（３４）のいずれかに記載の抑制方法。

本発明により、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法が提供される。

ＰＯＤ標識化抗ｓＩＬ−２ＲモノクローナルＦ（ａｂ’）_２抗体のゲルろ過カラムクロマトグラム。

１．非特異的反応
本発明における非特異的反応としては、測定対象物の免疫学的測定法において見られる非特異的反応であれば特に制限はないが、ＨＡＭＡに起因する非特異的反応、標識酵素に反応する抗体に起因する非特異的反応などがあげられる。ＨＡＭＡとしては、ＨＡＭＡタイプＩおよびＨＡＭＡタイプＩＩがあげられる。標識酵素に反応する抗体としては、例えばペルオキシダーゼに反応する抗体、アルカリフォスファターゼに反応する抗体等があげられる。本発明における標識酵素に反応する抗体とは、本発明の免疫学的測定法において用いている酵素標識化抗体を標識している該酵素に反応する抗体であり、非特異反応を惹起する。

２．試料
本発明において使用される試料としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液などがあげられるが、全血、血漿、血清などが好ましい。

３．測定対象物
本発明の測定対象物としては、抗原となる物質であればいかなるものでもよく特に制限はないが、少なくとも２個の抗原決定基を有する抗原であるのが好ましい。例えば、ｓＩＬ−２Ｒ、心筋梗塞のマーカーとして知られているミオグロビン、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、トロポニンＴなどがあげられる。

４．抗体
本発明において使用される酵素標識化抗体を形成する第１の抗体としては、測定対象物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、抗体のみならず、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）_２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’などのＦｃ部分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、Ｆ（ａｂ’）_２が特に好ましい。

本発明において使用される固相化抗体を形成する第２の抗体としては、測定対象物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。第２抗体は、第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する抗体であることが好ましい。

本発明において使用する抗体は、測定対象物またはそのエピトープに相当するペプチドを抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。
ｓＩＬ−２Ｒに特異的に結合する抗体としては、例えばハイブリドーマＡＭ９２．３が産生するモノクローナル抗体〔ピアース（ＰＩＥＲＣＥ）社製〕、モノクローナル抗体７Ｇ７／Ｂ６（ピアース社製；特開昭６２−７０７６１公報参照）などがあげられ、それぞれ任意に第１の抗体または第２の抗体として使用できる。

５．酵素標識
本発明において第１の抗体と結合している酵素としては、例えばペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどがあげられ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼが好ましく、ペルオキシダーゼが特に好ましい。ペルオキシダーゼとしては、いかなる由来のペルオキシダーゼも使用できるが、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼが好ましい。アルカリフォスファターゼとしては、例えば牛小腸由来のアルカリフォスファターゼなどがあげられる。

６．第１抗体と酵素の結合
本発明における酵素標識化抗体は、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合しているものであるが、当該結合における結合様式としては、例えば共有結合があげられ、酵素と抗体が直接結合していても、リンカーなどを介して間接的に結合していてもよい。結合体の作製方法としては、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスフィド法などをあげることができる（例えば、石川榮治著「酵素免疫測定法」１９８７年、医学書院発行参照）が、マレイミド法が好ましい。具体的には、例えばイミノチオランなどでスルフヒドリル化した抗体と、スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１カルボン酸（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、ＳＭＣＣ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド〔Ｎ−（６−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ、ＥＭＣＳ〕などでマレイミド化した酵素とを混合して調製することができる。

７．酵素標識化抗体の抗体と酵素の結合数
本発明に使用する酵素標識化抗体は、抗体１分子当たり少数の標識酵素分子が結合している酵素標識化抗体であり、具体的には、第１の抗体と酵素の結合数が、それぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体であり、好ましくは、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体であり、より好ましくは、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体である。

標識化抗体としては、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体が特に好ましく、酵素標識化抗体が混合物であるときは、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
このような酵素標識化抗体は、前述のグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法などで第１の抗体と酵素とを結合させたあと、多数の酵素が結合した第１の抗体、未反応の酵素および抗体を、例えばイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法などの方法やこれらの方法を組み合わせた方法などを用いて除去することにより調製することができる。

８．固相化抗体
本発明における固相化抗体は、測定対象物に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合しているものである。分離手段としては、固相それ自体または固相に結合した物質に特異的に結合する物質等あげられる。当該結合における結合様式としては、固相を用いるときは非共有結合があげられ、固相に結合した物質に特異的に結合する物質を用いるときは共有結合があげられ、抗体と該物質が直接結合していても、リンカーなどを介して間接的に結合していてもよい。固相に結合した物質およびそれに特異的に結合する物質の組み合わせとしてはビオチンとアビジンの組み合わせ等があげられる。

固相としては、第２の抗体を固定化し、測定対象物の免疫学的測定法を可能にする固相であれば特に制限はなく、例えばマイクロタイタープレートなどのポリスチレンプレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物（ビーズ）、ガラス製または合成樹脂製の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜などの各種メンブレン、合成樹脂製の試験管などがあげられる。

９．ＩｇＧ重合体およびＩｇＧ
本発明におけるＩｇＧ重合体としては、ＩｇＧが重合したものであれば特に制限はなく、例えばＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ、ＭＭ３３−ＩｇＧ（２ｂ）／Ｆａｂ（２ａ）Ｐｏｌｙ〔いずれも、ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製〕などがあげられる。本発明におけるＩｇＧとしては、動物のＩｇＧであれば特に制限はなく、例えばマウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ウシ、ウマなどの動物のＩｇＧがあげられるが、マウスＩｇＧが好ましい。動物のＩｇＧは精製したものでもよいし、動物の血清でもよい。

１０．水性媒体
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液などがあげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。

グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤などがあげられる。

緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。

１１．金属イオン
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどがあげられる。

１２．塩類
塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウムなどがあげられる。
１３．糖類
糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトールなどがあげられる。

１４．界面活性剤
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤などがあげられ、非イオン性界面活性剤が好ましい。非イオン性界面活性剤としては、例えばツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）などがあげられる。

１５．防腐剤
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、バイオエース、プロクリン３００、プロキセル（Ｐｒｏｘｅｌ）ＧＸＬなどがあげられる。

１６．タンパク質
タンパク質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース^ＴＭ（大日本製薬社製）などがあげられる。

１７．タンパク質安定化剤
タンパク質安定化剤としては、例えばパーオキシダーゼ安定化緩衝液〔Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、ダコサイトメーション（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）社製〕などがあげられる。

１８．不活性化した酵素
本発明における不活性化した酵素としては、本発明の測定対象物の免疫学的定量方法に用いる酵素標識化抗体の標識に用いている酵素と同じ酵素、すなわち同じ生物由来で同じ酵素活性の酵素を不活性化したものであればよい。例えば、免疫学的定量方法においてＰＯＤ標識化抗体を用いている場合は、該ＰＯＤを不活性化したものを用い、アルカリフォスファターゼ標識化抗体を用いている場合は、該アルカリフォスファターゼを不活性化したものを用いる。不活性化した酵素は、担体や抗体に結合したものでもよいが、この場合の抗体は測定対象物や抗体と反応しないものである必要がある。不活性化とは、非特異反応の原因となる標識酵素に反応する抗体との反応性は保ちながら、本発明の免疫学的定量方法に関与する酵素活性を完全または実質的に欠失させることをいい、加熱処理、酸またはアルカリによる変性処理、プロテアーゼによる酵素消化、凍結融解等の処理、これらを組み合わせた処理により行うことができる。例えばＰＯＤでは１００〜１２５℃で１０〜６０分間処理することにより不活性化ＰＯＤを得ることができる。不活性したＰＯＤとしては、Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙ−ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）があげられる。不活性化したアルカリフォスファターゼとしては、Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ−ＡＬＰ（オリエンタル酵母社製）などがあげられる。

１９．測定対象物の免疫学的定量方法
本発明の測定対象物の免疫学的定量方法としては、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含む方法であれば特に制限はないが、さらに第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している固相化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む方法が好ましい。

酵素標識化抗体としては、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体が好ましく、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体がより好ましい。

酵素標識化抗体としては、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体が特に好ましく、酵素標識化抗体が混合物であるときは、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
具体的な定量方法としては、例えばサンドイッチ法、競合法などがあげられるが、サンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法としては、例えば１ステップ法、ディレイ１ステップ法、２ステップ法などがあげられる。

より具体的な測定対象物の免疫学的定量方法の例としては、例えば以下の工程を含有する定量方法があげられる。
（１）固相化抗体と試料中の測定対象物を反応させ、免疫複合体を形成させる工程（１次反応）、
（２）酵素標識化抗抗体と試料中の測定対象物を反応させ、免疫複合体を形成させる工程（２次反応）、
（３）免疫複合体を形成しない酵素標識化抗体を固相と分離する工程、
（４）固相に生成した免疫複合体中の酵素標識の酵素活性を測定する工程、
（５）予め既知濃度の測定対象物を用いて作成した検量線より、工程（４）で測定した酵素活性と比較することにより測定対象物を定量する工程。

上記の（１）と（２）の工程との間に、必要に応じて１次反応後の固相を洗浄する工程を追加してもよい。また、（１）の工程と（２）の工程は同時行うこともできる。
１次反応は水性媒体中で行われることが好ましい。１次反応の反応温度としては、例えば０〜５０℃であり、４℃〜４０℃が好ましい。１次反応の反応時間としては、例えば５分間〜２０時間である。１次反応後の固相の洗浄の際に使用する洗浄液としては、例えばリン酸緩衝化生理食塩水（０．１５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、以下、ＰＢＳと記す）や界面活性剤を含有するＰＢＳなどがあげられる。界面活性剤としては、例えばツイーン２０などの非イオン性界面活性剤などがあげられる。

２次反応は水性媒体中で行われることが好ましい。２次反応において使用され、酵素標識化抗を形成する抗体（第１の抗体）における抗原決定基は、１次反応において使用される抗体（第２の抗体）における抗原決定基と異なっていることが好ましい。２次反応の反応温度としては、例えば０〜５０℃であり、４℃〜４０℃が好ましい。２次反応の反応時間としては、例えば５分間〜２０時間である。１次反応後の固相の洗浄の際に使用する洗浄液としては、例えば前記の洗浄液などがあげられる。

２次反応により固相上に生成した免疫複合体中の酵素標識の活性を測定する方法としては、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、免疫複合体中の酵素活性を測定することができる。酵素の基質と当該酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法などにより免疫複合体中のペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体などがあげられる。

ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）などがあげられる。

酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンなどがあげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジ（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）などがあげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）などがあげられる。

過酸化水素の測定において、過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、生成した蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリンなどがあげられる。

発光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、生成した発光の強度を測定する方法などがあげられる。当該発光物質としては、例えばルミノールなどがあげられる。
酵素がアルカリ性ホスファターゼである場合には、例えば発光法などにより免疫複合体中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリ性ホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリ性ホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。アルカリ性ホスファターゼの基質としては、例えば３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ（３．３．１．１^３，７）デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−Ｓｔａｒ^ＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ（３．３．１．１^３，７）デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤ^ＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（Ｌｕｍｉｇｅｎ^ＴＭＡＰＳ−５）などがあげられる。

酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法などにより免疫複合体中のルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリンなどがあげられる。

酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）などにより免疫複合体中のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−ラクトシド、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ−）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ）などがあげられる。

酵素がグルコースオキシダーゼである場合には、グルコースオキシダーゼにその基質であるグルコースを作用させ、生成した過酸化水素を測定することにより、免疫複合体中のグルコースオキシダーゼ活性を測定することができる。過酸化水素の測定は、例えば前述のペルオキシダーゼ活性の測定法により行うことができる。
本発明の免疫学的定量方法においては、前述の緩衝剤、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤などを反応に共存させることができる。

２０．定量試薬
本発明の測定対象物を定量する免疫学的測定方法に用いる試薬は、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体、必要に応じて、第１の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している固相化抗体および／または酵素活性測定用試薬をさらに含有する。

酵素標識化抗体としては、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体が好ましく、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体がより好ましい。

酵素標識化抗体としては、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体が特に好ましく、酵素標識化抗体が混合物であるときは、第１の抗体と酵素の結合数が１：１または１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。

本発明の測定用試薬の具体的態様を以下に記す。
・試薬１
固相化抗体、酵素標識化抗体および、標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬２
固相化抗体、酵素標識化抗体、ＩｇＧ重合体および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬３
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウスＩｇＧおよび標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬４
固相化抗体、酵素標識化抗体、ＩｇＧ重合体、マウスＩｇＧおよび標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。

・試薬５
固相化抗体、酵素標識化抗体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬６
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウスＩｇＧ、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬７
固相化抗体、酵素標識化抗体、ＩｇＧ重合体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
・試薬８
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウスＩｇＧ、ＩｇＧ重合体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。

・試薬９
固相化抗体、酵素標識化抗体、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１０
固相化抗体、酵素標識化抗体、ＩｇＧ重合体、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１１
固相化抗体、酵素標識化抗体抗、マウスＩｇＧ、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１２
固相化抗体、酵素標識化抗体抗、ＩｇＧ重合体、マウスＩｇＧ、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。

・試薬１３
固相化抗体、酵素標識化抗体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１４
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウスＩｇＧ、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１５
固相化抗体、酵素標識化抗体、ＩｇＧ重合体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
・試薬１６
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウスＩｇＧ、ＩｇＧ重合体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。

本発明の測定用試薬における標識した酵素の活性測定用試薬としては、例えば当該酵素の基質を含有する試薬があげられる。当該酵素活性測定用試薬における酵素としては、例えば前述の酵素があげられる。当該基質としては、例えば前述の基質があげられる。
本発明の測定用試薬における測定対象物標準品としては、例えば既知濃度に調整された測定対象物の水溶液があげられる。

本発明の測定用試薬は、キットの形態で保存、運搬されてもよく、また、必要に応じて、前述の緩衝剤、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤などを含有してもよい。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬、酵素、血清および器具を使用した。
ハイブリドーマＡＭ９２．３：ピアース社製
ハイブリドーマ７Ｇ７／Ｂ６：ピアース社製
α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ）：インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製
９６穴マイクロタイタープレート：ナルジェ・ヌンク・インターナショナル（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社製
ＢＳＡ：インタージェン（ＩｎｔｅｒＧｅｎ）社製
サッカロース：関東化学社製
ツイーン２０：関東化学社製
ゲンタマイシン：和光純薬工業社製
塩化ナトリウム：和光純薬工業社製
バイオエース：クミアイ化学工業社製
オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）：シグマーアルドリッチ社製
尿素過酸化水素塩：シグマーアルドリッチ社製
プロクリン：シグマーアルドリッチ社製
ＰＯＤ：東洋紡績社製、ロシュ・ダイアグノスティックス社製
硫酸：関東化学社製
ペプシン：ロシュ・ダイアグノスティックス社製
イミノチオラン：ピアース社製
ＥＭＣＳ：ピアース社製
ＦＢＳ：ハイクローン（ＨｙＣｌｏｎｅ）社製
ＮＰ−４０：カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社製
マウスＩｇＧ：スカンティボデーズ・ラボラトリー（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社製
プロキセルＧＸＬ：アビシア（Ａｖｅｃｉａ）社製
ＰＯＤ安定化緩衝液：ダコサイトメーション社製
ＭＥＳ：同仁化学研究所社製
ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製
ＭＡＫ３３−ＩｇＧ（２ｂ）／Ｆａｂ（２ａ）Ｐｏｌｙ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製
正常人血清：アリエス社製
ＨＡＭＡ血清タイプＩ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製
ＨＡＭＡ血清タイプＩＩ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製
Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙ−ＰＯＤ：ロシュ・ダイアグノスティックス社製

参考例１ 抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体の調製と精製
抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＡＭ９２．３およびハイブリドーマ７Ｇ７／Ｂ６をそれぞれプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水を回収した。腹水からモノクローナル抗体を、常法に従いプロテインＡカラムｒプロテインＡセファロース・ファスト・フロー（ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ、アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いて精製した。ハイブリドーマＡＭ９２．３より得られたモノクローナル抗体をＫＴＭ−３０２抗体、ハイブリドーマ７Ｇ７／Ｂ６より得られたモノクローナル抗体をＫＴＭ−３０３抗体とした。

参考例２ ｓＩＬ−２Ｒの調製
凍結保存された、ｓＩＬ−２Ｒを分泌発現することが知られているリンフォーマ細胞株Ｕ９３７（大日本製薬株式会社製）を３７℃の水浴で素早く解凍し、１５ｍＬ滅菌チューブに移し１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭを１０ｍＬ添加し、穏やかに懸濁した。これを室温で５分間遠心分離（１２００ｒｐｍ）した後、上清を吸引除去した。残渣に同培地を１０ｍＬ添加し懸濁させた細胞懸濁液を２５ｃｍ^２Ｔフラスコに全量移し、炭酸ガス培養装置（５％ＣＯ_２、３７℃）で２〜３日間培養した。その後、１５０ｃｍ^２Ｔフラスコ、２２５ｃｍ^２Ｔフラスコへと順次、拡大培養を行った。２２５ｃｍ^２Ｔフラスコ内で細胞が１００％コンフルエントになったことを確認した後、培養上清を滅菌された容器に回収し、４℃で１０分間遠心分離（１２００ｒｐｍ）した。遠心分離により得られた上清を滅菌された容器に移し、１５分間穏やかに撹拌した後、０．２μｍフィルターでろ過処理をしたものをｓＩＬ−２Ｒの標準物質とした。

なお、文献〔Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，３１７２−３１７７（１９８５）〕に基づき、１０％ＩＬ−２で４日間刺激した正常ヒトＩＬ−２依存性Ｔ細胞の無細胞培養上清（無希釈）中に含まれるｓＩＬ−２Ｒの量を１０００Ｕ／ｍＬとして、標準物質の値付けを行った。

参考例３ 抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体を固定化した固相の調製
ＫＴＭ−３０２抗体を終濃度４μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、固相用の９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに１００μＬずつ添加した。室温で１晩静置後、ブロッキング液〔１％ＢＳＡ、５％サッカロース、０．０５％ツイーン２０、０．０１％ゲンタマイシン硫酸塩を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．２〕で洗浄し、ブロッキング液を２００μＬ加え室温で１晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、真空乾燥機で３日間乾燥し、抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体固定化固相（プレート）を調製した。

（１）ＰＯＤ標識化抗ｓＩＬ−２ＲモノクローナルＦ（ａｂ’）_２抗体の作製
参考例１で調製したＫＴＭ−３０３抗体を０．０１％ペプシンで消化した後、Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製；φ２１．５ｍｍ×６０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣシステム（日立製作所社製）でＦ（ａｂ’）_２を分離精製した。得られたＦ（ａｂ’）_２４ｍｇを１００ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した。
該抗ｓＩＬ−２ＲモノクローナルＦ（ａｂ’）_２抗体とＰＯＤ（東洋紡績社製）とを以下のようにマレイミド法によって結合させた。

すなわち、該Ｆ（ａｂ’）_２をイミノチオランを用いてスルフヒドリル化し、セファデックスＧ−２５カラム（アマシャム・バイオサイエンス社製）で未反応のイミノチオランを除去した。ＰＯＤは、マレイミド化試薬ＥＭＣＳを用いてマレイミド化し、セファデックスＧ−２５カラムで未反応のＥＭＣＳを除去した。上述のスルフヒドリル化した該Ｆ（ａｂ’）_２モノクローナル抗体とマレイミド化したＰＯＤとを混合し、３０℃で３０分間反応させ、ＰＯＤ標識化抗ｓＩＬ−２ＲモノクローナルＦ（ａｂ’）_２抗体を作製した。

（２）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによるＰＯＤ標識化抗ｓＩＬ−２ＲモノクローナルＦ（ａｂ’）_２抗体の分離
Ｆ（ａｂ’）_２抗体の分子量は約９２ｋＤａ、ＰＯＤの分子量は約４４ｋＤａである。従って、該抗体とＰＯＤの結合数が１：１である酵素標識化抗体の分子量は約１３６ｋＤａ、１：２のものは約１８０ｋＤａ、１：３のものは約２２４ｋＤａ、１：４のものは約２６８ｋＤａ、１：５のものは約３１２ｋＤａ、２：１のものは約２２８ｋＤａ、２：２のものは約２７２ｋＤａ、２：３のものは約３１６ｋＤａ、３：１のものは約３２０ｋＤａと計算される。

上記（１）に記載の方法で調製した標識化抗体を、Ｇ３０００ＳＷカラム（東ソー社製；φ２１．５ｍｍ×６０ｃｍ）を用いたＨＰＬＣシステム（日立製作所社製）で分画した。０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を移動相として流速３ｍＬ／分、室温でＨＰＬＣを行った。フラクション回収は３ｍＬ／フラクションで行った。なお分子量マーカーは高分子量ゲルろ過較正用キット（ＨＭＷ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）および低分子量ゲルろ過較正用キット（ＬＭＷ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、アマシャム・バイオサイエンス社製）を使用した。

各フラクションの２８０ｎｍでの吸光度を測定した結果を図１に示す。図１に示すように１）フラクション３３、２）フラクション４０、３）フラクション４３、４）フラクション４８、５）フラクション５２に吸光度のピークが確認された。
分子量マーカーとの比較により推定された上記の吸光度のピークを示した各フラクションの分子量は、それぞれ１）２５０ｋＤａ以上、２）約１７０ｋＤａ、３）約１４０ｋＤａ、４）約１００ｋＤａ、５）約４０ｋＤａであった。従って、１）フラクション３３中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤが重合化した標識化抗体、２）フラクション４０中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２１分子にＰＯＤ２分子が結合した標識抗体、３）フラクション４３中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２１分子にＰＯＤ１分子が結合した標識抗体、４）フラクション４８には、未反応のＦ（ａｂ’）_２が、５）フラクション５２には、未反応のＰＯＤが含有されることが推測された。

（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる各フラクション中の酵素標識化抗体の同定
上記（２）で得られたフラクション３２〜５２の各フラクションについて、それぞれのフラクション由来の蛋白量が２〜３μｇ／レーンになるように電気泳動用サンプルを調製した。このサンプルにＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー［８％ＳＤＳ（和光純薬工業社製）、２４％ ２−メルカプトエタノール（ナカライテスク社製）、および４０％グリセロール（関東化学社製）を含有する１ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６．８］を１／４量添加し、９５℃で５分間加熱した。熱処理したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル〔パジェル ＳＰＧ−５２０Ｌ（アトー社製）〕に２０μＬ／レーンでアプライし、ゲル１枚当たり２０ｍＡで電気泳動を行い、常法に従いバンドを検出した。なお、分子量マーカーはプレステインド・ブロード・レンジ〔Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｂｒｏａｄ Ｒａｎｇｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、２５０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ、３７ｋＤａ、２５ｋＤａ、１６ｋＤａ、１０ｋＤａ）を使用した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥで得られたバンドの位置と分子量マーカーから、フラクション３２〜３５中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤの結合数がそれぞれ１：５、２：３、３：１などの高重合体である酵素標識化抗体の混合物（バンドはスメア状に観察された）、フラクション３６中の酵素標識化抗体はＦ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数がそれぞれ１：４および２：２である酵素標識化抗体、フラクション３７中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数がそれぞれ１：４、１：３、２：１および２：２である酵素標識化抗体の混合物であると同定した。

同様に、フラクション３８中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数がそれぞれ１：３および２：１である酵素標識化抗体の混合物、フラクション３９中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数がそれぞれ１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体の混合物、フラクション４０〜４１中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数が１：２である酵素標識化抗体、フラクション４２中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数がそれぞれ１：２および１：１である酵素標識化抗体の混合物、フラクション４３〜４６中の酵素標識化抗体は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数が１：１の酵素標識化抗体であると同定した。

また、フラクション４７中のタンパク質は、Ｆ（ａｂ’）_２とＰＯＤとの結合数が１：１の酵素標識化抗体と未反応Ｆ（ａｂ’）_２の混合物、フラクション４８〜５１中のタンパク質は、未反応Ｆ（ａｂ’）_２、フラクション５２中のタンパク質は未反応のＰＯＤであると同定した。

（４）各フラクション中の酵素標識化抗体を用いるｓＩＬ−２Ｒの定量用検量線の作成
参考例３で調製した固相化プレートに、０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、１６００Ｕ／ｍＬ、３２００Ｕ／ｍＬ、６４００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒを含む標準物質溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロースおよび０．０１％バイオエースを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）を各ウェルに５０μＬずつ添加した。酵素標識化抗体希釈液［１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸緩衝液、ｐＨ６．０］を用いて上記（２）の各フラクション中の標識化抗体を希釈して調製した標識化抗体溶液（２４〜１４０ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、水平回転振とう器を用い室温で９０分間振とうした（１４０〜１６０ｒｐｍ）。洗浄液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツイーン２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ６．８）で各ウェルを洗浄後、ＯＰＤ溶液〔２ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ、０．７５ｇ／Ｌ尿素過酸化水素塩、０．０１％プロクリン３００を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ４．４〕を各ウェル１００μＬずつ添加し、室温で３０分間、静置反応させた。反応停止液として１ｍｏｌ／Ｌ硫酸を５０μＬ添加し、反応液の吸光度を主波長４９０ｎｍ、副波長６６０ｎｍで測定した。抗原濃度と吸光度から各フラクションの標識化抗体別に検量線を作成した。

（５）ＰＯＤ標識抗ｓＩＬ−２Ｒモノクローナル抗体を用いた試料中のｓＩＬ−２Ｒの測定
試料として、ＨＡＭＡ血清タイプＩ（Ｌｏｔ．９２０６９７２１）、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩ（Ｌｏｔ．１４４８２６８４）および正常人血清（Ｌｏｔ．１０１００１−２）５０μＬを用い、各血清試料中のｓＩＬ−２Ｒを、上記（２）の各フラクションの標識化抗体を用いて上記（４）記載の方法で測定した。ｓＩＬ−２Ｒ測定値（Ｕ／ｍＬ）を第１表に示す。

抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：５、２：３、３：１などを含む高重合体である酵素標識化抗体であるフラクション３２〜３５ではＨＡＭＡ血清タイプＩにおけるｓＩＬ−２Ｒの測定値が１０００Ｕ／ｍＬを越えており、特に高重合化していると考えられるフラクション３２は約１６０００Ｕ／ｍＬと高値であった。また、抗体と酵素の結合数が１：４または２：２と同定されたフラクション３６もかなりの高値を示した。

しかし、抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：３、２：１、１：２および１：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを含有すると同定されたフラクション３８から４６中の酵素標識化抗体では、ほぼ５００Ｕ／ｍＬ以下とＨＡＭＡ血清タイプＩの非特異反応が抑制されることが示された。
特に、Ｆ（ａｂ’）_２１分子にＰＯＤ２分子が結合した酵素標識化抗体を含有するフラクション４０からＦ（ａｂ’）_２１分子にＰＯＤ１分子が結合した酵素標識化抗体を含有するフラクション４６付近で約３００Ｕ／ｍＬで平衡状態となった。

これらの結果より、抗体１分子当たり少数の標識酵素分子が結合している酵素標識化抗体、好ましくは、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２、１：３および２：１である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体、より好ましくは、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２および１：３である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体、特に好ましくは、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１および１：２である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を用いることによりＨＡＭＡ血清タイプＩに強く認められる非特異反応が効果的に抑制されることが示される。

ＨＡＭＡ非特異反応におけるマウスＩｇＧの効果
ＨＡＭＡによる非特異的反応の抑制に及ぼすマウスＩｇＧの添加効果を検討した。実施例１で調製したフラクション４０〜４６中の酵素標識化抗体を酵素標識抗体希釈液〔１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、マウスＩｇＧ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液、０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を含有する７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．５）〕で希釈し、マウスＩｇＧ濃度をそれぞれ０．２０、４０、６０、８０、１００、２００μｇ／ｍＬとなるように調製した。

ＨＡＭＡ血清タイプＩ（Ｌｏｔ．９２０６９７２１）、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩ（Ｌｏｔ．１４４８２６８４）および正常人血清（Ｌｏｔ．１０１００１−２）各５０μＬを用い、各血清中のｓＩＬ−２Ｒ活性を、実施例１（５）と同様な方法で測定した。
結果を第２表に示す。

マウスＩｇＧが添加されていない時のＨＡＭＡ血清タイプＩＩの測定値は９０００Ｕ／ｍＬ以上でＨＡＭＡによる非特異反応が生じているが、マウスＩｇＧを２０μｇ／ｍＬ添加することでＨＡＭＡによる非特異反応が抑制され、４３７Ｕ／ｍＬまで低下した。しかしながら、さらにマウスＩｇＧを添加することでＨＡＭＡ血清の測定値が低下し、８０μｇ／ｍＬ以上の添加でｓＩＬ−２Ｒ値は平衡に達した。ＨＡＭＡ血清タイプＩにおいても、８０μｇ／ｍＬで測定値が平衡に達したが、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩの時のような大きな変化は見られなかった。また、正常人血清の測定値はマウスＩｇＧ濃度に依存せず一定であることから、マウスＩｇＧの添加は、２００μｇ／ｍＬまで測定系に影響を及ぼさないことが確認された。これらの結果から、マウスＩｇＧを８０μｇ／ｍＬ以上添加することでＨＡＭＡ血清タイプＩＩによる非特異反応を十分に抑制できることが判明した。ＨＡＭＡ血清タイプＩにおいても抑制効果は確認された。

ＨＡＭＡ非特異反応における高重合化マウスＩｇＧの効果および高重合化マウスＩｇＧの至適濃度の検討
ＨＡＭＡによる非特異的反応の抑制に及ぼす高重合化マウスＩｇＧの添加を検討した。実施例１で調製したフラクション４０〜４６中の酵素標識化抗体を酵素標識抗体希釈液〔１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、高重合化マウスＩｇＧ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を含有する７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５〕で希釈した。重合化マウスＩｇＧとしてＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙを用いた場合は、該濃度がそれぞれ０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００μｇ／ｍＬとなるように酵素標識化抗体溶液を調製した。重合化マウスＩｇＧとしてＭＡＫ３３−ＩｇＧ（２ｂ）／Ｆａｂ（２ａ）Ｐｏｌｙを用いた場合には、該濃度がそれぞれ０、５、５０、１００μｇ／ｍＬの濃度となるように酵素標識化抗体を調製した。

ＨＡＭＡ血清タイプＩ（Ｌｏｔ．９０６４３６２９）、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩ（Ｌｏｔ．９２０６９８３１）および正常人血清（Ｌｏｔ．１０１００１−２）各５０μＬを用い、各血清中のｓＩＬ−２Ｒを、実施例１（５）と同様な方法で測定した。
ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙの添加効果を第３表に示す。

その結果、第３表に示すように、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ未添加の状態でのＨＡＭＡ血清タイプＩ中のｓＩＬ ２Ｒの測定値は４３５Ｕ／ｍＬであるが、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙの添加濃度依存的に測定値が低下し、添加濃度１２５μｇ／ｍＬ以上でｓＩＬ−２Ｒの測定値がほぼ一定となった。
また、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙを３００μｇ／ｍＬまで添加しても正常人血清の測定値が変動しておらず、３００μｇ／ｍＬまでのＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ添加は測定系に影響を及ぼさないことが確認された。

これらの結果より、酵素標識化抗体溶液にＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙを１２５μｇ／ｍＬ以上添加することでＨＡＭＡ血清タイプＩによる非特異反応を十分に抑制できることが判明した。
また、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ（２ｂ）／Ｆａｂ（２ａ）Ｐｏｌｙの添加効果を第４表に示す。

第４表に示されているように、ＭＡＫ３３−ＩｇＧ（２ｂ）／Ｆａｂ（２ａ）ＰｏｌｙをＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙの代わりに用いた場合でも、同様に、ＨＡＭＡ血清タイプＩ中のｓＩＬ−２Ｒの測定値が低下した。
このことから、ＩｇＧ１だけでなく、その他のサブタイプのＩｇＧ重合体を添加することでもＨＡＭＡ血清タイプＩによる非特異反応を抑制できることが判明した。

ＨＡＭＡ血清検体中のｓＩＬ−２Ｒの測定（１）
実施例１で調製したフラクション４０〜４６の酵素標識化抗体を標識化抗体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、２００μｇ／ｍＬ ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤを含有する７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５）により希釈して調製した酵素標識化抗体溶液を用いて、実施例１（５）の方法と同様により、ＨＡＭＡ血清タイプＩ（Ｌｏｔ．９０６４３６３７）およびＨＡＭＡ血清タイプＩＩ（Ｌｏｔ．９２０６９８４０）中のｓＩＬ−２Ｒを測定した。以下、上記で調製した酵素標識化抗体溶液、および実施例１（４）に記載の方法で用いる酵素標識化抗体溶液以外の試薬（参考例３で調製した固相化プレート、実施例１（４）の標準物質溶液、洗浄液、ＯＰＤ溶液および反応停止液）をまとめて、「実施例４の試薬」とよぶ。以下に実施例４の試薬の組成を記載する。

実施例４の試薬
抗ｓＩＬ−２Ｒ抗体固定化プレート：４μｇ／ｍＬ ＫＴＭ−３０２抗体を１００μＬ／ウェルで固相化した８ウェル×１２ストリップの９６ウェルマイクロタイタープレート
標準物質溶液：０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、１６００Ｕ／ｍＬ、３２００Ｕ／ｍＬ、６４００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒをそれぞれ含む標準物質溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロースおよび０．０１％バイオエースを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）
酵素標識化抗体溶液：所定量（２４〜１４０ｎｇ／ｍＬ）の実施例１のフラクション４０〜４６のＰＯＤ標識化抗体を含む標識化抗体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、２００μｇ／ｍＬ ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤを含有する７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５）
洗浄液：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツイーン２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ６．８
ＯＰＤ溶液：２ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ、０．７５ｇ／Ｌ尿素過酸化水素塩、０．０１％プロクリン３００を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ４．４
反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ硫酸
また、別にイムライズＩＬ−２Ｒ（ＤＰＣ社製）を用いた各血清中のｓＩＬ−２Ｒの測定も行った。結果を表５表に示す。

その結果、イムライズＩＬ−２Ｒのキットを用いた測定よりも、ＨＡＭＡ血清中のｓＩＬ−２Ｒが低く、ＨＡＭＡの非特異反応を十分に抑制できていることが示唆された。

ＨＡＭＡを含む検体のｓＩＬ−２Ｒの測定（２）
正常人血清にＨＡＭＡ血清を量を変えて添加した検体のｓＩＬ−２Ｒを測定し、ＨＡＭＡの濃度が測定値に及ぼす影響を調べた。
まず、検体の調製に用いるＨＡＭＡ血清タイプＩ（Ｌｏｔ．９０６４３６５６）、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩ（Ｌｏｔ．９２０６９８５８）および正常人血清（Ｆ４１４８９Ｂ）を試料とし、各試料のｓＩＬ−２Ｒを実施例４の試薬を用いて測定し、またＨＡＭＡをＨＡＭＡ測定用サンドイッチＥＬＩＳＡキットであるイムストリップＨＡＭＡフラグメント（ＩｍｍｕＳＴＲＩＰ ＨＡＭＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ）〔イムノメディクス（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ）社製〕を用いて測定した。それぞれの測定結果、および検体の調製には５倍濃縮したＨＡＭＡ血清（以下、５×ＨＡＭＡ血清とよぶ）を用いるので、５×ＨＡＭＡ血清のｓＩＬ−２ＲおよびＨＡＭＡの濃度の理論値（理論値＝測定値×５）を第６表に示した。

５×ＨＡＭＡ血清（タイプＩまたはタイプＩＩ）と正常人血清とを１：１、１：２および１：４でそれぞれ混合したものを試料として、各試料のｓＩＬ−２Ｒを実施例４の試薬およびイムライズＩＬ−２Ｒを用いて測定した。一方、上記で求めた５×ＨＡＭＡ血清および正常人血清のｓＩＬ−２Ｒ濃度と試料の血清の混合比とから計算される、各試料のｓＩＬ−２Ｒの理論値を求め、さらに各試料のｓＩＬ−２Ｒの理論値に対する測定値の比から、測定値への影響率（％）を求めた。各試料のＨＡＭＡの濃度もｓＩＬ−２Ｒの理論値と同様にして計算により求めた。
５×ＨＡＭＡ血清と正常人血清の混合比が１：ａの場合のｓＩＬ−２Ｒの理論値
＝（５×ＨＡＭＡ血清のｓＩＬ−２Ｒ濃度（理論値）＋正常人血清のｓＩＬ−２Ｒ濃度×ａ）／（１＋ａ）影響率（％）＝〔（ｓＩＬ−２Ｒ濃度の測定値／ｓＩＬ−２Ｒ濃度の理論値）×１００〕−１００
第７表に実施例４の試薬を用いた場合、第８表にイムライズＩＬ−２Ｒを用いた場合それぞれの、各試料中のＨＡＭＡの濃度、ｓＩＬ−２Ｒ濃度の理論値と測定値、影響率を示した。

ＨＡＭＡ血清タイプＩに関して、実施例４の試薬で測定した場合は、ＨＡＭＡ濃度が６５．３μｇ／ｍＬ（市販ＨＡＭＡ血清タイプＩに含まれるＨＡＭＡの２．５倍）まで上昇しても測定値への影響率は１０％以下であるが、イムライズＩＬ−２Ｒで測定した場合は、測定値への影響率が３０〜４０％でありＨＡＭＡの影響を受けることが判明した。また、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩに関して、実施例４の試薬で測定した場合は、ＨＡＭＡ濃度が３１．１μｇ／ｍＬ（市販ＨＡＭＡ血清タイプＩＩに含まれるＨＡＭＡの２．５倍）まで上昇しても測定値への影響率は５％以下であるが、イムライズＩＬ−２Ｒで測定した場合は、測定値への影響率が１２０〜１６０％でありＨＡＭＡの影響を大きく受けることが判明した。これらの結果からも、イムライズＩＬ−２ＲではＨＡＭＡによる非特異反応の抑制が不十分であるが、実施例４の試薬は、ＨＡＭＡによる非特異反応を十分に抑制できていることが示唆された。

ｓＩＬ−２Ｒ測定キット
下記の各試薬からなる試薬キットを構成した。
１）抗ｓＩＬ−２Ｒ抗体固定化プレート
４μｇ／ｍＬ ＫＴＭ−３０２抗体を１００μＬ／ウェルで固相化した８ウェル×１２ストリップの９６ウェルマイクロタイタープレート
２）酵素標識化抗体
組成：所定量（２４〜１４０ｎｇ／ｍＬ）の実施例１のフラクション４０〜４６のＰＯＤ標識化抗体を含む標識化抗体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、１００μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、２００μｇ／ｍＬ ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１／ＩｇＧ１ Ｐｏｌｙ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬＰＯＤを含有する７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ６．５）
容量：６ｍＬ／ボトル
３）標準物質
０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、１６００Ｕ／ｍＬ、３２００Ｕ／ｍＬ、６４００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒをそれぞれ含む標準物質溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロースおよび０．０１％バイオエースを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）０．５ｍＬ／バイアル相当の凍結乾燥品
４）検体希釈液
組成：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロース、０．２％プロキセルＧＸＬおよび２０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４５）
容量：６ｍＬ／ボトル。
５）発色基質
ＯＰＤタブレット（シグマーアルドリッチ社製）１０ｍｇ／錠×６
６）発色基質溶解液
組成：０．７５ｇ／Ｌ尿素過酸化水素塩および０．１％プロクリン３００を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ４．４）
容量：３０ｍＬ／ボトル
７）反応停止液
組成：１ｍｏｌ／Ｌ硫酸
容量：６ｍＬ／ボトル
８）洗浄液
１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムおよび０．０５％ツイーン２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）

ＰＯＤに反応する抗体に起因する非特異反応の抑制
（１）ＨＡＭＡ以外の原因による非特異反応を示す検体
ヒトの血清である検体Ａを、検体希釈液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロース、０．２％プロキセルＧＸＬおよび２０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．４５）で１／１、１／４、１／８に希釈し、それぞれのｓＩＬ−２Ｒの濃度を実施例４の試薬で測定した。第９表に、測定値および測定値と希釈率とから求めた検体原液のｓＩＬ−２Ｒの計算値を示した。検体原液のｓＩＬ−２Ｒ計算値が希釈率によって異なっていて、希釈直線性が不良であり、非特異反応が生じていることが判明した。

検体Ａの非特異反応の原因がＨＡＭＡであるかどうかを確認するため、検体Ａに含まれるＨＡＭＡの濃度を、ＨＡＭＡ測定キットであるＨＡＭＡ ＥＬＩＳＡ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いて測定した。結果を第１０表に示したが、ＨＡＭＡ血清タイプＩ、ＨＡＭＡ血清タイプＩＩでは、高濃度のＨＡＭＡが検出されたが、検体ＡのＨＡＭＡ値は定量限界である５ｎｇ／ｍＬを下回っており、ＨＡＭＡの存在が否定された。したがって、検体Ａの非特異反応は、ＨＡＭＡ以外の原因によるものと考えられた。

（２）検体Ａの非特異反応の抑制
検体Ａを検体希釈液で１／２、１／４、１／６、１／１１、１／２１、１／３１に希釈し、以下に示す構成からなる、過ヨウ素酸法で標識されたＰＯＤ標識抗体を用いたｓＩＬ−２Ｒ測定試薬（以下、ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂとよぶ）を用いてｓＩＬ−２Ｒを測定し、測定値と希釈率から検体原液のｓＩＬ−２Ｒの計算値を求めた。なお、ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂは酵素標識化抗体溶液以外は実施例４の試薬と同じ構成であり、そのＰＯＤ標識抗体は、ゲルろ過による抗体の分離はされていない。

ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂ
抗ｓＩＬ−２Ｒ抗体固定化プレート：４μｇ／ｍＬ ＫＴＭ−３０２抗体を１００μＬ／ウェルで固相化した８ウェル×１２ストリップの９６ウェルマイクロタイタープレート
標準物質溶液：０Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、１６００Ｕ／ｍＬ、３２００Ｕ／ｍＬ、６４００Ｕ／ｍＬのｓＩＬ−２Ｒをそれぞれ含む標準物質溶液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、４％ＢＳＡ、１％サッカロースおよび０．０１％バイオエースを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）
酵素標識化抗体溶液：所定量（２４〜１４０ｎｇ／ｍＬ）の過ヨウ素酸法で標識されたＰＯＤ標識化抗体を含む標識化抗体希釈液（１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１０％ＦＢＳ、０．２％ＮＰ−４０、２０μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ、０．２％プロキセルＧＸＬ、１０％ＰＯＤ安定化緩衝液および０．１６μｇ／ｍＬ ＰＯＤ）を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．５）
洗浄液：１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、０．０５％ツイーン２０を含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ６．８
ＯＰＤ溶液：２ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ、０．７５ｇ／Ｌ尿素過酸化水素塩、０．０１％プロクリン３００を含有する１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ４．４
反応停止液：１ｍｏｌ／Ｌ硫酸

一方、検体Ａをマウス血清で１／２、１／４、１／８と希釈し、実施例４の試薬を用いてｓＩＬ−２Ｒの測定を行う非特異反応吸収試験の結果、検体Ａに含まれるｓＩＬ−２Ｒの理論値は３６２４Ｕ／ｍＬと計算された。上記および（１）の実施例４の試薬を用いた場合の各希釈率での検体原液のｓＩＬ−２Ｒの計算値について、理論値３６２４Ｕ／ｍＬに対する比を求め、ｓＩＬ−２Ｒ測定値、検体原液のｓＩＬ−２Ｒ計算値とともに、第１１表（実施例４の試薬を用いた場合）および第１２表（ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂを用いた場合）に示した。

同じ希釈率１／４の検体の測定値で比較した場合に、実施例４の試薬と比べ、ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂでの測定値は約４倍の値を示した。また、実施例４の試薬は１／８の希釈率で非特異反応の影響がほぼなくなるのに対し、ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂでは、１／１１の希釈率でも理論値に対し１２５％の値の非特異反応が見られ、ほぼ非特異反応の影響をなくすためには１／２１〜１／３１の希釈が必要であった。一般的に、過ヨウ素酸法により抗体と酵素を結合させると、重合化したハイコンジュゲートな標識抗体となることが報告されている（石川榮治著「酵素免疫測定法」１９８７年、医学書院発行）。したがって、ｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂで使用している過ヨウ素酸法で標識されたＰＯＤ標識抗体は、抗体とＰＯＤの結合数が１：４や１：５のように抗体１分子当たりのＰＯＤ結合数が高いものや、抗体とＰＯＤの結合数が２：２、２：３および３：１のような抗体が重合したものが含まれていると考えられる。

以上から、実施例１のフラクション４０〜４６のＰＯＤ標識化抗体、すなわち抗体とＰＯＤの結合数がそれぞれ１：１および１：２であるＰＯＤ標識抗体を用いた実施例４の試薬は、ＨＡＭＡ以外の原因による非特異反応に対しても効果的に抑制することが示された。

（３）検体Ａの非特異反応における不活性化したパーオキシダーゼの効果
２００μｇ／ｍＬ ＭＡＫ３３−ＩｇＧ Ｐｏｌｙまたは４００μｇ／ｍＬ Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙ−ＰＯＤを添加した酵素標識化抗体希釈液を用いた実施例４の試薬により、１／４希釈した検体Ａおよびコントロール血清ＩＩ（ヒト正常人血清にｓＩＬ−２Ｒを添加したもの）のｓＩＬ−２Ｒを測定した。対照として実施例４の試薬でも測定を行った。結果を第１３表に示した。なお、コントロール血清ＩＩに含まれるｓＩＬ２−ＲはｓＩＬ−２Ｒ測定試薬Ｂによる測定で２１５４Ｕ／ｍＬであり、１／４希釈した検体ＡのｓＩＬ２−Ｒの理論値は９０６Ｕ／ｍＬ（３６２４Ｕ／ｍＬ×１／４）と計算された。

実施例４の試薬に、２００μｇ／ｍＬ ＭＡＫ３３−ＩｇＧ Ｐｏｌｙまたは４００μｇ／ｍＬ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｌｏｙ−ＰＯＤを添加しても、コントロール血清ＩＩの測定値が変化しないことから、測定系への影響はないと考えられた。
１／４希釈した検体Ａの実施例４の試薬によるｓＩＬ−２Ｒ測定値は２０２２Ｕ／ｍＬであり、理論値と比べると非特異反応が認められるが、標識化抗体希釈液にＭＡＫ３３−ＩｇＧ ＰｏｌｙまたはＩｎａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙ−ＰＯＤを添加することにより、理論値付近まで測定値が低下し、非特異反応がさらに抑制されていた。特に、Ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙ−ＰＯＤを添加により非特異反応がほぼ完全に抑制されていることから、ＰＯＤと反応する抗体に起因する非特異反応が存在していることが判明した。実施例４の試薬は、検体Ａの非特異反応、すなわちＰＯＤに反応する抗体に起因する非特異反応を抑制することができ、さらに不活性化したＰＯＤを共存させることで、抗ＰＯＤ抗体に起因する非特異反応を十分に抑制することができた。

本発明により、病態モニタリングや疾患の診断などに有用な試料中の測定対象物の免疫学的定量方法および定量試薬、ならびに、免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法が提供される。

Claims (23)

1. 水性媒体中、可溶性インターロイキン−２受容体に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の可溶性インターロイキン−２受容体を定量する免疫学的定量法において、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上である酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする、ヒト抗マウス抗体に起因する非特異的反応が抑制された可溶性インターロイキン−２受容体の免疫学的定量方法。
2. 第１の抗体が結合する可溶性インターロイキン−２受容体の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程を含む請求項１記載の免疫学的定量方法。
3. 第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である請求項１または２記載の免疫学的定量方法。
4. 酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程に、ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧを共存させる請求項１〜３のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
5. ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧが、マウスＩｇＧ重合体および／またはマウスＩｇＧである請求項４記載の免疫学的定量方法。
6. 酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程に、該酵素標識化抗体の標識に用いる酵素と同じ酵素を不活性化した酵素を共存させる請求項１〜５のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
7. 酵素がペルオキシダーゼである請求項１〜６のいずれかに記載の免疫学的定量方法。
8. 可溶性インターロイキン−２受容体に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体であって、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上である酵素標識化抗体を含有することを特徴とする、ヒト抗マウス抗体に起因する非特異的反応が抑制された可溶性インターロイキン−２受容体の免疫学的定量方法に用いる試薬。
9. 第１の抗体が結合する可溶性インターロイキン−２受容体の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を含有する請求項８記載の試薬。
10. 酵素活性測定用試薬を含有する請求項８または９記載の試薬。
11. 第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である請求項８〜１０のいずれかに記載の試薬。
12. ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧを含む請求項８〜１１のいずれかに記載の試薬。
13. ＩｇＧ重合体および／またはＩｇＧが、マウスＩｇＧ重合体および／またはマウスＩｇＧである、請求項１２記載の試薬。
14. 酵素標識化抗体の標識に用いる酵素と同じ酵素を不活性化した酵素を含む請求項８〜１３のいずれかに記載の試薬。
15. 酵素がペルオキシダーゼである請求項８〜１４のいずれかに記載の試薬。
16. さらに、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤からなる群より選ばれる一つまたは複数の物質を含有する請求項８〜１５のいずれかに記載の試薬。
17. 可溶性インターロイキン−２受容体に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の可溶性インターロイキン−２受容体を定量する免疫学的定量方法において、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ１：１、１：２である酵素標識化抗体の、全標識化抗体に対する分子数の割合が５０％以上である酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程を含むことを特徴とする、可溶性インターロイキン−２受容体の免疫学的定量方法における、ヒト抗マウス抗体に起因する非特異的反応の抑制方法。
18. 第１の抗体が結合する可溶性インターロイキン−２受容体の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第２の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程を含む請求項１７記載の抑制方法。
19. 第１の抗体が、Ｆｃ部分を除去した抗体である請求項１７または１８記載の抑制方法。
20. 酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程に、ＩｇＧ重合体／またはＩｇＧを共存させる請求項１７〜１９のいずれかに記載の抑制方法。
21. ＩｇＧ重合体／またはＩｇＧが、マウスＩｇＧ重合体／またはマウスＩｇＧである請求項２０記載の抑制方法。
22. 酵素標識化抗体を試料に反応させ可溶性インターロイキン−２受容体との免疫複合体を形成させる工程に、該酵素標識化抗体の標識に用いる酵素と同じ酵素を不活性化した酵素を共存させる請求項１７〜２１のいずれかに記載の抑制方法。
23. 酵素がペルオキシダーゼである請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。

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