CN112986164A - 一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测试剂技术领域，特别是涉及一种抗肝素稳定的α‑L‑岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用。本发明所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L、缓冲液50~500mmol/L、底物0.1~3g/L、表面活性剂1~50g/L、稳定剂0.001~0.1g/L和防腐剂0.3~3g/L；所述底物包括2‑氯‑对硝基苯酚‑α‑L‑岩藻糖苷或M‑G‑2‑氯‑对硝基苯酚‑α‑L‑岩藻糖苷。本发明通过在α‑L‑岩藻糖苷酶检测试剂中添加适宜浓度的硫酸链霉素，有效去除了样本中肝素的干扰，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题。

Description

一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及检测试剂技术领域，特别是涉及一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用。

背景技术

α-L-岩藻糖苷酶（AFU）是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体内的各种组织、细胞和体液中，尤其以肝、肾等组织活性较高。AFU在诊断肝细胞癌中敏感性好，阳性率高，是AFP阳性率的三倍以上，对AFP阴性病例及小细胞肝癌的诊断价值极大，是早期原发性肝癌诊断的有用指标。

目前检测AFU的方法主要有荧光法、终点比色法、速率法。荧光法是利用岩藻糖苷酶化合物在岩藻糖苷酶水解后，释放出可发射荧光的4-甲基伞形酮，通过检查荧光强度来分析酶活力。该方法对仪器要求高，还需要凝胶过滤去除干扰物质，不能用于自动化分析，难以进行普及推广。终点比色法是以PNP-AFU为底物，底物被酶分解后产生色团，该色团在碱性条件下呈现黄色，利用分光光度法进行定量分析。该方法操作简便，对于设备要求也不高，但是酶本身的抗干扰性差，不能解决血清溶血、脂血等因素对测定的影响。主要测定操作繁琐，所需反应的时间也较长，不能自动化检测所以难以推广。速率法是以AFU在合适的反应条件下催化含呈色基团的特定底物水解，在一定的波长下使吸光度增加，连续监测吸光度值的变化可以计算出样本中AFU的活性。该方法操作简单，测定时间短，灵敏度和抗干扰性都有提高，适用于各种半/全自动分析仪器，便于普及推广。由于速率法具有便于临床推广应用的特点，近年来AFU检测逐步在临床医学方面得到普遍应用。

然而，样本经抗凝剂肝素处理后，肝素会使α-L-岩藻糖苷酶单试剂发生浑浊，导致吸光度假性偏高，从而使检测结果偏高，阴阳性不符。因此，亟需一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测单试剂。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用。本发明提供的试剂盒有效去除了肝素的干扰，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L、缓冲液50~500mmol/L、底物0.1~3g/L、表面活性剂1~50g/L、稳定剂0.001~0.1g/L和防腐剂0.3~3g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

优选的，所述稳定剂包括L-半胱氨酸。

优选的，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.05~0.1g/L、缓冲液250~300mmol/L、底物1g/L、表面活性剂30g/L、L-半胱氨酸0.03~0.1g/L和防腐剂1~2g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

优选的，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.05g/L、缓冲液300mmol/L、底物1g/L、表面活性剂30g/L、L-半胱氨酸0.05g/L和防腐剂2g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷

优选的，所述缓冲液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或Good's缓冲液；所述缓冲液的pH值为4.5~5.5。

优选的，所述表面活性剂包括曲拉通100、Brij35和吐温-20中的一种或多种。

优选的，所述防腐剂包括叠氮钠或Proclin 300。

本发明还提供了上述试剂盒在检测α-L-岩藻糖苷酶中的应用。

优选的，检测的样本包括含有肝素的样本。

有益效果：

本发明提供一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L、缓冲液50~500mmol/L、底物0.1~3g/L、表面活性剂1~50g/L、稳定剂0.001~0.1g/L和防腐剂0.3~3g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷酶或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。本发明通过在α-L-岩藻糖苷酶检测试剂中添加适宜浓度的硫酸链霉素，有效去除了样本中肝素的干扰，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题；且本发明制备的试剂盒在检测肝素类抗凝血浆时基本不发生值的偏移，对结果几乎不产生影响，与市场流通的双试剂盒测值接近，相关性r=0.9987，相比之下，市场流通的单试剂盒处理肝素样本时检测结果有不同程度升高且没有规律性，与对照双试剂盒的相关性r=0.5105，可见，本发明制备的试剂盒在抗肝素的效果与双试剂盒接近，且相对于双试剂盒具有配制简单、操作方便和检测时间短的优势。

附图说明

图1为本发明应用例1中实施例2制备的试剂盒与对照双试剂盒检测普通样本（含有肝素样本）时相关性图谱；

图2为本发明应用例1中AFU单试剂盒与对照双试剂盒检测普通样本（含有肝素样本）时相关性图谱。

具体实施方式

本发明提供一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L、缓冲液50~500mmol/L、底物0.1~3g/L、表面活性剂1~50g/L、稳定剂0.001~0.1g/L和防腐剂0.3~3g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

如无特殊说明本发明对所述试剂盒中各组分来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

本发明所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L，优选0.05~0.1g/L，更优选为0.05~0.06g/L，最优选为0.05g/L。本发明通过添加适宜浓度的硫酸链霉素，使硫酸链霉素与肝素结合，从而有效去除了样本中肝素的干扰。

本发明所述试剂盒包括缓冲液50~500mmol/L，优选为250~350mmol/L，更优选为300mmol/L。在本发明中，所述缓冲液优选包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或Good's缓冲液，更优选为醋酸-醋酸钠缓冲液；所述缓冲液的pH值优选为4.5~5.5，更优选为5.2。本发明通过缓冲液调整试剂的pH，从而提高了底物的稳定性，进而提高了检测结果的准确性。

本发明所述试剂盒包括底物0.1~3g/L，优选为0.8~1.5g/L，更优选为1g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷，优选为M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。本发明所述底物为检测α-L-岩藻糖苷酶的反应物。

本发明所述试剂盒包括表面活性剂1~50g/L，优选为20~35g/L，更优选为30g/L。在本发明中，所述表面活性剂优选包括曲拉通100、Brij35和吐温-20中的一种或多种，更优选为曲拉通100。本发明所述表面活性剂具有提升检测反应的灵敏度的作用。

本发明所述试剂盒包括稳定剂0.001~0.1g/L，优选为0.03~0.1g/L，进一步优选为0.03~0.06g/L，更优选为0.05g/L。在本发明中所述稳定剂优选包括L-半胱氨酸。本发明通过添加适宜浓度的L-半胱氨酸，提高了试剂的稳定性，使得检测试剂在2~8℃的条件下能保持稳定18个月以上。

本发明所述试剂盒包括防腐剂0.3~3g/L，优选为1~2.2g/L，更优选为2g/L。在本发明中，所述优选包括叠氮钠或Proclin 300，更优选为Proclin 300。本发明所述防腐剂具有抑制杂菌生长，延长试剂盒有效期的作用。

本发明合理调配α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒中各组分的种类和用量，不仅有效去除了样本中肝素的干扰，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题；而且采用本发明特定组成的试剂盒在检测肝素类抗凝血浆时基本不发生值的偏移，对结果几乎不产生影响，与市场流通的双试剂盒测值接近，相关性r=0.9987，且相对于双试剂盒具有配制简单、操作方便和检测时间短的优势；同时，各种组分用量的合理配合提高了试剂盒的开瓶稳定性和加热稳定性。

本发明优选还提供了上述试剂盒的制备方法，包括：将缓冲液、底物、表面活性剂、硫酸链霉素、稳定剂和防腐剂混合，调整pH为4.5~5.5，定容至1L，得到试剂R；将试剂R分装后得到上述试剂盒。在本发明中，所述调整pH的试剂优选包括盐酸或氢氧化钠溶液。本发明对所述调整pH的操作没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作即可。

本发明还提供了上述试剂盒在检测α-L-岩藻糖苷酶中的应用。在本发明中，所述检测的样本优选包括含有肝素的样本。本发明所述试剂盒检测α-L-岩藻糖苷酶是以非诊断为目的，仅是为了获得一个α-L-岩藻糖苷酶的中间值。

在本发明中，所述检测α-L-岩藻糖苷酶的方法优选包括速率法；所述检测的设备优选包括全自动生化分析仪；所述检测的条件优选包括：反应温度为37℃，反应时间为10min，主波长为404nm，副波长为524nm，样本量为25μl，上述试剂R量为225μl。本发明对所述检测设备的来源没有限定，采用本领域技术人员所熟知市售商品即可。

本发明通过在试剂中加入了适宜浓度的硫酸链霉素并结合特定的缓冲液和适宜浓度的L-半胱氨酸，有效去除了肝素的干扰且不影响试剂的稳定性和检测结果的准确性，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒的制备：将300mmol醋酸-醋酸钠缓冲液、1g M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷、30g曲拉通100、0.03g硫酸链霉素、0.1gL-半胱氨酸和2g Proclin 300依次加入烧杯中搅拌至完全溶解，用盐酸和氢氧化钠溶液调整pH为5.2后，定容到1L，得到试剂R，将试剂R分装（60mL/瓶），得到试剂盒。

实施例2

一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒的制备：将300mmol醋酸-醋酸钠缓冲液、1g M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷、30g曲拉通100、0.05g硫酸链霉素、0.05gL-半胱氨酸和2g Proclin 300依次加入烧杯中搅拌至完全溶解，用盐酸和氢氧化钠溶液调整pH为5.2后，定容到1L，得到试剂R，将试剂R分装（60mL/瓶），得到试剂盒。

实施例3

一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，所述试剂盒的制备：将250mmol醋酸-醋酸钠缓冲液、1g M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷、30g曲拉通100、0.1g硫酸链霉素、0.03gL-半胱氨酸和1g Proclin 300依次加入烧杯中搅拌至完全溶解，用盐酸和氢氧化钠溶液调整pH为5.2后，定容到1L，得到试剂R，将试剂R分装（60mL/瓶），得到试剂盒。

对比例1

一种与实施例2相似的试剂盒，唯一区别在于，试剂中未添加硫酸链霉素。

对比例2

一种与实施例2相似的试剂盒，唯一区别在于，试剂中未添加L-半胱氨酸。

对比例3

一种与实施例2相似组成的试剂盒，唯一区别在于，试剂中硫酸链霉素的浓度为0.15g/L。

对比例4

一种与实施例2相似组成的试剂盒，唯一区别在于，试剂中硫酸链霉素的浓度为0.01g/L。

对比例5

一种与实施例2相似组成的试剂盒，唯一区别在于，试剂中L-半胱氨酸的浓度为0.15g/L。

对比例6

一种与实施例2相似组成的试剂盒，唯一区别在于，将L-半胱氨酸替换为氯化胆碱。

对比例7

一种与实施例2相似组成的试剂盒，唯一区别在于，将L-半胱氨酸替换为山梨醇。

应用例1

从医院采取血清样本和肝素同源样本，其中血清样本分别编号1至10，肝素样本分别编号肝素1至肝素10，样本11至样本40均为普通血清样本，分别采用实施例2制备的试剂盒、AFU单试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司，商品名：金斯尔，批号20-0730）和AFU双试剂盒（北京九强生物技术股份有限公司，商品名：金斯尔，批号20-0514）对上述样本进行检测，检测方法为速率法；所述检测的设备为全自动生化分析仪；所述检测的条件为：反应温度为37℃，反应时间为10min，主波长为404nm，副波长为524nm，样本量为25μl，上述试剂R量为225μl，实验结果见表1、图1和图2。

表1 不同试剂盒对不同样本中α-L-岩藻糖苷酶的检测结果（单位：g/L）

应用例2

一种与应用例1相似的方法，唯一区别在于，本对比例的试剂盒为对比例1制备的试剂盒，检测结果见表2。

表2 不同试剂盒对不同样本中α-L-岩藻糖苷酶的检测结果（单位：g/L）

由表1、表2、图1和图2可以看出本发明制备的试剂盒在检测肝素类抗凝血浆时基本不发生值的偏移，对结果几乎不产生影响，与对照双试剂盒测值接近，相关性r=0.9987，相比之下，对照单试剂盒处理肝素样本时检测结果有不同程度升高且没有规律性，与对照双试剂盒的相关性r=0.5105，可见，本发明制备的试剂盒在抗肝素的效果与双试剂盒接近，且相对于双试剂盒具有配制简单、操作方便和检测时间短的优势。

应用例3

一种与应用例1相似的检测方法，区别在于，采用实施例2制备的试剂盒与市场上流通的AFU单试剂盒进行对比，对同一AFU低值样本和同一AFU高值样本进行重复性检测，检测结果见表3和表4。

表3 不同试剂盒对同一AFU低值样本的检测结果（单位：g/L）

表4 不同试剂盒对同一AFU高值样本的检测结果（单位：g/L）

由表3和表4可知，本发明试剂盒与对照单试剂盒都能满足行业标准，变异系数在5%以内。

应用例4

将实施例1、2、3制备的试剂盒、对比例2、6、7制备的试剂盒和对照单试剂盒分别留取试剂在定标通道下进行仪器内开瓶检测、4℃检测、以及37℃加热检测，在试剂定标曲线下每隔3~7d取出检测质控，检测结果见表5。

表5 不同试剂盒稳定性测试结果（单位：g/L）

由表5可知，本发明试剂盒与对照单试剂盒的加热都能稳定至第31天；但本发明试剂开瓶至少稳定一个月，比对照试剂更有优势；另外由实施例2和对比例2的数据可知，本发明通过添加适宜浓度的L-半胱氨酸，提高了试剂的稳定性；最后，由实施例2、对比例6和对比例7的数据可知，L-半胱氨酸作为稳定剂的稳定性效果最好。

应用例5

从医院采取血清样本和肝素同源样本，其中血清样本分别编号a1至a12，肝素样本分别编号肝素a1至肝素a12，分别采用实施例2制备的试剂盒、实施例3制备的试剂盒和对比例3~5制备的试剂盒，对上述样本进行检测，检测方法为速率法；所述检测的设备为全自动生化分析仪；所述检测的条件为：反应温度为37℃，反应时间为10min，主波长为404nm，副波长为524nm，样本量为25μl，上述试剂R量为225μl，实验结果见表6。

表6 不同试剂盒对不同样本中α-L-岩藻糖苷酶的检测结果（单位：g/L）

由表6可知，与实施例2制备的试剂盒相比，对比例3制备的试剂盒中硫酸链霉素浓度增加，抗肝素效果虽然有所提高，但会影响血清样本的检测结果，使检测值偏高；而对比例4制备的试剂盒虽然对血清样本的检测结果没有影响，但抗肝素效果差。

另外，由实施例2和对比例5的实验结果可知，L-半胱氨酸浓度提高后将影响试剂盒的抗肝素效果。本发明通过适宜浓度的硫酸链霉素和L-半胱氨酸复配不仅有效去除了肝素的干扰，而且对检测结果没有影响。

综上所述，本发明通过在试剂中加入了适宜浓度的硫酸链霉素并结合特定的缓冲液和适宜浓度的L-半胱氨酸，有效去除了肝素的干扰且不影响试剂的稳定性和检测结果的准确性，解决了AFU单试剂不抗肝素的问题。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.03~0.1g/L、缓冲液50~500mmol/L、底物0.1~3g/L、表面活性剂1~50g/L、稳定剂0.001~0.1g/L和防腐剂0.3~3g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂包括L-半胱氨酸。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.05~0.1g/L、缓冲液250~300mmol/L、底物1g/L、表面活性剂30g/L、L-半胱氨酸0.03~0.1g/L和防腐剂1~2g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括硫酸链霉素0.05g/L、缓冲液300mmol/L、底物1g/L、表面活性剂30g/L、L-半胱氨酸0.05g/L和防腐剂2g/L；所述底物包括2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷或M-G-2-氯-对硝基苯酚-α-L-岩藻糖苷。

5.根据权利要求1~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液或Good's缓冲液；所述缓冲液的pH值为4.5~5.5。

6.根据权利要求1~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂包括曲拉通100、Brij35和吐温-20中的一种或多种。

7.根据权利要求1~4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂包括叠氮钠或Proclin 300。

8.权利要求1~7任一项所述试剂盒在检测α-L-岩藻糖苷酶中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，检测的样本包括含有肝素的样本。

Images