JPS6345066B2 - - Google Patents
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- JPS6345066B2 JPS6345066B2 JP8629379A JP8629379A JPS6345066B2 JP S6345066 B2 JPS6345066 B2 JP S6345066B2 JP 8629379 A JP8629379 A JP 8629379A JP 8629379 A JP8629379 A JP 8629379A JP S6345066 B2 JPS6345066 B2 JP S6345066B2
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は新規なリウマチ因子の測定方法に関す
る。 リウマチ因子検出法としてはSinger−Plotz法
の応用によるヒトガンマグロブリンをラテツクス
に吸着させた試薬を使用するラテツクス凝集反応
法、Waaler−Rose法の応用による免疫ガンマグ
ロブリンをヒツジ赤血球に感作させた試薬を使用
する赤血球凝集反応法があり、殊にラテツクス凝
集反応性は慢性関節リウマチ患者のスクリーニン
グ検査として一般の臨床検査室と日常検査に広く
取り入れられており数多くのメーカーから種々の
試薬が製造販売されている。 又、ラテツクス凝集反応の変法としてラテツク
スの代りにイオン交換樹脂、活性炭素などを使用
した製品も市販されている。 しかしながらこれらの凝集反応を利用した測定
法は検体を適当倍数に希釈する操作が必要である
こと、凝集像を肉眼的に判定し通常陰性、疑陽
性、弱陽性、強陽性の四段階に判定する半定量法
に過ぎず、又測定条件、測定手技、判定者の主観
などから精度管理上に極めて大きな問題を含むも
のであつた。 又、最近の文献によると免疫グロブリンをパパ
イン分解して得られたFcフグラメントを結合コ
ーテイングしたプラスチツク試験管に試料を入れ
リウマチ因子を結合させた後に、ラジオアイソト
ープで標識した抗IgGと反応させて結合したラジ
オアイソトープの放射活性を測定することからリ
ウマチ因子を定量する方法が報告されている（ジ
ヤーナラ・オブ・イムノロジイ、119巻、No.１、
295頁（1977年））が、測定手技の上からは末だ実
用化に遠いものがある。 本発明者らはこれら従来法の欠点に鑑み殊に操
作の簡便化、精度管理上の諸問題の解決、年々増
加する検体数に対応する為の検体処理能力の増強
にポイントを置いて研究を重ねた結果、一定の条
件の下で変性した変性ヒト免疫グロブリンをリウ
マチ因子と、好ましくは凝集促進剤を含む溶液中
でインキユベートすると、リウマチ因子の量に応
じた濁度を有する均一な混濁液が得られるという
全く予期しない新しい知見を得、本発明を完成す
るに至つた。 即ち、本発明は、変性ヒト免疫グロブリンを含
有してなる試薬を用い、光学的にリウマチ因子を
測定することを特徴とする、新規なリウマチ因子
測定方法である。 本発明は、例えば変性免疫グロブリンを含む試
薬に検体試料を添加し、一定時間インキユベート
したのち、反応液の濁りの量を光学的に測定し、
同時にリウマチ因子（以下、RFを略称する。）の
含量既知の標準試料を用いて同様の操作を行い、
その濁りの量から検体試料中のRFの含量を計算
することによつて行われる。 本発明における免疫グロブリンの変性手段とし
ては熱処理、尿素処理、グアニジン塩処理が特に
有効である。 例えばヒト免疫グロブリンを変性させる方法に
ついて一例を述べれば、ヒト免疫グロブリンを
0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.5に溶解、63℃
20分間加温後、ポリエチレングリコールの１％の
割合になるよう溶解しRF測定用試薬とする。尿
素変性を行う方法の一例としては6M尿素水溶液
にヒト免疫グロブリンを溶解、25℃75時間保持し
たのち生理食塩液に対し透析し尿素を除いたの
ち、不溶物を除いた上清にポリエチレングリコー
ルを溶解しRF測定試薬とする。 この場合尿素の代りにグアニジン塩たとえば塩
酸グアニジンを用い25℃20時間変性しても同様の
結果が得られる。 又ヒト免疫グロブリンの代りにヒトCohn.Fr.
を用いても同様の結果が得られる。 RFと免疫グロブリン又は変性免疫グロブリン
の免疫反応について本発明者らが検索した結果を
表１に示す。
る。 リウマチ因子検出法としてはSinger−Plotz法
の応用によるヒトガンマグロブリンをラテツクス
に吸着させた試薬を使用するラテツクス凝集反応
法、Waaler−Rose法の応用による免疫ガンマグ
ロブリンをヒツジ赤血球に感作させた試薬を使用
する赤血球凝集反応法があり、殊にラテツクス凝
集反応性は慢性関節リウマチ患者のスクリーニン
グ検査として一般の臨床検査室と日常検査に広く
取り入れられており数多くのメーカーから種々の
試薬が製造販売されている。 又、ラテツクス凝集反応の変法としてラテツク
スの代りにイオン交換樹脂、活性炭素などを使用
した製品も市販されている。 しかしながらこれらの凝集反応を利用した測定
法は検体を適当倍数に希釈する操作が必要である
こと、凝集像を肉眼的に判定し通常陰性、疑陽
性、弱陽性、強陽性の四段階に判定する半定量法
に過ぎず、又測定条件、測定手技、判定者の主観
などから精度管理上に極めて大きな問題を含むも
のであつた。 又、最近の文献によると免疫グロブリンをパパ
イン分解して得られたFcフグラメントを結合コ
ーテイングしたプラスチツク試験管に試料を入れ
リウマチ因子を結合させた後に、ラジオアイソト
ープで標識した抗IgGと反応させて結合したラジ
オアイソトープの放射活性を測定することからリ
ウマチ因子を定量する方法が報告されている（ジ
ヤーナラ・オブ・イムノロジイ、119巻、No.１、
295頁（1977年））が、測定手技の上からは末だ実
用化に遠いものがある。 本発明者らはこれら従来法の欠点に鑑み殊に操
作の簡便化、精度管理上の諸問題の解決、年々増
加する検体数に対応する為の検体処理能力の増強
にポイントを置いて研究を重ねた結果、一定の条
件の下で変性した変性ヒト免疫グロブリンをリウ
マチ因子と、好ましくは凝集促進剤を含む溶液中
でインキユベートすると、リウマチ因子の量に応
じた濁度を有する均一な混濁液が得られるという
全く予期しない新しい知見を得、本発明を完成す
るに至つた。 即ち、本発明は、変性ヒト免疫グロブリンを含
有してなる試薬を用い、光学的にリウマチ因子を
測定することを特徴とする、新規なリウマチ因子
測定方法である。 本発明は、例えば変性免疫グロブリンを含む試
薬に検体試料を添加し、一定時間インキユベート
したのち、反応液の濁りの量を光学的に測定し、
同時にリウマチ因子（以下、RFを略称する。）の
含量既知の標準試料を用いて同様の操作を行い、
その濁りの量から検体試料中のRFの含量を計算
することによつて行われる。 本発明における免疫グロブリンの変性手段とし
ては熱処理、尿素処理、グアニジン塩処理が特に
有効である。 例えばヒト免疫グロブリンを変性させる方法に
ついて一例を述べれば、ヒト免疫グロブリンを
0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.5に溶解、63℃
20分間加温後、ポリエチレングリコールの１％の
割合になるよう溶解しRF測定用試薬とする。尿
素変性を行う方法の一例としては6M尿素水溶液
にヒト免疫グロブリンを溶解、25℃75時間保持し
たのち生理食塩液に対し透析し尿素を除いたの
ち、不溶物を除いた上清にポリエチレングリコー
ルを溶解しRF測定試薬とする。 この場合尿素の代りにグアニジン塩たとえば塩
酸グアニジンを用い25℃20時間変性しても同様の
結果が得られる。 又ヒト免疫グロブリンの代りにヒトCohn.Fr.
を用いても同様の結果が得られる。 RFと免疫グロブリン又は変性免疫グロブリン
の免疫反応について本発明者らが検索した結果を
表１に示す。
【表】
熱処理；63℃ 30分処理
尿素処理；6M尿素液で20時間処理
グアニジン処理；4M塩酸グアニジンで24時間処
理 各変性免疫グロブリン及び免疫グロブリンをプ
リエチレングリコール１％を含む0.01Mリン酸緩
衝液PH7.0で希釈し、希釈液１mlに検体0.1mlを混
合して15分間インキユベート後レーザネフエロメ
ーターで光散乱強度（Ｖ）を測定した。数値は光
散乱強度を表わす。 すなわちRF陽性の患者血清と熱処理、尿素又
は塩酸グアニジン処理変性免疫グロブリンとの間
には免疫反応による顕著な混濁を生ずるにも拘ら
ず、免疫グロブリンとは全く反応を示していな
い。また一方、変性免疫グロブリンはRF陰性の
正常血清とは全く反応しない。この結果より免疫
グロブリンの変性処理によりRFに特異的に反応
する全く新しい成分を生成する事がわかる。 すなわち変性処理免疫グロブリン及び免疫グロ
ブリンの分子篩過クロマトグラム（第１図−
ａ，ｂ，ｃ）に示されるように変性処理すること
によつて免疫グロブリンは新しい分画成分（第１
又は第３成分）に一部変化する。 尚、第１図−ａは、60℃、30分熱処理免疫グロ
ブリン液を、第１図−ｂは、免疫グロブリン液
を、また、第１図ｃは、6M尿素液で20時間処理
した免疫グロブリン液を夫々セフアデツクスＧ−
200カラムにチヤージし夫々下記条件でクロマト
を行つた結果を示したものである。 カラムスケール 1.5×90cm 試料量 1.5ml 溶出速度 12ml／hr 各成分のRFとの免疫反応性を検索した結果、
表２に示される如く第１及び第３成分がRFと反
応し、第２及び第４成分はRFとは全く反応しな
いという知見を得た。
理 各変性免疫グロブリン及び免疫グロブリンをプ
リエチレングリコール１％を含む0.01Mリン酸緩
衝液PH7.0で希釈し、希釈液１mlに検体0.1mlを混
合して15分間インキユベート後レーザネフエロメ
ーターで光散乱強度（Ｖ）を測定した。数値は光
散乱強度を表わす。 すなわちRF陽性の患者血清と熱処理、尿素又
は塩酸グアニジン処理変性免疫グロブリンとの間
には免疫反応による顕著な混濁を生ずるにも拘ら
ず、免疫グロブリンとは全く反応を示していな
い。また一方、変性免疫グロブリンはRF陰性の
正常血清とは全く反応しない。この結果より免疫
グロブリンの変性処理によりRFに特異的に反応
する全く新しい成分を生成する事がわかる。 すなわち変性処理免疫グロブリン及び免疫グロ
ブリンの分子篩過クロマトグラム（第１図−
ａ，ｂ，ｃ）に示されるように変性処理すること
によつて免疫グロブリンは新しい分画成分（第１
又は第３成分）に一部変化する。 尚、第１図−ａは、60℃、30分熱処理免疫グロ
ブリン液を、第１図−ｂは、免疫グロブリン液
を、また、第１図ｃは、6M尿素液で20時間処理
した免疫グロブリン液を夫々セフアデツクスＧ−
200カラムにチヤージし夫々下記条件でクロマト
を行つた結果を示したものである。 カラムスケール 1.5×90cm 試料量 1.5ml 溶出速度 12ml／hr 各成分のRFとの免疫反応性を検索した結果、
表２に示される如く第１及び第３成分がRFと反
応し、第２及び第４成分はRFとは全く反応しな
いという知見を得た。
【表】
第１、第２、第３、及び第４の各成分をポリエ
チレングリコール１％を含む緩衝液で希釈し、検
体との反応をレーザーネフエロメーターで測定し
た結果。数値は光散乱強度を表わす。各成分と抗
ヒトIgG（免疫グロブリンに対する抗体）との免
疫反応を検索した結果（第１図−ｄ）から第１及
び第３成分は抗ヒトIgGと殆ど反応しないが第２
及び第４成分は抗ヒトIgGと顕著に反応し、第１
及び第３成分は変性処理により生成した予期しな
かつたRF反応成分であり、第２及び第４成分は
未変性のまま残存した免疫グロブリンである。 尚、第１図−ｄは、寒天ゲルによるオクタロニ
ー分析法の結果を示したもので厚さ２mmの寒天ゲ
ル平板に孔径２mmの小孔を作成し各小孔に抗ヒト
IgG、第１成分及び第２成分を各10μずつ注入
し24時間インキユベートして沈降線の有無を観察
した結果である。 変性免疫グロブリンを分子篩過クロマトする
と免疫グロブリンの前の分画に新たな成分（第１
図−ａ，ｃの第１及び第３成分）を得るというこ
とは従来の常識から考えて分子量が増大したこ
と、たとえば変性処理により会合などが起つたと
考えられ、変性処理によつて免疫グロブリン分子
が会合結合することによつてRFと反応性を有す
る新しい成分が生成したと考えられる。 変性の程度即ち試液中の変性免疫グロブリンの
含量は測定感度と密接な関係があり、又変性処理
の条件は変性の程度と関係するので望ましい感度
に合せて任意の条件を選ぶことが望ましい。 第２図は熱処理における温度、変性度、感度の
関係を示したものであり、変性度が一定限度を越
えるとRFに対する感度が低下することを示し、
一定の条件を選ぶ必要性を示している。 図中、−〇−は活性感度を示し、−●−は変性度を
示す。尚、測定操作法は下記の通りである。 免疫グロブリン100mgを0.01Mリン酸緩衝生理
食塩液PH7.5、10mlに溶解後各温度で20分間加温
し各溶液の濁度を分光光度計（400nｍ）で測定
し変性度の指数とする。各溶液と0.01Mリン酸緩
衝生理食塩液PH7.5で10倍希釈後ポリエチレング
リコール6000、１ｇを加えて試液とする。試液
0.5mlに検体血清0.05mlを加えて15分間反応させ
た後レーザーネフエロメーターで光散乱強度
（Ｖ）を測定し感度とする。 第３図は尿素処理時間と感度（光散乱強度）の
関係を示したものであり、このように変性条件は
望ましい感度に合せて任意に設定出来るが、熱処
理においては加熱温度が65℃以上に及ぶと免疫グ
ロブリンの極端な変性沈殿が起り使用できないこ
とはいうまでもない。 尚、測定操作法は下記の通りである。 免疫グロブリン100mgを6M尿素水溶液20mlに溶
解し25℃で各時間保温後生理食塩液に透析して尿
素を除去後生理食塩液で10倍に希釈した後ポリエ
チレングリコール6000、１ｇを加えて試液とす
る。試液0.5mlに検体血清0.05mlを加えて15分間
反応させた後レーザーフエロメーターで光散乱強
度（Ｖ）を測定し感度とする。 一般に極端な変性沈殿をきたさない限り種々の
条件が選択できるが、望ましい条件としては免疫
グロブリン0.01〜１ｇ／dlの熱処理の場合、温度
50〜63℃、処理時間10〜60分、尿素処理、塩酸グ
アニジン処理においては尿素濃度２〜15M又は、
塩酸グアニジン１〜10M、処理時間10〜72時間が
選ばれるが、たとえば熱処理において温度条件が
50℃以下であつてもさらに長時間処理することに
よつて目的は達せられるので上記の条件は発明の
範囲を拘束するものではない。 又、通常得られる溶液は変性と未変性の混合物
となるが未変性免疫グロブリンが夾雑しても全く
妨げとならないばかりではなく試液の安定性から
は混合物としておく方が実用上有利である。 凝集促進剤としては分子量1500〜6000のポリビ
ニルアルコール、分子量1000〜20000のポリエチ
レングリコールなどの有機重合体等が有効に使用
できる。促進剤の添加量は試液の測定感度に関係
があり一般に高濃度になる程測定感度は高くなり
測定上有利であるが、2.0％以上になると試液自
身の混濁を招き盲検の上昇という弊害を来すので
極端な混濁を招かない範囲で添加する必要があ
り、望ましくは0.5〜1.5％の範囲を選ぶことがで
きる。 光学測定機器としては光散乱強度を測定するネ
フエロメーター、螢光光度計等、又吸光度を測定
する分光光度計等が有効に使用できる。分光光度
計を用いた吸光度測定の場合の測定波長は好まし
くは400〜700μｍを選ぶことができる。光散乱強
度を測定する方法においての光源はタングステ
ン、水銀、キセノン、又はレーザー光などを使用
した比ろう計、螢光光度計などが適用できる。 周知の如く、近来臨床病理学の急速な進展に伴
ない臨床検査の検査結果が患者の疾病の診断に極
めて重大な意味を持つようになり、それとともに
よりすぐれた検査法の開発が強く要望されてい
る。今日の臨床検査方法において望まれる点とし
ては手技が簡便で迅速に結果が判明すること、精
度よく正確な結果が得られること、さらに測定者
の違いや測定条件、測定日時の違いに関係なく再
現性のよい結果が得られること等はいうまでもな
く、日々に厖大な量に及ぶ検体を処理する為の検
体処理能力の増強が挙げられる。 従来最も普及しているラテツクス凝集反応では
のせガラス板上に試料と試液をのせて混合し２〜
３分間ガラス平板を揺り動かした後凝集の有無を
肉眼判定するのであるが、手技が簡便で迅速に結
果が判明しスポツト的な少数検体の処理には適し
ているものの精度、正確度、再現性の点で問題を
残し、さらに多数検体の連続処理が不可能である
為自ずと処理能力には限界があり到致今日の臨床
検査の要望を満足するものではない。 本発明の方法においては前述の如く測定操作が
単純化され通常検査室において実施されている以
外の特別な操作を全く必要とせず、又最終的な測
定は光学的に測定するので測定者の違いや条件の
違いによる判定の差を含まない客観的なデータが
得られる。 さらに本法の凝集反応法と比較しての最大の利
点は試料の採取、試液の分注が連続して実施でき
るので機械組み込みによる自動分析が可能となる
点にある。これにより単位時間内の検体処理能力
の飛躍的な増強と省力化が実現されることにな
る。 以上の如く本発明によれば現在臨床検査におい
て直面している技術的問題点はことごとく解決さ
れるばかりでなく疾病の診断治療の面からも経済
的な面からもその効果は大なるものがある。 以下に本発明の実施例を挙げて更に具体的に説
明する。 実施例 １ ヒト免疫グロブリン100mgを0.01Mリン酸緩衝
生理食塩液PH7.5、10mlに溶解後、63℃20分間加
温した溶液を0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.5
で希釈して全溶を100mlとした後ポリエチレング
リコール6000、１ｇを溶解してRF測定用試薬を
得る。得られた測定試薬２mlに検体血清200μ
を混合し分光光度計波長400nｍの吸光度変化を
37℃15分間測定する（ΔDs）。同時に標準試料を
用いて同様の操作を行い吸光度変化（ΔDstd）を
測定し次式により検体中のリウマチ因子量を計算
する。 検体リウマチ因子量（タイター）＝ΔDs／ΔDstd ×標準試料のタイター 測定例を表３に示す。
チレングリコール１％を含む緩衝液で希釈し、検
体との反応をレーザーネフエロメーターで測定し
た結果。数値は光散乱強度を表わす。各成分と抗
ヒトIgG（免疫グロブリンに対する抗体）との免
疫反応を検索した結果（第１図−ｄ）から第１及
び第３成分は抗ヒトIgGと殆ど反応しないが第２
及び第４成分は抗ヒトIgGと顕著に反応し、第１
及び第３成分は変性処理により生成した予期しな
かつたRF反応成分であり、第２及び第４成分は
未変性のまま残存した免疫グロブリンである。 尚、第１図−ｄは、寒天ゲルによるオクタロニ
ー分析法の結果を示したもので厚さ２mmの寒天ゲ
ル平板に孔径２mmの小孔を作成し各小孔に抗ヒト
IgG、第１成分及び第２成分を各10μずつ注入
し24時間インキユベートして沈降線の有無を観察
した結果である。 変性免疫グロブリンを分子篩過クロマトする
と免疫グロブリンの前の分画に新たな成分（第１
図−ａ，ｃの第１及び第３成分）を得るというこ
とは従来の常識から考えて分子量が増大したこ
と、たとえば変性処理により会合などが起つたと
考えられ、変性処理によつて免疫グロブリン分子
が会合結合することによつてRFと反応性を有す
る新しい成分が生成したと考えられる。 変性の程度即ち試液中の変性免疫グロブリンの
含量は測定感度と密接な関係があり、又変性処理
の条件は変性の程度と関係するので望ましい感度
に合せて任意の条件を選ぶことが望ましい。 第２図は熱処理における温度、変性度、感度の
関係を示したものであり、変性度が一定限度を越
えるとRFに対する感度が低下することを示し、
一定の条件を選ぶ必要性を示している。 図中、−〇−は活性感度を示し、−●−は変性度を
示す。尚、測定操作法は下記の通りである。 免疫グロブリン100mgを0.01Mリン酸緩衝生理
食塩液PH7.5、10mlに溶解後各温度で20分間加温
し各溶液の濁度を分光光度計（400nｍ）で測定
し変性度の指数とする。各溶液と0.01Mリン酸緩
衝生理食塩液PH7.5で10倍希釈後ポリエチレング
リコール6000、１ｇを加えて試液とする。試液
0.5mlに検体血清0.05mlを加えて15分間反応させ
た後レーザーネフエロメーターで光散乱強度
（Ｖ）を測定し感度とする。 第３図は尿素処理時間と感度（光散乱強度）の
関係を示したものであり、このように変性条件は
望ましい感度に合せて任意に設定出来るが、熱処
理においては加熱温度が65℃以上に及ぶと免疫グ
ロブリンの極端な変性沈殿が起り使用できないこ
とはいうまでもない。 尚、測定操作法は下記の通りである。 免疫グロブリン100mgを6M尿素水溶液20mlに溶
解し25℃で各時間保温後生理食塩液に透析して尿
素を除去後生理食塩液で10倍に希釈した後ポリエ
チレングリコール6000、１ｇを加えて試液とす
る。試液0.5mlに検体血清0.05mlを加えて15分間
反応させた後レーザーフエロメーターで光散乱強
度（Ｖ）を測定し感度とする。 一般に極端な変性沈殿をきたさない限り種々の
条件が選択できるが、望ましい条件としては免疫
グロブリン0.01〜１ｇ／dlの熱処理の場合、温度
50〜63℃、処理時間10〜60分、尿素処理、塩酸グ
アニジン処理においては尿素濃度２〜15M又は、
塩酸グアニジン１〜10M、処理時間10〜72時間が
選ばれるが、たとえば熱処理において温度条件が
50℃以下であつてもさらに長時間処理することに
よつて目的は達せられるので上記の条件は発明の
範囲を拘束するものではない。 又、通常得られる溶液は変性と未変性の混合物
となるが未変性免疫グロブリンが夾雑しても全く
妨げとならないばかりではなく試液の安定性から
は混合物としておく方が実用上有利である。 凝集促進剤としては分子量1500〜6000のポリビ
ニルアルコール、分子量1000〜20000のポリエチ
レングリコールなどの有機重合体等が有効に使用
できる。促進剤の添加量は試液の測定感度に関係
があり一般に高濃度になる程測定感度は高くなり
測定上有利であるが、2.0％以上になると試液自
身の混濁を招き盲検の上昇という弊害を来すので
極端な混濁を招かない範囲で添加する必要があ
り、望ましくは0.5〜1.5％の範囲を選ぶことがで
きる。 光学測定機器としては光散乱強度を測定するネ
フエロメーター、螢光光度計等、又吸光度を測定
する分光光度計等が有効に使用できる。分光光度
計を用いた吸光度測定の場合の測定波長は好まし
くは400〜700μｍを選ぶことができる。光散乱強
度を測定する方法においての光源はタングステ
ン、水銀、キセノン、又はレーザー光などを使用
した比ろう計、螢光光度計などが適用できる。 周知の如く、近来臨床病理学の急速な進展に伴
ない臨床検査の検査結果が患者の疾病の診断に極
めて重大な意味を持つようになり、それとともに
よりすぐれた検査法の開発が強く要望されてい
る。今日の臨床検査方法において望まれる点とし
ては手技が簡便で迅速に結果が判明すること、精
度よく正確な結果が得られること、さらに測定者
の違いや測定条件、測定日時の違いに関係なく再
現性のよい結果が得られること等はいうまでもな
く、日々に厖大な量に及ぶ検体を処理する為の検
体処理能力の増強が挙げられる。 従来最も普及しているラテツクス凝集反応では
のせガラス板上に試料と試液をのせて混合し２〜
３分間ガラス平板を揺り動かした後凝集の有無を
肉眼判定するのであるが、手技が簡便で迅速に結
果が判明しスポツト的な少数検体の処理には適し
ているものの精度、正確度、再現性の点で問題を
残し、さらに多数検体の連続処理が不可能である
為自ずと処理能力には限界があり到致今日の臨床
検査の要望を満足するものではない。 本発明の方法においては前述の如く測定操作が
単純化され通常検査室において実施されている以
外の特別な操作を全く必要とせず、又最終的な測
定は光学的に測定するので測定者の違いや条件の
違いによる判定の差を含まない客観的なデータが
得られる。 さらに本法の凝集反応法と比較しての最大の利
点は試料の採取、試液の分注が連続して実施でき
るので機械組み込みによる自動分析が可能となる
点にある。これにより単位時間内の検体処理能力
の飛躍的な増強と省力化が実現されることにな
る。 以上の如く本発明によれば現在臨床検査におい
て直面している技術的問題点はことごとく解決さ
れるばかりでなく疾病の診断治療の面からも経済
的な面からもその効果は大なるものがある。 以下に本発明の実施例を挙げて更に具体的に説
明する。 実施例 １ ヒト免疫グロブリン100mgを0.01Mリン酸緩衝
生理食塩液PH7.5、10mlに溶解後、63℃20分間加
温した溶液を0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.5
で希釈して全溶を100mlとした後ポリエチレング
リコール6000、１ｇを溶解してRF測定用試薬を
得る。得られた測定試薬２mlに検体血清200μ
を混合し分光光度計波長400nｍの吸光度変化を
37℃15分間測定する（ΔDs）。同時に標準試料を
用いて同様の操作を行い吸光度変化（ΔDstd）を
測定し次式により検体中のリウマチ因子量を計算
する。 検体リウマチ因子量（タイター）＝ΔDs／ΔDstd ×標準試料のタイター 測定例を表３に示す。
【表】
実施例 ２
ヒト免疫グロブリン100mgを0.01Mリン酸緩衝
生理食塩液PH7.2、10mlで溶解後、60℃１時間加
温した溶液を0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.2
で希釈して全容を100mlとした後、ポリエチレン
グリコール20000、0.5ｇを溶解してRF測定用試
薬を得る。 得られた測定試薬を用いて、実施例１に記載し
たと同様の方法で測定した測定例を表４に示す。
生理食塩液PH7.2、10mlで溶解後、60℃１時間加
温した溶液を0.01Mリン酸緩衝生理食塩液PH7.2
で希釈して全容を100mlとした後、ポリエチレン
グリコール20000、0.5ｇを溶解してRF測定用試
薬を得る。 得られた測定試薬を用いて、実施例１に記載し
たと同様の方法で測定した測定例を表４に示す。
【表】
実施例 ３
ヒト免疫グロブリン100mgを6M尿素水溶液20ml
で溶解し、25℃72時間保温後生理食塩液20に対
して72時間透析し尿素を完全に除く。不溶物を
3000rpm20分間遠心分離して除いた上清を0.01M
リン酸緩衝生理食塩液PH6.5で希釈し全容を100ml
とした後ポリビニルアルコール1.5ｇを溶解し、
RF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用いて、実施例１に記載し
たと同様の方法で測定した測定例を表５に示す。
で溶解し、25℃72時間保温後生理食塩液20に対
して72時間透析し尿素を完全に除く。不溶物を
3000rpm20分間遠心分離して除いた上清を0.01M
リン酸緩衝生理食塩液PH6.5で希釈し全容を100ml
とした後ポリビニルアルコール1.5ｇを溶解し、
RF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用いて、実施例１に記載し
たと同様の方法で測定した測定例を表５に示す。
【表】
実施例 ４
ヒトCohn.Fr.100mgを0.01Mバルビタール緩
衝生理食塩液PH8.0、10mlで溶解後、56℃１時間
加温し不溶物を過除去する。液を0.01Mバル
ビタール緩衝生理食塩液PH8.0で希釈して全容を
100mlとした後ポリエチレングリコール6000、１
ｇを溶解してRF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ５ ヒトCohn.Fr.H10mgを0.01Mリン酸緩衝生理食
塩液PH7.0、10mlに溶解後、61℃10分間加温し不
溶物を過除去する。液を0.01Mリン酸緩衝生
理食塩液PH7.0で希釈して全容を100mlとした後ポ
リビニルアルコール２ｇを溶解してRF測定用試
薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ６ ヒトCohn.Fr.100mgを4M尿素溶液20mlに溶解
し、25℃48時間保温後、生理食塩液20に対して
72時間透析し、尿素を完全に除く。不溶物を過
除去した溶液を生理食塩液で希釈して全容を100
mlとした後、ポリエチレングリコール１ｇを溶解
してRF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ７ ヒト免疫グロブリン50mgを5M塩酸グアニジン
水溶液20mlで溶解し、25℃20時間保温後生理食塩
液20に対して72時間透析し塩酸グアニジンを完
全に除く。不溶物を過除去した溶液を生理食塩
液で希釈して全容100mlとした後、ポリエチレン
グリコール２ｇを溶解してRF測定用試薬とする。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ８ ヒト免疫グロブリン200mgを生理食塩液20mlで
溶解し52℃４時間加温した溶液を0.01Mバルビタ
ール緩衝生理食塩液PH8.0で希釈して全容を100ml
とした後、ポリエチレングリコール２ｇを溶解し
てRF測定用試薬を得る。
衝生理食塩液PH8.0、10mlで溶解後、56℃１時間
加温し不溶物を過除去する。液を0.01Mバル
ビタール緩衝生理食塩液PH8.0で希釈して全容を
100mlとした後ポリエチレングリコール6000、１
ｇを溶解してRF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ５ ヒトCohn.Fr.H10mgを0.01Mリン酸緩衝生理食
塩液PH7.0、10mlに溶解後、61℃10分間加温し不
溶物を過除去する。液を0.01Mリン酸緩衝生
理食塩液PH7.0で希釈して全容を100mlとした後ポ
リビニルアルコール２ｇを溶解してRF測定用試
薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ６ ヒトCohn.Fr.100mgを4M尿素溶液20mlに溶解
し、25℃48時間保温後、生理食塩液20に対して
72時間透析し、尿素を完全に除く。不溶物を過
除去した溶液を生理食塩液で希釈して全容を100
mlとした後、ポリエチレングリコール１ｇを溶解
してRF測定用試薬を得る。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ７ ヒト免疫グロブリン50mgを5M塩酸グアニジン
水溶液20mlで溶解し、25℃20時間保温後生理食塩
液20に対して72時間透析し塩酸グアニジンを完
全に除く。不溶物を過除去した溶液を生理食塩
液で希釈して全容100mlとした後、ポリエチレン
グリコール２ｇを溶解してRF測定用試薬とする。 得られた測定試薬を用い、実施例１に記載の方
法に従い、検体中のリウマチ因子量を求める。 実施例 ８ ヒト免疫グロブリン200mgを生理食塩液20mlで
溶解し52℃４時間加温した溶液を0.01Mバルビタ
ール緩衝生理食塩液PH8.0で希釈して全容を100ml
とした後、ポリエチレングリコール２ｇを溶解し
てRF測定用試薬を得る。
第１図−ａ〜ｃは、変性処理免疫グロブリン及
び免疫グロブリンの分子篩過クロマトグラムを
示し、第１図−ａは60℃、30分熱処理免疫グロブ
リン液を、第１図−ｂは免疫グロブリン液を、ま
た、第１図−ｃは6M尿素液で20時間処理した免
疫グロブリン液を夫々セフアデツクスＧ−200カ
ラムにチヤージし夫々下記条件でクロマトを行つ
た結果を示す。 カラムスケール 1.5×90cm 試料量 1.5ml 溶出速度 12ml／hr 第１図−ｄは、第１図−ａに於ける第１、第２
成分及び第１図−ｃに於ける第３、第４成分の各
成分と抗ヒトIgG（免疫グロブリンに対する抗体）
との免疫反応性を寒天ゲルによるオクタロニー分
析法により検索した結果を示す。第２図は、免疫
グロブリンを熱変性処理した場合の温度、変性
度、感度に関係を示したものであり、図中−〇−
は、活性感度を示し、−●−は、変性度を示す。第
３図は、免疫グロブリンを尿素処理した場合の尿
素処理時間と感度（光散乱強度）の関係を示した
ものであり、横軸は、処理時間（hrs）を示し、
縦軸は、光散乱強度（Ｖ）を示す。
び免疫グロブリンの分子篩過クロマトグラムを
示し、第１図−ａは60℃、30分熱処理免疫グロブ
リン液を、第１図−ｂは免疫グロブリン液を、ま
た、第１図−ｃは6M尿素液で20時間処理した免
疫グロブリン液を夫々セフアデツクスＧ−200カ
ラムにチヤージし夫々下記条件でクロマトを行つ
た結果を示す。 カラムスケール 1.5×90cm 試料量 1.5ml 溶出速度 12ml／hr 第１図−ｄは、第１図−ａに於ける第１、第２
成分及び第１図−ｃに於ける第３、第４成分の各
成分と抗ヒトIgG（免疫グロブリンに対する抗体）
との免疫反応性を寒天ゲルによるオクタロニー分
析法により検索した結果を示す。第２図は、免疫
グロブリンを熱変性処理した場合の温度、変性
度、感度に関係を示したものであり、図中−〇−
は、活性感度を示し、−●−は、変性度を示す。第
３図は、免疫グロブリンを尿素処理した場合の尿
素処理時間と感度（光散乱強度）の関係を示した
ものであり、横軸は、処理時間（hrs）を示し、
縦軸は、光散乱強度（Ｖ）を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 変性ヒト免疫グロブリンを含有してなる試薬
を用い、光学的にリウマチ因子を測定することを
特徴とする、新規なリウマチ因子測定方法。 ２ 変性ヒト免疫グロブリンのほかにヒト免疫グ
ロブリンを含有してなる試薬を用いる、特許請求
の範囲第１項記載のリウマチ因子測定方法。 ３ 変性ヒト免疫グロブリンがヒト免疫グロブリ
ンを熱処理することによつて生成する変性ヒト免
疫グロブリンである特許請求の範囲第１項又は第
２項記載のリウマチ因子測定方法。 ４ 変性ヒト免疫グロブリンがヒト免疫グロブリ
ンを尿素処理することによつて生成する変性ヒト
免疫グロブリンである特許請求の範囲第１項又は
第２項記載のリウマチ因子測定方法。 ５ 変性ヒト免疫グロブリンがヒト免疫グロブリ
ンをグアニジン塩処理することによつて生成する
変性ヒト免疫グロブリンである特許請求の範囲第
１項又は第２項記載のリウマチ因子測定方法。 ６ ポリエチレングリコールを凝集促進剤として
含有する特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれ
かに記載のリウマチ因子測定方法。 ７ ポリビニルアルコールを凝集促進剤として含
有する特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか
に記載のリウマチ因子測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8629379A JPS5610254A (en) | 1979-07-07 | 1979-07-07 | New rheumatism factor measuring reagent |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8629379A JPS5610254A (en) | 1979-07-07 | 1979-07-07 | New rheumatism factor measuring reagent |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5610254A JPS5610254A (en) | 1981-02-02 |
| JPS6345066B2 true JPS6345066B2 (ja) | 1988-09-07 |
Family
ID=13882782
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8629379A Granted JPS5610254A (en) | 1979-07-07 | 1979-07-07 | New rheumatism factor measuring reagent |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5610254A (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5969963U (ja) * | 1982-10-28 | 1984-05-12 | 横河商事株式会社 | バ−ンアウト用空気送入形カ−ボンセンサ保護管 |
| JPS5977560U (ja) * | 1982-11-10 | 1984-05-25 | 株式会社浪速製作所 | 自硬性砂を用いる鋳型造型機におけるブロープレート及びブローノズル自動清掃装置 |
| JPS6021410U (ja) * | 1983-07-20 | 1985-02-14 | ニユ−ロング株式会社 | 微粉体充填包装機における脱気装置 |
| JPS6034314A (ja) * | 1983-07-30 | 1985-02-21 | オリオン機械工業株式会社 | 袋の封印方法 |
| JPS6111323A (ja) * | 1984-06-26 | 1986-01-18 | 株式会社 フジヤマ技研 | 茶袋シ−ル機 |
| CA1339952C (en) * | 1984-10-29 | 1998-07-14 | William J. Knowles | Immunoassays for denatured protein analytes, particularly hb alc, and monoclonal antibodies thereto |
| JPS61254861A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Nitsusui Seiyaku Kk | ヒトγ−グロブリン変性物 |
| JPS61254860A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Nitsusui Seiyaku Kk | Ｒｆの測定法 |
| JPS62168827A (ja) * | 1985-08-12 | 1987-07-25 | 有限会社 石津製機 | チヤンバ−ボツクス内における袋への不活性ガス流入方法 |
| JPH0668492B2 (ja) * | 1986-03-20 | 1994-08-31 | 日立化成工業株式会社 | リウマチ因子の定量法 |
| JPH0672888B2 (ja) * | 1986-03-24 | 1994-09-14 | 日立化成工業株式会社 | リウマチ因子定量用試薬 |
-
1979
- 1979-07-07 JP JP8629379A patent/JPS5610254A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5610254A (en) | 1981-02-02 |
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