CN103616507B - 无蛋白包被板封闭液 - Google Patents

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Abstract

本发明属于临床体外检测技术领域，特别涉及一种无蛋白包被板封闭液含有pH=7.4的Tris-HCL缓冲液、大分子物质、表面活性剂、海藻糖、叠氮钠，大分子物质为PEG-20000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种的混合物。使用本发明的包被板封闭液，不但能够与包被板表面上的空白位置结合，对包被板起到封闭效果，而且在包被板离开低温环境后能够更长时间地保持其表面抗原/抗体的生物活性。本发明提供的封闭液是一种无蛋白封闭液，成本低、操作简单、性质稳定，封闭时间也较BSA短，能达到降低本底且稳定包被板的效果。

Description

无蛋白包被板封闭液
技术领域    
本发明属于临床体外检测技术领域，特别涉及一种无蛋白包被板封闭液。
背景技术   
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，elisA）用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。该检测体系中，保证一个稳定的固相载体包被板最为重要。
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG 对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在 Fc 段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。
封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关大分子溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在 ELISA 其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。如果封闭做的不好，造成制备的试剂盒出现假阳性的情况，因此封闭工作对于ELISA检测试剂盒的准确检测至关重要。
封闭液中的大分子物质可以与固相载体表面上的空白位置结合，以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在固相载体表面，有效地覆盖了蛋白结合位点，避免样本中的背侧蛋白非特异性结合到固相载体表面，出现假阳性的现象。封闭剂应封闭所有的未结合位点而不影响表面上的靶蛋白，同时也不结合靶蛋白表位、不与抗体或检测蛋白有交叉反应。
封闭液常用的物质有BSA、脱脂牛奶、络蛋白等，但是大部分BSA中有抗体残留，会导致抗原/抗体之间的交叉污染，产生高背景，使得本底水平增高；由于奶粉的成分复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用；络蛋白虽然比较纯净，稳定性也较好，但是由于蛋白上的离子基团非特异性吸附，会导致封闭后的微孔板空白吸光度增高，影响试剂盒检测的线性和灵敏度；同时几种常见的封闭液封闭处理后的包被板在 2~8℃冰箱存放一周或37℃破坏一天，其生物活性就损失了50％以上。
可见，常规的封闭液应用后，包被板的本底较高，而且封闭后的包被板稳定性较差。
发明内容   
针对于以上常规封闭液存在的问题，本发明采用一种以高分子物质为主体制备的无蛋白封闭液，分子呈中性，无特异性吸附，性质稳定，封闭时间也较BSA短，能达到降低本底且稳定包被板的效果。
本发明是通过以下措施实现的：
一种无蛋白包被板封闭液，含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCL缓冲液   0.01-0.1mol/L，
大分子物质                 0.5-1g/L，
表面活性剂                 0.5-5g/L，
海藻糖                     1-10g/L，
叠氮钠                     0.1-1g/L，
所述大分子物质为PEG-20000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或两种的混合物。
所述的无蛋白包被板封闭液，含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.1mol/L，
PEG-20000                  1g/L，
表面活性剂                 5g/L，
海藻糖                     10g/L，
叠氮钠                     1g/L。
所述的无蛋白包被板封闭液，含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.01mol/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
表面活性剂                 0.5g/L，
海藻糖                     1g/L，
叠氮钠                     0.1g/L。
所述的无蛋白包被板封闭液，含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.05mol/L，
PEG-20000                  0.5g/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
表面活性剂                1g/L，
海藻糖                     5g/L，
叠氮钠                     0.5g/L。
优选所述表面活性剂为吐温-20、曲拉通X-100和聚氧乙烯月桂醚中的一种。
本发明的有益效果：
借助于本发明提供的技术方案，使用本发明的包被板封闭液，不但能够与包被板表面上的空白位置结合，对包被板起到封闭效果，而且在包被板离开低温环境后能够更长时间地保持其表面抗原/抗体的生物活性。本发明提供的封闭液是一种无蛋白封闭液，成本低、操作简单、性质稳定，封闭时间也较BSA短，能达到降低本底且稳定包被板的效果。
附图说明
图1为对比实施例1得到的包被板检测高低值质控品的结果，
图2为实施例1得到的包被板检测高低值质控品的结果。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
对比实施例1
常规的包被板封闭液，其组分和浓度为：
BSA                       5g/L
吐温-20(Tween-20)           5g/L
叠氮钠                     1g/L
包被板封闭液使用方法：
首先，把抗原或抗体以pH7.4 0.02mol/L的磷酸盐缓冲液稀释成一定浓度；其次，按100μL/孔加入稀释好的包被液，在37℃下包被2小时；然后，弃去包被板内的包被液，将包被板拍干后，按100μL～300μL /孔加入上述配制好的包被板封闭液，在2～8℃下包被16～20小时；最后，弃去包被板内的封闭液，将包被板拍干后，放置于湿度小于30％的35～39℃干燥箱中烘干4～6小时即可。
常规实验包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）包括以下步聚：
1、以抗HCV单抗包被白色微孔板，包被浓度为 5μg/ml，100μL / 孔，37℃包被2小时，洗板后，以包被板封闭液按200μL / 孔 4℃包被8小时后，弃去包被板内的封闭液，拍干后，放置于湿度为25％的 37℃干燥箱中烘干4小时；再把多个包被好的包被板分别放置于37℃的恒温箱中3天、7 天、15 天、30 天、60 天后取出，与2～8℃存放的包被板平行比较；
2、设定好加样孔，将50μl 系列HCV定标品和质控品 QCL（低浓度）、QCH（高浓度）加在存放在2～8℃的HCV包被板和分别放置于 37℃的恒温箱中 3 天、7 天、15 天、30 天、60 天破坏后的HCV包被板上，再加 50μl 稀释抗HCV单抗-HRP 酶结合物，37℃反应 1 小时后，洗板 5 次，拍干；
3、每孔加入显色液 A 液和 B 液各 50uL，避光 37℃显色 15min；
4、每孔加入终止液各 50uL，用酶标仪在波长 450nm/630nm 处读取吸光度（OD）值。
检测结果如下表1所示：
表1 不同存放条件检测各个浓度标准品的OD值
定义检测0pg含量的标准品所得的OD值为空白吸光度值，用实施例1操作制备的包被板空白吸光度为0.1。通过对比的实验数据，常规封闭液封闭的包被板在37℃环境下存放15天已经出现破坏，相关系数已经低于0.99。
同样的结论也表现在测定质控品的结果上，分别放置于37℃的恒温箱中3天、7 天、15 天、30 天、60 天的包被板检测高低值质控品的结果如图1所示：
    包被板在37℃的恒温箱中放置15天后，检测结果明显降低，说明此时包被板上抗体的生物活性受到了很大影响。
实施例1
以本发明实施例包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）步骤与对比实施例1相同，区别在于步骤1中包被板封闭液的组分为：
Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）   0.1mol/L，
PEG-20000                  1g/L，
吐温-20(Tween-20)           5g/L，
海藻糖                     10g/L，
叠氮钠                     1g/L。
弃去包被板内的包被液，将包被板拍干后，按100μL～300μL /孔加入上述配制好的包被板封闭液，在37℃下包被2小时；其余操作同对比实施例1中操作相同。检测结果如下表2所示。
表2 不同存放条件检测各个浓度标准品的OD值
通过实验数据，应用实施例2制备的包被板空白吸光度为0.056左右，比实施例1中得空白吸光度要低很多，因此应用实施例2制备的封闭液能有效降低包被板的本底吸光度，并且包被时间大大缩短了，提高了工作效率。通过2～8℃和37℃存放对比的实验数据，本发明封闭液封闭的包被板在37℃环境下能稳定存放60天不出现破坏，相关系数依旧维持在0.99以上，达到试剂盒的要求。
通过检测质控品，验证应用实施例2封闭的包被板能够稳定存放的时间。分别利用放置于37℃的恒温箱中3天、7 天、15 天、30 天、60 天的包被板检测高低值质控品，检测结果如图2所示。
通过图2检测质控品结果变化的趋势，利用实施例2封闭的包被板在37℃的恒温箱中放置60天检测结果还是没有太大变化，说明本发明实施例2中的封闭液处理后的包被板能长久保证表面抗体的生物活性。
对比实施例2
以本发明实施例包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）步骤与实施例1相同，区别在于步骤1中包被板封闭液的组分为：
Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）   0.1mol/L，
吐温-20(Tween-20)           5g/L，
海藻糖                     10g/L，
叠氮钠                     1g/L。
表3 对比实施例2检测结果
对比实施例3
以本发明实施例包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）步骤与实施例1相同，区别在于步骤1中包被板封闭液的组分为：
包被板封闭液的组分为：
Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）   0.1mol/L，
PEG-20000                  1g/L，
吐温-20(Tween-20)           5g/L，
叠氮钠                     1g/L。
表4 对比实施例3检测结果
通过实验数据，实施例1与对比实施例1、2、3制备的包被板可知：在不应用BSA封闭的情况下，试剂空白吸光度会比较低；封闭液中在同时加入大分子物质和海藻糖的情况下，制备的包被板在37℃环境下能稳定存放60天不出现破坏，相关系数依旧维持在0.99以上，如果单独加入大分子物质或海藻糖就无法达到上述要求。
实施例2
以本发明实施例包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）步骤与实施例1相同，区别在于步骤1中包被板封闭液的组分为：
Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）   0.01mol/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
吐温-20(Tween-20)           0.5g/L，
海藻糖                     1g/L，
叠氮钠                     0.1g/L。
实验操作流程同实施例1中所述步骤。
实施例3
以本发明实施例包被的丙型肝炎核心抗原(HCV)单抗建立的丙型肝炎核心抗原检测试剂盒（ELISA）步骤与实施例1相同，区别在于步骤1中包被板封闭液的组分为：
Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）   0.05mol/L，
PEG-20000                  0.5g/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
吐温-20(Tween-20)           1g/L，
海藻糖                     5g/L，
叠氮钠                     0.5g/L。
实验操作流程同实施例1中所述步骤。
利用实施例2、实施例3、实施例4中的封闭液处理的包被板，分别放置于37℃的恒温箱中 1天、3 天、7 天、15 天、30 天、60 天破坏后，对质控品 QCL（低浓度）、QCH（高浓度）进行检测的结果如表 5所示：
表5实施例2、3、4检测结果对比
    经过对比实施例2、实施例3、实施例4质控品检测结果，三种实施例测得的结果偏差不大，因此三种配方的封闭液都可以达到试剂盒的要求。
经过实验证明，本发明的无蛋白封闭液不但能够与包被板表面上的空白位置结合，对包被板起到封闭效果，而且在包被板离开低温环境后能够更长时间地保持其表面抗原/抗体的生物活性，能达到降低本底且稳定包被板的效果。

Claims (4)

1.一种无蛋白包被板封闭液，其特征在于含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.1mol/L，
PEG-20000                  1g/L，
表面活性剂                 5g/L，
海藻糖                     10g/L，
叠氮钠                     1g/L。
2.一种无蛋白包被板封闭液，其特征在于含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.01mol/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
表面活性剂                 0.5g/L，
海藻糖                     1g/L，
叠氮钠                     0.1g/L。
3.一种无蛋白包被板封闭液，其特征在于含有以下原料：
pH=7.4的Tris-HCl缓冲液   0.05mol/L，
PEG-20000                  0.5g/L，
聚乙烯吡咯烷酮             0.5g/L，
表面活性剂                1g/L，
海藻糖                     5g/L，
叠氮钠                     0.5g/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的无蛋白包被板封闭液，其特征在于所述表面活性剂为吐温-20、曲拉通X-100和聚氧乙烯月桂醚中的一种。
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