WO2005121795A1 - 非特異反応が抑制された免疫測定方法および試薬 - Google Patents

非特異反応が抑制された免疫測定方法および試薬 Download PDF

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Kazuki Morita
Koji Uzawa
Emiko Suzuki
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    • G01N2333/55—IL-2

Definitions

  • the present invention relates to a method and an immunoassay for an immunological quantification method of a measurement object in which nonspecific reaction is suppressed, an immunological quantification method of a measurement object in which nonspecific reaction is suppressed, and an object to be measured.
  • the present invention relates to a method for suppressing a non-specific reaction in a method for immunological quantification of A.
  • HAMA human anti-mouse antibodies
  • HAMA type I has been sensitized to mouse protein! ⁇ ⁇ ⁇ It is produced in human blood
  • HAMA type II is animal breeder It is produced in people who are in contact with mice, such as in mice, and in those who receive mouse proteins such as mouse antibodies.
  • HAMA is a non-specific factor that is a problem when using mouse antibodies in immunological quantification methods.It is known that HAMA causes errors in the measurement system and makes it impossible to measure accurate values. ing. Therefore, there is a need for the development of a measurement method that gives an accurate quantitative value, which may give erroneous judgments when monitoring the disease state, etc. with the quantitative value of the target substance obtained by the immunoassay method for quantifying the target substance in the sample. It has been demanded.
  • Interleukin-1 2 (hereinafter referred to as IL-2) has a site power of 133 amino acids It is mainly produced from CD4 + and CD8 + T cells. It is also produced from natural killer cells ( ⁇ cells). IL-2 is mainly involved in the activation of the immune system and has various physiological activities. For example, IL-2 acts on ⁇ -cells, ⁇ -cells, ⁇ -cells, LAK cells (lymphokine activated killer cells), macrophages, neutrophils, etc., as a progression factor that promotes the cell cycle.
  • IL-2 acts on ⁇ -cells, ⁇ -cells, ⁇ -cells, LAK cells (lymphokine activated killer cells), macrophages, neutrophils, etc.
  • the receptor for IL-2 (hereinafter, referred to as IL-2R) is composed of an ⁇ -chain, a chain, and a ⁇ -chain! It is known that two receptors (hereinafter referred to as SIL-2R) are present in blood.
  • SIL-2R is activated ⁇ Because it is produced by cells and ⁇ cells, SIL-2R in the blood rises due to the activation of the immune defense mechanism in the living body and the activation of ⁇ cell lines and ⁇ cell lines It has been reported that Serum SIL-2R levels are high in patients with autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE), and viral infections such as viral hepatitis and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). It has been reported to be one of the indicators of activated lymphocytes in the body.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (SLE)
  • viral infections such as viral hepatitis and acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). It has been reported to be one of the indicators of activated lymphocytes in the body.
  • Serum SIL-2R concentration is clinically used as an index for monitoring disease status in adult T-cell leukemia, and as a measure for non-Hodgkin's lymphoma, as a measure of therapeutic effect, follow-up after remission, and early detection of recurrence. It is being used effectively.
  • Patent Document 1 JP-A-61-65162
  • Patent Document 2 JP-A-1-254869
  • Patent document 3 JP-A-5-188055
  • Patent Document 4 JP-A-62-70761
  • Non-patent Document 1 Tally's Chemistry, 1999, Vol. 45, 942-95 6 pages
  • Non-Patent Document 2 Cancer-Immological Therapy (Cancer Immunolgical Immu notherapy), 1991, Vol. 33, pp. 80-84
  • Non-Patent Document 3 Tally's Chemistry, 1990, Vol. 36, p. 1093
  • An object of the present invention is to provide an immunological quantification method for a measurement target in which a non-specific reaction is suppressed, a reagent used in an immunological quantification method for a measurement target in which a non-specific reaction is suppressed, and a measurement target
  • An object of the present invention is to provide a method for suppressing a non-specific reaction in an immunological quantification method for a substance.
  • the present invention relates to the following (1) to (35).
  • Immunoassay for quantifying an analyte in a sample using an enzyme-labeled antibody in which an enzyme is bound as a label to a first antibody that specifically binds to the analyte in an aqueous medium
  • one or more enzyme-labeled enzymes selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 2: 1 respectively
  • a non-specific method comprising reacting an enzyme-labeled antibody substantially containing only an antibody with a sample to form an immune complex with an analyte and measuring the enzyme activity of the immune complex. For quantitatively determining an object to be measured in which a reaction is suppressed.
  • the immunological quantification method according to (1) comprising a step of forming an immune complex with the measurement object.
  • the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2 and 1: 3, respectively (12) to (14)! , A reagent described in any of the above.
  • It further contains one or more substances selected from the group consisting of aqueous media, metal ions, salts, saccharides, surfactants, preservatives, proteins and protein stabilizers (12) to (23) ) !, reagent described in any of them.
  • An immunological quantification method for quantifying an analyte in a sample using an enzyme-labeled antibody in which an enzyme is bound as a label to a first antibody that specifically binds to the analyte One or more enzyme-labeled antibodies selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 2: 1, respectively.
  • Non-specific method for immunological quantification of a measurement target which comprises a step of reacting an enzyme-labeled antibody containing substantially only the antibody with the sample to form an immune complex with the measurement target. How to suppress the reaction.
  • An antibody in which separation means is bound to a second antibody that specifically binds to an antigen determination site different from the antigen determination site of the measurement target to which the first antibody binds is reacted with the sample.
  • a reagent and a reagent for use in an immunological quantification method of a measurement object in which nonspecific reaction is suppressed an immunological quantification method of a measurement object in which nonspecific reaction is suppressed, and A method for suppressing a nonspecific reaction in an immunological quantification method is provided.
  • FIG. L Gel filtration column chromatogram of POD-labeled anti-SIL-2R monoclonal F (ab ') antibody
  • the non-specific reaction in the present invention is not particularly limited as long as it is a non-specific reaction that can be seen in an immunoassay for a measurement object, but non-specific reactions caused by HAMA and reactions with a labeled enzyme And non-specific reactions caused by the antibodies.
  • HAMA and Examples include HAMA type I and HAMA type II.
  • Examples of the antibody that reacts with the labeling enzyme include an antibody that reacts with peroxidase and an antibody that reacts with alkaline phosphatase.
  • the antibody that reacts with the labeling enzyme in the present invention is an antibody that is used in the immunological assay method of the present invention! Cause a non-specific reaction.
  • the sample used in the present invention includes, for example, whole blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, saliva, amniotic fluid, urine, sweat, knee fluid, etc., and preferably whole blood, plasma, serum and the like.
  • the measurement object of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that can serve as an antigen, but is preferably an antigen having at least two antigenic determinants.
  • examples include sIL-2R, myoglobin known as a marker of myocardial infarction, creatine kinase MB (CK-MB), tropon T and the like.
  • the first antibody that forms the enzyme-labeled antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to the measurement target, and can be any of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies. Antibodies are preferred. In addition, in the present invention, not only antibodies but also Fc parts such as Fab obtained by papain treatment of antibodies, F (ab ') obtained by pepsin treatment, Fab' obtained by pepsin treatment and reduction treatment, etc.
  • Antibody fragments that have been removed can also be used.
  • F (ab ') is particularly preferred as an antibody fragment.
  • the second antibody forming the immobilized antibody used in the present invention any of polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, which are not particularly limited as long as they specifically bind to the measurement target, can be used. Potentials Monoclonal antibodies are preferred.
  • the second antibody is preferably an antibody that specifically binds to an antigenic determinant different from the antigenic determinant of the measurement target to which the first antibody binds.
  • the antibody used in the present invention can be obtained by an ordinary method using a peptide to be measured or a peptide corresponding to its epitope as an antigen, and may be commercially available. Available.
  • Examples of the antibody that specifically binds to sIL-2R include, for example, a monoclonal antibody (manufactured by PIERCE) produced by the hybridoma AM92.3, and a monoclonal antibody 7G7 / B6 (manufactured by Pierce; -70761), and can be arbitrarily used as the first antibody or the second antibody, respectively.
  • a monoclonal antibody manufactured by PIERCE
  • a monoclonal antibody 7G7 / B6 manufactured by Pierce; -70761
  • examples of the enzyme that binds to the first antibody include peroxidase (hereinafter abbreviated as POD), alkaline phosphatase, luciferase, 13-D-galactosidase, glucose oxidase and the like. , Peroxidase and alkaline phosphatase are preferred, and peroxidase is particularly preferred.
  • POD peroxidase
  • alkaline phosphatase a peroxidase derived from horseradish rust, which can also use a peroxidase derived from the herb, is preferable.
  • alkaline phosphatase include alkaline phosphatase derived from bovine small intestine.
  • the enzyme-labeled antibody in the present invention is one in which an enzyme is bound as a label to a first antibody that specifically binds to an object to be measured, and examples of a binding mode in the binding include a covalent bond.
  • the enzyme and the antibody may be directly bonded, or may be indirectly bonded via a linker or the like.
  • Examples of the method for preparing the conjugate include the Daltaraldehyde method, the periodic acid method, the maleimide method, and the pyridyl disulfide method (for example, Eiji Ishikawa, Enzyme Immunoassay, published by Medical Shoin, 1987. See), but the preferred method is the maleimide method.
  • an antibody which is sulfhydrylated with iminothiolane or the like succinimidyl 4- [N-maleimidomethyl] -cyclohexane-1carboxylic acid (succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] -cyclohexane- 1-carboxylate, SMCC ), N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide [N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide, EMCS] or the like, and can be prepared by mixing with an enzyme which has been subjected to maleimidation.
  • the enzyme-labeled antibody used in the present invention is an enzyme-labeled antibody in which a small number of labeled enzyme molecules are bound per antibody molecule, and specifically, the number of bonds between the first antibody and the enzyme is Enzyme-labeled substantially containing only one or a plurality of enzyme-labeled antibodies selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies having a ratio of 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 2: 1: An antibody, preferably one or more enzyme-labeled antibodies selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies, wherein the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2 and 1: 3, respectively.
  • An enzyme-labeled antibody substantially containing only the antibody, more preferably an enzyme-labeled antibody in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1 and 1: 2, respectively.
  • An enzyme-labeled antibody substantially containing only one or more enzyme-labeled antibodies selected from the group.
  • the labeled antibody may be a mixture of the enzyme-labeled antibody, which is particularly preferable for the enzyme-labeled antibody having a binding force of 1: 1: about 1: 2.
  • the ratio of the number of molecules of the enzyme-labeled antibody in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1: 2 is preferably 50% or more of the total labeled antibodies, and 70% or more is more preferable. Preferred 90% or more is particularly preferred.
  • Such an enzyme-labeled dani antibody is prepared by combining the first antibody with the enzyme by the above-described dartal aldehyde method, periodate method, maleimide method, pyridyl disulfide method, etc.
  • the bound first antibody, unreacted enzyme, and antibody are separated using, for example, ion exchange chromatography, gel filtration column chromatography, hydrophobic chromatography, or a combination of these methods. It can be prepared by removing it.
  • the immobilized antibody in the present invention is one in which a separation means is bound to a second antibody that specifically binds to an object to be measured.
  • the separation means include a substance that specifically binds to the solid phase itself or a substance bound to the solid phase.
  • Non-covalent bonding is used when using a solid phase
  • covalent bonding is used when using a substance that specifically binds to a substance bound to the solid phase. They may be directly bonded or indirectly bonded via a linker or the like.
  • Examples of the combination of the substance bound to the solid phase and the substance specifically bound thereto include a combination of biotin and avidin.
  • the solid phase is not particularly limited as long as it is a solid phase on which the second antibody is immobilized and the immunological measurement method of the measurement object can be performed.
  • polystyrene such as a microtiter plate is used. Plates, glass or synthetic resin granules (beads), glass or synthetic resin spheres (balls), latex, magnetic particles, various membranes such as nitrocellulose membranes, synthetic resin test tubes, etc.
  • the IgG polymer in the present invention is not particularly limited as long as IgG is polymerized.
  • MAK33-IgGl / IgGl Poly, MAK33-IgG (2b) / Fab (2a) Poly both are Roche's Gnostics (Roche Diagnostics)].
  • the IgG in the present invention is not particularly limited as long as it is an animal IgG, and examples thereof include animal IgG such as mice, rats, hamsters, rabbits, guinea pigs, goats, higgs, -petri, birds, birds, etc. However, mouse IgG is preferred. Animal IgG may be purified or animal serum.
  • Examples of the aqueous medium include, for example, deionized water, distilled water, and a buffer, and a buffer, and a buffer is preferable.
  • the buffer used in the preparation of the buffer is not particularly limited as long as it has a buffering capacity.
  • Examples of pH 1 to 11 include lactate buffer, citrate buffer, acetate buffer, succinate buffer, Phthalate buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, ethanolamine buffer, lysine buffer, barbitur buffer, imidazole buffer, malate buffer, oxalate buffer, glycine buffer,
  • Examples include a borate buffer, a carbonate buffer, a glycine buffer, and a good buffer.
  • Examples of the good buffer include 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer, bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris) buffer, and tris (hydroxymethyl).
  • MES 2-morpholinoethanesulfonic acid
  • Bis-Tris bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
  • Tris tris (hydroxymethyl).
  • Aminomethane (Tris) buffer N- (2-acetamido) iminoniacetic acid (ADA) buffer, Piperazine- ⁇ , ⁇ '-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES) buffer, 2- [N- (2-acetamido) amino] ethanesulfonic acid (ACES) buffer, 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) buffer, 2- [ ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyethyl) amino ] Ethanesulfonic acid (BES) buffer, 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS) buffer, 2- ⁇ N- [tris (hydroxymethyl) methyl] amino ⁇ ethanesulfonic acid (TES) buffer, N- (2 -Hydroxyethyl)- ⁇ '-(2-sulfoethyl) piperazine (HEPES) buffer, 3- [ ⁇ , ⁇ -bis (2-hydroxyethyl) amino]-2-hydroxyprop
  • the concentration of the buffer solution is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.001 to 2.0 mol / L, more preferably 0.005 to 1.0 mol / L, and 0.01 to 0.1 mol / L. Is particularly preferred.
  • Examples of the metal ion include a magnesium ion, a manganese ion, and a zinc ion.
  • salts examples include sodium salt sodium and potassium salt sodium salt.
  • saccharide examples include mannitol and sorbitol.
  • the surfactant examples include a nonionic surfactant, a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant and the like, and a nonionic surfactant is preferred.
  • the nonionic surfactant examples include Tween 20 (Tween 20) and Nordet P-40 (NP-40).
  • preservatives examples include sodium azide, antibiotics (streptomycin, penicillin, gentamicin, etc.), bioace, Proclin 300, Proxel GXL and the like.
  • Protein examples of the protein include bovine serum albumin (BSA), fetal calf serum (FBS), casein, Block Ace TM (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like.
  • BSA bovine serum albumin
  • FBS fetal calf serum
  • casein Block Ace TM (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) and the like.
  • protein stabilizer examples include peroxidase stabilizing buffer [Peroxidase Stabilizing Buffer, manufactured by DakoCytomation].
  • the inactivated enzyme used in the present invention includes the same enzyme as the enzyme used for labeling the enzyme-labeled antibody used in the immunological quantification method of the measurement object of the present invention, that is, the same enzyme derived from the same organism. What is necessary is just to inactivate the active enzyme.
  • the immunological quantification method using a POD-labeled antibody, when using an inactive antibody of the POD, and using an alkaline phosphatase-labeled antibody, A product obtained by inactivating the alkaline phosphatase is used.
  • the inactivated enzyme may be one bound to a carrier or an antibody, but in this case, the antibody must be one that does not react with the object to be measured or the antibody.
  • Inactivation is to completely or substantially eliminate the enzymatic activity involved in the immunological quantification method of the present invention while maintaining the reactivity with an antibody that reacts with a labeled antibody that causes a nonspecific reaction. It can be performed by heat treatment, denaturation treatment with acid or alkali, enzymatic digestion with protease, freeze-thaw treatment, or a combination thereof.
  • an inactivated POD can be obtained by treating at 100 to 125 ° C for 10 to 60 minutes.
  • An inactive POD is Inactive Poly-POD (Roche's Diagnostics).
  • Examples of the inactivated alkaline phosphatase include Scavenger-ALP (manufactured by Oriental Yeast).
  • the immunological quantification method of the analyte of the present invention includes the following methods: the number of bindings between the first antibody and the enzyme that specifically binds to the analyte is 1: 1, 1: 2, 1: 3 and 2: 1, respectively.
  • Enzyme-labeled antibody which is selected from the group consisting of: one or more enzyme-labeled antibodies selected from the group, and an enzyme-labeled antibody substantially containing only the enzyme-labeled antibody is reacted with the sample to form an immune complex with the analyte.
  • the method is not particularly limited as long as the method includes a step and a step of measuring an enzyme activity of an immune complex, and further, an antigen different from an antigen determination site of a measurement target to which the first antibody binds
  • a method including a step of reacting a sample with an immobilized antibody in which a separation means is bound to a second antibody that specifically binds to a determination site to form an immune complex with an analyte is preferable.
  • the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2 and 1 respectively.
  • the labeled antibody is a mixture of the enzyme-labeled antibody, which is particularly preferable for the enzyme-labeled antibody having a binding power of 1: 1: about 1: 2, for the labeled antibody,
  • the ratio of the number of molecules of the enzyme-labeled antibody in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1: 2 is preferably 50% or more of the total labeled antibodies, and 70% or more is more preferable. Preferred 90% or more is particularly preferred.
  • Specific examples of the quantification method include, for example, a sandwich method and a competitive method, but the sandwich method is preferred.
  • the sandwich method include a one-step method, a one-step delay method, and a two-step method.
  • a more specific example of a method for immunological quantification of a measurement target is a quantification method including the following steps.
  • a step of quantifying the measurement target by comparing the enzyme activity measured in step (4) with a calibration curve prepared in advance using a measurement target having a known concentration.
  • a step of washing the solid phase after the primary reaction may be added. Further, the step (1) and the step (2) can be performed simultaneously.
  • the primary reaction is preferably performed in an aqueous medium.
  • the reaction temperature of the primary reaction For example, it is 0 to 50 ° C, preferably 4 to 40 ° C.
  • the reaction time of the primary reaction is, for example, 5 minutes to 20 hours.
  • a washing solution used for washing the solid phase after the primary reaction for example, phosphate buffered saline (10 mmol / L phosphate buffer containing 0.15 mol / L sodium chloride, pH 7.2, Hereinafter, it is referred to as PBS), and PBS containing a surfactant.
  • the surfactant include a nonionic surfactant such as Tween 20.
  • the secondary reaction is preferably performed in an aqueous medium.
  • the antigenic determinant in the antibody used in the secondary reaction to form the enzyme-labeled antibody (the first antibody) is different from the antigenic determinant in the antibody used in the primary reaction (the second antibody) Is preferred.
  • the reaction temperature of the secondary reaction is, for example, 0 to 50 ° C, preferably 4 to 40 ° C.
  • the reaction time of the secondary reaction is, for example, 5 minutes to 20 hours.
  • the washing solution used for washing the solid phase after the primary reaction includes, for example, the washing solution described above.
  • an enzyme is reacted with a substrate of the enzyme, and the generated substance is measured.
  • the enzyme activity in the complex can be measured.
  • the reaction between the enzyme substrate and the enzyme is preferably performed in an aqueous medium.
  • the peroxidase activity in the immune complex can be measured by, for example, an absorbance method, a fluorescence method, a luminescence method, or the like.
  • a method for measuring peroxidase activity by the absorbance method for example, peroxidase is reacted with a combination of its base hydrogen peroxide and an oxidative chromogen, and the absorbance of the reaction solution is measured with a spectrophotometer or the like.
  • the oxidative color-forming chromogen include a leuco-type chromogen and an oxidative coupling-coloring chromogen.
  • a leuco-type chromogen is a substance that is converted into a dye alone in the presence of a peroxidic active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxidic active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxidic active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxidic active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • Oxidative coupling color-forming chromogen is a substance that produces a dye by oxidative coupling of two compounds in the presence of a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • a peroxide active substance such as hydrogen peroxide and peroxidase.
  • the combination of the two compounds include a combination of a coupler with an arin (a Trinder reagent) and a combination of a coupler with a phenol.
  • the coupler include 4-aminoantipyrine (4-AA) and 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazine.
  • the concentration of the peroxide is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for the measurement.
  • the amount is preferably 1 to 100 kU / L.
  • the concentration of the oxidative coloring type chromogen is not particularly limited as long as it is a concentration suitable for measurement, but is preferably 0.01 to 10 g / L.
  • a method of measuring peroxidase activity by a fluorescence method for example, A method of reacting the enzyme with its substrate, hydrogen peroxide and a combination of a fluorescent substance, and measuring the intensity of the generated fluorescence.
  • the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • a method for measuring peroxidase activity by a luminescence method for example, a method of reacting peroxidase with a combination of a substrate thereof, hydrogen peroxide and a luminescent substance, and measuring the intensity of generated luminescence, etc. can give.
  • the luminescent substance include luminol.
  • alkaline phosphatase activity in the complex can be measured by, for example, a luminescence method.
  • a luminescence method for example, a method of reacting alkaline phosphatase with a substrate thereof and measuring the luminescence intensity of generated luminescence with a luminescence intensity meter or the like can be mentioned.
  • Substrates for alkaline phosphatase include, for example, 3- (2'-spiroadamantane) -4-methoxy-4- (3-phosphoryloxy) phenyl-1,2-dioxetane 'disodium salt (AMPPD) 2 black mouth - 5- ⁇ 4-methoxy-spiro [1,2 Jiokisetan - 3,2'(5'black port) Torishi black (3.3.1.1 3 '7) decane] - 4-I le ⁇ Hue -Ruphosphate 'disodium salt (CDP-Star TM),
  • luciferase activity in the immune complex can be measured by, for example, a luminescence method.
  • a method for measuring luciferase activity by a luminescence method include a method in which luciferase is reacted with its substrate, and the luminescence intensity of generated luminescence is measured by a luminescence intensity meter or the like.
  • the substrate of luciferase includes, for example, luciferin.
  • the activity of j8-D-galactosidase in the immune complex can be measured by, for example, an absorbance method (colorimetric method).
  • an absorbance method colorimetric method
  • 13-D-galactosidase activity by an absorbance method colorimetric method
  • a method of reacting cuctosidase with its substrate and measuring the absorbance of the reaction solution with a spectrophotometer or the like can be used.
  • Substrates for j8-D-galactosidase include, for example, 2-chloro-4-nitrophenyl D-ratatoside, 2--trophenyl-j8-D-galactoside (ONPG), 5-bromo-4-chloro-3- Indolyl-13-D-galactoside (X-gal) and the like.
  • the enzyme is glucose oxidase
  • the glucose oxidase is allowed to act on glucose as a substrate, and the generated hydrogen peroxide is measured to determine the glucose oxidase activity in the immune complex. Can be measured.
  • the measurement of hydrogen peroxide can be performed, for example, by the above-described method for measuring peroxidase activity.
  • the above-mentioned buffers, metal ions, salts, saccharides, surfactants, preservatives, proteins, protein stabilizers and the like can coexist in the reaction.
  • the reagent used in the immunoassay for quantifying the measurement target of the present invention includes a first antibody and an enzyme, which specifically bind to the measurement target, each having a binding number of 1: 1, 1: 2, and 1: 3. And an enzyme-labeled antibody substantially containing only one or more enzyme-labeled antibodies selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies in the ratio of 1: 1, to which the first antibody binds, if necessary It further contains a solid-phased antibody and a reagent for measuring Z or enzyme activity, wherein the separation means is bound to a second antibody that specifically binds to an antigen determination site different from the antigen determination site of the measurement target.
  • the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2 and 1 respectively.
  • the labeled antibody may be a mixture of the enzyme-labeled antibody which is particularly preferable for the enzyme-labeled antibody having a binding power of 1: 1: about 1: 2.
  • the ratio of the number of molecules of the enzyme-labeled antibody in which the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1: 2 is preferably 50% or more of the total labeled antibodies, and 70% or more is more preferable. Preferred 90% or more is particularly preferred.
  • An s3 ⁇ 4 drug containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme is provided.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, mouse IgG, and a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme is provided.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, mouse IgG, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme is provided.
  • a reagent comprising a solid-phased antibody, an enzyme-labeled antibody, an enzyme that inactivates an enzyme that labels the antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, mouse IgG, an enzyme that inactivates the enzyme that labels the antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme is provided.
  • a reagent comprising a solid-phased antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, an enzyme obtained by inactivating an enzyme labeling an antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, mouse IgG, an IgG polymer, an enzyme that inactivates an enzyme that labels the antibody, and a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme is provided.
  • a reagent containing a solid-phased antibody, an enzyme-labeled antibody, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard analyte • Reagent 10
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured is a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, mouse IgG, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured is a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, mouse IgG, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured.
  • a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, mouse IgG, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured is a reagent containing an immobilized antibody, an enzyme-labeled antibody, an IgG polymer, mouse IgG, a reagent for measuring the activity of a labeled enzyme, and a standard substance to be measured.
  • An immobilized antibody an enzyme-labeled antibody, an enzyme that inactivates an enzyme that labels an antibody, a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme, and a reagent containing a standard analyte.
  • Immobilized antibodies enzyme-labeled antibodies, mouse IgG, enzymes that inactivate the enzymes that label the antibodies, reagents for measuring the activity of the labeled enzymes, and reagents containing standard analytes
  • An immobilized antibody an enzyme-labeled antibody, a mouse IgG, an IgG polymer, an enzyme that inactivates an enzyme that labels the antibody, a reagent for measuring the activity of the labeled enzyme, and a reagent containing a standard analyte.
  • Examples of the reagent for measuring the activity of the labeled enzyme in the measurement reagent of the present invention include a reagent containing a substrate of the enzyme.
  • Examples of the enzyme in the reagent for measuring enzyme activity include the aforementioned enzymes.
  • Examples of the substrate include the aforementioned substrates.
  • Examples of the standard substance to be measured in the measurement reagent of the present invention include, for example, an aqueous solution of the substance to be measured adjusted to a known concentration.
  • the reagent for measurement of the present invention may be stored and transported in the form of a kit. If necessary, the above-mentioned buffers, metal ions, salts, saccharides, surfactants, preservatives, proteins and proteins may be used. It may contain a quality stabilizer and the like.
  • Sulfuric acid manufactured by Kanto Chemical Co.
  • FBS manufactured by HyClone NP-40: manufactured by Calbiochem
  • POD stability buffer manufactured by Dakosite Masonry
  • MAK33-IgGl / IgGl Poly manufactured by Roche Diagnostics
  • HAMA serum type I manufactured by Roche Diagnostics
  • HAMA serum type II manufactured by Roche Diagnostics
  • the cryopreserved lymphoma cell line U937 (manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), which is known to secrete and express SIL-2R, is quickly thawed in a 37 ° C water bath, and transferred to a 15 mL sterile tube. 10 mL of ⁇ -MEM containing 10% FBS, penicillin and streptomycin was added and gently suspended. After centrifugation (1200 rpm) at room temperature for 5 minutes, the supernatant was removed by suction.
  • the cell suspension obtained by adding 10 mL of the same medium to the residue and suspending the whole was transferred to a 25 cm 2 T flask, and cultured for 2 to 3 days in a carbon dioxide gas culture device (5% CO, 37 ° C). After that, 150cm 2 T
  • Expansion culture was performed sequentially on Lasco and 225 cm 2 T flasks. After confirming that the cells are 100% confluent in the 225 cm 2 T flask, collect the culture supernatant in a sterilized container. The mixture was centrifuged (1200 rpm) at 4 ° C for 10 minutes. The supernatant obtained by centrifugation was transferred to a sterilized container, gently stirred for 15 minutes, and then filtered with a 0.2 m filter to obtain a standard substance for SIL-2R.
  • the KTM-302 antibody was diluted with PBS to a final concentration of 4 / z g / mL, and 100 L of each was added to each well of a 96-well microtiter plate for solid phase. After standing at room temperature for 1 ⁇ , wash with blocking solution (10 mmol / L phosphate buffer containing 1% BSA, 5% saccharose, 0.05% Tween 20, 0.01% gentamicin sulfate, pH 7.2) and block. The solution was calcu- lated with 200 ⁇ L of calorie at room temperature for 1 ⁇ to block. After removing the blocking solution, the solution was dried in a vacuum dryer for 3 days to prepare an anti-SIL-2R monoclonal antibody-fixed solid phase (plate).
  • F (Hitachi Ltd.) HPLC system (Hitachi, Ltd.) ab ') was separated and purified. 4 mg of the obtained F (ab ') was treated with 100 mmol / L borate buffer (pH 8.0).
  • Coupling was achieved by the imide method.
  • the molecular weight of F (ab ') antibody is about 92 kDa, and the molecular weight of POD is about 44 kDa. Therefore, the anti
  • the molecular weight of the enzyme-labeled antibody which is l: l, is about 136 kDa, 1: 2 is about 180 kDa, 1: 3 is about 224 kDa, and 1: 4 is Approx. 268 kDa, approx. 312 kDa for 1: 5, approx. 228 kDa for 2: 1, approx. 272 kDa for 2: 2, approx. 316 kDa for 2: 3, approx. 3: 1 Is calculated to be about 320 kDa.
  • the labeled antibody prepared by the method described in the above (1) was fractionated by an HPLC system (manufactured by Hitachi, Ltd.) using a G3000SW column (manufactured by Tosoichi; 21.5 mm x 60 cm). HPLC was performed at room temperature at a flow rate of 3 mL / min using a 0.1 mol / L phosphate buffer (pH 7.4) as a mobile phase. Fraction collection was performed with 3 mLZ fractions.
  • the molecular weight marker is a high molecular weight gel filtration calibration kit (HMW Gel Filtration Calibration Kit, manufactured by Amersham Biosciences) and a low molecular weight gel filtration calibration kit (LMW Gel Filtration Calibration Kit, manufactured by Amersham NeuScience Science) )It was used.
  • HMW Gel Filtration Calibration Kit manufactured by Amersham Biosciences
  • LMW Gel Filtration Calibration Kit manufactured by Amersham NeuScience Science
  • FIG. 1 shows the results of measuring the absorbance at 280 nm of each fraction. As shown in FIG. 1, peaks of absorbance were observed in 1) fraction 33, 2) fraction 40, 3) fraction 43, 4) fraction 48, and 5) fraction 52.
  • the molecular weight of each fraction showing the above absorbance peak estimated by comparison with the molecular weight marker is 1) 250 kDa or more, 2) about 170 kDa, 3) about 140 kDa, 4) about 100 kDa, 5) It was about 40 kDa. Therefore, 1) the enzyme-labeled antibody in fraction 33 is a labeled antibody in which F (ab ') and POD are polymerized, 2) the enzyme-labeled antibody in fraction 40 is F (ab)
  • a sample for electrophoresis was prepared so that the amount of protein derived from each of the fractions was 2 to 3 ⁇ gZ lane.
  • Sample buffer for SDS-PAGE [8% SDS (Wako Pure Chemical Industries), 24% 2-mercaptoethanol (Nacalai Tester), and 40% glycerol (Kanto 1 mol / L Tris buffer solution (manufactured by Kagaku Co., Ltd., pH 6.8) was added in a 1/4 volume, and heated at 95 ° C for 5 minutes.
  • the heat-treated sample is applied to an SDS-PAGE gel (Padier SPG-520L (manufactured by Atto)) using a 20 ⁇ LZ lane, electrophoresed at 20 mA per gel, and bands are detected in the usual manner. did.
  • the molecular weight marker is a pre-stained Broad Range (Prestained Broad Range Bio-Rad, 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa, 25 kDa, 16 kDa, 10 kDa )It was used.
  • the enzyme-labeled antibodies in fraction 36 had F (ab ') and POD binding numbers of 1: 4 and 2: Yeast that is 2
  • the enzyme-labeled antibody in the fraction-labeled antibody, fraction 37 has a reduced number of F (ab ')-POD bonds.
  • the enzyme-labeled antibody in fraction 38 has a different number of bonds between F (ab ') and POD.
  • Enzyme-labeled antibody with a force of S 1: 2 enzyme-labeled antibody in fraction 42, F (ab ') and POD
  • the protein in fraction 47 is an enzyme-labeled compound having the number of bonds between F (ab ') and POD: 1
  • Enzyme-labeled antibody diluent [150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 ⁇ g / mL mouse IgG, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilization buffer and 0.16 g / mL POD (Roche Diagnostics, Inc. (2) was diluted with a 100 mmol / L acetate buffer solution (pH 6.0) containing the labeled iridani antibody solution (24-140 ng / l). mL) was added to each well, and the mixture was shaken at room temperature for 90 minutes using a horizontal rotary shaker (140 to 160 rpm).
  • HAMA serum type I Lid. 92069721
  • HAMA serum type II Lit. 14482684
  • normal human serum Lit. 101001-2
  • Fractions 32-35 which are high-molecular-weight, enzyme-labeled antibodies containing an antibody and an enzyme with a bond number of 1: 5, 2: 3, 3: 1, etc., respectively, contained SIL-2R in HAMA serum type I. The measured value of was over 1000 U / mL, and the fraction 32, which is considered to be highly polymerized, was as high as about 16 000 U / mL. Fraction 36, which was identified as having an antibody-enzyme binding force of 1: 4 or 2: 2, also showed significantly higher values.
  • enzyme-labeled antibodies selected from the group consisting of enzyme-labeled antibodies in which the number of bonds between the antibody and the enzyme is 1: 3, 2: 1, 1: 2 and 1: 1 respectively It was shown that the enzyme-labeled antibody in fractions 38 to 46 that were identified as containing contained approximately 500 U / mL or less and suppressed the non-specific reaction of HAMA serum type I.
  • the number of enzyme-labeled antibodies to which a small number of labeled enzyme molecules are bound per antibody molecule preferably the number of bonds between the first antibody and the enzyme is 1: 1, 1: 2, and 1 respectively.
  • the enzyme-labeled antibody in fractions 40 to 46 prepared in Example 1 was diluted with enzyme-labeled antibody diluent (150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, mouse IgG, 0.2% proxel GXL). , 10% POD stabilizing buffer, diluted with 0.16 ⁇ g / mL POD 75 mmol / L MES buffer containing (Roche 'die ⁇ Diagnostics sticks Co.) (pH 6. 5)], the mouse IgG concentration It was adjusted to be 0, 20, 40, 60, 80, 100, 200 ⁇ g / mL, respectively.
  • the measured value of HAMA serum type II when mouse IgG was not added was 9000 U / mL or more, and the nonspecific reaction caused by HAMA was caused by adding 20 g / mL mouse IgG. Non-specific reaction by AMA was suppressed and decreased to 437 U / mL.
  • the measured value of the HAMA serum decreased, and the siL-2R value reached equilibrium with 80 ⁇ g / mL or more.
  • the readings reached equilibrium at 80 g / mL, but no significant change was observed as in HAMA serotype II.
  • Enzyme-labeled antibody in fractions 40 to 46 prepared in Example 1 was diluted with enzyme-labeled antibody (150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 g / mL mouse IgG, high polymerization 75 mmol / L MES buffer containing mouse IgG, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilizing buffer and 0.16 g / mL POD (Roche Diagnostics), pH 6.5].
  • enzyme-labeled antibody 150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 g / mL mouse IgG, high polymerization 75 mmol / L MES buffer containing mouse IgG, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilizing buffer and 0.16 g / mL POD (Roche Diagnostics), pH 6.5].
  • MAK33-IgGl / IgGl Poly was used as the polymerized mouse IgG, the enzyme-labeled antibody solution was used so that the concentrations were 0, 75, 100, 125, 150, 175, 200, and 300 g / mL, respectively. Prepared.
  • MAK33-IgG (2b) / Fab (2a) Poly was used as the mouse IgG for polymerization, enzyme labeling was performed so that the concentrations were 0, 5, 50, and 100 ⁇ g / mL, respectively.
  • Antibodies were prepared.
  • HAMA serum type I Lit. 90643629
  • HAMA serum type II Lit. 92069831
  • normal human serum Lit. 1 Measured in the same manner as (5).
  • Table 3 shows the effect of adding MAK33-IgGl / IgGl Poly.
  • Table 4 shows the effect of adding MAK33-IgG (2b) / Fab (2a) Poly.
  • the enzyme-labeled antibodies in fractions 40 to 46 prepared in Example 1 were diluted with a labeled antibody diluent (150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 ⁇ g / mL mouse IgG, 200 ⁇ L g / mL MAK33- IgGl / IgGl Poly, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilizing buffer and 75 mmol / L MES buffer containing 0.16 ⁇ g / mL POD, pH 6.5).
  • a labeled antibody diluent 150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 ⁇ g / mL mouse IgG, 200 ⁇ L g / mL MAK33- IgGl / IgGl Poly, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilizing buffer and 75 mmol / L MES buffer containing 0.16 ⁇ g / m
  • Example 4 the enzyme-labeled antibody solution prepared above, and reagents other than the enzyme-labeled antibody solution used in the method described in Example 1 (4) (the immobilized plate prepared in Reference Example 3, Example 1 ( The standard substance solution, washing solution, OPD solution and reaction stop solution of 4) are collectively referred to as “the reagent of Example 4.”
  • the composition of the reagent of Example 4 is described below.
  • Standard substance solution Standard substance solutions containing sIL-2R at 0 U / mL, 200 U / mL, 400 U / mL, 1600 U / mL, 3200 U / mL, and 6400 U / mL (150 mmol / L sodium chloride, 4% BSA, (10 mmol / L phosphate buffer containing 1% saccharose and 0.01% BioAce, pH 7.5)
  • Enzyme-labeled antibody solution Predetermined amount (24-140 ng / mL) of fraction 40-46 of Example 1
  • Labeled antibody diluent containing OD-labeled antibody 150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 100 ⁇ g / mL mouse IgG, 200 ⁇ g / mL MAK33—Iggl / (75 mmo 1 / L MES buffer containing IgGl Poly, 0.2% proxel GXL, 10% POD stable buffer
  • Wash solution 150 mmol / L sodium chloride, 10 mmol / L phosphate buffer containing 0.05% Tween 20, pH 6.8
  • OPD solution 2 mg / mL OPD, 0.75 g / L urea hydrogen peroxide, 100 mmol / L phosphate-citrate buffer containing 0.01% procrine 300, pH 4.4
  • SIL-2R in each serum was also measured using Imuraz IL-2R (manufactured by DPC). Table 5 shows the results.
  • the sIL-2R of a sample obtained by adding HAMA serum to normal human serum at different amounts was measured, and HAMA ⁇ The effect of concentration on the measured values was investigated.
  • HAMA serum type I Lit. 90643656
  • HAMA serum type I KLot. HAMA was measured using a sandwich ELISA kit for HAMA measurement, ImmuSTRIP HAMA Fragment (manufactured by Imnomedics).
  • HAMA serotype I when measured with the reagent of Example 4, even if the HAMA concentration was increased to 65.3 ⁇ g / mL (2.5 times that of HAMA contained in commercially available HAMA serotype I), it was still measured. The effect rate of the measurement was 10% or less. When measured with the Imimrise IL-2R, the effect on the measured value was found to be 30-40%, indicating that HAMA was affected. When HAMA serum type II was measured using the reagent of Example 4, the measurement was performed even when the HAMA concentration was increased to 31.1 ⁇ g / mL (2.5 times that of HAMA contained in ⁇ sales ⁇ AMA serotype)).
  • a reagent kit comprising the following reagents was constructed.
  • Composition labeled antibody diluent (150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-) containing a predetermined amount (24-140 ng / mL) of POD-labeled antibody in fractions 40-46 of Example 1 40, 100 ⁇ g / mL mouse IgG, 200 ⁇ g / mL ⁇ 33-IgGl / IgGl Poly, 0.2% proxel GXL ⁇ 75 mmol / L MES containing 10% POD stabilization buffer and 0.16 g / mL POD (Buffer, pH 6.5)
  • Composition 10 mmol / L phosphate buffer (pH7.45) containing 150 mmol / L sodium chloride, 4% BSA, 1% saccharose, 0.2% proxel GXL and 20 g / mL mouse IgG
  • Composition 100 mmol / L containing 0.75 g / L urea hydrogen peroxide and 0.1% procrine 300 L-Phosphate-monocitrate buffer (pH 4.4)
  • composition 1 mol / L sulfuric acid
  • Sample A a human serum
  • a sample diluent (10 mmol / L phosphate buffer containing 50 mmol / L sodium chloride, 4% BSA, 1% saccharose, 0.2% proxel GXL and g / mL mouse IgG).
  • concentration of each sIL-2R was measured using the reagent of Example 4.
  • Table 9 shows the measured values and the calculated values of SIL-2R of the sample stock solution obtained from the measured values and the dilution ratio. The calculated SIL-2R values of the sample stock solution differed depending on the dilution ratio, indicating that the dilution linearity was poor and a nonspecific reaction occurred.
  • Sample A is diluted 1/2, 1/4, 1/6, 1/11, 1/21, 1/31 with the sample diluent, and labeled by the periodic acid method, consisting of the components shown below.
  • SIL-2R was measured using the SIL-2R measurement reagent (hereinafter referred to as SIL-2R measurement reagent B) using the POD-labeled antibody obtained, and the SIL-2R of the sample stock solution was determined from the measured value and the dilution ratio. The calculated value was determined.
  • the SIL-2R measurement reagent B had the same configuration as the reagent of Example 4 except for the enzyme-labeled antibody solution, and the POD-labeled antibody was not separated by gel filtration.
  • Anti-sIL-2R antibody-immobilized plate 96 well microtiter plate with 8 wells x 12 strips on which 4 / z g / mL KTM-302 antibody was immobilized at 100 ⁇ L / well
  • Standard solution 0 U / mL, 200 U / mL, 400 U / mL, 1600 U / mL, 3200 U / mL, 6400 U / mL Standard solution containing sIL-2R (150 mmol / L sodium chloride, 4% BSA, 1% 10 mmol / L phosphate buffer, pH 7.5 containing saccharose and 0.01% bioacease, pH 7.5)
  • Enzyme-labeled antibody solution POD labeling with the specified amount (24-140 ng / mL) by the periodate method
  • Antibody-containing labeled antibody diluent 150 mmol / L sodium chloride, 10% FBS, 0.2% NP-40, 20 ⁇ g / mL mouse IgG, 0.2% proxel GXL, 10% POD stabilizing buffer and (10 mmol / L phosphate buffer containing 0.16 ⁇ g / mL POD, pH 7.5)
  • Wash solution 150 mmol / L sodium chloride, 10 mmol / L phosphoric acid containing 0.05% Tween 20 Buffer, pH 6.8
  • OPD solution 2 mg / mL OPD, 0.75 g / L urea hydrogen peroxide, 100 mmol / L phosphate-citrate buffer containing 0.01% procrine 300, pH 4.4
  • the measured value with the reagent B for measuring SIL-2R was about 4 times that of the reagent of Example 4.
  • the reagent of Example 4 has a dilution ratio of 1/8.
  • SIL-2R reagent B a nonspecific reaction of 125% of the theoretical value was observed even at a dilution ratio of 1/11, while the effect of the nonspecific reaction was almost eliminated.
  • a dilution of 1/21 to 1/31 was required to eliminate.
  • a POD-labeled antibody labeled with the periodic acid method used in the si L-2R measurement reagent B! Is a single antibody molecule, such as a 1: 4 or 1: 5 binding force between the antibody and POD. It is considered that the number of POD bonds per unit is high, and that the number of antibodies and the number of POD bonds are 3 ⁇ 4: 2, 2: 3 and 3: 1.
  • the sIL-2R measurement value of the sample A diluted 1/4 with the reagent of Example 4 was 2022 U / mL, and a non-specific reaction was observed as compared with the theoretical value.However, MAK33-IgG Poly Alternatively, the addition of Inactive Poly-POD reduced the measured value to near the theoretical value, further suppressing nonspecific reactions. In particular, non-specific reactions were almost completely suppressed by the addition of Inactive Poly-POD to the mixture, indicating that non-specific reactions caused by antibodies reacting with POD were present.
  • the reagent of Example 4 can suppress the non-specific reaction of sample A, that is, the non-specific reaction caused by the antibody that reacts with POD, and furthermore, the co-presence of inactivated POD allows the anti-POD antibody It was possible to sufficiently suppress the non-specific reaction caused by this.
  • an immunological quantification method and a quantification reagent for an object to be measured in a sample which are useful for monitoring a disease state, diagnosing a disease, and the like, and a method for suppressing a nonspecific reaction in the immunological quantification method.

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Abstract

　水性媒体中、測定対象物に特異的に結合する第１の抗体に酵素が標識として結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量法において、第１の抗体と酵素の結合数がそれぞれ1：1、1：2、1：3および2：1である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法。

Description

明 細 書
非特異反応が抑制された免疫測定方法および試薬
技術分野
[0001] 本発明は、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、非特異 的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および測定対 象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法に関する。
背景技術
[0002] 測定対象物の免疫学的定量方法においては、しばしば非特異反応が起こることが 確認されて 、る。抗原抗体反応における非特異的反応としては様々な種類が知られ ているが、特に、ヒト抗マウス抗体（human anti-mouse antibody,以下 HAMAと略記す る）により生じる非特異反応が問題となっている。 HAMAには、 HAMAタイプ Iと HAMA タイプ IIの 2種類が存在し、 HAMAタイプ Iはマウスタンパク質に感作されたことのな!ヽ 人の血液に生じるものであり、 HAMAタイプ IIは動物飼育者などのマウスに接触して いる人やマウス抗体などのマウスタンパク質の投与を受けた人に生成するものである 。一般的に、 HAMAは免疫学的定量方法にマウス抗体を用いるときに問題となる非 特異因子で、 HAMAにより測定系へ誤差を与え正確な値を測定することができなくな ることが知られている。従って、試料中の測定対象物を定量する免疫測定方法で得 られる測定対象物の定量値で病態等をモニターする際に誤った判断を与えかねず、 正確な定量値を与える測定法の開発が求められている。
[0003] 免疫学的定量方法における HAMAによる非特異的反応の抑制方法としては、免疫 測定に用いる抗体と同一動物種における免疫グロブリンや重合ィ匕免疫グロブリン等 が有効であることが知られている (特許文献 1、特許文献 2、非特許文献 1、非特許文 献 2および非特許文献 3参照)。
また、抗原抗体反応における非特異的反応として、抗体の標識に用いる酵素に反 応する抗体により生じる非特異反応もあり、測定系に不活性化した該酵素を共存させ る非特異反応の抑制方法が報告されて 、る (特許文献 3参照)。
[0004] インターロイキン一 2 (以下、 IL-2と記す）は 133個のアミノ酸力も構成されるサイト力 インであり、主に CD4+や CD8+の T細胞より産生される力 ナチュラルキラー細胞（ΝΚ 細胞)からも産生される。 IL-2は、主に免疫系への活性ィ匕に関与し、様々な生理活性 を有している。例えば、 IL-2は Τ細胞、 Β細胞、 ΝΚ細胞、 LAK細胞（lymphokine activa ted killer細胞）、マクロファージ、好中球などに対し、細胞周期を進めるプログレッショ ン因子として作用する。
[0005] IL-2の受容体（以下、 IL-2Rと記す）は α鎖、 鎖、 γ鎖から構成されて!、るが、 α 鎖の一部が細胞上力 遊離した可溶性インターロイキン— 2受容体 (以下、 SIL-2Rと 記す）が血中に存在することが知られている。 SIL-2Rは活性化 Τ細胞、 Β細胞によって 産生されるために、生体の免疫防御機構の活性化、 Τ細胞系及び Β細胞系などの活 性ィ匕に伴い血中の SIL-2Rが上昇することが報告されている。血清中の SIL-2R濃度は 、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス (SLE)などの自己免疫疾患や、ウィルス 性肝炎、後天性免疫不全症候群 (AIDS)などのウィルス感染症の患者で高値を示し 、体内の活性化リンパ球の指標の 1つとなることが報告されている。また腫瘍細胞が si L-2Rを産生し、成人 T細胞白血病 (ATL)や非ホジキンリンパ腫の進行と血清中の sIL -2R濃度の変動が良く相関することが知られている。このように様々な免疫系の疾患 や病態との関連が報告され、造血疾患のなかで有望な血液中のマーカーとなってき て 、る。血清中の SIL-2R濃度は成人 T細胞白血病にお 、ては病態モニタリングの指 標など、非ホジキンリンパ腫においては治療効果の判定、寛解後のフォロー、再発の 早期発見の指標などとして臨床的に有効活用されている。
[0006] これまでに、 SIL-2Rの測定法として、 2つの抗 SIL-2R抗体を用いる免疫学的測定法 が報告されており（特許文献 4参照）、また SIL-2R測定用試薬として、酵素免疫測定 法に対応した試薬、例えば、「セルフリー IL— 2R」（山之内製薬株式会社製)などが 開発され、発売されている。
特許文献 1 :特開昭 61— 65162号公報
特許文献 2：特開平 1― 254869号公報
特許文献 3 :特開平 5— 188055号公報
特許文献 4：特開昭 62— 70761号公報
非特許文献 1 :タリ-カル 'ケミストリー（Clinical Chemistry) , 1999年，第 45卷， 942-95 6頁
非特許文献 2:キャンサ^ ~·ィムノロジカル'ィムノセラピィ（Cancer Immunolgical Immu notherapy) , 1991年，第 33卷， 80- 84頁
非特許文献 3:タリ-カル 'ケミストリー（Clinacal Chemistry), 1990年，第 36卷， 1093 頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の目的は、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、 非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および 測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法を提供すること にある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明は、下記（1)〜（35)に関する。
(1) 水性媒体中、測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として 結合している酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定 量法において、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1:1、 1:2、 1:3および 2:1であ る酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを 実質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を 形成させる行程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とす る非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法。
[0009] (2) 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に 特異的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ測 定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む（1)記載の免疫学的定量方法。 (3) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1:1、 1 :2および 1:3である（1)または (2) 記載の免疫学的定量方法。
[0010] (4) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1:1および 1:2である（1)または (2)記載 の免疫学的定量方法。
(5) 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である（1)〜 (4)のいずれかに記載の免 疫学的定量方法。
(6) 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（1)〜（5)のいずれ力ゝ に記載の免疫学的定量方法。
[0011] (7) 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させるェ 程に、 IgG重合体および Zまたは IgGを共存させる（1)〜（6)のいずれかに記載の免 疫学的定量方法。
(8) 非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である（1)〜 (5)の いずれかに記載の免疫学的定量方法。
[0012] (9) 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させるェ 程に、不活性化した該標識酵素を共存させる（1)〜 (8)の 、ずれかに記載の免疫学 的定量方法。
(10) 酵素がペルォキシダーゼである（1)〜（9)のいずれかに記載の免疫学的定量 方法。
(11) 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である（1)〜（10)のいずれ かに記載の免疫学的定量方法。
[0013] (12) 測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として結合している 酵素標識ィ匕抗体であって、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3およ び 2:1である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識ィ匕 抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を含有することを特徴とする非特異 的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬。
[0014] (13) 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位 に特異的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を含有する（12)記 載の試薬。
(14) 酵素活性測定用試薬を含有する（12)または (13)記載の試薬。
(15) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2および 1 : 3である（12)〜（14) の！、ずれかに記載の試薬。
[0015] (16) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1および 1 : 2である（12)〜（14)のい ずれかに記載の試薬。 (17) 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である（12)〜（16)のいずれかに記載の 試薬。
(18) 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（12)〜（17)のいず れかに記載の試薬。
[0016] (19) IgG重合体および Zまたは IgGを含む（12)〜（18)のいずれかに記載の試薬。
(20) 非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である（12)〜（17 )の 、ずれかに記載の試薬。
(21) 抗体を標識して！/ヽる酵素を不活性ィ匕した酵素を含む（12)〜 (20)の ヽずれ力ゝ に記載の試薬。
[0017] (22) 酵素がペルォキシダーゼである（12)〜（21)のいずれかに記載の試薬。
(23) 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である（12)〜（22)のいず れかに記載の試薬。
(24) さらに、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質 およびタンパク質安定化剤からなる群より選ばれる一つまたは複数の物質を含有す る（12)〜（23)の!、ずれかに記載の試薬。
[0018] (25) 測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として結合している 酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量方法にお いて、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標 識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的 に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成さ せる工程を含むことを特徴とする測定対象物の免疫学的定量方法における非特異 的反応の抑制方法。
[0019] (26) 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位 に特異的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ 測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む (25)記載の抑制方法。
(27) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2および 1 : 3である（25)または (2 6)記載の抑制方法。
[0020] (28) 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1および 1 : 2である（25)または（26)記 載の抑制方法。
(29) 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である（25)〜（28)のいずれかに記載の 抑制方法。
(30) 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である（25)〜（29)の ヽず れかに記載の抑制方法。
(31) 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる 工程に、 IgG重合体 Zまたは IgGを共存させる（25)〜（30)の 、ずれかに記載の抑制 方法。
[0021] (32) 非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である (25)〜 (29 )の 、ずれかに記載の抑制方法。
(33) 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる 工程に、不活性化した該標識酵素を共存させる (25)〜 (32)の ヽずれかに記載の抑 制方法。
(34) 酵素がペルォキシダーゼである（25)〜（33)の!、ずれかに記載の方法。
(35) 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である（25)〜（34)の 、ず れかに記載の抑制方法。
発明の効果
[0022] 本発明により、非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法、非特 異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬および測定 対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応の抑制方法が提供される。 図面の簡単な説明
[0023] [図 l]POD標識化抗 SIL-2Rモノクローナル F(ab')抗体のゲルろ過カラムクロマトグラム
2 発明を実施するための最良の形態
[0024] 1.非特異的反応
本発明における非特異的反応としては、測定対象物の免疫学的測定法において 見られる非特異的反応であれば特に制限はな 、が、 HAMAに起因する非特異的反 応、標識酵素に反応する抗体に起因する非特異的反応などがあげられる。 HAMAと しては、 HAMAタイプ Iおよび HAMAタイプ IIがあげられる。標識酵素に反応する抗体 としては、例えばペルォキシダーゼに反応する抗体、アルカリフォスファタ一ゼに反 応する抗体等があげられる。本発明における標識酵素に反応する抗体とは、本発明 の免疫学的測定法にぉ 、て用いて!、る酵素標識化抗体を標識して!/、る該酵素に反 応する抗体であり、非特異反応を惹起する。
[0025] 2.試料
本発明において使用される試料としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、 羊水、尿、汗、膝液などがあげられるが、全血、血漿、血清などが好ましい。
[0026] 3.測定対象物
本発明の測定対象物としては、抗原となる物質であればいかなるものでもよく特に 制限はないが、少なくとも 2個の抗原決定基を有する抗原であるのが好ましい。例え ば、 sIL-2R、心筋梗塞のマーカーとして知られているミオグロビン、クレアチンキナー ゼ MB (CK-MB)、トロポ-ン Tなどがあげられる。
[0027] 4.抗体
本発明において使用される酵素標識化抗体を形成する第 1の抗体としては、測定 対象物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなぐポリクローナル抗体、モノ クローナル抗体のいずれも使用できる力 モノクローナル抗体が好ましい。また、本発 明においては、抗体のみならず、抗体をパパイン処理により得られる Fab、ペプシン 処理により得られる F(ab')、ペプシン処理 還元処理により得られる Fab'などの Fc部
2
分を除去した抗体フラグメントも使用できる。抗体フラグメントとしては、 F(ab')が特に
2 好ましい。
[0028] 本発明において使用される固相化抗体を形成する第 2の抗体としては、測定対象 物に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなぐポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体のいずれも使用できる力 モノクローナル抗体が好ましい。第 2抗体は、 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異 的に結合する抗体であることが好ま 、。
[0029] 本発明において使用する抗体は、測定対象物またはそのェピトープに相当するぺ プチドを抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても 入手可能である。
sIL-2Rに特異的に結合する抗体としては、例えばノヽイブリドーマ AM92.3が産生す るモノクローナル抗体〔ピアース（PIERCE)社製〕、モノクローナル抗体 7G7/B6 (ピア ース社製;特開昭 62-70761公報参照）などがあげられ、それぞれ任意に第 1の抗体 または第 2の抗体として使用できる。
[0030] 5.酵素標識
本発明にお 、て第 1の抗体と結合して 、る酵素としては、例えばペルォキシダーゼ (以下、 PODと略す）、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、 13 -D-ガラクトシダ ーゼ、グルコースォキシダーゼなどがあげられ、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスフ ァターゼが好ましぐペルォキシダーゼが特に好ましい。ペルォキシダーゼとしては、 V、かなる由来のペルォキシダーゼも使用できる力 西洋ヮサビ由来のペルォキシダ ーゼが好ましい。アルカリフォスファターゼとしては、例えば牛小腸由来のアルカリフ ォスファターゼなどがあげられる。
[0031] 6.第 1抗体と酵素の結合
本発明における酵素標識化抗体は、測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体 に酵素が標識として結合しているものであるが、当該結合における結合様式としては 、例えば共有結合があげられ、酵素と抗体が直接結合していても、リンカ一などを介 して間接的に結合していてもよい。結合体の作製方法としては、例えばダルタールァ ルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジル 'ジスフイド法などをあげることができ る (例えば、石川榮治著「酵素免疫測定法」 1987年、医学書院発行参照）が、マレイミ ド法が好ま 、。具体的には、例えばイミノチオランなどでスルフヒドリルイ匕した抗体と 、スクシンィミジル 4- [N-マレイミドメチル] -シクロへキサン- 1カルボン酸（succinimidyl 4— [N— maleimidomethyl]— cyclohexane— 1— carboxylate、 SMCC)、 N— (6—マレイミドカプ ロイルォキシ)スクシンイミド〔N- (6- maleimidocaproyloxy) succinimide、 EMCS]などで マレイミドィ匕した酵素とを混合して調製することができる。
[0032] 7.酵素標識化抗体の抗体と酵素の結合数
本発明に使用する酵素標識化抗体は、抗体 1分子当たり少数の標識酵素分子が 結合している酵素標識ィ匕抗体であり、具体的には、第 1の抗体と酵素の結合数が、そ れぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つ または複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体であり、好 ましくは、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2および 1 : 3である酵素標識 化抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識ィ匕抗体のみを実質的に 含有する酵素標識化抗体であり、より好ましくは、第 1の抗体と酵素の結合数がそれ ぞれ 1： 1および 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複数の 酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体である。
[0033] 標識ィ匕抗体としては、第 1の抗体と酵素の結合数力 1：ほたは 1 : 2である酵素標識 化抗体が特に好ましぐ酵素標識ィ匕抗体が混合物であるときは、第 1の抗体と酵素の 結合数が 1：ほたは 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体の、全標識化抗体に対する分子数の 割合が 50%以上が好ましぐ 70%以上がより好ましぐ 90%以上が特に好ましい。 このような酵素標識ィ匕抗体は、前述のダルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレ イミド法、ピリジル 'ジスフイド法などで第 1の抗体と酵素とを結合させたあと、多数の酵 素が結合した第 1の抗体、未反応の酵素および抗体を、例えばイオン交換クロマトグ ラフィ一法、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法などの方 法やこれらの方法を組み合わせた方法などを用いて除去することにより調製すること ができる。
[0034] 8.固相化抗体
本発明における固相化抗体は、測定対象物に特異的に結合する第 2の抗体に分 離手段が結合しているものである。分離手段としては、固相それ自体または固相に結 合した物質に特異的に結合する物質等あげられる。当該結合における結合様式とし ては、固相を用いるときは非共有結合があげられ、固相に結合した物質に特異的に 結合する物質を用いるときは共有結合があげられ、抗体と該物質が直接結合してい ても、リンカ一などを介して間接的に結合していてもよい。固相に結合した物質およ びそれに特異的に結合する物質の組み合わせとしてはピオチンとアビジンの組み合 わせ等があげられる。
[0035] 固相としては、第 2の抗体を固定ィ匕し、測定対象物の免疫学的測定法を可能にす る固相であれば特に制限はなぐ例えばマイクロタイタープレートなどのポリスチレン プレート、ガラス製または合成樹脂製の粒状物 (ビーズ)、ガラス製または合成樹脂製 の球状物（ボール）、ラテックス、磁性粒子、ニトロセルロース膜などの各種メンブレン 、合成樹脂製の試験管などがあげられる。
[0036] 9. IgG重合体および IgG
本発明における IgG重合体としては、 IgGが重合したものであれば特に制限はなぐ 例えば MAK33- IgGl/IgGl Poly, MAK33- IgG(2b)/Fab(2a) Poly〔いずれも、ロシュ'ダ ィァグノスティックス（Roche Diagnostics)社製〕などがあげられる。本発明における IgG としては、動物の IgGであれば特に制限はなぐ例えばマウス、ラット、ハムスター、ゥ サギ、モルモット、ャギ、ヒッジ、 -ヮトリ、ゥシ、ゥマなどの動物の IgGがあげられるが、 マウス IgGが好ましい。動物の IgGは精製したものでもよいし、動物の血清でもよい。
[0037] 10.水性媒体
水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液などがあげられ、緩衝液が 好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特 に限定されないが、 pH 1〜11の例えば乳酸緩衝剤、クェン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、 コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールァミン緩衝剤、ジエタ ノールァミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リン ゴ酸緩衝剤、シユウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン 緩衝剤、グッド緩衝剤などがあげられる。
[0038] グッド緩衝剤としては、例えば 2—モルホリノエタンスルホン酸 (MES)緩衝剤、ビス（ 2 -ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル)メタン（Bis- Tris)緩衝剤、トリス（ヒド 口キシメチル）ァミノメタン (Tris)緩衝剤、 N- (2-ァセトアミド)イミノニ酢酸 (ADA)緩衝 剤、ピぺラジン- Ν,Ν'-ビス（2-エタンスルホン酸）（PIPES)緩衝剤、 2- [N- (2-ァセトァ ミド）ァミノ]エタンスルホン酸 (ACES)緩衝剤、 3-モルホリノ- 2-ヒドロキシプロパンスル ホン酸（MOPSO)緩衝剤、 2- [Ν,Ν-ビス（2-ヒドロキシェチル）ァミノ]エタンスルホン酸 (BES)緩衝剤、 3-モルホリノプロパンスルホン酸（MOPS)緩衝剤、 2- {N- [トリス（ヒドロ キシメチル)メチル]ァミノ }エタンスルホン酸 (TES)緩衝剤、 N- (2-ヒドロキシェチル) - Ν'- (2-スルホェチル）ピぺラジン（HEPES)緩衝剤、 3- [Ν,Ν-ビス（2-ヒドロキシェチル )ァミノ]- 2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（DIPSO)緩衝剤、 2-ヒドロキシ- 3- { [Ν-トリス (ヒドロキシメチル)メチル]ァミノ }プロパンスルホン酸（TAPSO)緩衝剤、ピぺラジン- N ,Ν'-ビス（2-ヒドロキシプロパン- 3-スルホン酸）（POPSO)緩衝剤、 Ν- (2-ヒドロキシェ チル） - Ν'- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル）ピぺラジン（HEPPSO)緩衝剤、 N- (2-ヒド 口キシェチル） -Ν'- (3-スルホプロピル）ピぺラジン（EPPS)緩衝剤、トリシン [Ν-トリス ( ヒドロキシメチル)メチルグリシン]緩衝剤、ビシン [Ν,Ν-ビス（2—ヒドロキシェチル）グリ シン]緩衝剤、 3- [Ν-トリス（ヒドロキシメチル)メチル]ァミノプロパンスルホン酸（TAPS) 緩衝剤、 2- (N-シクロへキシルァミノ）エタンスルホン酸（CHES)緩衝剤、 3- (N-シクロ へキシルァミノ） -2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（CAPSO)緩衝剤、 3- (N-シクロへキ シルァミノ）プロパンスルホン酸 (CAPS)緩衝剤などがあげられる。
[0039] 緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、 0.001-2.0 m ol/Lが好ましぐ 0.005〜1.0 mol/Lがより好ましぐ 0.01〜0.1 mol/Lが特に好ましい。
[0040] 11.金属イオン
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオンなどが あげられる。
[0041] 12.塩類
塩類としては、例えば塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウムなどがあげられる。
13.糖類
糖類としては、例えばマン-トール、ソルビトールなどがあげられる。
[0042] 14.界面活性剤
界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰ィ オン性界面活性剤、両性界面活性剤などがあげられ、非イオン性界面活性剤が好ま しい。非イオン性界面活性剤としては、例えばツイーン 20 (Tween 20)、ノ-デット P-4 0 (NP-40)などがあげられる。
[0043] 15.防腐剤
防腐剤としては、例えばアジィ匕ナトリウム、抗生物質 (ストレプトマイシン、ペニシリン 、ゲンタマイシンなど）、バイオエース、プロクリン 300、プロキセル（Proxel) GXLなどが あげられる。
[0044] 16.タンパク質 タンパク質としては、例えば牛血清アルブミン (BSA)、ゥシ胎児血清 (FBS)、カゼィ ン、ブロックエース TM (大日本製薬社製)などがあげられる。
[0045] 17.タンパク質安定化剤
タンパク質安定化剤としては、例えばパーォキシダーゼ安定ィ匕緩衝液 [Peroxidase Stabilizing Buffer,ダコサイトメーシヨン（DakoCytomation)社製〕などがあげられる。
[0046] 18.不活性化した酵素
本発明における不活性ィ匕した酵素としては、本発明の測定対象物の免疫学的定量 方法に用いる酵素標識ィ匕抗体の標識に用いている酵素と同じ酵素、すなわち同じ生 物由来で同じ酵素活性の酵素を不活性ィ匕したものであればよい。例えば、免疫学的 定量方法にぉ 、て POD標識ィ匕抗体を用いて 、る場合は、該 PODを不活性ィ匕したも のを用い、アルカリフォスファターゼ標識ィ匕抗体を用いている場合は、該アルカリフォ スファターゼを不活性ィ匕したものを用いる。不活性ィ匕した酵素は、担体や抗体に結合 したものでもよ ヽが、この場合の抗体は測定対象物や抗体と反応しな ヽものである必 要がある。不活性化とは、非特異反応の起因となる標識抗体に反応する抗体との反 応性は保ちながら、本発明の免疫学的定量方法に関与する酵素活性を完全または 実質的に欠失させることをいい、加熱処理、酸またはアルカリによる変性処理、プロテ ァーゼによる酵素消化、凍結融解等の処理、これらを組み合わせた処理により行うこ とができる。例えば PODでは 100〜125°Cで 10〜60分間処理することにより不活性化 P ODを得ることができる。不活性した PODとしては、 Inactive Poly-POD (ロシュ'ダイァ グノステイクス社製）があげられる。不活性ィ匕したアルカリフォスファターゼとしては、 Sc avenger- ALP (オリエンタル酵母社製)などがあげられる。
[0047] 19.測定対象物の免疫学的定量方法
本発明の測定対象物の免疫学的定量方法としては、測定対象物に特異的に結合 する第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標識 化抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識ィ匕抗体のみを実質的に 含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させ る工程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含む方法であれば特に制限 はないが、さらに第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原 決定部位に特異的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している固相化抗体を 試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程を含む方法が好まし い。
[0048] 酵素標識ィ匕抗体としては、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1、 1 : 2および 1
: 3である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体 のみを実質的に含有する酵素標識化抗体が好ましぐ第 1の抗体と酵素の結合数が それぞれ 1： 1および 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複 数の酵素標識ィ匕抗体のみを実質的に含有する酵素標識ィ匕抗体がより好ましい。
[0049] 標識ィ匕抗体としては、第 1の抗体と酵素の結合数力 1：ほたは 1 : 2である酵素標識 化抗体が特に好ましぐ酵素標識ィ匕抗体が混合物であるときは、第 1の抗体と酵素の 結合数が 1：ほたは 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体の、全標識化抗体に対する分子数の 割合が 50%以上が好ましぐ 70%以上がより好ましぐ 90%以上が特に好ましい。 具体的な定量方法としては、例えばサンドイッチ法、競合法などがあげられるが、サ ンドイッチ法が好ましい。サンドイッチ法としては、例えば 1ステップ法、ディレイ 1ステ ップ法、 2ステップ法などがあげられる。
[0050] より具体的な測定対象物の免疫学的定量方法の例としては、例えば以下の工程を 含有する定量方法があげられる。
(1)固相化抗体と試料中の測定対象物を反応させ、免疫複合体を形成させる工程（ 1次反応)、
(2)酵素標識化抗抗体と試料中の測定対象物を反応させ、免疫複合体を形成させる 工程 (2次反応)、
(3)免疫複合体を形成しな！ヽ酵素標識化抗体を固相と分離する工程、
(4)固相に生成した免疫複合体中の酵素標識の酵素活性を測定する工程、
(5)予め既知濃度の測定対象物を用いて作成した検量線より、工程 (4)で測定した 酵素活性と比較することにより測定対象物を定量する工程。
[0051] 上記の（1)と（2)の工程との間に、必要に応じて 1次反応後の固相を洗浄する工程 を追加してもよい。また、（1)の工程と（2)の工程は同時行うこともできる。
1次反応は水性媒体中で行われることが好ましい。 1次反応の反応温度としては、 例えば 0〜50°Cであり、 4°C〜40°Cが好ましい。 1次反応の反応時間としては、例えば 5分間〜 20時間である。 1次反応後の固相の洗浄の際に使用する洗浄液としては、 例えばリン酸緩衝ィ匕生理食塩水（0.15 mol/L塩化ナトリウムを含有する 10 mmol/Lリ ン酸緩衝液、 pH 7.2、以下、 PBSと記す)や界面活性剤を含有する PBSなどがあげら れる。界面活性剤としては、例えばツイーン 20などの非イオン性界面活性剤などがあ げられる。
[0052] 2次反応は水性媒体中で行われることが好ましい。 2次反応において使用され、酵 素標識化抗を形成する抗体 (第 1の抗体）における抗原決定基は、 1次反応において 使用される抗体 (第 2の抗体）における抗原決定基と異なっていることが好ましい。 2 次反応の反応温度としては、例えば 0〜50°Cであり、 4°C〜40°Cが好ましい。 2次反応 の反応時間としては、例えば 5分間〜 20時間である。 1次反応後の固相の洗浄の際 に使用する洗浄液としては、例えば前記の洗浄液などがあげられる。
[0053] 2次反応により固相上に生成した免疫複合体中の酵素標識の活性を測定する方法 としては、酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、免 疫複合体中の酵素活性を測定することができる。酵素の基質と当該酵素との反応は 、水性媒体中で行われることが好ましい。
酵素がペルォキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法、発光法など により免疫複合体中のペルォキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によ りペルォキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルォキシダーゼとその基 質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液 の吸光度を分光光度計などで測定する方法などがあげられる。酸化発色型色原体と しては、例えばロイコ型色原体、酸ィ匕カップリング発色型色原体などがあげられる。
[0054] ロイコ型色原体は、過酸ィヒ水素およびペルォキシダーゼなどの過酸ィヒ活性物質の 存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、 0-フエ-レンジァミン (0 PD)、テトラメチルベンジジン（TMB)、 10-N-カルボキシメチルカルバモイル- 3, 7-ビス (ジメチルァミノ）- 10H-フエノチアジン（CCAP)、 10-N-メチルカルバモィル-3,7-ビス (ジメチルァミノ）- 10H-フエノチアジン（MCDP)、 N- (カルボキシメチルァミノカルボ- ル） -4,4'-ビス（ジメチルァミノ）ジフエ-ルァミンナトリウム塩（DA- 64)、 4,4'-ビス（ジメ チルァミノ）ジフエ-ルァミン、ビス [3-ビス（4-クロ口フエ-ル)メチル -4-ジメチルァミノ フエ-ル]ァミン（BCMA)などがあげられる。
[0055] 酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルォキシダーゼなどの過 酸化活性物質の存在下、 2つの化合物が酸ィ匕的カップリングして色素を生成する物 質である。 2つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとァ-リン類（トリンダー試薬 )との組み合わせ、カプラーとフエノール類との組み合わせなどがあげられる。カプラ 一としては、例えば 4-ァミノアンチピリン（4-AA)、 3-メチル -2-ベンゾチアゾリノンヒド ラジンなどがあげられる。ァ-リン類としては、 N- (3-スルホプロピル）ァ-リン、 N-ェ チル- N- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル） -3-メチルァ-リン（TOOS)、 N-ェチル - N- (2-ヒドロキシ- 3-スルホプロピル）- 3,5-ジメチルァ-リン（MAOS)、 N-ェチル - N- (2- ヒドロキシ- 3-スルホプロピル）- 3,5-ジメトキシァ-リン（DAOS)、 N-ェチル - N- (3-ス ルホプロピル） -3-メチルァ-リン（TOPS)、 N- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル） -3,5- ジメトキシァ-リン（HDAOS)、 Ν,Ν-ジメチル- 3-メチルァ-リン、 Ν,Ν-ジ（3-スルホプロ ピル） -3,5-ジメトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル） -3-メトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル）ァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3-スルホプロピル） -3,5- ジメトキシァ-リン、 Ν- (3-スルホプロピル）- 3,5-ジメトキシァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (3- スルホプロピル） -3, 5-ジメチルァ-リン、 Ν-ェチル - Ν- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピ ル） -3-メトキシァ-リン、 Ν-ェチル -Ν- (2-ヒドロキシ -3-スルホプロピル）ァ-リン、 Ν- ェチル -Ν- (3-メチルフエ-ル） -Ν'-サクシ-ルエチレンジァミン（EMSE)、 Ν-ェチル- Ν- (3-メチルフエ-ル） -Ν'-ァセチルエチレンジァミン、 Ν-ェチル - Ν- (2-ヒドロキシ -3 -スルホプロピル） -4-フルォロ- 3,5-ジメトキシァ-リン（F- DAOS)などがあげられる。 フエノール類としては、フエノール、 4-クロ口フエノール、 3-メチルフエノール、 3-ヒドロ キシ -2,4,6-トリョード安息香酸 (ΗΤΙΒ)などがあげられる。
[0056] 過酸ィ匕水素の測定にぉ 、て、過酸ィ匕活性物質の濃度は、測定に適した濃度であ れば特に制限はな 、が、過酸ィ匕活性物質としてパーォキシダーゼを用いる場合は、 1〜100 kU/Lが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度で あれば特に制限はないが、 0.01〜10 g/Lが好ましい。
蛍光法によりペルォキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルォキシダ ーゼとその基質である過酸ィヒ水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、生成 した蛍光の強度を測定する方法などがあげられる。当該蛍光物質としては、例えば 4- ヒドロキシフエ-ル酢酸、 3-（4-ヒドロキシフエ-ル）プロピオン酸、クマリンなどがあげ られる。
[0057] 発光法によりペルォキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルォキシダ ーゼとその基質である過酸ィ匕水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、生成 した発光の強度を測定する方法などがあげられる。当該発光物質としては、例えばル ミノールなどがあげられる。
酵素がアルカリ性ホスファターゼである場合には、例えば発光法などにより複合体 中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリ性 ホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリ性ホスファターゼとその 基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計などで測定する方法など があげられる。アルカリ性ホスファタ一ゼの基質としては、例えば 3- (2'-スピロアダマ ンタン） -4-メトキシ -4- (3しホスホリルォキシ）フエ-ル- 1,2-ジォキセタン'ニナトリウム 塩 (AMPPD)、 2-クロ口- 5- {4-メトキシスピロ [1,2-ジォキセタン- 3,2'- (5'-クロ口）トリシ クロ（3.3.1.13'7)デカン]- 4-ィル }フエ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CDP- Star™)、
3- {4-メトキシスピロ [1,2-ジォキセタン- 3,2'- (5'-クロ口）トリシクロ（3.3.1.13'7)デカン]-
4-ィル }フエ-ルホスフェート 'ニナトリウム塩（CSPD™)、 [10-メチル -9 (10H) -アタリ ジ-ルイデン]フエノキシメチルリン酸.ニナトリウム塩（Lumigen™APS-5)などがあげら れる。
[0058] 酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法などにより免疫複合体中の ルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定 する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、生成した発光の 発光強度を発光強度計などで測定する方法などがあげられる。ルシフ ラーゼの基 質としては、例えばルシフェリンなどがあげられる。
[0059] 酵素が β -D-ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法 (比色法)などによ り免疫複合体中の j8 -D-ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法 (比 色法）により 13 -D-ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば 13 -D-ガラ クトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計などで測定する 方法などがあげられる。 j8 -D-ガラクトシダーゼの基質としては、例えば 2—クロロー 4 —ニトロフエ-ル D—ラタトシド、 2- -トロフエ-ル- j8 - D-ガラクトシド（ONPG)、 5 -ブロモ- 4-クロ口- 3-インドリル- 13 -D-ガラクトシド (X-gal)などがあげられる。
[0060] 酵素がグルコースォキシダーゼである場合には、グルコースォキシダーゼにその基 質であるグルコースを作用させ、生成した過酸ィ匕水素を測定することにより、免疫複 合体中のグルコースォキシダーゼ活性を測定することができる。過酸化水素の測定 は、例えば前述のペルォキシダーゼ活性の測定法により行うことができる。
本発明の免疫学的定量方法においては、前述の緩衝剤、金属イオン、塩類、糖類 、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タンパク質安定化剤などを反応に共存させること ができる。
[0061] 20.定量試薬
本発明の測定対象物を定量する免疫学的測定方法に用いる試薬は、測定対象物 に特異的に結合する第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1 である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体の みを実質的に含有する酵素標識化抗体、必要に応じて、第 1の抗体が結合する測定 対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異的に結合する第 2の抗体に 分離手段が結合している固相化抗体および Zまたは酵素活性測定用試薬をさらに 含有する。
[0062] 酵素標識ィ匕抗体としては、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1、 1 : 2および 1
: 3である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体 のみを実質的に含有する酵素標識化抗体が好ましぐ第 1の抗体と酵素の結合数が それぞれ 1： 1および 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複 数の酵素標識ィ匕抗体のみを実質的に含有する酵素標識ィ匕抗体がより好ましい。
[0063] 標識ィ匕抗体としては、第 1の抗体と酵素の結合数力 1：ほたは 1 : 2である酵素標識 化抗体が特に好ましぐ酵素標識ィ匕抗体が混合物であるときは、第 1の抗体と酵素の 結合数が 1：ほたは 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体の、全標識化抗体に対する分子数の 割合が 50%以上が好ましぐ 70%以上がより好ましぐ 90%以上が特に好ましい。 [0064] 本発明の測定用試薬の具体的態様を以下に記す。
•試薬 1
固相化抗体、酵素標識化抗体および、標識した酵素の活性測定用試薬を含有す る s¾薬。
•試薬 2
固相化抗体、酵素標識化抗体、 IgG重合体および標識した酵素の活性測定用試薬 を含有する試薬。
•試薬 3
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウス IgGおよび標識した酵素の活性測定用試薬 を含有する試薬。
'試薬 4
固相化抗体、酵素標識化抗体、 IgG重合体、マウス IgGおよび標識した酵素の活性 測定用試薬を含有する試薬。
[0065] ·試薬 5
固相化抗体、酵素標識化抗体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素およ び標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
•試薬 6
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウス IgG、抗体を標識している酵素を不活性化し た酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
•試薬 7
固相化抗体、酵素標識化抗体、 IgG重合体、抗体を標識している酵素を不活性ィ匕 した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
•試薬 8
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウス IgG、 IgG重合体、抗体を標識している酵素を 不活性化した酵素および標識した酵素の活性測定用試薬を含有する試薬。
[0066] ·試薬 9
固相化抗体、酵素標識化抗体、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象 物標準品を含有する試薬。 •試薬 10
固相化抗体、酵素標識化抗体、 IgG重合体、標識した酵素の活性測定用試薬およ び測定対象物標準品を含有する試薬。
•試薬 11
固相化抗体、酵素標識化抗体抗、マウス IgG、標識した酵素の活性測定用試薬お よび測定対象物標準品を含有する試薬。
•試薬 12
固相化抗体、酵素標識化抗体抗、 IgG重合体、マウス IgG、標識した酵素の活性測 定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
[0067] ·試薬 13
固相化抗体、酵素標識化抗体、抗体を標識している酵素を不活性化した酵素、標 識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬。
•試薬 14
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウス IgG、抗体を標識している酵素を不活性化し た酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試薬
•試薬 15
固相化抗体、酵素標識化抗体、 IgG重合体、抗体を標識している酵素を不活性ィ匕 した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含有する試 薬。
•試薬 16
固相化抗体、酵素標識化抗体、マウス IgG、 IgG重合体、抗体を標識している酵素を 不活性化した酵素、標識した酵素の活性測定用試薬および測定対象物標準品を含 有する試薬。
[0068] 本発明の測定用試薬における標識した酵素の活性測定用試薬としては、例えば当 該酵素の基質を含有する試薬があげられる。当該酵素活性測定用試薬における酵 素としては、例えば前述の酵素があげられる。当該基質としては、例えば前述の基質 があげられる。 本発明の測定用試薬における測定対象物標準品としては、例えば既知濃度に調 整された測定対象物の水溶液があげられる。
本発明の測定用試薬は、キットの形態で保存、運搬されてもよぐまた、必要に応じ て、前述の緩衝剤、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タン パク質安定化剤などを含有してもよ ヽ。
以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚 、本実施例においては、下記メーカーの試薬、酵素、血清および器具を使用した。 ハイプリドーマ AM92.3：ピアース社製
ハイプリドーマ 7G7/B6：ピアース社製
-MEM (Minimum Essential Medium alpna Medium)：インビトロンェン (Invitrogen) 社製
96穴マイクロタイタープレート：ナルジェ'ヌンク 'インターナショナル（Nalge Nunc Inter national)社製
BSA：インタージ工ン（InterGen)社製
サッカロース：関東ィ匕学社製
ツイーン 20 :関東化学社製
ゲンタマイシン：和光純薬工業社製
塩化ナトリウム：和光純薬工業社製
バイオエース：クミアイイ匕学工業社製
オルトフエ-レンジァミン（OPD)：シグマ アルドリッチ社製
尿素過酸化水素塩：シグマ アルドリッチ社製
プロタリン：シグマ アルドリッチ社製
POD：東洋紡績社製、ロシュ .ダイァグノスティックス社製
硫酸:関東化学社製
ペプシン：ロシュ ·ダイァグノスティックス社製
イミノチオラン：ピアース社製
EMCS :ピアース社製
FBS：ハイクローン（HyClone)社製 NP-40：カルビオケム（Calbiochem)社製
マウス IgG :スカンテイボデーズ'ラボラトリー（Scantibodies Laboratory)社製 プロキセル GXL：アビシァ（Avecia)社製
POD安定ィ匕緩衝液：ダコサイトメーシヨン社製
MES :同仁化学研究所社製
MAK33- IgGl/IgGl Poly：ロシュ ·ダイァグノスティックス社製
MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Poly：ロシュ ·ダイァグノスティックス社製
正常人血清:アリエス社製
HAMA血清タイプ I：ロシュ ·ダイァグノスティックス社製
HAMA血清タイプ II：ロシュ'ダイァグノスティックス社製
Inactive Poly- POD：ロシュ ·ダイァグノスティックス社製
[0070] 参考例 1 抗 SIL-2Rモノクローナル抗体の調製と精製
抗 SIL-2Rモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ AM92.3およびハイプリドー マ 7G7/B6をそれぞれプリスタン等で処理したマウス腹腔に移植し、腹水を回収した。 腹水からモノクローナル抗体を、常法に従いプロテイン Aカラム rプロテイン Aセファロ ース'ファスト'フロー（rProtein A Sepharose Fast Flow,アマシャム'バイオサイエンス 社製)を用いて精製した。ハイプリドーマ AM92.3より得られたモノクローナル抗体を K TM-302抗体、ハイプリドーマ 7G7/B6より得られたモノクローナル抗体を KTM-303抗 体とした。
[0071] 参考例 2 sIL- 2Rの調製
凍結保存された、 SIL-2Rを分泌発現することが知られて 、るリンフォーマ細胞株 U9 37 (大日本製薬株式会社製)を 37°Cの水浴で素早く解凍し、 15 mL滅菌チューブに 移し 10% FBS、ペニシリン、ストレプトマイシンを含有する α - MEMを 10 mL添加し、穏 やかに懸濁した。これを室温で 5分間遠心分離 (1200 rpm)した後、上清を吸引除去 した。残渣に同培地を 10 mL添加し懸濁させた細胞懸濁液を 25cm2Tフラスコに全量 移し、炭酸ガス培養装置（5%CO、 37°C)で 2〜3日間培養した。その後、 150cm2Tフ
2
ラスコ、 225cm2 Tフラスコへと順次、拡大培養を行った。 225cm2Tフラスコ内で細胞が 100%コンフルェントになったことを確認した後、培養上清を滅菌された容器に回収し 、 4°Cで 10分間遠心分離（1200 rpm)した。遠心分離により得られた上清を滅菌された 容器に移し、 15分間穏やかに撹拌した後、 0.2 mフィルターでろ過処理をしたもの を SIL-2Rの標準物質とした。
[0072] なお、文献〔J. Immunol., 135, 3172-3177 (1985)〕に基づき、 10% IL- 2で 4日間刺 激した正常ヒ HL-2依存性 T細胞の無細胞培養上清 (無希釈）中に含まれる SIL-2Rの 量を 1000 U/mLとして、標準物質の値付けを行った。
[0073] 参考例 3 抗 SIL-2Rモノクローナル抗体を固定ィ匕した固相の調製
KTM-302抗体を終濃度 4 /z g/mLになるように PBSで希釈し、固相用の 96穴マイクロ タイタープレートの各ゥエルに 100 Lずつ添カ卩した。室温で 1晚静置後、ブロッキン グ液〔1% BSA、 5%サッカロース、 0.05%ツイーン 20、 0.01%ゲンタマイシン硫酸塩 を含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH 7.2〕で洗浄し、ブロッキング液を 200 μ Lカロ え室温で 1晚静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、真空乾燥機で 3 日間乾燥し、抗 SIL-2Rモノクローナル抗体固定ィ匕固相（プレート）を調製した。
実施例 1
[0074] (1) POD標識化抗 SIL-2Rモノクローナル F(ab')抗体の作製
2
参考例 1で調製した KTM-303抗体を 0.01%ペプシンで消化した後、 G3000SWカラ ム（東ソ一社製； φ 21.5 mm X 60 cm)を用いた HPLCシステム（日立製作所社製)で F( ab')を分離精製した。得られた F(ab') 4 mgを 100 mmol/Lホウ酸緩衝液 (pH 8.0)で
2 2
透析した。
該抗 SIL-2Rモノクローナル F(ab')抗体と POD (東洋紡績社製）とを以下のようにマレ
2
イミド法によって結合させた。
[0075] すなわち、該 F(ab')をイミノチオランを用いてスルフヒドリル化し、セフアデックス G-2
2
5カラム (アマシャム'バイオサイエンス社製)で未反応のイミノチオランを除去した。 P ODは、マレイミド化試薬 EMCSを用いてマレイミド化し、セフアデックス G- 25カラムで 未反応の EMCSを除去した。上述のスルフヒドリル化した該 F(ab')モノクローナル抗体
2
とマレイミドィ匕した PODとを混合し、 30°Cで 30分間反応させ、 POD標識ィ匕抗 sIL- 2Rモ ノクローナル F(ab')抗体を作製した。
2
[0076] (2)ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる P〇D標識化抗 SIL-2Rモノクローナル F(ab， )抗体の分離
2
F(ab')抗体の分子量は約 92 kDa、 PODの分子量は約 44 kDaである。従って、該抗
2
体と PODの結合数力 l : lである酵素標識ィ匕抗体の分子量は約 136 kDa, 1 : 2のものは 約 180 kDa、 1 : 3のものは約 224 kDa、 1 :4のものは約 268 kDa、 1 : 5のものは約 312 kD a、 2 : 1のものは約 228 kDa、 2 : 2のものは約 272 kDa、 2 : 3のものは約 316 kDa、 3 : 1の ものは約 320 kDaと計算される。
[0077] 上記（1)に記載の方法で調製した標識化抗体を、 G3000SWカラム (東ソ一社製； φ 21.5mm X 60cm)を用いた HPLCシステム（日立製作所社製）で分画した。 0.1 mol/Lリ ン酸緩衝液 (pH 7.4)を移動相として流速 3 mL/分、室温で HPLCを行った。フラクショ ン回収は 3 mLZフラクションで行った。なお分子量マーカーは高分子量ゲルろ過較 正用キット（HMW Gel Filtration Calibration Kit,アマシャム'バイオサイエンス社製） および低分子量ゲルろ過較正用キット（LMW Gel Filtration Calibration Kit,アマシ ャム ·ノィ才サイエンス社製)を使用した。
[0078] 各フラクションの 280 nmでの吸光度を測定した結果を図 1に示す。図 1に示すように 1)フラクション 33、 2)フラクション 40、 3)フラクション 43、 4)フラクション 48、 5)フラクシ ヨン 52に吸光度のピークが確認された。
分子量マーカーとの比較により推定された上記の吸光度のピークを示した各フラク シヨンの分子量は、それぞれ 1) 250 kDa以上、 2)約 170 kDa、 3)約 140 kDa、 4)約 10 0 kDa, 5)約 40 kDaであった。従って、 1)フラクション 33中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(a b')と PODが重合ィ匕した標識ィ匕抗体、 2)フラクション 40中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab
2
') 1分子に POD 2分子が結合した標識抗体、 3)フラクション 43中の酵素標識ィ匕抗体
2
は、 F(ab') 1分子に POD 1分子が結合した標識抗体、 4)フラクション 48には、未反応
2
の F(ab') I 5)フラクション 52には、未反応の PODが含有されることが推測された。
2
[0079] (3) SDS-PAGEによる各フラクション中の酵素標識ィ匕抗体の同定
上記（2)で得られたフラクション 32〜52の各フラクションにつ!/、て、それぞれのフラク シヨン由来の蛋白量が 2〜3 μ gZレーンになるように電気泳動用サンプルを調製し た。このサンプルに SDS-PAGE用サンプルバッファー [8% SDS (和光純薬工業社製） 、 24% 2-メルカプトエタノール (ナカライテスタ社製）、および 40%グリセロール（関東 化学社製）を含有する 1 mol/L Tris緩衝液、 pH 6.8]を 1/4量添カ卩し、 95°Cで 5分間加 熱した。熱処理したサンプルを SDS-PAGE用ゲル〔パジエル SPG-520L (アト一社製） 〕に 20 μ LZレーンでアプライし、ゲル 1枚当たり 20 mAで電気泳動を行い、常法に従 いバンドを検出した。なお、分子量マーカーはプレステインド'ブロード'レンジ〔Prest ained Broad Rangeゝ Bio— Rad社製、 250 kDaゝ 150 kDaゝ 100 kDaゝ 75 kDaゝ 50 kDaゝ 3 7 kDa、 25 kDa、 16 kDa、 10 kDa)を使用した。
[0080] SDS-PAGEで得られたバンドの位置と分子量マーカーから、フラクション 32〜35中 の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と PODの結合数がそれぞれ 1 : 5、 2 : 3、 3 : 1などの高重
2
合体である酵素標識化抗体の混合物 (バンドはスメァ状に観察された）、フラクション 3 6中の酵素標識ィ匕抗体は F(ab')と PODとの結合数がそれぞれ 1 :4および 2 : 2である酵
2
素標識化抗体、フラクション 37中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と PODとの結合数がそ
2
れぞれ 1 :4、 1 : 3、 2 : 1および 2 : 2である酵素標識ィ匕抗体の混合物であると同定した。
[0081] 同様に、フラクション 38中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と PODとの結合数がそれぞ
2
れ 1： 3および 2： 1である酵素標識化抗体の混合物、フラクション 39中の酵素標識ィ匕抗 体は、 F(ab')と PODとの結合数がそれぞれ 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標識ィ匕抗
2
体の混合物、フラクション 40〜41中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と PODとの結合数
2
力 S 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体、フラクション 42中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と POD
2 との結合数がそれぞれ 1 : 2および 1： 1である酵素標識ィ匕抗体の混合物、フラクション 4 3〜46中の酵素標識ィ匕抗体は、 F(ab')と PODとの結合数力 ： 1の酵素標識ィ匕抗体で
2
あると同定した。
[0082] また、フラクション 47中のタンパク質は、 F(ab')と PODとの結合数力 ： 1の酵素標識
2
化抗体と未反応 F(ab')の混合物、フラクション 48〜51中のタンパク質は、未反応 F(ab'
2
)、フラクション 52中のタンパク質は未反応の PODであると同定した。
2
[0083] (4)各フラクション中の酵素標識ィ匕抗体を用いる SIL-2Rの定量用検量線の作成
参考例 3で調製した固相化プレートに、 0 U/mL、 200 U/mL、 400 U/mL、 1600 U/m L、 3200 U/mL、 6400 U/mLの sIL- 2Rを含む標準物質溶液（150 mmol/L塩化ナトリウ ム、 4% BSA、 1%サッカロースおよび 0.01%バイオエースを含有する 10 mmol/Lリン 酸緩衝液、 pH 7.5)を各ゥエルに 50 Lずつ添加した。酵素標識化抗体希釈液 [150 mmol/L塩化ナトリウム、 10% FBS、 0.2% NP- 40、 100 μ g/mLマウス IgG、 0.2%プロ キセル GXL、 10% POD安定化緩衝液および 0.16 g/mL POD (ロシュ ·ダイァグノス ティックス社製）を含有する 100 mmol/Lの酢酸緩衝液、 pH 6.0]を用いて上記（2)の 各フラクション中の標識ィ匕抗体を希釈して調製した標識ィ匕抗体溶液 (24〜140 ng/mL )を各ゥエルに 50 Lずつ添加し、水平回転振とう器を用い室温で 90分間振とうした（ 140〜160 rpm)。洗浄液（150 mmol/L塩化ナトリウム、 0.05%ツイーン 20を含有する 1 0 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH 6.8)で各ゥヱルを洗浄後、 OPD溶液〔2 mg/mL OPD、 0. 75g/L尿素過酸化水素塩、 0.01%プロクリン 300を含有する 100 mmol/Lリン酸—タエ ン酸緩衝液、 pH 4.4〕を各ゥエル 100 Lずつ添加し、室温で 30分間、静置反応させ た。反応停止液として 1 mol/L硫酸を 50 μ L添加し、反応液の吸光度を主波長 490 η m、副波長 660應で測定した。抗原濃度と吸光度力も各フラクションの標識ィ匕抗体別 に検量線を作成した。
[0084] (5) POD標識抗 SIL-2Rモノクローナル抗体を用いた試料中の SIL-2Rの測定
試料として、 HAMA血清タイプ I (Lot. 92069721)、 HAMA血清タイプ II(Lot. 1448268 4)および正常人血清（Lot. 101001-2) 50 Lを用い、各血清試料中の sIL-2Rを、上 記（2)の各フラクションの標識ィ匕抗体を用いて上記 (4)記載の方法で測定した。 sIL- 2R測定値 (U/mL)を第 1表に示す。
[0085] [表 1]
第 1表
Figure imgf000028_0001
[0086] 抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 :5,2:3,3: 1などを含む高重合体である酵素標 識化抗体であるフラクション 32〜35では HAMA血清タイプ Iにおける SIL-2Rの測定値 が 1000 U/mLを越えており、特に高重合化していると考えられるフラクション 32は約 16 000 U/mLと高値であった。また、抗体と酵素の結合数力 1: 4または 2 :2と同定された フラクション 36もかなりの高値を示した。
[0087] しかし、抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 :3、 2:1、 1 :2および 1： 1である酵素標識 化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを含有すると 同定されたフラクション 38から 46中の酵素標識化抗体では、ほぼ 500 U/mL以下と HA MA血清タイプ Iの非特異反応が抑制されることが示された。
特に、 F(ab') 1分子に POD 2分子が結合した酵素標識化抗体を含有するフラクショ
2
ン 40力も F(ab') 1分子に POD 1分子が結合した酵素標識化抗体を含有するフラクショ
2
ン 46付近で約 300 U/mLで平衡状態となった。
[0088] これらの結果より、抗体 1分子当たり少数の標識酵素分子が結合している酵素標識 化抗体、好ましくは、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1:1、 1:2、 1:3および 2:1 である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体の みを実質的に含有する酵素標識化抗体、より好ましくは、第 1の抗体と酵素の結合数 がそれぞれ 1： 1、 1 : 2および 1 : 3である酵素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つま たは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵素標識化抗体、特に好まし くは、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1および 1 : 2である酵素標識ィ匕抗体か らなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有する酵 素標識ィ匕抗体を用いることにより HAMA血清タイプ Iに強く認められる非特異反応が 効果的に抑制されることが示される。
実施例 2
[0089] HAMA非特異反応におけるマウス IgGの効果
HAMAによる非特異的反応の抑制に及ぼすマウス IgGの添加効果を検討した。実 施例 1で調製したフラクション 40〜46中の酵素標識化抗体を酵素標識抗体希釈液〔1 50 mmol/L塩化ナトリウム、 10% FBS、 0.2% NP- 40、マウス IgG、 0.2%プロキセル GX L、 10%POD安定化緩衝液、 0.16 μ g/mL POD (ロシュ'ダイァグノスティックス社製） を含有する75 mmol/L MES緩衝液 (pH6.5)〕で希釈し、マウス IgG濃度をそれぞれ 0、 20、 40、 60、 80、 100、 200 μ g/mLとなるように調製した。
[0090] HAMA血清タイプ I (Lot. 92069721)、 HAMA血清タイプ II(Lot. 14482684)および正 常人血清 (Lot. 101001-2)各 50 Lを用い、各血清中の sIL-2R活性を、実施例 1 (5) と同様な方法で測定した。
結果を第 2表に示す。
[0091] [表 2]
第 2表
Figure imgf000030_0001
[0092] マウス IgGが添カ卩されていない時の HAMA血清タイプ IIの測定値は 9000 U/mL以上 で HAMAによる非特異反応が生じている力 マウス IgGを 20 g/mL添加することで H AMAによる非特異反応が抑制され、 437 U/mLまで低下した。し力しながら、さらにマ ウス IgGを添カ卩することで HAMA血清の測定値が低下し、 80 μ g/mL以上の添カ卩で si L-2R値は平衡に達した。 HAMA血清タイプ Iにおいても、 80 g/mLで測定値が平衡 に達したが、 HAMA血清タイプ IIの時のような大きな変化は見られな力つた。また、正 常人血清の測定値はマウス IgG濃度に依存せず一定であることから、マウス IgGの添 加は、 200 g/mLまで測定系に影響を及ぼさないことが確認された。これらの結果 から、マウス IgGを 80 g/mL以上添加することで HAMA血清タイプ IIによる非特異反 応を十分に抑制できることが判明した。 HAMA血清タイプ Iにお ヽても抑制効果は確 f*i¾ れ 。
実施例 3
[0093] HAMA非特異反応における高重合ィ匕マウス IgGの効果および高重合ィ匕マウス IgGの 至適濃度の検討
HAMAによる非特異的反応の抑制に及ぼす高重合ィ匕マウス IgGの添加を検討した 。実施例 1で調製したフラクション 40〜46中の酵素標識化抗体を酵素標識抗体希釈 液〔150 mmol/L塩化ナトリウム、 10% FBS、 0.2% NP- 40、 100 g/mLマウス IgG、高 重合化マウス IgG、 0.2%プロキセル GXL、 10% POD安定化緩衝液および 0.16 g/ mL POD (ロシュ'ダイァグノスティックス社製）を含有する 75 mmol/L MES緩衝液、 pH 6.5〕で希釈した。重合化マウス IgGとして MAK33-IgGl/IgGl Polyを用いた場合は、 該濃度がそれぞれ 0、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 300 g/mLとなるように酵素標 識化抗体溶液を調製した。重合ィ匕マウス IgGとして MAK33- IgG(2b)/Fab(2a) Polyを用 いた場合には、該濃度がそれぞれ 0、 5、 50、 100 μ g/mLの濃度となるように酵素標 識化抗体を調製した。
[0094] HAMA血清タイプ I (Lot. 90643629)、 HAMA血清タイプ II (Lot. 92069831)および正 常人血清 (Lot. 101001-2)各 50 Lを用い、各血清中の sIL-2Rを、実施例 1 (5)と同 様な方法で測定した。
MAK33-IgGl/IgGl Polyの添加効果を第 3表に示す。
[0095] [表 3] 第 3表
Figure imgf000031_0001
[0096] その結果、第 3表に示すように、 MAK33-IgGl/IgGl Poly未添加の状態での HAMA 血清タイプ I中の sIL- 2Rの測定値は 435 U/mLである力 MAK33- IgGl/IgGl Polyの 添加濃度依存的に測定値が低下し、添加濃度 125 g/mL以上で SIL-2Rの測定値 がほぼ一定となった。
また、 MAK33-IgGl/IgGl Polyを 300 μ g/mLまで添カ卩しても正常人血清の測定値 が変動しておらず、 300 g/mLまでの MAK33-IgGl/IgGl Poly添カ卩は測定系に影響 を及ぼさな!/、ことが確認された。
[0097] これらの結果より、酵素標識ィ匕抗体溶液に MAK33 - IgGl/IgGl Polyを 125 μ g/mL 以上添加することで HAMA血清タイプ Iによる非特異反応を十分に抑制できることが 判明した。
また、 MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Polyの添加効果を第 4表に示す,
[0098] [表 4] 第 4表
Figure imgf000032_0001
[0099] 第 4表に示されて 、るように、 MAK33-IgG(2b)/Fab(2a) Polyを MAK33-IgGl/IgGl P olyの代わりに用いた場合でも、同様に、 HAMA血清タイプ I中の SIL-2Rの測定値が低 下した。
このことから、 IgGlだけでなぐその他のサブタイプの IgG重合体を添加することでも HAMA血清タイプ Iによる非特異反応を抑制できることが判明した。
実施例 4
[0100] HAMA血清検体中の sIL-2Rの測定（1)
実施例 1で調製したフラクション 40〜46の酵素標識化抗体を標識化抗体希釈液（15 0 mmol/L塩化ナトリウム、 10% FBS、 0.2% NP- 40、 100 μ g/mLマウス IgG、 200 μ g/ mL MAK33- IgGl/IgGl Poly, 0.2%プロキセル GXL、 10% POD安定化緩衝液およ び 0.16 μ g/mL PODを含有する 75 mmol/L MES緩衝液、 pH 6.5)により希釈して調 製した酵素標識化抗体溶液を用いて、実施例 1 (5)の方法と同様により、 HAMA血清 タイプ I (Lot. 90643637)および HAMA血清タイプ II (Lot. 92069840)中の sIL-2Rを測 定した。以下、上記で調製した酵素標識化抗体溶液、および実施例 1 (4)に記載の 方法で用いる酵素標識ィ匕抗体溶液以外の試薬 (参考例 3で調製した固相化プレート 、実施例 1 (4)の標準物質溶液、洗浄液、 OPD溶液および反応停止液）をまとめて、「 実施例 4の試薬」とよぶ。以下に実施例 4の試薬の組成を記載する。
[0101] 実施例 4の試薬 抗 sIL- 2R抗体固定化プレート： 4 /z g/mL KTM- 302抗体を 100 μ L/ゥエルで固相化し た 8ゥエル X 12ストリップの 96ウェルマイクロタイタ一プレート
標準物質溶液： 0U/mL、 200U/mL、 400U/mL、 1600U/mL、 3200U/mL、 6400U/mL の sIL-2Rをそれぞれ含む標準物質溶液（150mmol/L塩ィ匕ナトリウム、 4% BSA、 1% サッカロースおよび 0.01%バイオエースを含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH7.5) 酵素標識化抗体溶液:所定量 (24〜140ng/mL)の実施例 1のフラクション 40〜46の P OD標識化抗体を含む標識化抗体希釈液（150 mmol/L塩ィ匕ナトリウム、 10% FBS、 0. 2% NP— 40、 100 μ g/mLマウス IgG、 200 μ g/mL MAK33— IgGl/IgGl Poly, 0.2%プ ロキセル GXL、 10% POD安定ィヒ緩衝液および 0.16 /x g/mL PODを含有する 75 mmo 1/L MES緩衝液、 pH 6.5)
洗浄液： 150 mmol/L塩化ナトリウム、 0.05%ツイーン 20を含有する 10 mmol/Lリン酸 緩衝液、 pH 6.8
OPD溶液: 2 mg/mL OPD、 0.75g/L尿素過酸ィ匕水素塩、 0.01%プロクリン 300を含有 する 100 mmol/Lリン酸—クェン酸緩衝液、 pH 4.4
反応停止液： 1 mol/L硫酸
また、別にィムラィズ IL-2R(DPC社製）を用いた各血清中の SIL-2Rの測定も行った 。結果を表 5表に示す。
[0102] [表 5] 第 5表
Figure imgf000033_0001
[0103] その結果、ィムラィズ IL-2Rのキットを用いた測定よりも、 HAMA血清中の SIL-2Rが 低く、 HAMAの非特異反応を十分に抑制できて 、ることが示唆された。
実施例 5
[0104] HAMAを含む検体の sIL-2Rの測定（2)
正常人血清に HAMA血清を量を変えて添カ卩した検体の sIL-2Rを測定し、 HAMA© 濃度が測定値に及ぼす影響を調べた。
まず、検体の調製に用いる HAMA血清タイプ I (Lot. 90643656) HAMA血清タイプ I KLot. 92069858)および正常人血清 (F41489B)を試料とし、各試料の sIL-2Rを実施 例 4の試薬を用いて測定し、また HAMAを HAMA測定用サンドイッチ ELISAキットであ るィムストリップ HAMAフラグメント（ImmuSTRIP HAMA Fragment)〔ィムノメディクス（I m nomedics)社製〕を用いて測定した。それぞれの測定結果、および検体の調製に は 5倍濃縮した HAMA血清（以下、 5 X HAMA血清とよぶ）を用いるので、 5 X HAMA 血清の SIL-2Rおよび HAMAの濃度の理論値 (理論値 =測定値 X 5)を第 6表に示し た。
[表 6] 第 6表
Figure imgf000034_0001
5 X HAMA血清（タイプほたはタイプ Π)と正常人血清とを 1： 1 1： 2および 1： 4でそれ ぞれ混合したものを試料として、各試料の SIL-2Rを実施例 4の試薬およびィムライズ I L-2Rを用いて測定した。一方、上記で求めた 5 X HAMA血清および正常人血清の si L-2R濃度と試料の血清の混合比と力も計算される、各試料の sIL-2Rの理論値を求 め、さらに各試料の SIL-2Rの理論値に対する測定値の比から、測定値への影響率（ %)を求めた。各試料の HAMAの濃度も SIL-2Rの理論値と同様にして計算により求め た。
5 X HAMA血清と正常人血清の混合比が 1： aの場合の SIL-2Rの理論値
=(5 X HAMA血清の SIL-2R濃度 (理論値) +正常人血清の sIL-2R濃度 X a)Z (1 + a) 影響率(％)=〔(sIL- 2R濃度の測定値 ZsIL- 2R濃度の理論値) X 100〕一 100
第 7表に実施例 4の試薬を用 V、た場合、第 8表にィムラィズ IL-2Rを用 、た場合それ ぞれの、各試料中の HAMAの濃度、 SIL-2R濃度の理論値と測定値、影響率を示した [0107] [表 7] 第 7表 実施例 4の試薬での測定
Figure imgf000035_0001
[0108] [表 8] ィムラィズ I L-2Rでの測定
Figure imgf000035_0002
HAMA血清タイプ Iに関して、実施例 4の試薬で測定した場合は、 HAMA濃度が 65. 3 μ g/mL (巿販 HAMA血清タイプ Iに含まれる HAMAの 2.5倍）まで上昇しても測定値 への影響率は 10%以下である力 ィムライズ IL-2Rで測定した場合は、測定値への影 響率が 30〜40%であり HAMAの影響を受けることが判明した。また、 HAMA血清タイ プ IIに関して、実施例 4の試薬で測定した場合は、 HAMA濃度が 31.1 μ g/mL (巿販 Η AMA血清タイプ Πに含まれる HAMAの 2.5倍）まで上昇しても測定値への影響率は 5 %以下であるが、ィムライズ IL-2Rで測定した場合は、測定値への影響率が 120〜 160 %であり HAMAの影響を大きく受けることが判明した。これらの結果力もも、ィムライズ IL-2Rでは HAMAによる非特異反応の抑制が不十分である力 実施例 4の試薬は、 H AMAによる非特異反応を十分に抑制できていることが示唆された。
実施例 6
sIL- 2R測定キット
下記の各試薬からなる試薬キットを構成した。
1) 抗 sIL- 2R抗体固定ィ匕プレート
4 μ g/mL KTM-302抗体を 100 μ L/ゥエルで固相化した 8ゥエル X 12ストリップの 96 ウエノレマイクロタイタ一プレート
2) 酵素標識化抗体
組成：所定量（24〜140ng/mL)の実施例 1のフラクション 40〜46の POD標識化抗体 を含む標識化抗体希釈液（150 mmol/L塩ィ匕ナトリウム、 10% FBS、 0.2% NP- 40、 10 0 μ g/mLマウス IgG、 200 μ g/mL ΜΑΚ33- IgGl/IgGl Poly, 0.2%プロキセル GXLゝ 1 0% POD安定化緩衝液および 0.16 g/mL PODを含有する 75 mmol/L MES緩衝液 、 pH 6.5)
容量： 6 mLZボトル
3) 標準物質
0U/mL、 200U/mL、 400U/mL、 1600U/mL、 3200U/mL、 6400U/mLの sIL- 2Rをそれ ぞれ含む標準物質溶液（150mmol/L塩化ナトリウム、 4% BSA、 1%サッカロースおよ び 0.01%バイオエースを含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH7.5) 0.5mL/バイアル 相当の凍結乾燥品
4) 検体希釈液
組成： 150 mmol/L塩化ナトリウム、 4% BSA、 1%サッカロース、 0.2%プロキセル GX Lおよび 20 g/mLマウス IgGを含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液 (pH7.45)
容量： 6 mLZボトル。
5) 発色基質
OPDタブレット（シグマ アルドリッチ社製） 10 mgZ錠 X 6
6) 発色基質溶解液
組成： 0.75g/L尿素過酸化水素塩および 0.1%プロクリン 300を含有する 100 mmol/ Lリン酸一クェン酸緩衝液 (pH 4.4)
容量： 30mL/ボトル
7)反応停止液
組成： 1 mol/L硫酸
容量： 6 mLZボトル
8) 洗浄液
150 mmol/L塩化ナトリウムおよび 0.05%ツイーン 20を含有する 10 mmol/Lリン酸緩 衝液（pH 6.8)
実施例 7
[0111] PODに反応する抗体に起因する非特異反応の抑制
(1) HAMA以外の原因による非特異反応を示す検体
ヒトの血清である検体 Aを、検体希釈液（50 mmol/L塩化ナトリウム、 4% BSA、 1% サッカロース、 0.2%プロキセル GXLおよび g/mLマウス IgGを含有する 10 mmol/L リン酸緩衝液、 PH7.45)で 1/1、 1/4、 1/8に希釈し、それぞれの sIL-2Rの濃度を実施 例 4の試薬で測定した。第 9表に、測定値および測定値と希釈率とから求めた検体原 液の SIL-2Rの計算値を示した。検体原液の SIL-2R計算値が希釈率によって異なって いて、希釈直線性が不良であり、非特異反応が生じていることが判明した。
[0112] [表 9] 第 9表
Figure imgf000037_0001
[0113] 検体 Aの非特異反応の原因が HAMAであるかどうかを確認するため、検体 Aに含ま れる HAMAの濃度を、 HAMA測定キットである HAMA ELISA (ロシュ'ダイァグノスティ ックス社製)を用いて測定した。結果を第 10表に示した力 HAMA血清タイプ I、 HAM A血清タイプ IIでは、高濃度の HAMAが検出された力 検体 Aの HAMA値は定量限界 である 5 ng/mLを下回っており、 HAMAの存在が否定された。したがって、検体 Aの非 特異反応は、 HAMA以外の原因によるものと考えられた。
[表 10] 第 10表
Figure imgf000038_0001
[0115] (2)検体 Aの非特異反応の抑制
検体 Aを検体希釈液で 1/2、 1/4、 1/6、 1/11、 1/21、 1/31に希釈し、以下に示す構 成カゝらなる、過ヨウ素酸法で標識された POD標識抗体を用いた SIL-2R測定試薬 (以 下、 SIL-2R測定試薬 Bとよぶ)を用いて SIL-2Rを測定し、測定値と希釈率から検体原 液の SIL-2Rの計算値を求めた。なお、 SIL-2R測定試薬 Bは酵素標識ィ匕抗体溶液以 外は実施例 4の試薬と同じ構成であり、その POD標識抗体は、ゲルろ過による抗体の 分離はされていない。
[0116] sIL- 2R測定試薬 B
抗 sIL- 2R抗体固定化プレート：4 /z g/mL KTM- 302抗体を 100 μ L/ゥエルで固相化し た 8ウエノレ X 12ストリップの 96ウェルマイクロタイタ一プレート
標準物質溶液： 0U/mL、 200U/mL、 400U/mL、 1600U/mL、 3200U/mL、 6400U/mL の sIL-2Rをそれぞれ含む標準物質溶液（150mmol/L塩化ナトリウム、 4% BSA、 1% サッカロースおよび 0.01%バイオエースを含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH7.5) 酵素標識化抗体溶液：所定量 (24〜140ng/mL)の過ヨウ素酸法で標識された POD標 識化抗体を含む標識化抗体希釈液（150 mmol/L塩ィ匕ナトリウム、 10% FBS、 0.2% N P- 40、 20 μ g/mLマウス IgG、 0.2%プロキセル GXL、 10% POD安定化緩衝液および 0.16 μ g/mL PODを含有する 10 mmol/Lリン酸緩衝液、 pH 7.5)
洗浄液： 150 mmol/L塩化ナトリウム、 0.05%ツイーン 20を含有する 10 mmol/Lリン酸 緩衝液、 pH 6.8
OPD溶液： 2 mg/mL OPD、 0.75g/L尿素過酸化水素塩、 0.01%プロクリン 300を含有 する 100 mmol/Lリン酸—クェン酸緩衝液、 pH 4.4
反応停止液： 1 mol/L硫酸
[0117] 一方、検体 Aをマウス血清で 1/2、 1/4、 1/8と希釈し、実施例 4の試薬を用いて sIL- 2Rの測定を行う非特異反応吸収試験の結果、検体 Aに含まれる sIL-2Rの理論値は 3 624 U/mLと計算された。上記および（1)の実施例 4の試薬を用いた場合の各希釈率 での検体原液の SIL-2Rの計算値について、理論値 3624 U/mLに対する比を求め、 si L-2R測定値、検体原液の SIL-2R計算値とともに、第 11表 (実施例 4の試薬を用いた 場合)および第 12表 (SIL-2R測定試薬 Bを用いた場合）に示した。
[0118] [表 11] 第 1 1表
Figure imgf000039_0001
[0119] [表 12] 第 1 2表
Figure imgf000039_0002
同じ希釈率 1/4の検体の測定値で比較した場合に、実施例 4の試薬と比べ、 SIL-2R 測定試薬 Bでの測定値は約 4倍の値を示した。また、実施例 4の試薬は 1/8の希釈率 で非特異反応の影響がほぼなくなるのに対し、 SIL-2R測定試薬 Bでは、 1/11の希釈 率でも理論値に対し 125%の値の非特異反応が見られ、ほぼ非特異反応の影響をな くすためには 1/21〜1/31の希釈が必要であった。一般的に、過ヨウ素酸法により抗 体と酵素を結合させると、重合ィ匕したハイコンジュゲートな標識抗体となることが報告 されている (石川榮治著「酵素免疫測定法」 1987年、医学書院発行)。したがって、 si L-2R測定試薬 Bで使用して!/ヽる過ヨウ素酸法で標識された POD標識抗体は、抗体と PODの結合数力 1： 4や 1： 5のように抗体 1分子当たりの POD結合数が高レ、ものや、抗 体と PODの結合数力 ¾： 2、 2： 3および 3： 1のような抗体が重合したものが含まれて 、る と考えられる。
[0121] 以上から、実施例 1のフラクション 40〜46の P〇D標識ィヒ抗体、すなわち抗体と P〇D の結合数がそれぞれ 1： 1および 1： 2である POD標識抗体を用いた実施例 4の試薬は 、HAMA以外の原因による非特異反応に対しても効果的に抑制することが示された。
[0122] (3)検体 Aの非特異反応における不活性ィヒしたパーォキシダーゼの効果
200 μ g/mL MAK33- IgG Polyまたは 400 μ g/mL Inactive Poly- PODを添加した酵 素標識ィ匕抗体希釈液を用いた実施例 4の試薬により、 1/4希釈した検体 Aおよびコン トロール血清 II (ヒト正常人血清に sIL-2Rを添加したもの）の SIL-2Rを測定した。対照 として実施例 4の試薬でも測定を行った。結果を第 13表に示した。なお、コントロール 血清 IIに含まれる SIL2-Rは sIL - 2R測定試薬 Bによる測定で 2154 U/mLであり、 1/4希 釈した検体 Aの SIL2-Rの理論値は 906 U/mL (3624 U/mL X 1/4)と計算された。
[0123] [表 13] 第 1 3表
Figure imgf000040_0001
実施例 4の試薬に、 200 ^ g/mL MAK33-IgG Polyまたは 400 μ g/mL inactive Ploy- PODを添カ卩しても、コントロール血清 IIの測定値が変化しないことから、測定系への影 響はないと考えられた。
1/4希釈した検体 Aの実施例 4の試薬による sIL- 2R測定値は 2022U/mLであり、理 論値と比べると非特異反応が認められるが、標識化抗体希釈液に MAK33-IgG Poly または Inactive Poly-PODを添加することにより、理論値付近まで測定値が低下し、非 特異反応がさらに抑制されていた。特に、 Inactive Poly-PODを添カ卩により非特異反 応がほぼ完全に抑制されて!、ることから、 PODと反応する抗体に起因する非特異反 応が存在していることが判明した。実施例 4の試薬は、検体 Aの非特異反応、すなわ ち PODに反応する抗体に起因する非特異反応を抑制することができ、さらに不活性 化した PODを共存させることで、抗 POD抗体に起因する非特異反応を十分に抑制す ることがでさた。
産業上の利用可能性
本発明により、病態モニタリングや疾患の診断などに有用な試料中の測定対象物 の免疫学的定量方法および定量試薬、ならびに、免疫学的定量方法における非特 異的反応の抑制方法が提供される。

Claims

請求の範囲
[1] 水性媒体中、測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として結合 している酵素標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量法 において、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵 素標識ィ匕抗体力 なる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識ィ匕抗体のみを実 質的に含有する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形 成させる行程および免疫複合体の酵素活性を測定する工程を含むことを特徴とする 非特異的反応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法。
[2] 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異 的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ測定対 象物との免疫複合体を形成させる工程を含む請求項 1記載の免疫学的定量方法。
[3] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1、 1 : 2および 1 : 3である請求項 1または 2記 載の免疫学的定量方法。
[4] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1および 1 : 2である請求項 1または 2記載の 免疫学的定量方法。
[5] 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である請求項 1〜4のいずれかに記載の免疫 学的定量方法。
[6] 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である請求項 1〜5のいずれかに 記載の免疫学的定量方法。
[7] 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に
、 IgG重合体および Zまたは IgGを共存させる請求項 1〜6の 、ずれかに記載の免疫 学的定量方法。
[8] 非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である請求項 1〜5のい ずれかに記載の免疫学的定量方法。
[9] 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に
、不活性化した該標識酵素を共存させる請求項 1〜8の ヽずれかに記載の免疫学的 定量方法。
[10] 酵素がペルォキシダーゼである請求項 1〜9の 、ずれかに記載の免疫学的定量方法
[11] 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である請求項 1〜10のいずれかに 記載の免疫学的定量方法。
[12] 測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として結合している酵素 標識ィ匕抗体であって、第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標識化抗体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体 のみを実質的に含有する酵素標識化抗体を含有することを特徴とする非特異的反 応が抑制された測定対象物の免疫学的定量方法に用いる試薬。
[13] 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異 的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を含有する請求項 12記載 の試薬。
[14] 酵素活性測定用試薬を含有する請求項 12または 13記載の試薬。
[15] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2ぉょび1 : 3でぁる請求項12〜14のぃ ずれかに記載の試薬。
[16] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1および 1 : 2である請求項 12〜14のいずれ かに記載の試薬。
[17] 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である請求項 12〜16のいずれかに記載の試 薬。
[18] 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である請求項 12〜17のいずれ力ゝ に記載の試薬。
[19] IgG重合体および Zまたは IgGを含む請求項 12〜18のいずれかに記載の試薬。
[20] 非特異的反応が、標識酵素に対する抗体に起因する反応である請求項 12〜17のい ずれかに記載の試薬。
[21] 抗体を標識している酵素を不活性ィ匕した酵素を含む請求項 12〜20のいずれかに記 載の試薬。
[22] 酵素がペルォキシダーゼである請求項 12〜21のいずれかに記載の試薬。
[23] 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である請求項 12〜22のいずれか に記載の試薬。
[24] さらに、水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質、タン パク質安定化剤からなる群より選ばれる一つまたは複数の物質を含有する請求項 12 〜23の!、ずれかに記載の試薬。
[25] 測定対象物に特異的に結合する第 1の抗体に酵素が標識として結合している酵素 標識化抗体を用いて試料中の測定対象物を定量する免疫学的定量方法において、 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1 : 1、 1 : 2、 1 : 3および 2 : 1である酵素標識ィ匕抗 体からなる群より選ばれる一つまたは複数の酵素標識化抗体のみを実質的に含有 する酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させるェ 程を含むことを特徴とする測定対象物の免疫学的定量方法における非特異的反応 の抑制方法。
[26] 第 1の抗体が結合する測定対象物の抗原決定部位とは異なる抗原決定部位に特異 的に結合する第 2の抗体に分離手段が結合している抗体を試料に反応させ測定対 象物との免疫複合体を形成させる工程を含む請求項 25記載の抑制方法。
[27] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1、 1 : 2および 1 : 3である請求項 25または 26 記載の抑制方法。
[28] 第 1の抗体と酵素の結合数がそれぞれ 1： 1および 1 : 2である請求項 25または 26記載 の抑制方法。
[29] 第 1の抗体が、 Fc部分を除去した抗体である請求項 25〜28のいずれかに記載の抑 制方法。
[30] 非特異的反応が、ヒト抗マウス抗体に起因する反応である請求項 25〜29のいずれ力ゝ に記載の抑制方法。
[31] 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に 、 IgG重合体 Zまたは IgGを共存させる請求項 25〜30の 、ずれかに記載の抑制方法
[32] 非特異的反応が、標識酵素に反応する抗体に起因する反応である請求項 25〜29の
V、ずれかに記載の抑制方法。
[33] 酵素標識化抗体を試料に反応させ測定対象物との免疫複合体を形成させる工程に
、不活性化した該標識酵素を共存させる請求項 25〜32の 、ずれかに記載の抑制方 法。
[34] 酵素がペルォキシダーゼである請求項 25〜33の 、ずれかに記載の方法。
[35] 測定対象物が、可溶性インターロイキン 2受容体である請求項 25〜34のいずれか に記載の抑制方法。
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