JP4830966B2 - 不活化アルカリフォスファターゼの製造方法及び酵素免疫測定用の精度向上剤 - Google Patents
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0.1Mクエン酸水溶液(pH 2.0)2.5mLに、100倍濃度のプロテアーゼインヒビターカクテル(一般用、シグマ社製)25μL及びEIAグレードのALP(ウシ小腸由来ALP、分子量14〜15万、オリエンタル酵母工業社製)1.25mgを添加して溶解し、0.5 mg/mLのALP溶液とした。これを4℃で2日間放置することにより、ALPの不活化処理を行なった。上記プロテアーゼインヒビターカクテルは合計で5種類のプロテアーゼインヒビターを含んでおり、不活化処理に供したALP溶液中のプロテアーゼインヒビターの合計濃度は2.25mmol/Lであった。なお、上記プロテアーゼインヒビターカクテルは、ABTSF、アプロチニン、E-64、ロイペプチンヘミ硫酸塩一水和物、エチレンジアミン四酢酸二水素二ナトリウム二水和物を含むものであった。
実施例1及び2で用いたものと同様のオリエンタル酵母工業社製のALPを0.1Mクエン酸水溶液(pH 2.0)に溶解し、0.5mg/mLのALP溶液とした。これを4℃で2日間放置することにより、ALPの不活化処理を行なった。不活化処理後のALP溶液は、0.1Mトリス/HCl(pH 7.2)にバッファー交換・濃縮し、精度向上剤とした(比較例1)。バッファー交換・濃縮後の不活化ALPについて、実施例1及び2と同様の方法により酵素活性を評価し、ALPの酵素活性を実質的に消失できたことを確認した。
実施例1、2及び比較例1で作製した精度向上剤を4℃にて2週間保存し、その後、SDS-PAGEに供した。電気泳動像を図1に示す。下記表1は、上記で調製した各精度向上剤のプロテアーゼインヒビター使用条件をまとめたものである。
(1) 偽高値を示す検体の同定
検体として、ヒト由来の血清を用いた。抗PIVKA II抗体を結合した0.025%(v/v)磁性粒子(富士レビオ社製)250μLに対し、検体液20μLを加え、37℃で10分間反応させた。ルミパルスシステム洗浄液(富士レビオ社製)で洗浄後、2.5μg/mLのALP50(オリエンタル酵母社製)200μLを加え、37℃で5分間反応させた。反応後、該粒子を洗浄液で洗浄し、該粒子に発光基質を加え、37℃で5分間反応させた後にフォトンカウンターで発光測定した。この時の発光シグナル測定値がバックグラウンド値と比較して有意に大きな値となった検体をALP基因の偽高値を示す検体と同定した。
上記の通り同定した偽高値検体を用いて、実施例1、2及び比較例1で調製した精度向上剤の偽高値低減性能の評価を行なった。各精度向上剤は、4℃にて2週間保存した後のものを用いた。
ウシ小腸から抽出したALPの不活化を模擬するため、以下の方法により不活化ALPの調製を行ない、得られた不活化ALPの品質を評価した。
ウシ小腸(JA全農フーズ社製)300gの小腸外膜に付いている脂肪を手術用ハサミにより出来るだけ取り除いた。小腸内膜を上に向け、スパーテルの平らな部分で内膜を削り取った。削り取った膜成分に20mMビストリス緩衝液pH7.5、1mM Mg−0.01mM Zn溶液25mLを加え、プロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライ社製)を250μL加えた。高速遠心機(クボタ社製)で3,000r.p.m、20分間遠心して、上清に浮いた脂肪成分のみ取り除いた。次に、ポリトロンホモジナイザーで1分間処理し、懸濁液をスターラーで1時間、撹拌した。再び高速遠心機(クボタ社製)で12,000r.p.m、20分間遠心し、上清をビーカーに採取した。飽和硫安溶液を上清と同容量加え、4℃、1時間撹拌した。硫安沈殿成分を回収し、4℃中で20mMビストリス緩衝液pH7.5、1mM Mg−0.01mM Zn溶液で100倍量に調製して2回の透析操作を行ない、ウシ小腸抽出液を得た。該抽出液のタンパク質濃度はBCA(ピアス社製)蛋白定量キットを用いて算出した。
(1)で作製したウシ小腸抽出液(タンパク質濃度20mg/mL)50μLにALP24(18mg/mL、EIAグレード、分子量14万、オリエンタル酵母工業社製)を200μL加えた。これを0.1Mクエン酸水溶液pH2.0に添加し、タンパク濃度として0.5mg/mLの溶液に調製した。該溶液にプロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライ社製)を25μL添加した溶液(実施例5)及びインヒビターを添加しなかった溶液(比較例2)を60℃で3時間加熱し、不活化処理を行なった。処理後のALPは、PD-10カラム(GE社製)を用いて、20mMビストリス緩衝液pH7.0にバッファー交換をした。バッファー交換後の不活化ALP溶液は、濃縮して不活化ALP濃度を1.0 mg/mLに調製後、実施例1及び2と同様の方法によりALP酵素活性を評価し、ALPの酵素活性を実質的に消失できたことを確認した。バッファー交換後の不活化ALPをSDS−PAGEに供した。電気泳動像を図2に示す。なお、上記プロテアーゼインヒビターカクテルは、セリンプロテアーゼインヒビター、エステラーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、トリプシン様プロテアーゼインヒビター及びメタロプロテアーゼインヒビターを含むものであり、インヒビターの使用濃度は合計で1mmol/Lであった。
実施例1〜5で用いたものと同様のオリエンタル酵母工業社製のALP24を0.1Mクエン酸水溶液(pH 2.0)に溶解し、0.5mg/mLのALP溶液とした。これを4℃で2日間放置することにより、ALPの不活化処理を行なった。不活化処理後のALP溶液は、0.1Mトリス/HCl(pH 7.2)にバッファー交換・濃縮した(不活化ALP濃度は0.5mg/ml〜100mg/ml)。バッファー交換・濃縮後の不活化ALPについて、実施例1及び2と同様の方法により酵素活性を評価し、ALPの酵素活性を実質的に消失できたことを確認した。濃縮後の溶液を二つに分け、一方はプロテアーゼインヒビターカクテル(ナカライ社製)を合計最終濃度が1mmol/Lとなるように添加してプロテアーゼインヒビターを含む精度向上剤(実施例6)とし、もう一方はプロテアーゼインヒビターカクテルを非添加の精度向上剤(比較例3)とした。
実施例6及び比較例3で作製した精度向上剤を4℃にて2週間保存し、その後、SDS-PAGEに供した。電気泳動像を図3に示す。下記表3は、上記で調製した各精度向上剤のプロテアーゼインヒビター使用条件をまとめたものである。
Claims (11)
- プロテアーゼインヒビターの共存下でアルカリフォスファターゼの不活化処理を行なう工程を含んでなることを特徴とする、不活化アルカリフォスファターゼの製造方法。
- 前記プロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、エステラーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、トリプシン様プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター及びアミノペプチダーゼインヒビターから成る群より選択される少なくとも1種である請求項1記載の方法。
- 前記不活化処理が、酸処理、熱処理及びキレート試薬処理から成る群より選択される少なくとも1つである請求項1又は2記載の方法。
- 前記不活化処理は、
(1) アルカリフォスファターゼ濃度が1μg/mL〜100mg/mL、pHが1.0〜5.0、処理温度が0℃〜40℃、処理時間が3分間〜5日間の条件、
(2) アルカリフォスファターゼ濃度が1μg/mL〜100mg/mL、pHが1.0〜5.0、処理温度が40℃〜80℃、処理時間が3分間〜6時間の条件、又は
(3) アルカリフォスファターゼ濃度が1μg/mL〜100mg/mL、処理温度が40℃〜80℃、処理時間が3分間〜4時間の条件
で行なわれる請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。 - 請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法で製造された不活化アルカリフォスファターゼを含む酵素免疫測定用の精度向上剤。
- 不活化アルカリフォスファターゼ及びプロテアーゼインヒビターを含む、酵素免疫測定用の精度向上剤。
- 前記不活化アルカリフォスファターゼが請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法で製造される請求項6記載の精度向上剤。
- 前記プロテアーゼインヒビターが、セリンプロテアーゼインヒビター、アスパラギン酸プロテアーゼインヒビター、エステラーゼインヒビター、システインプロテアーゼインヒビター、トリプシン様プロテアーゼインヒビター、メタロプロテアーゼインヒビター及びアミノペプチダーゼインヒビターから成る群より選択される少なくとも1種である請求項6又は7記載の精度向上剤。
- 前記プロテアーゼインヒビターがタンパク質性のプロテアーゼインヒビターである請求項6ないし8のいずれか1項に記載の精度向上剤。
- 標識酵素にアルカリフォスファターゼを用いる酵素免疫測定方法において、反応系内に、不活化アルカリフォスファターゼ及びプロテアーゼインヒビターを共存させること、又は、プロテアーゼインヒビターの共存下でアルカリフォスファターゼの不活化処理を行なうことを含む方法により製造された不活化アルカリフォスファターゼを共存させることを特徴とする酵素免疫測定方法。
- サンドイッチ法または競合法により行なわれる請求項10記載の方法。
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