KR20070026576A - 비특이 반응이 억제된 면역 측정 방법 및 시약 - Google Patents

비특이 반응이 억제된 면역 측정 방법 및 시약 Download PDF

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Abstract

수성 매체 중, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체를 사용하여 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 정량법에 있어서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정 및 면역 복합체의 효소 활성을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법.
표지화 항체, 면역 복합체

Description

비특이 반응이 억제된 면역 측정 방법 및 시약{METHOD OF IMMUNOASSAY HAVING NONSPECIFIC REACTION INHIBITED AND REAGENT THEREFOR}
본 발명은, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용되는 시약 및 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법에 관한 것이다.
측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 있어서는 종종 비특이 반응이 일어나는 것이 확인되어 있다. 항원 항체 반응에 있어서의 비특이적 반응으로는 여러가지 종류가 알려져 있는데, 특히, 인간 항마우스 항체 (human anti-mouse antibody, 이하 HAMA 로 약기한다) 에 의해 생기는 비특이 반응이 문제로 되어 있다. HAMA 에는 HAMA 타입 I 과 HAMA 타입 II 의 2 종류가 존재하며, HAMA 타입 I 은 마우스 단백질에 감작된 적이 없는 사람의 혈액에 생기는 것이고, HAMA 타입 II 는 동물 사육자 등과 같은 마우스에 접촉하고 있는 사람이나 마우스 항체 등의 마우스 단백질의 투여를 받은 사람에게 생성되는 것이다. 일반적으로, HAMA 는 면역학적 정량 방법에 마우스 항체를 사용할 때에 문제가 되는 비특이 인자로, HAMA 로 인해 측정계에 오차를 부여하여 정확한 값을 측정할 수 없게 되는 것이 알려져 있다. 따라서, 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역 측정 방법에서 얻어지는 측정 대상물의 정량치에 의해 병태 등을 모니터할 때에 잘못된 판단을 제공할 수도 있어, 정확한 정량치를 제공하는 측정법의 개발이 요구되고 있다.
면역학적 정량 방법에 있어서 HAMA 에 의한 비특이적 반응의 억제 방법으로는, 면역 측정에 사용하는 항체와 동일 동물종에 있어서의 면역 글로불린이나 중합화 면역 글로불린 등이 유효함이 알려져 있다 (특허 문헌 1, 특허 문헌 2, 비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2 및 비특허 문헌 3 참조).
또, 항원 항체 반응에 있어서의 비특이적 반응으로서, 항체의 표지에 사용되는 효소에 반응하는 항체에 의해 생기는 비특이 반응도 있어, 측정계에 불활성화한 그 효소를 공존시키는 비특이 반응의 억제 방법이 보고되어 있다 (특허 문헌 3 참조).
인터류킨-2 (이하, IL-2 로 기재한다) 는 133 개의 아미노산으로 구성되는 사이토카인으로, 주로 CD4＋ 나 CD8＋ 의 T 세포로부터 생성되지만, 내츄럴 킬러 세포 (NK 세포) 로부터도 생성된다. IL-2 는 주로 면역계에 대한 활성화에 관여하고, 여러가지 생리 활성을 갖고 있다. 예를 들어, IL-2 는 T 세포, B 세포, NK 세포, LAK 세포 (lymphokine activated killer 세포), 매크로파지, 호중구 등에 대하여 세포 주기를 진행시키는 프로그레션 인자로서 작용한다.
IL-2 의 수용체 (이하, IL-2R 이라고 적는다) 는 α 사슬, β 사슬, γ 사슬로 구성되어 있지만, α 사슬의 일부가 세포 상에서 유리된 가용성 인터류킨-2 수 용체 (이하, sIL-2R 이라고 적는다) 가 혈중에 존재하는 것이 알려져 있다. sIL-2R 은 활성화 T 세포, B 세포에 의해서 생성되기 때문에, 생체의 면역 방어 기구의 활성화, T 세포계 및 B 세포계 등의 활성화에 수반하여 혈중의 sIL-2R 가 상승하는 것이 보고되어 있다. 혈청 중의 sIL-2R 농도는, 만성 관절 류머티즘, 전신성 홍반성 낭창 (SLE) 등의 자기 면역 질환이나, 바이러스성 간염, 후천성 면역부전 증후군 (AIDS) 등의 바이러스 감염증 환자에게서 높은 값을 나타내어, 체내 활성화 림프구의 지표의 하나가 됨이 보고되어 있다. 또한 종양 세포가 sIL-2R 을 생성하여, 성인 T 세포 백혈병 (ATL) 이나 비(非)호지킨 림프종의 진행과 혈청 중의 sIL-2R 농도의 변동이 깊게 상관되는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 여러가지 면역계의 질환이나 병태와의 관련이 보고되어, 조혈 질환 중에서 유망한 혈액 중의 마커로 되고 있다. 혈청 중의 sIL-2R 농도는 성인 T 세포 백혈병에 있어서는 병태 모니터링의 지표 등, 비호지킨 림프종에 있어서는 치료 효과의 판정, 관해 (寬解) 후의 팔로우, 재발의 조기 발견 지표 등으로서 임상적으로 유효하게 활용되고 있다.
지금까지, sIL-2R 의 측정법으로서 2 개의 항 sIL-2R 항체를 사용하는 면역학적 측정법이 보고되어 있고 (특허 문헌 4 참조), 또한 sIL-2R 측정용 시약으로서 효소 면역 측정법에 대응한 시약, 예를 들어 「셀프리 IL-2R」(야마노우치 제약 주식회사 제조) 등이 개발되어, 발매되고 있다.
특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 소61-65162호
특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 평1-254869호
특허 문헌 3: 일본 공개특허공보 평5-188055호
특허 문헌 4: 일본 공개특허공보 소62-70761호
비특허 문헌 1: 클리니컬 케미스트리 (Clinical Chemistry), 1999년, 제45권, 942-956페이지
비특허 문헌 2: 암 면역 요법 (Cancer Immunological Immunotherapy), 1991년, 제33권, 80-84페이지
비특허 문헌 3: 클리니컬 케미스트리 (Clinical Chemistry), 1990년, 제36권, 1093페이지
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용되는 시약 및 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법을 제공하는 것에 있다.
발명을 해결하기 위한 수단
본 발명은, 하기 (1)∼(35) 에 관한 것이다.
(1) 수성 매체 중, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체를 사용하여 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 정량법에 있어서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 행정 및 면역 복합체의 효소 활성을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법.
(2) 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 (1) 에 기재된 면역학적 정량 방법.
(3) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 면역학적 정량 방법.
(4) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 (1) 또는 (2) 에 기재된 면역학적 정량 방법.
(5) 제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(6) 비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(7) 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, IgG 중합체 및/또는 IgG 을 공존시키는 (1)∼(6) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(8) 비특이적 반응이 표지 효소에 반응하는 항체에 기인하는 반응인 (1)∼(5) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(9) 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, 불활성화한 그 표지 효소를 공존시키는 (1)∼(8) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(10) 효소가 퍼옥시다아제인 (1)∼(9) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(11) 측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 (1)∼(10) 중 어느 한 항에 기재된 면역학적 정량 방법.
(12) 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체로서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용되는 시약.
(13) 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 함유하는 (12) 에 기재된 시약.
(14) 효소 활성 측정용 시약을 함유하는 (12) 또는 (13) 에 기재된 시약.
(15) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 (12)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(16) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 (12)∼(14) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(17) 제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 (12)∼(16) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(18) 비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 (12)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(19) IgG 중합체 및/또는 IgG 을 함유하는 (12)∼(18) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(20) 비특이적 반응이 표지 효소에 대한 항체에 기인하는 반응인 (12)∼(17) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(21) 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소를 함유하는 (12)∼(20) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(22) 효소가 퍼옥시다아제인 (12)∼(21) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(23) 측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 (12)∼(22) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(24) 추가로, 수성 매체, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 물질을 함유하는 (12)∼(23) 중 어느 한 항에 기재된 시약.
(25) 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체를 사용하여 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 정량 방법에 있어서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법.
(26) 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 (25) 에 기재된 억제 방법.
(27) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 (25) 또는 (26) 에 기재된 억제 방법.
(28) 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 (25) 또는 (26) 에 기재된 억제 방법.
(29) 제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 (25)∼(28) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
(30) 비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 (25)∼(29) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
(31) 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, IgG 중합체/또는 IgG 을 공존시키는 (25)∼(30) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
(32) 비특이적 반응이 표지 효소에 반응하는 항체에 기인하는 반응인 (25)∼(29) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
(33) 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, 불활성화한 그 표지 효소를 공존시키는 (25)∼(32) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
(34) 효소가 퍼옥시다아제인 (25)∼(33) 중 어느 한 항에 기재된 방법.
(35) 측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 (25)∼(34) 중 어느 한 항에 기재된 억제 방법.
발명의 효과
본 발명에 의해, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법, 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용되는 시약 및 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법이 제공된다.
도 1 은 POD 표지화 항 sIL-2R 모노클로날 F(ab')2 항체의 겔 여과 칼럼 크로마토그램.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
1. 비특이적 반응
본 발명에서의 비특이적 반응으로는, 측정 대상물의 면역학적 측정법에 있어서 관찰되는 비특이적 반응이면 특별히 제한은 없지만, HAMA 에 기인하는 비특이적 반응, 표지 효소에 반응하는 항체에 기인하는 비특이적 반응 등을 들 수 있다. HAMA 로는, HAMA 타입 I 및 HAMA 타입 II 를 들 수 있다. 표지 효소에 반응하는 항체로는, 예를 들어 퍼옥시다아제에 반응하는 항체, 알칼리 포스파타아제에 반응하는 항체 등을 들 수 있다. 본 발명에서의 표지 효소에 반응하는 항체란, 본 발명의 면역학적 측정법에 있어서 사용되고 있는 효소 표지화 항체를 표지하고 있는 그 효소에 반응하는 항체로, 비특이 반응을 야기한다.
2. 시료
본 발명에 있어서 사용되는 시료로는, 예를 들어 전혈(全血), 혈장, 혈청, 수액, 타액, 양수, 뇨, 땀, 췌액 등을 들 수 있으며, 전혈, 혈장, 혈청 등이 바람직하다.
3. 측정 대상물
본 발명의 측정 대상물로는, 항원이 되는 물질이면 어떠한 것이라도 상관없고 특별히 제한은 없지만, 적어도 2 개의 항원 결정기를 갖는 항원인 것이 바람직하다. 예를 들어, sIL-2R, 심근경색의 마커로서 알려져 있는 미오글로빈, 크레아틴 키나아제 MB (CK-MB), 트로포닌 T 등을 들 수 있다.
4. 항체
본 발명에 있어서 사용되는 효소 표지화 항체를 형성하는 제 1 항체로는, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 항체이면 특별히 제한은 없고, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이나 사용할 수 있지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서는, 항체뿐만 아니라, 항체를 파파인 처리에 의해 얻어지는 Fab, 펩신 처리에 의해 얻어지는 F(ab')2, 펩신 처리-환원 처리에 의해 얻어지는 Fab' 등의 Fc 부분을 제거한 항체 프래그먼트도 사용할 수 있다. 항체 프래그먼트로는 F(ab')2 가 특히 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 고상화 항체를 형성하는 제 2 항체로는, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 항체이면 특별히 제한은 없고, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이나 사용할 수 있지만, 모노클로날 항체가 바람직하다. 제 2 항체는, 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용하는 항체는, 측정 대상물 또는 그 에피토프에 상당하는 펩티드를 항원으로서 사용하여 통상의 방법에 의해 취득할 수 있지만, 시판품으로도 입수 가능하다.
sIL-2R 에 특이적으로 결합하는 항체로는, 예를 들어 하이브리도마 AM92.3 이 생성하는 모노클로날 항체[피어스 (PIERCE) 사 제조], 모노클로날 항체 7G7/B6 (피어스사 제조; 일본 공개특허공보 소62-70761호 참조) 등을 들 수 있고, 각각 임의로 제 1 항체 또는 제 2 항체로서 사용할 수 있다.
5. 효소 표지
본 발명에 있어서 제 1 항체와 결합하고 있는 효소로는, 예를 들어 퍼옥시다 아제 (이하, POD 로 약기한다), 알칼리 포스파타아제, 루시페라아제, β-D-갈락토시다아제, 글루코오스옥시다아제 등을 들 수 있고, 퍼옥시다아제, 알칼리 포스파타아제가 바람직하고, 퍼옥시다아제가 특히 바람직하다. 퍼옥시다아제로는 어떠한 유래의 퍼옥시다아제도 사용할 수 있지만, 서양 고추냉이 유래의 퍼옥시다아제가 바람직하다. 알칼리 포스파타아제로는 예를 들어 소의 소장 유래의 알칼리 포스파타아제 등을 들 수 있다.
6. 제 1 항체와 효소의 결합
본 발명에서의 효소 표지화 항체는 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 것이지만, 당해 결합에 있어서의 결합 양식으로는, 예를 들어 공유 결합을 들 수 있고, 효소와 항체가 직접 결합하고 있거나, 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 결합하고 있어도 된다. 결합체의 제작 방법으로는, 예를 들어 글루탈알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 피리딜ㆍ디수피드법 등을 들 수 있으며 (예를 들어, 이시카와 에이지 저 「효소 면역 측정법」 1987년, 의학서원 발행 참조), 말레이미드법이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어 이미노티올란 등으로 술프히드릴화한 항체와, 숙신이미딜4-[N-말레이미도메틸]-시클로헥산-1카르복실산(succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), N-(6-말레이미도카프로일옥시)숙신이미드 [N-(6-maleimidocaproyloxy)succinimide, EMCS]등으로 말레이미드화한 효소를 혼합하여 조제할 수 있다.
7. 효소 표지화 항체의 항체와 효소의 결합수
본 발명에 사용하는 효소 표지화 항체는 항체 1 분자 당 소수의 표지 효소분자가 결합하고 있는 효소 표지화 항체이고, 구체적으로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체이고, 바람직하게는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체이고, 보다 바람직하게는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체이다.
표지화 항체로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체가 특히 바람직하고, 효소 표지화 항체가 혼합물일 때에는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체의, 전체 표지화 항체에 대한 분자수의 비율이 50% 이상이 바람직하고, 70% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 특히 바람직하다.
이러한 효소 표지화 항체는, 전술한 글루탈알데히드법, 과요오드산법, 말레이미드법, 피리딜ㆍ디수피드법 등에 의해 제 1 항체와 효소를 결합시킨 후, 다수의 효소가 결합한 제 1 항체, 미반응 효소 및 항체를, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피법, 겔 여과 칼럼 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법 등의 방법이나 이들 방법을 조합한 방법 등을 사용하여 제거함으로써 조제할 수 있다.
8. 고상화 항체
본 발명에서의 고상화 항체는, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 것이다. 분리 수단으로는, 고상 그 자체 또는 고상에 결합한 물질에 특이적으로 결합하는 물질 등을 들 수 있다. 당해 결합에 있어서의 결합 양식으로는, 고상을 사용할 때에는 비공유 결합을 들 수 있고, 고상에 결합한 물질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용할 때에는 공유 결합을 들 수 있고, 항체와 그 물질이 직접 결합하고 있거나, 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 결합하고 있어도 된다. 고상에 결합한 물질 및 거기에 특이적으로 결합하는 물질의 조합으로는 비오틴과 아비딘의 조합 등을 들 수 있다.
고상으로는, 제 2 항체를 고정화하고, 측정 대상물의 면역학적 측정법을 가능하게 하는 고상이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 마이크로 타이터 플레이트 등의 폴리스티렌 플레이트, 유리제 또는 합성 수지제의 입상물 (비드), 유리제 또는 합성 수지제의 구상물 (볼), 라텍스, 자성 입자, 니트로셀룰로오스막 등의 각종 멤브레인, 합성 수지제의 시험관 등을 들 수 있다.
9. IgG 중합체 및 IgG
본 발명에서의 IgG 중합체로는, IgG 이 중합한 것이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 MAK33-IgG1/IgG1 Poly, MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly [모두, 로슈 다이아그노스틱 (Roche Diagnostics) 사 제조] 등을 들 수 있다. 본 발명에서의 IgG 로는, 동물의 IgG 이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 모르모트, 염소, 양, 닭, 소, 말 등의 동물의 IgG 을 들 수 있고, 마우스 IgG 이 바람직하다. 동물의 IgG 은 정제한 것이어도 되고, 동물의 혈청이어도 된다.
10. 수성 매체
수성 매체로는, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있고, 완충액이 바람직하다. 완충액의 조제에 사용되는 완충제로는 완충능을 갖는 것이면 특히 한정되지 않지만, pH 1∼11 의 예를 들어 락트산 완충제, 시트르산 완충제, 아세트산 완충제, 숙신산 완충제, 프탈산 완충제, 인산 완충제, 트리에탄올아민 완충제, 디에탄올아민 완충제, 리신 완충제, 바르비톨 완충제, 이미다졸 완충제, 말산 완충제, 옥살산 완충제, 글리신 완충제, 붕산 완충제, 탄산 완충제, 글리신 완충제, 굿즈 완충제 (Goods Buffer) 등을 들 수 있다.
굿즈 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES) 완충제, 비스(2-히드록시에틸)이미노트리스(히드록시메틸)메탄 (Bis-Tris) 완충제, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (Tris) 완충제, N-(2-아세트아미드)이미노2아세트산 (ADA) 완충제, 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES) 완충제, 2-[N-(2-아세트아미드)아미노]에탄술폰산 (ACES) 완충제, 3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산 (MOPSO) 완충제, 2-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]에탄술폰산 (BES) 완충제, 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS) 완충제, 2-{N-[트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}에탄술폰산 (TES) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-술포에틸)피페라진 (HEPES) 완충제, 3-[N,N-비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-히드록시프로판술폰산 (DIPSO) 완충제, 2-히드록시-3-{[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노}프로판술폰산 (TAPSO) 완충제, 피 페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-3-술폰산) (POPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(2-히드록시-3-술포프로필)피페라진 (HEPPSO) 완충제, N-(2-히드록시에틸)-N'-(3-술포프로필)피페라진 (EPPS) 완충제, 트리신[N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신] 완충제, 비신[N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신] 완충제, 3-[N-트리스(히드록시메틸)메틸]아미노프로판술폰산 (TAPS) 완충제, 2-(N-시클로헥실아미노)에탄술폰산 (CHES) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)-2-히드록시프로판술폰산 (CAPSO) 완충제, 3-(N-시클로헥실아미노)프로판술폰산 (CAPS) 완충제 등을 들 수 있다.
완충액의 농도는 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한되지는 않지만, 0.001∼2.0㏖/L 가 바람직하고, 0.005∼1.0㏖/L 가 보다 바람직하고, 0.01∼0.1㏖/L 가 특히 바람직하다.
11. 금속 이온
금속 이온으로는, 예를 들어 마그네슘 이온, 망간 이온, 아연 이온 등을 들 수 있다.
12. 염류
염류로는, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼륨 등을 들 수 있다.
13. 당류
당류로는, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 등을 들 수 있다.
14. 계면 활성제
계면 활성제로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있고, 비이온성 계면 활성제 가 바람직하다. 비이온성 계면 활성제로는, 예를 들어 트윈 20 (Tween 20), 노니뎃 P-40 (NP-40) 등을 들 수 있다.
15. 방부제
방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질 (스트렙토마이신, 페니실린, 겐타마이신 등), 바이오에이스, 프로클린 (Proclin) 300, 프록셀 (Proxel) GXL 등을 들 수 있다.
16. 단백질
단백질로는, 예를 들어 소 혈청 알부민 (BSA), 소 태아 혈청 (FBS), 카세인, 블록 에이스 TM (다이닛폰 제약사 제조) 등을 들 수 있다.
17. 단백질 안정화제
단백질 안정화제로는, 예를 들어 퍼옥시다아제 안정화 완충액 [Peroxidase Stabilizing Buffer, 다코 사이토메이션 (Dako Cytomation) 사 제조] 등을 들 수 있다.
18. 불활성화한 효소
본 발명에서의 불활성화한 효소로는, 본 발명의 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용하는 효소 표지화 항체의 표지에 사용되고 있는 효소와 동일한 효소, 즉 동일한 생물 유래로 동일한 효소 활성의 효소를 불활성화한 것이면 된다. 예를 들어, 면역학적 정량 방법에 있어서 POD 표지화 항체를 사용하고 있는 경우에는 그 POD 를 불활성화한 것을 사용하고, 알칼리 포스파타아제 표지화 항체를 사용 하고 있는 경우에는 그 알칼리 포스파타아제를 불활성화한 것을 사용한다. 불활성화한 효소는, 담체나 항체에 결합한 것이어도 되지만, 이 경우의 항체는 측정 대상물이나 항체와 반응하지 않는 것일 필요가 있다. 불활성화란, 비특이 반응의 기인이 되는 표지 항체에 반응하는 항체와의 반응성은 유지하면서, 본 발명의 면역학적 정량 방법에 관여하는 효소 활성을 완전하게 또는 실질적으로 결실시키는 것을 말하고, 가열 처리, 산 또는 알칼리에 의한 변성 처리, 프로테아제에 의한 효소 소화, 동결 융해 등의 처리, 이들을 조합한 처리에 의해 실시할 수 있다. 예를 들어 POD 에서는 100∼125℃ 에서 10∼60 분간 처리함으로써 불활성화 POD 를 얻을 수 있다. 불활성한 POD 로는, Inactive Poly-POD (로슈 다이아그노스틱사 제조) 를 들 수 있다. 불활성화한 알칼리 포스파타아제로는, Scavenger-ALP (오리엔탈 효모사 제조) 등을 들 수 있다.
19. 측정 대상물의 면역학적 정량 방법
본 발명의 측정 대상물의 면역학적 정량 방법으로는, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정 및 면역 복합체의 효소 활성을 측정하는 공정을 포함하는 방법이면 특별히 제한은 없지만, 추가로 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 고상화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복 합체를 형성시키는 공정을 포함하는 방법이 바람직하다.
효소 표지화 항체로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체가 바람직하고, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체가 보다 바람직하다.
표지화 항체로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체가 특히 바람직하고, 효소 표지화 항체가 혼합물일 때에는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체의, 전체 표지화 항체에 대한 분자수의 비율이 50% 이상이 바람직하고, 70% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 특히 바람직하다.
구체적인 정량 방법으로는, 예를 들어 샌드위치법, 경합법 등을 들 수 있지만, 샌드위치법이 바람직하다. 샌드위치법으로는, 예를 들어 1 스텝법, 딜레이 1 스텝법, 2 스텝법 등을 들 수 있다.
보다 구체적인 측정 대상물의 면역학적 정량 방법의 예로는, 예를 들어 이하의 공정을 함유하는 정량 방법을 들 수 있다.
(1) 고상화 항체와 시료 중의 측정 대상물을 반응시켜, 면역 복합체를 형성시키는 공정 (1 차 반응),
(2) 효소 표지화 항항체와 시료 중의 측정 대상물을 반응시켜, 면역 복합체 를 형성시키는 공정 (2 차 반응),
(3) 면역 복합체를 형성하지 않은 효소 표지화 항체를 고상과 분리하는 공정,
(4) 고상에 생성된 면역 복합체 중의 효소 표지의 효소 활성을 측정하는 공정,
(5) 미리 농도를 알고 있는 측정 대상물을 사용하여 작성한 검량선으로부터, 공정 (4) 에서 측정한 효소 활성과 비교함으로써 측정 대상물을 정량하는 공정.
상기의 (1) 과 (2) 공정 사이에, 필요에 따라서 1 차 반응 후의 고상을 세정하는 공정을 추가해도 된다. 또, (1) 의 공정과 (2) 의 공정은 동시에 실시할 수도 있다.
1 차 반응은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 1 차 반응의 반응 온도로는, 예를 들어 0∼50℃ 이고, 4℃∼40℃ 가 바람직하다. 1 차 반응의 반응 시간으로는, 예를 들어 5 분∼20 시간이다. 1 차 반응 후의 고상의 세정시에 사용하는 세정액으로는, 예를 들어 인산 완충화 생리식염수 (0.15㏖/L 염화나트륨을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.2, 이하, PBS 라고 기재한다) 나 계면 활성제를 함유하는 PBS 등을 들 수 있다. 계면 활성제로는, 예를 들어 트윈 20 등의 비이온성 계면 활성제 등을 들 수 있다.
2 차 반응은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다. 2 차 반응에서 사용되고, 효소 표지화 항을 형성하는 항체 (제 1 항체) 에 있어서의 항원 결정기는, 1 차 반응에서 사용되는 항체 (제 2 항체) 에 있어서의 항원 결정기와 상이 한 것이 바람직하다. 2 차 반응의 반응 온도로는, 예를 들어 0∼50℃ 이고, 4℃∼40℃ 가 바람직하다. 2 차 반응의 반응 시간으로는, 예를 들어 5 분∼20 시간이다. 1 차 반응 후의 고상의 세정시에 사용하는 세정액으로는, 예를 들어 상기한 세정액 등을 들 수 있다.
2 차 반응에 의해 고상 상에 생성된 면역 복합체 중의 효소 표지의 활성을 측정하는 방법으로는, 효소의 기질을 당해 효소와 반응시켜서 생성된 물질을 측정함으로써, 면역 복합체 중의 효소 활성을 측정할 수 있다. 효소의 기질과 당해 효소와의 반응은 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다.
효소가 퍼옥시다아제인 경우에는, 예를 들어 흡광도법, 형광법, 발광법 등에 의해 면역 복합체 중의 퍼옥시다아제 활성을 측정할 수 있다. 흡광도법에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화 수소 및 산화 발색형 색원체의 조합을 반응시켜서, 반응액의 흡광도를 분광 광도계 등에 의해 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 산화 발색형 색원체로는, 예를 들어 로이코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체 등을 들 수 있다.
로이코형 색원체는, 과산화 수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 단독으로 색소로 변환되는 물질이다. 구체적으로는, o-페닐렌디아민 (OPD), 테트라메틸벤지딘 (TMB), 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로 로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
산화 커플링 발색형 색원체는, 과산화 수소 및 퍼옥시다아제 등의 과산화 활성 물질의 존재 하, 2 개의 화합물이 산화적 커플링하여 색소를 생성하는 물질이다. 2 개의 화합물의 조합으로는, 커플러와 아닐린류 (트린더 시약) 의 조합, 커플러와 페놀류의 조합 등을 들 수 있다. 커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린(4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논히드라진 등을 들 수 있다. 아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다. 페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-히드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
과산화 수소의 측정에 있어서, 과산화 활성 물질의 농도는 측정에 적합한 농 도이면 특별히 제한은 없지만, 과산화 활성 물질로서 퍼옥시다아제를 사용하는 경우에는, 1∼100kU/L 가 바람직하다. 또한, 산화 발색형 색원체의 농도는, 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한은 없지만, 0.01∼10g/L 가 바람직하다.
형광법에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화 수소 및 형광 물질의 조합을 반응시켜, 생성된 형광의 강도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 당해 형광 물질로는, 예를 들어 4-히드록시페닐아세트산, 3-(4-히드록시페닐)프로피온산, 쿠마린 등을 들 수 있다.
발광법에 의해 퍼옥시다아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 그 기질인 과산화 수소 및 발광 물질의 조합을 반응시켜, 생성된 발광의 강도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 당해 발광 물질로는, 예를 들어 루미놀 등을 들 수 있다.
효소가 알칼리성 포스파타아제인 경우에는, 예를 들어 발광법 등에 의해 복합체 중의 알칼리성 포스파타아제 활성을 측정할 수 있다. 발광법에 의해 알칼리성 포스파타아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 알칼리성 포스파타아제와 그 기질을 반응시켜, 생성된 발광의 발광 강도를 발광 강도계 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 알칼리성 포스파타아제의 기질로는, 예를 들어 3-(2'-스피로아다만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)페닐-1,2-디옥세탄ㆍ2나트륨염 (AMPPD), 2-클로로-5-{4-메톡시스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로(3.3.1.13,7)데칸]-4-일}페닐포스페이트ㆍ2나트륨염 (CDP-StarTM), 3-{4-메톡시스 피로[1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로(3.3.1.13,7)데칸]-4-일}페닐포스페이트ㆍ2나트륨염 (CSPDTM), [10-메틸-9(10H)-아크리디닐이덴]페녹시메틸인산ㆍ2나트륨염 (LumigenTM APS-5) 등을 들 수 있다.
효소가 루시페라아제인 경우에는, 예를 들어 발광법 등에 의해 면역 복합체 중의 루시페라아제 활성을 측정할 수 있다. 발광법에 의해 루시페라아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 루시페라아제와 그 기질을 반응시켜, 생성된 발광의 발광 강도를 발광 강도계 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 루시페라아제의 기질로는, 예를 들어 루시페린 등을 들 수 있다.
효소가 β-D-갈락토시다아제인 경우에는, 예를 들어 흡광도법 (비색법) 등에 의해 면역 복합체 중의 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정할 수 있다. 흡광도법 (비색법) 에 의해 β-D-갈락토시다아제 활성을 측정하는 방법으로는, 예를 들어 β-D-갈락토시다아제와 그 기질을 반응시켜, 반응액의 흡광도를 분광 광도계 등으로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. β-D-갈락토시다아제의 기질로는, 예를 들어 2-클로로-4-니트로페닐β-D-락토시드, 2-니트로페닐-β-D-갈락토시드 (ONPG), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드 (X-gal) 등을 들 수 있다.
효소가 글루코오스옥시다아제인 경우에는, 글루코오스옥시다아제에 그 기질인 글루코오스를 작용시켜, 생성된 과산화 수소를 측정함으로써, 면역 복합체 중의 글루코오스옥시다아제 활성을 측정할 수 있다. 과산화 수소의 측정은, 예를 들어 전술한 퍼옥시다아제 활성의 측정법에 의해 사용할 수 있다.
본 발명의 면역학적 정량 방법에 있어서는, 전술한 완충제, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제 등을 반응에 공존시킬 수 있다.
20. 정량 시약
본 발명의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 측정 방법에 사용되는 시약은, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체, 필요에 따라, 제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 고상화 항체 및/또는 효소 활성 측정용 시약을 추가로 함유한다.
효소 표지화 항체로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체가 바람직하고, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체가 보다 바람직하다.
표지화 항체로는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체가 특히 바람직하고, 효소 표지화 항체가 혼합물일 때에는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 1:1 또는 1:2 인 효소 표지화 항체의, 전체 표지화 항체에 대한 분 자수의 비율이 50% 이상이 바람직하고, 70% 이상이 보다 바람직하고, 90% 이상이 특히 바람직하다.
본 발명의 측정용 시약의 구체적 양태를 이하에 기재한다.
ㆍ시약 1
고상화 항체, 효소 표지화 항체 및, 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 2
고상화 항체, 효소 표지화 항체, IgG 중합체 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 3
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 마우스 IgG 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 4
고상화 항체, 효소 표지화 항체, IgG 중합체, 마우스 IgG 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 5
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 6
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 마우스 IgG, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 7
고상화 항체, 효소 표지화 항체, IgG 중합체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 8
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 마우스 IgG, IgG 중합체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소 및 표지한 효소의 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
ㆍ시약 9
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 10
고상화 항체, 효소 표지화 항체, IgG 중합체, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 11
고상화 항체, 효소 표지화 항체항, 마우스 IgG, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 12
고상화 항체, 효소 표지화 항체항, IgG 중합체, 마우스 IgG, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 13
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 14
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 마우스 IgG, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 15
고상화 항체, 효소 표지화 항체, IgG 중합체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
ㆍ시약 16
고상화 항체, 효소 표지화 항체, 마우스 IgG, IgG 중합체, 항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소, 표지한 효소의 활성 측정용 시약 및 측정 대상물 표준품을 함유하는 시약.
본 발명의 측정용 시약에 있어서 표지한 효소의 활성 측정용 시약으로는, 예를 들어 당해 효소의 기질을 함유하는 시약을 들 수 있다. 당해 효소 활성 측정용 시약에 있어서의 효소로는, 예를 들어 전술한 효소를 들 수 있다. 당해 기질로는, 예를 들어 전술한 기질을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약에 있어서의 측정 대상물 표준품으로는, 예를 들어 기 지의 농도로 조정된 측정 대상물의 수용액을 들 수 있다.
본 발명의 측정용 시약은, 키트의 형태로 보존, 운반되어도 되고, 또한, 필요에 따라, 전술한 완충제, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제 등을 함유해도 된다.
이하에, 본 발명의 실시예를 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 한편, 본 실시예에 있어서는 하기 메이커의 시약, 효소, 혈청 및 기구를 사용하였다.
하이브리도마 AM92.3: 피어스사 제조
하이브리도마 7G7/B6: 피어스사 제조
α-MEM (Minimum Essential Medium alpha Medium): 인비트로겐 (Invitrogen) 사 제조
96 웰 마이크로 타이터 플레이트: 날제 눈크 인터내셔널 (Nalge Nunc International) 사 제조
BSA: 인터젠 (InterGen) 사 제조
수크로오스: 칸토 화학사 제조
트윈 20 :칸토 화학사 제조
겐타마이신: 와코 쥰야쿠 공업사 제조
염화나트륨: 와코 쥰야쿠 공업사 제조
바이오에이스: 쿠미아이 화학 공업사 제조
오르토페닐렌디아민 (OPD): 시그마 알드리치사 제조
우레아과산화 수소염: 시그마 알드리치사 제조
프로클린: 시그마 알드리치사 제조
POD: 토요방적사 제조, 로슈 다이아그노스틱사 제조
황산: 칸토 화학사 제조
펩신: 로슈 다이아그노스틱사 제조
이미노티올란: 피어스사 제조
EMCS: 피어스사 제조
FBS: 하이클론 (HyClone) 사 제조
NP-40: 칼바이오켐 (Calbiochem) 사 제조
마우스 IgG: 스캔티바디즈 래버라토리 (Scantibodies Laboratory) 사 제조
프록셀 GXL: 아비시아 (Avecia) 사 제조
POD 안정화 완충액: 다코사이토메이션사 제조
MES: 도진 (同仁) 화학 연구소사 제조
MAK33-IgG1/IgG1 Poly: 로슈 다이아그노스틱사 제조
MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Poly: 로슈 다이아그노스틱사 제조
정상인 혈청: 아리에스사 제조
HAMA 혈청 타입 I: 로슈 다이아그노스틱사 제조
HAMA 혈청 타입 II: 로슈 다이아그노스틱사 제조
Inactive Poly-POD: 로슈 다이아그노스틱사 제조
참고예 1 항 sIL-2R 모노클로날 항체의 조제와 정제
항 sIL-2R 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 AM92.3 및 하이브리도마 7G7/B6 을 각각 프리스테인 (pristane) 등으로 처리한 마우스 복강에 이식하고, 복수(腹水)를 회수하였다. 복수로부터 모노클로날 항체를 통상적인 방법에 따라서 프로테인 A 칼럼 r 프로테인 A 세파로스 퍼스트 플로우 (rProtein A Sepharose Fast Flow, 아마샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하여 정제하였다. 하이브리도마 AM92.3 로부터 얻어진 모노클로날 항체를 KTM-302 항체, 하이브리도마 7G7/B6 로부터 얻어진 모노클로날 항체를 KTM-303 항체로 하였다.
참고예 2 sIL-2R 의 조제
동결 보존된 sIL-2R 을 분비 발현함이 알려져 있는 림포머 세포주 U937 (다이닛폰 제약 주식회사 제조) 를 37℃ 의 수욕에서 빠르게 해동하고, 15mL 멸균 튜브로 옮겨 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM 을 10mL 첨가하여, 천천히 현탁하였다. 이것을 실온에서 5 분간 원심 분리 (1200rpm) 한 후, 상청을 흡인 제거하였다. 잔사에 동 배지를 10mL 첨가하여 현탁시킨 세포 현탁액을 25㎠T 플라스크에 전량 옮기고, 탄산 가스 배양 장치 (5% CO2, 37℃) 에서 2∼3일간 배양하였다. 그 후, 150㎠T 플라스크, 225㎠T 플라스크로 순차 확대 배양하였다. 225㎠T 플라스크 내에서 세포가 100% 컨플루언트해진 것을 확인한 후, 배양 상청을 멸균된 용기에 회수하고, 4℃ 에서 10 분간 원심 분리 (1200rpm) 하였다. 원심 분리에 의해 얻어진 상청을 멸균된 용기로 옮겨, 15 분간 천천히 교반한 후, 0.2㎛ 필터로 여과 처리한 것을 sIL-2R 의 표준 물질로 하였다.
또, 문헌 [J. Immunol., 135, 3172-3177 (1985)]에 기초하여, 10% IL-2 로 4 일간 자극한 정상 인간 IL-2 의존성 T 세포의 무세포 배양 상청 (무희석) 중에 함유되는 sIL-2R 의 양을 1000U/mL 로 하여, 표준 물질의 값을 매겼다.
참고예 3 항 sIL-2R 모노클로날 항체를 고정화한 고상의 조제
KTM-302 항체를 최종농도 4㎍/mL 가 되도록 PBS 로 희석하고, 고상용의 96 웰 마이크로 타이터 플레이트의 각 웰에 100μL 씩 첨가하였다. 실온에서 하룻밤 정치 후, 블로킹액 [1% BSA, 5% 수크로오스, 0.05% 트윈 20, 0.01% 겐타마이신 황산염을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.2]로 세정하고, 블로킹액을 200μL 를 첨가하고 실온에서 하룻밤 정치하여 블로킹하였다. 블로킹액을 제거한 후, 진공 건조기로 3 일간 건조시켜, 항 sIL-2R 모노클로날 항체 고정화 고상 (플레이트) 을 조제하였다.
실시예 1
(1) POD 표지화 항 sIL-2R 모노클로날 F(ab')2 항체의 제작
참고예 1 에서 조제한 KTM-303 항체를 0.01% 펩신으로 소화시킨 후, G3000SW 칼럼 (토소사 제조; φ21.5㎜×60㎝) 을 사용한 HPLC 시스템 (히타치 제작소사 제조) 에 의해 F(ab')2 를 분리 정제하였다. 얻어진 F(ab')2 4㎎ 을 100m㏖/L 붕산 완충액 (pH 8.0) 으로 투석하였다.
그 항 sIL-2R 모노클로날 F(ab')2 항체와 POD (토요 방적사 제조) 를 아래와 같이 말레이미드법에 의해 결합시켰다.
즉, 그 F(ab')2 를 이미노티올란을 사용하여 술프히드릴화하여, 세파덱스 G-25 칼럼 (아마샴 바이오사이언스사 제조) 에 의해 미반응 이미노티올란을 제거하였다. POD 는, 말레이미드화 시약 EMCS 를 사용하여 말레이미드화하고, 세파덱스 G-25 칼럼에 의해 미반응 EMCS 를 제거하였다. 상기 서술한 술프히드릴화한 그 F(ab')2 모노클로날 항체와 말레이미드화한 POD 를 혼합하여, 30℃ 에서 30 분간 반응시키고, POD 표지화 항 sIL-2R 모노클로날 F(ab')2 항체를 제작하였다.
(2) 겔 여과 칼럼 크로마토그래피에 의한 POD 표지화 항 sIL-2R 모노클로날 F(ab')2 항체의 분리
F(ab')2 항체의 분자량은 약 92kDa, POD 의 분자량은 약 44kDa 이다. 따라서, 그 항체와 POD 의 결합수가 1:1 인 효소 표지화 항체의 분자량은 약 136kDa, 1:2 인 것은 약 180kDa, 1:3 인 것은 약 224kDa, 1:4 인 것은 약 268kDa, 1:5 인 것은 약 312kDa, 2:1 인 것은 약 228kDa, 2:2 인 것은 약 272kDa, 2:3 인 것은 약 316kDa, 3:1 인 것은 약 320kDa 로 계산된다.
상기 (1) 에 기재된 방법으로 조제한 표지화 항체를, G3000SW 칼럼 (토소사 제조; φ21.5㎜×60㎝) 를 사용한 HPLC 시스템 (히타치 제작소사 제조) 에 의해 분획하였다. 0.1㏖/L 인산 완충액 (pH 7.4) 을 이동상으로 하여 유속 3mL/분, 실온에서 HPLC 를 실시하였다. 프랙션의 회수는 3mL/프랙션으로 실시하였다. 또 분자량 마커는 고분자량 겔 여과 교정용 키트 (HMW Gel Filtration Calibration Kit, 아마샴 바이오사이언스사 제조) 및 저분자량 겔 여과 교정용 키트 (LMW Gel Filtration Calibration Kit, 아마샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하였다.
각 프랙션의 280㎚ 에서의 흡광도를 측정한 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 에 나타내는 바와 같이 1) 프랙션 33, 2) 프랙션 40, 3) 프랙션 43, 4) 프랙션 48, 5) 프랙션 52 에 흡광도의 피크가 확인되었다.
분자량 마커와의 비교에 의해 추정된 상기의 흡광도의 피크를 나타낸 각 프랙션의 분자량은, 각각 1) 250kDa 이상, 2) 약 170kDa, 3) 약 140kDa, 4) 약 100kDa, 5) 약 40kDa 였다. 따라서, 1) 프랙션 33 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 가 중합화한 표지화 항체, 2) 프랙션 40 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 1 분자에 POD 2 분자가 결합한 표지 항체, 3) 프랙션 43 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 1 분자에 POD 1 분자가 결합한 표지 항체, 4) 프랙션 48 에는, 미반응 F(ab')2 가, 5) 프랙션 52 에는, 미반응 POD 가 함유되는 것으로 추측된다.
(3) SDS-PAGE 에 의한 각 프랙션 중의 효소 표지화 항체의 동정
상기 (2) 에서 얻어진 프랙션 32∼52 의 각 프랙션에 관해서, 각각의 프랙션 유래의 단백량이 2∼3㎍/레인이 되도록 전기 영동용 샘플을 조제하였다. 이 샘플에 SDS-PAGE 용 샘플 버퍼 [8% SDS (와코 쥰야쿠 공업사 제조), 24% 2-메르캅토에탄올 (나카라이테스크사 제조), 및 40% 글리세롤 (칸토 화학사 제조) 을 함유하는 1㏖/L Tris 완충액, pH 6.8] 를 1/4 량 첨가하고, 95℃ 에서 5 분간 가열하였 다. 열 처리한 샘플을 SDS-PAGE 용 겔 [파젤 SPG-520L (아토사 (ATTO Corporation) 제조)]에 20μL/레인으로 어플라이하고, 겔 1 장 당 20mA 로 전기 영동을 실시하여, 통상적인 방법에 따라서 밴드를 검출하였다. 또, 분자량 마커는 프레스테인드 브로드 레인지[Prestained Broad Range, Bio-Rad 사 제조, 250kDa, 150kDa, 100kDa, 75kDa, 50kDa, 37kDa, 25kDa, 16kDa, 10kDa]를 사용하였다.
SDS-PAGE 에서 얻어진 밴드의 위치와 분자량 마커로부터, 프랙션 32∼35 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:5, 2:3, 3:1 등의 고중합체인 효소 표지화 항체의 혼합물 (밴드는 스미어 형상으로 관찰되었다), 프랙션 36 중의 효소 표지화 항체는 F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:4 및 2:2 인 효소 표지화 항체, 프랙션 37 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:4, 1:3, 2:1 및 2:2 인 효소 표지화 항체의 혼합물로 동정되었다.
마찬가지로, 프랙션 38 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체의 혼합물, 프랙션 39 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체의 혼합물, 프랙션 40∼41 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 1:2 인 효소 표지화 항체, 프랙션 42 중의 효소 표지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 각각 1:2 및 1:1 인 효소 표지화 항체의 혼합물, 프랙션 43∼46 중의 효소 표 지화 항체는, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 1:1 인 효소 표지화 항체로 동정되었다.
또한, 프랙션 47 중의 단백질은, F(ab')2 와 POD 의 결합수가 1:1 인 효소 표지화 항체와 미반응 F(ab')2 의 혼합물, 프랙션 48∼51 중의 단백질은, 미반응 F(ab')2, 프랙션 52 중의 단백질은 미반응 POD 로 동정되었다.
(4) 각 프랙션 중의 효소 표지화 항체를 사용하는 sIL-2R 의 정량용 검량선의 작성
참고예 3 에서 조제한 고상화 플레이트에, 0U/mL, 200U/mL, 400U/mL, 1600U/mL, 3200U/mL, 6400U/mL 의 sIL-2R 을 함유하는 표준 물질 용액 (150m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스 및 0.01% 바이오에이스를 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.5) 을 각 웰에 50μL 씩 첨가하였다. 효소 표지화 항체 희석액 [150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100㎍/mL 마우스 IgG, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD (로슈 다이아그노스틱사 제조) 를 함유하는 100m㏖/L 의 아세트산 완충액, pH 6.0] 을 사용해서 상기 (2) 의 각 프랙션 중의 표지화 항체를 희석하여 조제한 표지화 항체 용액 (24∼140ng/mL) 을 각 웰에 50μL 씩 첨가하고, 수평 회전 진탕기를 사용하여 실온에서 90 분간 진탕하였다 (140∼160rpm). 세정액 (150m㏖/L 염화나트륨, 0.05% 트윈 20 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 6.8) 으로 각 웰을 세정한 후, OPD 용액 [2㎎/mL OPD, 0.75g/L 우레아과산화 수소염, 0.01% 프로클린 300 을 함유하는 100m㏖/L 인산-시트르산 완충액, pH 4.4]을 각 웰에 100μL 씩 첨가하여, 실온에서 30 분간, 정치 반응시켰다. 반응 정지액으로서 1㏖/L 황산을 50μL 첨가하여, 반응액의 흡광도를 주파장 490㎚, 부파장 660㎚ 에서 측정하였다. 항원 농도와 흡광도로부터 각 프랙션의 표지화 항체별로 검량선을 작성하였다.
(5) POD 표지 항 sIL-2R 모노클로날 항체를 사용한 시료 중의 sIL-2R 의 측정
시료로서, HAMA 혈청 타입 I (Lot.92069721), HAMA 혈청 타입 II (Lot.14482684) 및 정상인 혈청 (Lot.101001-2) 50μL 를 사용하여, 각 혈청 시료 중의 sIL-2R 을 상기 (2) 의 각 프랙션의 표지화 항체를 사용하여 상기 (4) 에 기재된 방법으로 측정하였다. sIL-2R 측정치 (U/mL) 를 표 1 에 나타낸다.
프랙션 번호 sIL-2R 측정치 (U/mL)
HAMA 혈청 타입 I HAMA 혈청 타입 II 정상인 혈청
32 16142 1005 230
33 3688 259 270
34 1881 196 266
35 1502 176 290
36 913 158 280
37 662 144 284
38 508 144 284
39 435 135 311
40 367 142 310
41 326 129 321
42 272 133 322
43 287 134 325
44 301 134 332
45 310 137 322
46 286 148 346
항체와 효소의 결합수가 각각 1:5, 2:3, 3:1 등을 함유하는 고중합체인 효소 표지화 항체인 프랙션 32∼35 에서는 HAMA 혈청 타입 I 에서의 sIL-2R 의 측정치가 1000U/mL 를 초과하고 있고, 특히 고중합화되어 있다고 생각되는 프랙션 32 는 약 16000U/mL 로 높은 값이었다. 또한, 항체와 효소의 결합수가 1:4 또는 2:2 로 동정된 프랙션 36 도 상당한 높은 값을 나타내었다.
그러나, 항체와 효소의 결합수가 각각 1:3, 2:1, 1:2 및 1:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 함유하는 것으로 동정된 프랙션 38 내지 46 중의 효소 표지화 항체에서는, 대략 500U/mL 이하로 HAMA 혈청 타입 I 의 비특이 반응이 억제되는 것이 개시되었다.
특히, F(ab')2 1 분자에 POD 2 분자가 결합한 효소 표지화 항체를 함유하는 프랙션 40 내지 F(ab')2 1 분자에 POD 1 분자가 결합한 효소 표지화 항체를 함유하는 프랙션 46 부근에서 약 300U/mL 로 평형 상태가 되었다.
이들의 결과로부터, 항체 1 분자 당 소수의 표지 효소 분자가 결합하고 있는 효소 표지화 항체, 바람직하게는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체, 보다 바람직하게는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체, 특히 바람직하게는, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 사용함으로써 HAMA 혈청 타입 I 에 강하게 관찰되는 비특이 반응이 효과적으로 억제되는 것이 개시되었다.
실시예 2
HAMA 비특이 반응에 있어서의 마우스 IgG 의 효과
HAMA 에 의한 비특이적 반응의 억제에 미치는 마우스 IgG 의 첨가 효과를 검토하였다. 실시예 1 에서 조제한 프랙션 40∼46 중의 효소 표지화 항체를 효소 표지 항체 희석액 [150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 마우스 IgG, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액, 0.16㎍/mL POD (로슈 다이아그노스틱사 제조) 를 함유하는 75m㏖/L MES 완충액 (pH 6.5)]으로 희석하여, 마우스 IgG 농도를 각각 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200㎍/mL 가 되도록 조제하였다.
HAMA 혈청 타입 I (Lot.92069721), HAMA 혈청 타입 II (Lot.14482684) 및 정상인 혈청 (Lot.101001-2) 각 50μL 를 사용하여, 각 혈청 중의 sIL-2R 활성을 실시예 1(5) 와 동일한 방법으로 측정하였다.
결과를 표 2 에 나타낸다.
마우스 IgG 농도 sIL-2R 측정치 (U/mL)
HAMA 혈청 타입 I HAMA 혈청 타입 II 정상인 혈청
0 452 9063 351
20 458 437 333
40 456 338 336
60 452 296 327
80 403 268 320
100 405 264 334
200 400 268 345
마우스 IgG 이 첨가되어 있지 않을 때의 HAMA 혈청 타입 II 의 측정치는 9000U/mL 이상으로 HAMA 에 의한 비특이 반응이 발생되어 있지만, 마우스 IgG 을 20㎍/mL 첨가함으로써 HAMA 에 의한 비특이 반응이 억제되어, 437U/mL 까지 저하되었다. 그러나, 추가로 마우스 IgG 을 첨가함으로써 HAMA 혈청의 측정치가 저하되고, 80㎍/mL 이상의 첨가에 의해 sIL-2R 값은 평형에 도달하였다. HAMA 혈청 타입 I 에서도 80㎍/mL 에서 측정치가 평형에 도달하였지만, HAMA 혈청 타입 II 의 경우과 같은 큰 변화는 보이지 않았다. 또한, 정상인 혈청의 측정치는 마우스 IgG 농도에 의존하지 않고 일정하다는 것에서, 마우스 IgG 의 첨가는 200㎍/mL 까지 측정계에 영향을 미치지 않음이 확인되었다. 이들 결과로부터, 마우스 IgG 을 80㎍/mL 이상 첨가함으로써 HAMA 혈청 타입 II 에 의한 비특이 반응을 충분히 억제할 수 있음이 판명되었다. HAMA 혈청 타입 I 에서도 억제 효과는 확인되었다.
실시예 3
HAMA 비특이 반응에 있어서의 고중합화 마우스 IgG 의 효과 및 고중합화 마우스 IgG 의 지적 (至適) 농도의 검토
HAMA 에 의한 비특이적 반응의 억제에 미치는 고중합화 마우스 IgG 의 첨가를 검토하였다. 실시예 1 에서 조제한 프랙션 40∼46 중의 효소 표지화 항체를 효소 표지 항체 희석액 [150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100㎍/mL 마우스 IgG, 고중합화 마우스 IgG, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD (로슈 다이아그노스틱사 제조) 를 함유하는 75m㏖/L MES 완충액, pH 6.5]으로 희석하였다. 중합화 마우스 IgG 으로서 MAK33-IgG1/IgG1 Poly 를 사용한 경우에는, 그 농도가 각각 0, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300㎍/mL 가 되도록 효소 표지화 항체 용액을 조제하였다. 중합화 마우스 IgG 으로서 MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Poly 를 사용한 경우에는, 그 농도가 각각 0, 5, 50, 100㎍/mL 의 농도가 되도록 효소 표지화 항체를 조제하였다.
HAMA 혈청 타입 I (Lot.90643629), HAMA 혈청 타입 II (Lot.92069831) 및 정상인 혈청 (Lot.101001-2) 각 50μL 를 사용하여, 각 혈청 중의 sIL-2R 을 실시예 1(5) 와 동일한 방법으로 측정하였다.
MAK33-IgG1/IgG1 Poly 의 첨가 효과를 표 3 에 나타낸다.
MAK33-IgG1/IgG1 Poly (㎍/mL) sIL-2R 측정치 (U/mL)
HAMA I HAMA II 정상인 혈청
0 435 281 340
75 285 270 339
100 268 257 317
125 248 247 331
150 241 247 329
175 237 247 329
200 227 229 324
300 217 224 322
그 결과, 표 3 에 나타내는 바와 같이, MAK33-IgG1/IgG1 Poly 미첨가 상태에서의 HAMA 혈청 타입 I 중의 sIL-2R 의 측정치는 435U/mL 이지만, MAK33-IgG1/IgG1 Poly 의 첨가 농도 의존적으로 측정치가 저하되고, 첨가 농도 125㎍/mL 이상에서 sIL-2R 의 측정치가 거의 일정해졌다.
또한, MAK33-IgG1/IgG1 Poly 를 300㎍/mL 까지 첨가하더라도 정상인 혈청의 측정치가 변동하고 있지 않아, 300㎍/mL 까지의 MAK33-IgG1/IgG1 Poly 첨가는 측정계에 영향을 미치지 않음이 확인되었다.
이들의 결과로부터, 효소 표지화 항체 용액에 MAK33-IgG1/IgG1 Poly 를 125㎍/mL 이상 첨가함으로써 HAMA 혈청 타입 I 에 의한 비특이 반응을 충분히 억제할 수 있음이 판명되었다.
또한, MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Poly 의 첨가 효과를 표 4 에 나타낸다.
MAK33-IgG(2b)/Fab(2a)Poly (㎍/mL) sIL-2R 측정치 (U/mL)
HAMA I HAMA II 정상인 혈청
0 556 176 343
5 516 175 355
50 348 175 356
100 235 171 345
표 4 에 나타낸 바와 같이, MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Poly 를 MAK33-IgG1/IgG1 Poly 대신에 사용한 경우라도, 마찬가지로 HAMA 혈청 타입 I 중의 sIL-2R 의 측정치가 저하되었다.
이것으로부터, IgG1 뿐만 아니라, 그 밖의 서브 타입의 IgG 중합체를 첨가하는 것에 의해서도 HAMA 혈청 타입 I 에 의한 비특이 반응을 억제할 수 있음이 판명되었다.
실시예 4
HAMA 혈청 검체 중의 sIL-2R 의 측정 (1)
실시예 1 에서 조제한 프랙션 40∼46 의 효소 표지화 항체를 표지화 항체 희석액 (150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100㎍/mL 마우스 IgG, 200㎍/mL MAK33-IgG1/IgG1 Poly, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD 를 함유하는 75m㏖/L MES 완충액, pH 6.5) 에 의해 희석하여 조제한 효소 표지화 항체 용액을 사용하고, 실시예 1(5) 의 방법과 동일하게 하여, HAMA 혈청 타입 I (Lot.90643637) 및 HAMA 혈청 타입 II (Lot.92069840) 중의 sIL-2R 을 측정하였다. 이하, 상기에서 조제한 효소 표지화 항체 용액, 및 실시예 1(4) 에 기재된 방법에서 사용하는 효소 표지화 항체 용액 이외의 시약 (참고예 3 에서 조제한 고상화 플레이트, 실시예 1(4) 의 표준 물질 용액, 세정액, OPD 용액 및 반응 정지액) 을 일괄하여 「실시예 4 의 시약」이라고 부른다. 이하에 실시예 4 의 시약의 조성을 기재한다.
실시예 4 의 시약
항 sIL-2R 항체 고정화 플레이트: 4㎍/mL KTM-302 항체를 100μL/웰로 고상화한 8 웰×12 스트립의 96 웰 마이크로 타이터 플레이트
표준 물질 용액: 0U/mL, 200U/mL, 400U/mL, 1600U/mL, 3200U/mL, 6400U/mL 의 sIL-2R 을 각각 함유하는 표준 물질 용액 (150m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스 및 0.01% 바이오에이스를 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.5)
효소 표지화 항체 용액: 소정량 (24∼140 ng/mL) 의 실시예 1 의 프랙션 40∼46 의 POD 표지화 항체를 함유하는 표지화 항체 희석액 (150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100㎍/mL 마우스 IgG, 200㎍/mL MAK33-IgG1/IgG1 Poly, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD 를 함유하는 75m㏖/L MES 완충액, pH 6.5)
세정액: 150m㏖/L 염화나트륨, 0.05% 트윈 20 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 6.8
OPD 용액: 2㎎/mL OPD, 0.75g/L 우레아과산화 수소염, 0.01% 프로클린 300 을 함유하는 100m㏖/L 인산-시트르산 완충액, pH 4.4
반응 정지액: 1㏖/L 황산
또한, 따로 이뮤라이즈 IL-2R (DPC 사 제조) 을 사용한 각 혈청 중의 sIL-2R 의 측정도 실시하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
시약 sIL-2R 측정치 (U/mL)
HAMA 혈청 타입 I HAMA 혈청 타입 II
이뮤라이즈 IL-2R 408 906
실시예 4 의 시약 200 219
그 결과, 이뮤라이즈 IL-2R 의 키트를 사용한 측정보다도, HAMA 혈청 중의 sIL-2R 가 낮아, HAMA 의 비특이 반응을 충분히 억제되어 있음이 시사되었다.
실시예 5
HAMA 를 함유하는 검체의 sIL-2R 의 측정 (2)
정상인 혈청에 HAMA 혈청을 양을 변경해서 첨가한 검체의 sIL-2R 을 측정하여, HAMA 의 농도가 측정치에 미치는 영향을 조사하였다.
우선, 검체의 조제에 사용하는 HAMA 혈청 타입 I (Lot.90643656), HAMA 혈청 타입 II (Lot.92069858) 및 정상인 혈청 (F41489B) 을 시료로 하여, 각 시료의 sIL-2R 을 실시예 4 의 시약을 사용하여 측정하고, 또한 HAMA 를 HAMA 측정용 샌드위치 ELISA 키트인 이뮤스트립 HAMA 프래그먼트 (ImmuSTRIP HAMA Fragment) [이뮤노메딕 (Immunomedics) 사 제조]를 사용하여 측정하였다. 각각의 측정 결과, 및 검체의 조제에는 5 배로 농축한 HAMA 혈청 (이하, 5×HAMA 혈청이라고 부른다) 을 사용하기 때문에, 5×HAMA 혈청의 sIL-2R 및 HAMA 농도의 이론치 (이론치=측정치×5) 를 표 6 에 나타내었다.
시료 sIL-2R (U/mL) HAMA (㎍/mL)
측정치 5×HAMA 혈청의 이론치 측정치 5×HAMA 혈청의 이론치
HAMA 혈청 타입 I 260.5 1302.7 26.1 130.5
HAMA 혈청 타입 II 275.5 1377.7 12.5 62.5
정상인 혈청 266.0 - 0.0 -
5×HAMA 혈청 (타입 I 또는 타입 II) 과 정상인 혈청을 1:1, 1:2 및 1:4 로 각각 혼합한 것을 시료로 하여, 각 시료의 sIL-2R 을 실시예 4 의 시약 및 이뮤라이즈 IL-2R 을 사용하여 측정하였다. 한편, 상기에서 구한 5×HAMA 혈청 및 정상인 혈청의 sIL-2R 농도와 시료 혈청의 혼합비로부터 계산되는, 각 시료의 sIL-2R 의 이론치를 구하고, 다시 각 시료의 sIL-2R 의 이론치에 대한 측정치의 비로부터 측정치에 대한 영향률 (%) 을 구하였다. 각 시료의 HAMA 의 농도도 sIL-2R 의 이론치와 동일한 방법으로 계산에 의해 구하였다.
5×HAMA 혈청과 정상인 혈청의 혼합비가 1:a 인 경우의 sIL-2R 의 이론치
= (5×HAMA 혈청의 sIL-2R 농도 (이론치) ＋ 정상인 혈청의 sIL-2R 농도×a)/(1 ＋ a)
영향률 (%) = [(sIL-2R 농도의 측정치/sIL-2R 농도의 이론치)×100]－100
표 7 에 실시예 4 의 시약을 사용한 경우, 표 8 에 이뮤라이즈 IL-2R 을 사용한 경우 각각의, 각 시료 중의 HAMA 의 농도, sIL-2R 농도의 이론치와 측정치, 영향률을 나타내었다.
실시예 4 의 시약에 의한 측정
시료 sIL-2R
HAMA 혈청 혈청의 혼합비 5×HAMA:정상인 HAMA (㎍/mL) 이론치 (U/mL) 측정치 (U/mL) 측정치에 대한 영향률
HAMA 혈청 타입 I 1:4 26.1 473.3 514.1 8.6%
1:2 43.5 611.6 660.4 8.0%
1:1 65.3 784.3 837.0 6.7%
HAMA 혈청 타입 II 1:4 12.5 488.3 511.5 4.7%
1:2 20.8 636.6 663.0 4.2%
1:1 31.1 821.9 847.3 3.1%
이뮤라이즈 IL-2R 에 의한 측정
시료 sIL-2R
HAMA 혈청 혈청의 혼합비 5×HAMA:정상인 HAMA (㎍/mL) 이론치 (U/mL) 측정치 (U/mL) 측정치에 대한 영향률
HAMA 혈청 타입 I 1:4 26.1 504.5 709.0 40.5%
1:2 43.5 637.6 890.0 39.6%
1:1 65.3 803.8 1040.0 29.4%
HAMA 혈청 타입 II 1:4 12.5 519.5 1150.0 121.3%
1:2 20.8 662.6 1630.0 146.0%
1:1 31.1 841.4 2200.0 161.5%
HAMA 혈청 타입 I 에 관해서, 실시예 4 의 시약으로 측정한 경우에는, HAMA 농도가 65.3㎍/mL (시판 HAMA 혈청 타입 I 에 함유되는 HAMA 의 2.5배) 까지 상승해도 측정치에 대한 영향률은 10% 이하이지만, 이뮤라이즈 IL-2R 로 측정한 경우에는 측정치에 대한 영향률이 30∼40% 로 HAMA 의 영향을 받는 것이 판명되었다. 또한, HAMA 혈청 타입 II 에 관해서, 실시예 4 의 시약으로 측정한 경우에는, HAMA 농도가 31.1㎍/mL (시판 HAMA 혈청 타입 II 에 함유되는 HAMA 의 2.5배) 까지 상승해도 측정치에 대한 영향률은 5% 이하이지만, 이뮤라이즈 IL-2R 로 측정한 경우에는 측정치에 대한 영향률이 120∼160% 로 HAMA 의 영향을 크게 받는 것이 판명되었다. 이들의 결과로부터도, 이뮤라이즈 IL-2R 에서는 HAMA 에 의한 비특이 반응의 억제가 불충분하지만, 실시예 4 의 시약은 HAMA 에 의한 비특이 반응을 충분히 억제할 수 있음이 시사되었다.
실시예 6
sIL-2R 측정 키트
하기의 각 시약으로 이루어지는 시약 키트를 구성하였다.
1) 항 sIL-2R 항체 고정화 플레이트
4㎍/mL KTM-302 항체를 100μL/웰로 고상화한 8 웰×12 스트립의 96 웰 마이크로 타이터 플레이트
2) 효소 표지화 항체
조성: 소정량 (24∼140ng/mL) 의 실시예 1 의 프랙션 40∼46 의 POD 표지화 항체를 함유하는 표지화 항체 희석액 (150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100㎍/mL 마우스 IgG, 200㎍/mL MAK33-IgG1/IgG1 Poly, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD 를 함유하는 75m㏖/L MES 완충액, pH 6.5)
용량: 6mL/병
3) 표준 물질
0U/mL, 200U/mL, 400U/mL, 1600U/mL, 3200U/mL, 6400U/mL 의 sIL-2R 을 각각 함유하는 표준 물질 용액 (150m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스 및 0.01% 바이오에이스를 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.5) 0.5mL/바이알 상당의 동결 건조품
4) 검체 희석액
조성: 150m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스, 0.2% 프록셀 GXL 및 20㎍/mL 마우스 IgG 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액 (pH 7.45)
용량: 6mL/병.
5) 발색 기질
OPD 타블렛 (시그마 알드리치사 제조) 10㎎/정×6
6) 발색 기질 용해액
조성: 0.75g/L 우레아과산화 수소염 및 0.1% 프로클린 300 을 함유하는 100m㏖/L 인산-시트르산 완충액 (pH 4.4)
용량: 30mL/병
7) 반응 정지액
조성: 1㏖/L 황산
용량: 6mL/병
8) 세정액
150m㏖/L 염화나트륨 및 0.05% 트윈 20 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액 (pH 6.8)
실시예 7
POD 에 반응하는 항체에 기인하는 비특이 반응의 억제
(1) HAMA 이외의 원인에 의한 비특이 반응을 나타내는 검체
인간의 혈청인 검체 A 를, 검체 희석액 (50m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스, 0.2% 프록셀 GXL 및 20㎍/mL 마우스 IgG 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.45) 으로 1/1, 1/4, 1/8 로 희석하고, 각각의 sIL-2R 의 농도를 실시예 4 의 시약으로 측정하였다. 표 9 에, 측정치 및 측정치와 희석률로부터 구한 검체 원액의 sIL-2R 의 계산치를 나타내었다. 검체 원액의 sIL-2R 계산치가 희석률에 따라서 달라, 희석 직선성이 불량하고, 비특이 반응이 발생되고 있음이 판명되었다.
희석률 sIL-2R 측정치 (U/mL) 검체 원액의 sIL-2R 계산치 (U/mL)
1/1 11794 11794
1/4 2169 8676
1/8 486 3888
검체 A 의 비특이 반응의 원인이 HAMA 인지 여부를 확인하기 위해, 검체 A 에 함유되는 HAMA 의 농도를, HAMA 측정 키트인 HAMA ELISA (로슈 다이아그노스틱사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 결과를 표 10 에 나타내었는데, HAMA 혈청 타입 I, HAMA 혈청 타입 II 에서는 고농도의 HAMA 가 검출되었지만, 검체 A 의 HAMA 값은 정량 한계인 5ng/mL 를 하회하고 있어, HAMA 의 존재가 부정되었다. 따라서, 검체 A 의 비특이 반응은 HAMA 이외의 원인에 의한 것으로 생각되었다.
시료 HAMA 측정치 (ng/mL)
검체 A 3.5
HAMA 혈청 타입 I 3603
HAMA 혈청 타입 II 18033
(2) 검체 A 의 비특이 반응의 억제
검체 A 를 검체 희석액에 의해 1/2, 1/4, 1/6, 1/11, 1/21, 1/31 로 희석하고, 이하에 나타내는 구성으로 이루어지는, 과요오드산법에 의해 표지된 POD 표지 항체를 사용한 sIL-2R 측정 시약 (이하, sIL-2R 측정 시약 B라고 부른다) 을 사용하여 sIL-2R 을 측정하고, 측정치와 희석률로부터 검체 원액의 sIL-2R 의 계산치를 구하였다. 또, sIL-2R 측정 시약 B 는 효소 표지화 항체 용액 이외에는 실시예 4 의 시약과 동일한 구성이며, 그 POD 표지 항체는, 겔 여과에 의한 항체의 분리는 되어 있지 않다.
sIL-2R 측정 시약 B
항 sIL-2R 항체 고정화 플레이트: 4㎍/mL KTM-302 항체를 100μL/웰로 고상화한 8 웰×12 스트립의 96 웰 마이크로 타이터 플레이트
표준 물질 용액: 0U/mL, 200U/mL, 400U/mL, 1600U/mL, 3200U/mL, 6400U/mL 의 sIL-2R 을 각각 함유하는 표준 물질 용액 (150m㏖/L 염화나트륨, 4% BSA, 1% 수크로오스 및 0.01% 바이오에이스를 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.5)
효소 표지화 항체 용액: 소정량 (24∼140ng/mL) 의 과요오드산법에 의해 표지된 POD 표지화 항체를 함유하는 표지화 항체 희석액 (150m㏖/L 염화나트륨, 10% FBS, 0.2% NP-40, 20㎍/mL 마우스 IgG, 0.2% 프록셀 GXL, 10% POD 안정화 완충액 및 0.16㎍/mL POD 를 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 7.5)
세정액: 150m㏖/L 염화나트륨, 0.05% 트윈 20 을 함유하는 10m㏖/L 인산 완충액, pH 6.8
OPD 용액: 2㎎/mL OPD, 0.75g/L 우레아과산화 수소염, 0.01% 프로클린 300 을 함유하는 100m㏖/L 인산-시트르산 완충액, pH 4.4
반응 정지액: 1㏖/L 황산
한편, 검체 A 를 마우스 혈청에 의해 1/2, 1/4, 1/8 로 희석하고, 실시예 4 의 시약을 사용하여 sIL-2R 의 측정을 실시하는 비특이 반응 흡수 시험의 결과, 검체 A 에 함유되는 sIL-2R 의 이론치는 3624U/mL 로 계산되었다. 상기 및 (1) 의 실시예 4 의 시약을 사용한 경우의 각 희석률에서의 검체 원액의 sIL-2R 의 계산치에 관해서 이론치 3624U/mL 에 대한 비를 구하여, sIL-2R 측정치, 검체 원액의 sIL-2R 계산치와 함께, 표 11 (실시예 4 의 시약을 사용한 경우) 및 표 12 (sIL-2R 측정 시약 B 를 사용한 경우) 에 나타내었다.
희석률 측정치 검체 원액의 sIL-2R 계산치 (U/mL) 계산치의 이론치 3624U/mL 에 대한 비 (%)
1/2 11794 11794 325
1/4 2169 8676 239
1/8 486 3888 107
희석률 측정치 검체 원액의 sIL-2R 계산치 (U/mL) 계산치의 이론치 3624U/mL 에 대한 비 (%)
1/1 10657 21314 588
1/4 8623 34492 952
1/6 1233 7398 204
1/11 413 4543 125
1/21 177 3717 103
1/31 119 3689 98
동일한 희석률 1/4 의 검체의 측정치로 비교한 경우, 실시예 4 의 시약과 비교하여 sIL-2R 측정 시약 B 에서의 측정치는 약 4 배의 값을 나타내었다. 또한, 실시예 4 의 시약은 1/8 의 희석률에서 비특이 반응의 영향이 거의 없어지는 데에 반하여, sIL-2R 측정 시약 B 에서는, 1/11 의 희석률이라도 이론치에 대하여 125% 의 값의 비특이 반응이 관찰되어, 거의 비특이 반응의 영향을 없애기 위해서는 1/21∼1/31 의 희석이 필요하였다. 일반적으로, 과요오드산법에 의해 항체와 효소를 결합시키면, 중합화한 하이콘쥬게이트인 표지 항체가 되는 것이 보고되어 있다 (이시카와 에이지 저 「효소 면역 측정법」 1987년, 의학서원 발행). 따라서, sIL-2R 측정 시약 B 에서 사용하고 있는 과요오드산법에 의해 표지된 POD 표지 항체는, 항체와 POD 의 결합수가 1:4 나 1:5 와 같이 항체 1 분자당 POD 결합수가 높은 것이나, 항체와 POD 의 결합수가 2:2, 2:3 및 3:1 과 같은 항체가 중합한 것이 포함되어 있는 것으로 생각된다.
이상으로부터, 실시예 1 의 프랙션 40∼46 의 POD 표지화 항체, 즉 항체와 POD 의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 POD 표지 항체를 사용한 실시예 4 의 시약은, HAMA 이외의 원인에 의한 비특이 반응에 대해서도 효과적으로 억제함이 나타났다.
(3) 검체 A 의 비특이 반응에 있어서의 불활성화한 퍼옥시다아제의 효과
200㎍/mL MAK33-IgG Poly 또는 400㎍/mL Inactive Poly-POD 를 첨가한 효소 표지화 항체 희석액을 사용한 실시예 4 의 시약에 의해, 1/4 희석한 검체 A 및 컨트롤 혈청 II (인간 정상인 혈청에 sIL-2R 을 첨가한 것) 의 sIL-2R 을 측정하였다. 대조로서 실시예 4 의 시약으로도 측정을 실시하였다. 결과를 표 13 에 나타내었다. 또, 컨트롤 혈청 II 에 함유되는 sIL2-R 은 sIL-2R 측정 시약 B 에 의한 측정에서 2154U/mL 이고, 1/4 로 희석한 검체 A 의 sIL2-R 의 이론치는 906U/mL (3624U/mL×1/4) 로 계산되었다.
표지화 항체 희석액 sIL-2R 측정치 (U/mL)
1/4 희석 검체 A 컨트롤 혈청 II
실시예 4 의 시약 2022 2213
＋MAK33-IgG Poly 1034 2176
＋Inactive Poly-POD 736 2276
sIL-2R 이론치 906 2154
실시예 4 의 시약에, 200㎍/mL MAK33-IgG Poly 또는 400㎍/mL inactive Ploy-POD 를 첨가해도 컨트롤 혈청 II 의 측정치가 변화하지 않는 것으로부터, 측정계에 대한 영향은 없는 것으로 생각되었다.
1/4 로 희석한 검체 A 의 실시예 4 의 시약에 의한 sIL-2R 측정치는 2022U/mL 로, 이론치와 비교하면 비특이 반응이 인정되지만, 표지화 항체 희석액에 MAK33-IgG Poly 또는 Inactive Poly-POD 를 첨가함으로써 이론치 부근까지 측정치가 저하되어, 비특이 반응이 더욱 억제되어 있었다. 특히, Inactive Poly-POD 를 첨가하는 것에 의해 비특이 반응이 거의 완전히 억제되어 있다는 것으로부터, POD 와 반응하는 항체에 기인하는 비특이 반응이 존재하고 있음이 판명되었다. 실시예 4 의 시약은, 검체 A 의 비특이 반응, 즉 POD 에 반응하는 항체에 기인하는 비특이 반응을 억제할 수 있고, 또한 불활성화한 POD 를 공존시킴으로써, 항 POD 항체에 기인하는 비특이 반응을 충분히 억제할 수 있었다.
본 발명에 의해, 병태 모니터링이나 질환의 진단 등에 유용한 시료 중의 측정 대상물의 면역학적 정량 방법 및 정량 시약, 그리고, 면역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법이 제공된다.

Claims (35)

  1. 수성 매체 중, 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체를 사용하여 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 정량법에 있어서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 행정 및 면역 복합체의 효소 활성을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 면역학적 정량 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 면역학적 정량 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 면역학적 정량 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 면역학적 정량 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 면역학적 정량 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, IgG 중합체 및/또는 IgG 을 공존시키는 면역학적 정량 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 표지 효소에 반응하는 항체에 기인하는 반응인 면역학적 정량 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시 키는 공정에, 불활성화한 그 표지 효소를 공존시키는 면역학적 정량 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소가 퍼옥시다아제인 면역학적 정량 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 면역학적 정량 방법.
  12. 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체로서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 비특이적 반응이 억제된 측정 대상물의 면역학적 정량 방법에 사용되는 시약.
  13. 제 12 항에 있어서,
    제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 함유하는 시약.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    효소 활성 측정용 시약을 함유하는 시약.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 시약.
  16. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 시약.
  17. 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 시약.
  18. 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 시약.
  19. 제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    IgG 중합체 및/또는 IgG 을 함유하는 시약.
  20. 제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 표지 효소에 대한 항체에 기인하는 반응인 시약.
  21. 제 12 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체를 표지하고 있는 효소를 불활성화한 효소를 함유하는 시약.
  22. 제 12 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소가 퍼옥시다아제인 시약.
  23. 제 12 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 시약.
  24. 제 12 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 수성 매체, 금속 이온, 염류, 당류, 계면 활성제, 방부제, 단백질, 단백질 안정화제로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 물질을 함유하는 시약.
  25. 측정 대상물에 특이적으로 결합하는 제 1 항체에 효소가 표지로서 결합하고 있는 효소 표지화 항체를 사용하여 시료 중의 측정 대상물을 정량하는 면역학적 정량 방법에 있어서, 제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2, 1:3 및 2:1 인 효소 표지화 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 복수의 효소 표지화 항체만을 실질적으로 함유하는 효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 대상물의 면 역학적 정량 방법에 있어서의 비특이적 반응의 억제 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    제 1 항체가 결합하는 측정 대상물의 항원 결정 부위와는 상이한 항원 결정 부위에 특이적으로 결합하는 제 2 항체에 분리 수단이 결합하고 있는 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정을 포함하는 억제 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1, 1:2 및 1:3 인 억제 방법.
  28. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    제 1 항체와 효소의 결합수가 각각 1:1 및 1:2 인 억제 방법.
  29. 제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항체가 Fc 부분을 제거한 항체인 억제 방법.
  30. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 인간 항마우스 항체에 기인하는 반응인 억제 방법.
  31. 제 25 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, IgG 중합체/또는 IgG 을 공존시키는 억제 방법.
  32. 제 25 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    비특이적 반응이 표지 효소에 반응하는 항체에 기인하는 반응인 억제 방법.
  33. 제 25 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소 표지화 항체를 시료에 반응시켜 측정 대상물과의 면역 복합체를 형성시키는 공정에, 불활성화한 그 표지 효소를 공존시키는 억제 방법.
  34. 제 25 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
    효소가 퍼옥시다아제인 방법.
  35. 제 25 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
    측정 대상물이 가용성 인터류킨-2 수용체인 억제 방법.
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