JP2003002894A - α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法Info
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- JP2003002894A JP2003002894A JP2001190209A JP2001190209A JP2003002894A JP 2003002894 A JP2003002894 A JP 2003002894A JP 2001190209 A JP2001190209 A JP 2001190209A JP 2001190209 A JP2001190209 A JP 2001190209A JP 2003002894 A JP2003002894 A JP 2003002894A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なα−Ｌ−フコース誘導体、
これを含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試
薬、及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定法
を提供する。 【解決手段】 一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体、これを含んでなるα
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、及びこれを用いる
ことを特徴とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法。
これを含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試
薬、及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定法
を提供する。 【解決手段】 一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体、これを含んでなるα
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、及びこれを用いる
ことを特徴とするα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なα−Ｌ−フコー
ス誘導体、並びにこれを含んで成るα−Ｌ−フコシダー
ゼ活性測定用試薬及びこれを用いることを特徴とするα
−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法に関するものであ
る。
ス誘導体、並びにこれを含んで成るα−Ｌ−フコシダー
ゼ活性測定用試薬及びこれを用いることを特徴とするα
−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】α−Ｌ−フコシダーゼ（EC3.2.1.51）
は、糖蛋白質の一種であるフコプロテインの異化作用に
関与するリソソーム酵素である。
は、糖蛋白質の一種であるフコプロテインの異化作用に
関与するリソソーム酵素である。
【０００３】血清α−Ｌ−フコシダーゼ活性は、肝疾患
に於いて有意に上昇することから、最近、肝細胞癌のマ
ーカーとして注目されている。従来、α−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性の測定用基質としては、例えばｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｌ−フコシド[例えばClinica Chimica Acta,
73,321-327(1976)、Clinica chimica Acta,73,329-346
(1976)等の文献]、４−メチルウンべリフェリル−α−
Ｌ−フコシド［例えばClinica Chimica Acta，91,197-2
02(1979)、Clinica Chimica Acta,114,269-274(1981)、
Biochemica Biophysica Acta,485,147-155(1977)等の文
献］、２−ハロゲノ又はニトロ置換−ｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｌ−フコシド（特開平6-179690号公報）等が知
られている。
に於いて有意に上昇することから、最近、肝細胞癌のマ
ーカーとして注目されている。従来、α−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性の測定用基質としては、例えばｐ−ニトロフェ
ニル−α−Ｌ−フコシド[例えばClinica Chimica Acta,
73,321-327(1976)、Clinica chimica Acta,73,329-346
(1976)等の文献]、４−メチルウンべリフェリル−α−
Ｌ−フコシド［例えばClinica Chimica Acta，91,197-2
02(1979)、Clinica Chimica Acta,114,269-274(1981)、
Biochemica Biophysica Acta,485,147-155(1977)等の文
献］、２−ハロゲノ又はニトロ置換−ｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｌ−フコシド（特開平6-179690号公報）等が知
られている。
【０００４】しかし、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フ
コシドをα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用基質として用
いる場合は、エンドポイント法のみにしか使用できな
い。即ち、酵素活性を測定する際に、先ず該酵素の至適
ｐＨ５〜６で酵素反応を行わせ、次いでこの反応液を、
遊離したｐ−ニトロフェノールの発色定量に適するｐＨ
10程度の強アルカリ性にする必要があるため、酵素反応
を停止させなければならない。従って、このような基質
では、酵素活性測定法として最適な、酵素反応進行中に
直接吸光度変化を計測するレイトアッセイ法を使用する
ことができないという欠点を有している。
コシドをα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用基質として用
いる場合は、エンドポイント法のみにしか使用できな
い。即ち、酵素活性を測定する際に、先ず該酵素の至適
ｐＨ５〜６で酵素反応を行わせ、次いでこの反応液を、
遊離したｐ−ニトロフェノールの発色定量に適するｐＨ
10程度の強アルカリ性にする必要があるため、酵素反応
を停止させなければならない。従って、このような基質
では、酵素活性測定法として最適な、酵素反応進行中に
直接吸光度変化を計測するレイトアッセイ法を使用する
ことができないという欠点を有している。
【０００５】また、４−メチルウンべリフェリル−α−
Ｌ−フコシドをα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用基質と
して用いる場合は、例えば蛍光強度計のような特殊な測
定機器が必要であり、それ故に多数検体処理には不向き
であるという欠点を有している。
Ｌ−フコシドをα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用基質と
して用いる場合は、例えば蛍光強度計のような特殊な測
定機器が必要であり、それ故に多数検体処理には不向き
であるという欠点を有している。
【０００６】近年、レイトアッセイ法での測定が可能と
なった、２−ハロゲノ或いはニトロ置換−ｐ−ニトロフ
ェニル−α−Ｌ−フコシドが開発されたが、これをα−
Ｌ−フコシダーゼ活性用基質として用いた場合は、酵素
との親和性の問題、遊離してくる２−ハロゲノ或いはニ
トロ置換−ｐ−ニトロフェノール誘導体の有効波長（極
大吸収波長）が例えばビリルビン、ヘモグロビン等の血
清成分の影響を受けるため測定精度が悪くなる等の欠点
を有している。
なった、２−ハロゲノ或いはニトロ置換−ｐ−ニトロフ
ェニル−α−Ｌ−フコシドが開発されたが、これをα−
Ｌ−フコシダーゼ活性用基質として用いた場合は、酵素
との親和性の問題、遊離してくる２−ハロゲノ或いはニ
トロ置換−ｐ−ニトロフェノール誘導体の有効波長（極
大吸収波長）が例えばビリルビン、ヘモグロビン等の血
清成分の影響を受けるため測定精度が悪くなる等の欠点
を有している。
【０００７】このような状況下、α−Ｌ−フコシダーゼ
活性を、より酵素との親和性が高く、血清成分の影響を
受けることなく、レイトアッセイ法により効率よく且つ
高精度に測定し得る試薬として使用可能な新規なα−Ｌ
−フコシダーゼ活性測定用試薬の開発が要望されている
現状にある。
活性を、より酵素との親和性が高く、血清成分の影響を
受けることなく、レイトアッセイ法により効率よく且つ
高精度に測定し得る試薬として使用可能な新規なα−Ｌ
−フコシダーゼ活性測定用試薬の開発が要望されている
現状にある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した如
き状況に鑑みなされたもので、新規なα−Ｌ−フコース
誘導体、これを含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測
定用試薬、及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性
測定法を提供することを課題とする。
き状況に鑑みなされたもので、新規なα−Ｌ−フコース
誘導体、これを含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測
定用試薬、及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性
測定法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記課題を解
決する目的でなされたものであり、（１）一般式［１］
決する目的でなされたものであり、（１）一般式［１］
【００１０】
【化５】
【００１１】（式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体、（２）
一般式［１］
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体、（２）
一般式［１］
【００１２】
【化６】
【００１３】（式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を含んで
なる、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、（３）一
般式［１］
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を含んで
なる、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、（３）一
般式［１］
【００１４】
【化７】
【００１５】（式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を用いる
ことを特徴とする、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方
法、及び（４）α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料と、一般
式［１］
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を用いる
ことを特徴とする、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方
法、及び（４）α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料と、一般
式［１］
【００１６】
【化８】
【００１７】（式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体とを接触
させ、遊離した４−アシルフェノール誘導体を定量し、
その変化量に基づいてα−Ｌ−フコシダーゼ活性を算出
することを特徴とする、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定
方法、に関する発明である。
基を表し、Ｘはハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数
を表す。）で示されるα−Ｌ−フコース誘導体とを接触
させ、遊離した４−アシルフェノール誘導体を定量し、
その変化量に基づいてα−Ｌ−フコシダーゼ活性を算出
することを特徴とする、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定
方法、に関する発明である。
【００１８】即ち、発明者等は、上記目的を達成すべく
鋭意研究を重ねた結果、新規なα−Ｌ−フコース誘導体
を開発し、これを用いてα−Ｌ−フコシダーゼ活性を測
定することにより、従来のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測
定用試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−Ｌ−フコシダーゼ活性を、血清成分である例え
ばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けることな
く、レイトアッセイ法で効率よく、且つ高精度に測定し
得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
鋭意研究を重ねた結果、新規なα−Ｌ−フコース誘導体
を開発し、これを用いてα−Ｌ−フコシダーゼ活性を測
定することにより、従来のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測
定用試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服
し、α−Ｌ−フコシダーゼ活性を、血清成分である例え
ばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けることな
く、レイトアッセイ法で効率よく、且つ高精度に測定し
得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１９】一般式［１］に於いて、Ｒで示される低級
アルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れ
でもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜４のもの
が挙げられ、具体的には、例えばメチル基，エチル基，
ｎ−プロピル基，ｎ−ブチル基，ｎ−ペンチル基，ｎ−
ヘキシル基等の直鎖状低級アルキル基、例えばイソプロ
ピル基，イソブチル基，sec-ブチル基，tert-ブチル
基，イソペンチル基，sec-ペンチル基，tert-ペンチル
基基，ネオペンチル基，イソヘキシル基，sec-ヘキシル
基，tert-ヘキシル基，ネオヘキシル基等の分枝状低級
アルキル基、例えばシクロプロピル基，シクロブチル
基，シクロペンチル基，シクロヘキシル基等の環状低級
アルキル基等が挙げられ、中でも直鎖状又は分枝状のも
の、就中、直鎖状のものが好ましい。
アルキル基としては、直鎖状、分枝状或いは環状の何れ
でもよく、通常炭素数１〜６、好ましくは１〜４のもの
が挙げられ、具体的には、例えばメチル基，エチル基，
ｎ−プロピル基，ｎ−ブチル基，ｎ−ペンチル基，ｎ−
ヘキシル基等の直鎖状低級アルキル基、例えばイソプロ
ピル基，イソブチル基，sec-ブチル基，tert-ブチル
基，イソペンチル基，sec-ペンチル基，tert-ペンチル
基基，ネオペンチル基，イソヘキシル基，sec-ヘキシル
基，tert-ヘキシル基，ネオヘキシル基等の分枝状低級
アルキル基、例えばシクロプロピル基，シクロブチル
基，シクロペンチル基，シクロヘキシル基等の環状低級
アルキル基等が挙げられ、中でも直鎖状又は分枝状のも
の、就中、直鎖状のものが好ましい。
【００２０】Ｒで示されるアリール基としては、例えば
フェニル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ナフ
チル基等が挙げられ、中でもフェニル基が好ましい。
フェニル基、トリル基、キシリル基、メシチル基、ナフ
チル基等が挙げられ、中でもフェニル基が好ましい。
【００２１】Ｘで示されるハロゲン原子としては、例え
ばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙
げられる。
ばフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙
げられる。
【００２２】ｎは、通常１〜４の整数、好ましくは１又
は２、より好ましくは１である。
は２、より好ましくは１である。
【００２３】ｎが１の場合、１個のＸは芳香環の２位、
３位、５位又は６位に、好ましくは２位に置換される。
３位、５位又は６位に、好ましくは２位に置換される。
【００２４】ｎが２の場合、２個のＸは芳香環の2,3
位、2,5位、2,6位又は3,5位に、好ましくは2,3位又は2,
5位に置換される。
位、2,5位、2,6位又は3,5位に、好ましくは2,3位又は2,
5位に置換される。
【００２５】一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース
誘導体の具体例としては、例えば２−フルオロ−４−ア
セチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−クロロ−４−
アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−ブロモ−４
−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−ヨード−
４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジ
フルオロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、
２，５−ジフルオロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−
フコシド、２，６−ジフルオロ−４−アセチルフェニル
−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジクロロ−４−アセチル
フェニル−α−Ｌ−フコシド、２，５−ジクロロ−４−
アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２，６−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシドなどが挙
げられ、中でも２−クロロ−４−アセチルフェニル−α
−Ｌ−フコシドが好ましい。
誘導体の具体例としては、例えば２−フルオロ−４−ア
セチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−クロロ−４−
アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−ブロモ−４
−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２−ヨード−
４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジ
フルオロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、
２，５−ジフルオロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−
フコシド、２，６−ジフルオロ−４−アセチルフェニル
−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジクロロ−４−アセチル
フェニル−α−Ｌ−フコシド、２，５−ジクロロ−４−
アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド、２，６−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシドなどが挙
げられ、中でも２−クロロ−４−アセチルフェニル−α
−Ｌ−フコシドが好ましい。
【００２６】一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース
誘導体は、例えばフェニルグリコシド誘導体の合成に用
いられる融解法（新実験化学講座,14(Ｖ),2471,2475-24
76）に従って、以下の如くして製造すればよい。
誘導体は、例えばフェニルグリコシド誘導体の合成に用
いられる融解法（新実験化学講座,14(Ｖ),2471,2475-24
76）に従って、以下の如くして製造すればよい。
【００２７】即ち、一般式［１］で示される化合物を合
成するには、例えば一般式［２］
成するには、例えば一般式［２］
【００２８】
【化９】
【００２９】（式中、Ａｃは、アセチル基を表す。）で
示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースと、一般
式［３］
示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースと、一般
式［３］
【００３０】
【化１０】
【００３１】（式中、Ｒ、Ｘ及びｎは前記に同じ。）で
示される４−アシルフェノール誘導体とを溶融させ、触
媒存在下、縮合反応により一般式［４］
示される４−アシルフェノール誘導体とを溶融させ、触
媒存在下、縮合反応により一般式［４］
【００３２】
【化１１】
【００３３】（式中、Ｒ、Ｘ、ｎ及びＡｃは前記に同
じ、）で示されるトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコー
ス誘導体を製造し、次いでアルカリ存在下、脱アセチル
化反応させることにより得られる。
じ、）で示されるトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコー
ス誘導体を製造し、次いでアルカリ存在下、脱アセチル
化反応させることにより得られる。
【００３４】一般式［３］で示される４−アセチルフェ
ノール誘導体の使用量は、使用する４−アセチルフェノ
ール誘導体の種類によって異なるが、通常、一般式
［２］で示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコース
１当量に対して、１〜100倍モル、好ましくは５〜20倍
モルである。
ノール誘導体の使用量は、使用する４−アセチルフェノ
ール誘導体の種類によって異なるが、通常、一般式
［２］で示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコース
１当量に対して、１〜100倍モル、好ましくは５〜20倍
モルである。
【００３５】溶融温度は、一般式［２］で示されるテト
ラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコース及び４−アセチルフェ
ノール誘導体が溶融すればよく、通常100〜150℃であ
る。
ラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコース及び４−アセチルフェ
ノール誘導体が溶融すればよく、通常100〜150℃であ
る。
【００３６】縮合反応に用いられる触媒としては、この
反応を促進させるものなら特に限定されないが、例えば
塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム等のハロゲン化
金属類、例えばタングステン酸、リンタングステン酸等
のタングステン酸類、例えばモリブデン酸、リンモリブ
デン酸等のモリブデン酸類、例えば硫酸、トルエンスル
ホン酸等が挙げられ、中でも塩化亜鉛、臭化亜鉛が好ま
しい。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み
合わせて用いてもよい。
反応を促進させるものなら特に限定されないが、例えば
塩化亜鉛、臭化亜鉛、塩化アルミニウム等のハロゲン化
金属類、例えばタングステン酸、リンタングステン酸等
のタングステン酸類、例えばモリブデン酸、リンモリブ
デン酸等のモリブデン酸類、例えば硫酸、トルエンスル
ホン酸等が挙げられ、中でも塩化亜鉛、臭化亜鉛が好ま
しい。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み
合わせて用いてもよい。
【００３７】触媒の使用量は、一般式［３］で示される
４−アセチルフェノール誘導体の種類によって異なる
が、一般式［２］で示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ
−フコース１当量に対して、通常0.5〜10倍モル、好ま
しくは１〜２倍モルである。
４−アセチルフェノール誘導体の種類によって異なる
が、一般式［２］で示されるテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ
−フコース１当量に対して、通常0.5〜10倍モル、好ま
しくは１〜２倍モルである。
【００３８】縮合反応は、好ましくは減圧下で行われ、
要すれば、例えば少量の酢酸−無水酢酸混液を添加して
行ってもよい。
要すれば、例えば少量の酢酸−無水酢酸混液を添加して
行ってもよい。
【００３９】縮合反応時間は、特に限定されないが、通
常0.5〜12時間、好ましくは２〜４時間である。
常0.5〜12時間、好ましくは２〜４時間である。
【００４０】一般式［２］で示されるテトラ−Ｏ−アセ
チル−Ｌ−フコースは、α−アノマー、β−アノマー或
いはこれらの混合物の何れでもよい。また、当該化合物
は、市販品を用いても、例えばBiochem.J.,80,433-435
(1961)等の文献に記載された方法、即ちＬ−フコースを
無水酢酸及びピリジンを用いてアセチル化させる方法に
従って製造してもよい。
チル−Ｌ−フコースは、α−アノマー、β−アノマー或
いはこれらの混合物の何れでもよい。また、当該化合物
は、市販品を用いても、例えばBiochem.J.,80,433-435
(1961)等の文献に記載された方法、即ちＬ−フコースを
無水酢酸及びピリジンを用いてアセチル化させる方法に
従って製造してもよい。
【００４１】一般式［３］で示される４−アセチルフェ
ノール誘導体は、市販品を用いても、常法により製造さ
れたものを用いてもよい。
ノール誘導体は、市販品を用いても、常法により製造さ
れたものを用いてもよい。
【００４２】一般式［３］で示される４−アシルフェノ
ール誘導体の具体例としては、例えば２−フルオロ−４
−アセチルフェノール、２−クロロ−４−アセチルフェ
ノール、２−ブロモ−４−アセチルフェノール、２−ヨ
ード−４−アセチルフェノール、２，３−ジフルオロ−
４−アセチルフェノール、２，５−ジフルオロ−４−ア
セチルフェノール、２，６−ジフルオロ−４−アセチル
フェノール、２，３−ジクロロ−４−アセチルフェノー
ル、２，５−ジクロロ−４−アセチルフェノール、２，
６−ジクロロ−４−アセチルフェノールなどが挙げら
れ、中でも２−クロロ−４−アセチルフェノールが好ま
しい。
ール誘導体の具体例としては、例えば２−フルオロ−４
−アセチルフェノール、２−クロロ−４−アセチルフェ
ノール、２−ブロモ−４−アセチルフェノール、２−ヨ
ード−４−アセチルフェノール、２，３−ジフルオロ−
４−アセチルフェノール、２，５−ジフルオロ−４−ア
セチルフェノール、２，６−ジフルオロ−４−アセチル
フェノール、２，３−ジクロロ−４−アセチルフェノー
ル、２，５−ジクロロ−４−アセチルフェノール、２，
６−ジクロロ−４−アセチルフェノールなどが挙げら
れ、中でも２−クロロ−４−アセチルフェノールが好ま
しい。
【００４３】脱アセチル化反応に用いられる溶媒として
は、例えばトルエン，キシレン，ベンゼン，シクロヘキ
サン，ｎ−ヘキサン，ｎ−オクタン等の炭化水素類、例
えばメタノール，エタノール，ｎ−プロパノール，イソ
プロパノール，ｎ−ブタノール等のアルコール類、例え
ば四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ジクロロ
エタン，トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、
例えば酢酸エチル，酢酸ブチル，プロピオン酸メチル等
のエステル類、例えばアセトン，エチルメチルケトン，
ジエチルケトン等のケトン類、例えばジエチルエーテ
ル，テトラヒドロフラン，ジオキサン等のエーテル類、
アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド等が挙げられる。これらは夫々単独で用いて
も、二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。
は、例えばトルエン，キシレン，ベンゼン，シクロヘキ
サン，ｎ−ヘキサン，ｎ−オクタン等の炭化水素類、例
えばメタノール，エタノール，ｎ−プロパノール，イソ
プロパノール，ｎ−ブタノール等のアルコール類、例え
ば四塩化炭素，クロロホルム，塩化メチレン，ジクロロ
エタン，トリクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類、
例えば酢酸エチル，酢酸ブチル，プロピオン酸メチル等
のエステル類、例えばアセトン，エチルメチルケトン，
ジエチルケトン等のケトン類、例えばジエチルエーテ
ル，テトラヒドロフラン，ジオキサン等のエーテル類、
アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスル
ホキシド等が挙げられる。これらは夫々単独で用いて
も、二種以上適宜組み合わせて用いてもよい。
【００４４】脱アセチル化反応に使用するアルカリとし
ては、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の水
酸化物、例えば炭酸ナトリウム，炭酸カリウム等の炭酸
化物、例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノ
ラート等のアルカリ金属アルコラート、例えばアンモニ
ア等が挙げられ、中でもナトリウムメチラートが好まし
い。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み合
わせて用いてもよい。また、これらは例えばメタノー
ル、エタノール等に溶解したアルカリ溶液として用いて
もよい。
ては、例えば水酸化ナトリウム，水酸化カリウム等の水
酸化物、例えば炭酸ナトリウム，炭酸カリウム等の炭酸
化物、例えばナトリウムメチラート、ナトリウムフェノ
ラート等のアルカリ金属アルコラート、例えばアンモニ
ア等が挙げられ、中でもナトリウムメチラートが好まし
い。これらは夫々単独で用いても、二種以上適宜組み合
わせて用いてもよい。また、これらは例えばメタノー
ル、エタノール等に溶解したアルカリ溶液として用いて
もよい。
【００４５】アルカリの使用量は、使用する一般式
［４］で示されるトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコー
ス誘導体の種類により異なるが、通常、当該トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｌ−フコース誘導体１当量に対して、0.
01〜５倍モルである。
［４］で示されるトリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコー
ス誘導体の種類により異なるが、通常、当該トリ−Ｏ−
アセチル−α−Ｌ−フコース誘導体１当量に対して、0.
01〜５倍モルである。
【００４６】脱アセチル化反応に於ける反応温度は、通
常０〜100℃である。反応時間は、通常10分〜３時間で
ある。
常０〜100℃である。反応時間は、通常10分〜３時間で
ある。
【００４７】一般式［４］で示されるトリ−Ｏ−アセチ
ル−α−Ｌ−フコース誘導体の具体例としては、例えば
２−フルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｌ−フコシド、２−クロロ−４−アセチルフ
ェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２−
ブロモ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｌ−フコシド、２−ヨード−４−アセチルフェニル
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジ
フルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｌ−フコシド、２，５−ジフルオロ−４−アセチ
ルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、
２，６−ジフルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジクロロ−４
−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フ
コシド、２，５−ジクロロ−４−アセチルフェニル−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，６−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｌ−フコシドなどが挙げられ、中でも２−クロロ−４−
アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコ
シドが好ましい。
ル−α−Ｌ−フコース誘導体の具体例としては、例えば
２−フルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｌ−フコシド、２−クロロ−４−アセチルフ
ェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２−
ブロモ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−
α−Ｌ−フコシド、２−ヨード−４−アセチルフェニル
−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジ
フルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル
−α−Ｌ−フコシド、２，５−ジフルオロ−４−アセチ
ルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、
２，６−ジフルオロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ
−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，３−ジクロロ−４
−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フ
コシド、２，５−ジクロロ−４−アセチルフェニル−ト
リ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシド、２，６−ジクロ
ロ−４−アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−
Ｌ−フコシドなどが挙げられ、中でも２−クロロ−４−
アセチルフェニル−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコ
シドが好ましい。
【００４８】このようにして得られた一般式［１］で示
されるα−Ｌ−フコース誘導体の精製法及び上記以外の
反応操作並びに後処理方法等は、通常行われる同種反応
に準じて行われる。
されるα−Ｌ−フコース誘導体の精製法及び上記以外の
反応操作並びに後処理方法等は、通常行われる同種反応
に準じて行われる。
【００４９】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用
試薬は、一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導
体を含んでなるものであり、例えば自体公知のα−Ｌ−
フコシダーゼ活性測定法に用いられる試薬中に、一般式
［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を直接添加、
共存させるか、或いは一般式［１］で示されるα−Ｌ−
フコース誘導体を適当な溶媒に含有させて溶液状態と
し、これを当該測定用試薬に添加、共存させることによ
り容易に調製し得る。
試薬は、一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導
体を含んでなるものであり、例えば自体公知のα−Ｌ−
フコシダーゼ活性測定法に用いられる試薬中に、一般式
［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導体を直接添加、
共存させるか、或いは一般式［１］で示されるα−Ｌ−
フコース誘導体を適当な溶媒に含有させて溶液状態と
し、これを当該測定用試薬に添加、共存させることによ
り容易に調製し得る。
【００５０】一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース
誘導体は、単独で用いても、二種以上適宜組み合わせて
用いてもよい。
誘導体は、単独で用いても、二種以上適宜組み合わせて
用いてもよい。
【００５１】本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用
試薬は、本発明に係る一般式［１］で示されるα−Ｌ−
フコース誘導体を適当な溶媒に溶解して得られる組成物
の形をとることができ、この組成物は、使用に供される
まで、凍結処理、凍結乾燥処理等を施した状態、或いは
溶液等の状態等、多種の形態で保存し得るものである。
試薬は、本発明に係る一般式［１］で示されるα−Ｌ−
フコース誘導体を適当な溶媒に溶解して得られる組成物
の形をとることができ、この組成物は、使用に供される
まで、凍結処理、凍結乾燥処理等を施した状態、或いは
溶液等の状態等、多種の形態で保存し得るものである。
【００５２】この場合の一般式［１］で示されるα−Ｌ
−フコース誘導体の濃度としては、試薬や反応溶液中に
通常0.1〜20ｍＭ、好ましくは１〜10ｍＭとなるように
添加される。
−フコース誘導体の濃度としては、試薬や反応溶液中に
通常0.1〜20ｍＭ、好ましくは１〜10ｍＭとなるように
添加される。
【００５３】一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース
誘導体を含有させる溶媒としては、当該化合物を溶解し
得るものなら特に限定されないが、通常の緩衝液として
用いられているものが好ましい。緩衝液を構成する緩衝
剤の具体例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン
酸塩、例えば2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタン
スルホン酸（ＢＥＳ）、N-(2-アセトアミド)-2-アミノ
エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、3-(N-モルホリノ)プロ
パンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、2-[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジン]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等
のグッド緩衝剤等の通常この分野で用いられる緩衝剤は
全て挙げられる。
誘導体を含有させる溶媒としては、当該化合物を溶解し
得るものなら特に限定されないが、通常の緩衝液として
用いられているものが好ましい。緩衝液を構成する緩衝
剤の具体例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、クエン
酸塩、例えば2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタン
スルホン酸（ＢＥＳ）、N-(2-アセトアミド)-2-アミノ
エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、3-(N-モルホリノ)プロ
パンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、2-[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジン]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等
のグッド緩衝剤等の通常この分野で用いられる緩衝剤は
全て挙げられる。
【００５４】当該緩衝液のｐＨとしては、通常ｐＨ0.4
〜8.0、好ましくはｐＨ4.5〜7.0の範囲から適宜選択さ
れる。
〜8.0、好ましくはｐＨ4.5〜7.0の範囲から適宜選択さ
れる。
【００５５】当該緩衝剤の使用濃度としては、試薬又は
反応溶液中に通常１〜1000ｍＭ、好ましくは10〜200ｍ
Ｍとなるように添加される。
反応溶液中に通常１〜1000ｍＭ、好ましくは10〜200ｍ
Ｍとなるように添加される。
【００５６】また、要すれば、例えばポリオキシエチレ
ンオクチルフェニルエーテル〔例えば、トリトンＸ−１
００：ローム・アンド・ハース社製〕、ポリオキシエチ
レンラウリルエーテル〔例えば、エマルゲン１２０：花
王（株）製〕等のノニオン型界面活性剤等の界面活性
剤、例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤、例えば18-Cro
wn-6等のクラウンエーテル類、例えばα−シクロデキス
トリン等のシクロデキストリン類、例えばポリエチレン
グリコール等のグリコール類等の溶解補助剤、例えば塩
化ナトリウム等のイオン強度調製剤等のα−Ｌ−フコシ
ダーゼ活性測定法に於いて用いられる試薬類が、通常こ
の分野で用いられる濃度範囲で含まれていてもよいこと
はいうまでもない。
ンオクチルフェニルエーテル〔例えば、トリトンＸ−１
００：ローム・アンド・ハース社製〕、ポリオキシエチ
レンラウリルエーテル〔例えば、エマルゲン１２０：花
王（株）製〕等のノニオン型界面活性剤等の界面活性
剤、例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤、例えば18-Cro
wn-6等のクラウンエーテル類、例えばα−シクロデキス
トリン等のシクロデキストリン類、例えばポリエチレン
グリコール等のグリコール類等の溶解補助剤、例えば塩
化ナトリウム等のイオン強度調製剤等のα−Ｌ−フコシ
ダーゼ活性測定法に於いて用いられる試薬類が、通常こ
の分野で用いられる濃度範囲で含まれていてもよいこと
はいうまでもない。
【００５７】自体公知のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定
法としては、この分野で通常用いられるレイトアッセイ
による測定方法が全て挙げられるが、具体的には以下の
如くである。
法としては、この分野で通常用いられるレイトアッセイ
による測定方法が全て挙げられるが、具体的には以下の
如くである。
【００５８】即ち、α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料中
に、一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導体及
び緩衝剤を添加した後、20〜60℃、ｐＨ4.5〜6.5の条件
下、１分以上、好ましくは３〜10分間酵素反応させ、遊
離（生成）する発色性化合物の一般式［３］で示される
４−アシルフェノール誘導体の例えば吸光度（有効波長
（極大吸収波長）は、320〜360ｎｍ付近）等を直接分光
光度計を用いて測定し、単位時間当たりの吸光度の変化
量を求める。そして、予め測定したα−Ｌ−フコシダー
ゼ標品の吸光度変化量と対比させて当該試料中のα−Ｌ
−フコシダーゼ活性を算出する。
に、一般式［１］で示されるα−Ｌ−フコース誘導体及
び緩衝剤を添加した後、20〜60℃、ｐＨ4.5〜6.5の条件
下、１分以上、好ましくは３〜10分間酵素反応させ、遊
離（生成）する発色性化合物の一般式［３］で示される
４−アシルフェノール誘導体の例えば吸光度（有効波長
（極大吸収波長）は、320〜360ｎｍ付近）等を直接分光
光度計を用いて測定し、単位時間当たりの吸光度の変化
量を求める。そして、予め測定したα−Ｌ−フコシダー
ゼ標品の吸光度変化量と対比させて当該試料中のα−Ｌ
−フコシダーゼ活性を算出する。
【００５９】本発明の一般式［１］で示されるα−Ｌ−
フコース誘導体を基質として用いてα−Ｌ−フコシダー
ゼ活性を測定した場合には、遊離する４−アシルフェノ
ール誘導体は、α−Ｌ−フコシダーゼの至適ｐＨ域で測
定可能な分子吸光係数を有し、且つその有効波長（極大
吸収波長）が320〜360ｎｍ付近である為、試料中に含ま
れる例えばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受ける
ことなく、レイトアッセイ法により高感度、高精度でα
−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し得る。
フコース誘導体を基質として用いてα−Ｌ−フコシダー
ゼ活性を測定した場合には、遊離する４−アシルフェノ
ール誘導体は、α−Ｌ−フコシダーゼの至適ｐＨ域で測
定可能な分子吸光係数を有し、且つその有効波長（極大
吸収波長）が320〜360ｎｍ付近である為、試料中に含ま
れる例えばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受ける
ことなく、レイトアッセイ法により高感度、高精度でα
−Ｌ−フコシダーゼ活性を測定し得る。
【００６０】α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料としては、
α−Ｌ−フコシダーゼを含有するものであれば特に限定
されないが、具体的には、例えば微生物を含む培養液、
植物の抽出液、体液、尿、組織及びこれらの抽出液等が
挙げられ、中でも例えば血清、血液、血漿等の体液が好
ましい。また、緩衝剤としては、上記に挙げたものが同
様にして挙げられる。
α−Ｌ−フコシダーゼを含有するものであれば特に限定
されないが、具体的には、例えば微生物を含む培養液、
植物の抽出液、体液、尿、組織及びこれらの抽出液等が
挙げられ、中でも例えば血清、血液、血漿等の体液が好
ましい。また、緩衝剤としては、上記に挙げたものが同
様にして挙げられる。
【００６１】以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。
【００６２】
【実施例】実施例１ ２−クロロ−４−アセチルフェニ
ル−α−Ｌ−フコシドの合成 Biochem.J.,80,433-435(1961)文献に記載の方法に従っ
て、テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースを製造した。
即ち、無水酢酸 84ml−ピリジン 108ml混合溶媒中に
Ｌ−フコース 10g(61mmol)を氷冷下、撹拌しながら添
加した後、０℃で２日間撹拌反応させた。反応終了後、
反応液にクラッシュドアイスを添加し、４時間撹拌した
後クロロホルム500mlで抽出を行った。得られたクロロ
ホルム層を水 300mlで６回洗浄後、硫酸マグネシウム
20gで乾燥させ留去し、テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−
フコ−スのα−アノマーとβ−アノマーの混合物 18g
（54mmol、収率89％）を得た。
ル−α−Ｌ−フコシドの合成 Biochem.J.,80,433-435(1961)文献に記載の方法に従っ
て、テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコースを製造した。
即ち、無水酢酸 84ml−ピリジン 108ml混合溶媒中に
Ｌ−フコース 10g(61mmol)を氷冷下、撹拌しながら添
加した後、０℃で２日間撹拌反応させた。反応終了後、
反応液にクラッシュドアイスを添加し、４時間撹拌した
後クロロホルム500mlで抽出を行った。得られたクロロ
ホルム層を水 300mlで６回洗浄後、硫酸マグネシウム
20gで乾燥させ留去し、テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−
フコ−スのα−アノマーとβ−アノマーの混合物 18g
（54mmol、収率89％）を得た。
【００６３】得られたテトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−フコ
ース 10.0g（30mmol）に、J.Chem.Soc.(C),2596(1971)
文献記載の方法に従って調製された２−クロロ−４−ア
セチルフェノール 52g（300mmol）、酢酸 14ml、無水
酢酸 １ml及び塩化亜鉛 ４g（30mmol）を加え、減圧
下、120℃で10分間攪拌しながら反応させた。次いで、
ジメチルスルホキシド 50ml及びジクロロメタン １Ｌ
を加えて反応物を溶解させた。この溶液を0.1Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液 １Ｌで３回、飽和食塩水１Ｌで３回
洗浄した後、硫酸マグネシウム 20gを加えて乾燥させ
た。溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィにより精製し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶
媒（１：４）により溶出した画分を濃縮し、２−クロロ
−４−アセチルフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｌ−フコシド 2.17g（4.9mmol、収率16％）
を得た。
ース 10.0g（30mmol）に、J.Chem.Soc.(C),2596(1971)
文献記載の方法に従って調製された２−クロロ−４−ア
セチルフェノール 52g（300mmol）、酢酸 14ml、無水
酢酸 １ml及び塩化亜鉛 ４g（30mmol）を加え、減圧
下、120℃で10分間攪拌しながら反応させた。次いで、
ジメチルスルホキシド 50ml及びジクロロメタン １Ｌ
を加えて反応物を溶解させた。この溶液を0.1Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液 １Ｌで３回、飽和食塩水１Ｌで３回
洗浄した後、硫酸マグネシウム 20gを加えて乾燥させ
た。溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィにより精製し、ヘキサン−酢酸エチル混合溶
媒（１：４）により溶出した画分を濃縮し、２−クロロ
−４−アセチルフェニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセ
チル−α−Ｌ−フコシド 2.17g（4.9mmol、収率16％）
を得た。
【００６４】得られた２−クロロ−４−アセチルフェニ
ル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシ
ド 2.17g（4.9mmol）を脱水メタノール 100mlに溶解
し、これに0.1Ｎナトリウムメチラート−メタノール溶
液 0.1mlを加え、室温で２時間撹拌反応させた。次い
でイオン交換樹脂（アンバーリスト１５：オルガノ
（株）社製） 0.2gで中和した後、当該樹脂を濾別し溶
媒を留去した。残渣をエタノール 50mlにより再結晶し
て、２−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコ
シド 1.1g（3.47mmol、収率71％）を得た。
ル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコシ
ド 2.17g（4.9mmol）を脱水メタノール 100mlに溶解
し、これに0.1Ｎナトリウムメチラート−メタノール溶
液 0.1mlを加え、室温で２時間撹拌反応させた。次い
でイオン交換樹脂（アンバーリスト１５：オルガノ
（株）社製） 0.2gで中和した後、当該樹脂を濾別し溶
媒を留去した。残渣をエタノール 50mlにより再結晶し
て、２−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコ
シド 1.1g（3.47mmol、収率71％）を得た。
【００６５】融点：171.0〜172.0℃
元素分析値 Ｃ１４Ｈ１７ＣｌＯ６：３１７．９５
実測値（％） Ｃ：５２．６５ Ｈ：５．８６
計算値（％） Ｃ：５２．８８ Ｈ：５．７７
ＩＲ(cm-1)：3422.3, 1666.9, 1594.91
Ｈ-ＮＭＲ（400MHz）(CD3OD)：δ(ppm) 1.158（3H, d,
J＝6.8Hz）, 2.558（3H, ｓ）, 3.772（1H, m）, 3.99
4−4.076（3H, m）, 4.820（3H, s）, 5.765（1H, d, J
＝3.6Hz）, 7.378（1H, d, J＝8.8Hz）, 7.955（1H, d
d, J＝8.8, 2.4Hz）, 8.006（1H, d, J＝2.4Hz） ＩＲスペクトル及び１Ｈ-ＮＭＲスペクトルの測定結果
を図１及び図２に示す。
J＝6.8Hz）, 2.558（3H, ｓ）, 3.772（1H, m）, 3.99
4−4.076（3H, m）, 4.820（3H, s）, 5.765（1H, d, J
＝3.6Hz）, 7.378（1H, d, J＝8.8Hz）, 7.955（1H, d
d, J＝8.8, 2.4Hz）, 8.006（1H, d, J＝2.4Hz） ＩＲスペクトル及び１Ｈ-ＮＭＲスペクトルの測定結果
を図１及び図２に示す。
【００６６】実施例２ ２−クロロ−４−アセチルフェ
ニル−α−Ｌ−フコシドを基質として用いたα−Ｌ−フ
コシダーゼ活性測定 （検体）血清１０検体 （試薬） 基質液 2.0mM２−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド 50mMクエン酸緩衝液（pH5.6、25℃） （操作法）基質液 2.7mlと検体0.15mlとを混合し、37
℃で５分間インキュベートした後、吸光度（有効波長：
340nm）の測定を開始し、吸光度を１分毎に５分間測定
した。得られた測定値から１分間当たりの吸光度変化量
（ΔＡ）を求めた。一方、試薬ブランク（ΔＢ）は、検
体の代わりに生理食塩水を用いた以外、同じ試薬を用
い、同様の操作を行って測定した。得られたΔＡ及びΔ
Ｂを下記の式に代入し、α−Ｌ−フコシダーゼ活性値を
算出した。
ニル−α−Ｌ−フコシドを基質として用いたα−Ｌ−フ
コシダーゼ活性測定 （検体）血清１０検体 （試薬） 基質液 2.0mM２−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシド 50mMクエン酸緩衝液（pH5.6、25℃） （操作法）基質液 2.7mlと検体0.15mlとを混合し、37
℃で５分間インキュベートした後、吸光度（有効波長：
340nm）の測定を開始し、吸光度を１分毎に５分間測定
した。得られた測定値から１分間当たりの吸光度変化量
（ΔＡ）を求めた。一方、試薬ブランク（ΔＢ）は、検
体の代わりに生理食塩水を用いた以外、同じ試薬を用
い、同様の操作を行って測定した。得られたΔＡ及びΔ
Ｂを下記の式に代入し、α−Ｌ−フコシダーゼ活性値を
算出した。
【００６７】検体のα−Ｌ−フコシダーゼ活性（ｕ／
Ｌ）＝｛（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０６｝／
（分子吸光係数×検体液量） ΔＡ：検体の340nmの１分間当たりの吸光度変化量 ΔＢ：試薬ブランクの340nmの１分間当たりの吸光度変
化量 反応時の総液量：2.85ml 分子吸光係数：2518L・mol-1・cm-1 検体液量：0.15ml
Ｌ）＝｛（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０６｝／
（分子吸光係数×検体液量） ΔＡ：検体の340nmの１分間当たりの吸光度変化量 ΔＢ：試薬ブランクの340nmの１分間当たりの吸光度変
化量 反応時の総液量：2.85ml 分子吸光係数：2518L・mol-1・cm-1 検体液量：0.15ml
【００６８】参考例１ ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−
フコシドを基質として用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性
測定 Hepatology, 19, 1414-1417(1994)（H.Takahashi et a
l.）文献記載の方法に従った。 （検体）血清１０検体（実施例２と同様） （試薬） 第１試薬溶液：150mM クエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0） 0.005％ ウシ血清アルブミン １mM ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド 第２試薬溶液：200mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH10.5 （操作法）第１試薬溶液 50μlと検体 10μlとを混合
し、37℃で１時間インキュベートした後、これに第２試
薬溶液 160μlを加え反応を停止させ、吸光度（有効波
長：400nm）を測定した。得られた測定値から１分間当
たりの吸光度増加（ＯＤ１）を求めた。一方、検体盲検
（ブランク）は、第１試薬溶液 50μlを37℃で１時間
インキュベートした後、これに第２試薬溶液 160μlを
加え、さらに検体10μlを混合し、吸光度（有効波長：4
00nm）を測定した。得られた測定値から１分間当たりの
吸光度増加（ＯＤｂｌ）を求めた。得られたＯＤ１及び
ＯＤｂｌを下記の式に代入し、α−Ｌ−フコシダーゼ活
性値を算出した。
フコシドを基質として用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性
測定 Hepatology, 19, 1414-1417(1994)（H.Takahashi et a
l.）文献記載の方法に従った。 （検体）血清１０検体（実施例２と同様） （試薬） 第１試薬溶液：150mM クエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0） 0.005％ ウシ血清アルブミン １mM ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシド 第２試薬溶液：200mM グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液 pH10.5 （操作法）第１試薬溶液 50μlと検体 10μlとを混合
し、37℃で１時間インキュベートした後、これに第２試
薬溶液 160μlを加え反応を停止させ、吸光度（有効波
長：400nm）を測定した。得られた測定値から１分間当
たりの吸光度増加（ＯＤ１）を求めた。一方、検体盲検
（ブランク）は、第１試薬溶液 50μlを37℃で１時間
インキュベートした後、これに第２試薬溶液 160μlを
加え、さらに検体10μlを混合し、吸光度（有効波長：4
00nm）を測定した。得られた測定値から１分間当たりの
吸光度増加（ＯＤｂｌ）を求めた。得られたＯＤ１及び
ＯＤｂｌを下記の式に代入し、α−Ｌ−フコシダーゼ活
性値を算出した。
【００６９】検体のα−Ｌ−フコシダーゼ活性（ｕ／
Ｌ）＝｛（ＯＤ１−ＯＤｂｌ）×反応時の総液量×１０
６｝/（分子吸光係数×検体液量） ＯＤ１ ：検体の400nmでの反応後の吸光度 ＯＤｂｌ ：検体盲検（検体の400nmでのα−Ｌ−フコシ
ダーゼによらない反応後の吸光度） 反応時の総液量：220μl 分子吸光係数：18337L・mol-1・cm-1 検体液量：10μl
Ｌ）＝｛（ＯＤ１−ＯＤｂｌ）×反応時の総液量×１０
６｝/（分子吸光係数×検体液量） ＯＤ１ ：検体の400nmでの反応後の吸光度 ＯＤｂｌ ：検体盲検（検体の400nmでのα−Ｌ−フコシ
ダーゼによらない反応後の吸光度） 反応時の総液量：220μl 分子吸光係数：18337L・mol-1・cm-1 検体液量：10μl
【００７０】実施例２及び参考例１で得られた各検体の
活性測定値との相関図を図３に示す。また、これら測定
値を統計処理して得られた回帰直線及び相関係数（ｒ）
は、以下の如くであった。 回帰直線式：Ｙ＝１．４７Ｘ＋１．１４ 相関係数（ｒ）：０．９７７ Ｘ：参考例１で得られた活性値 Ｙ：実施例２で得られた活性値
活性測定値との相関図を図３に示す。また、これら測定
値を統計処理して得られた回帰直線及び相関係数（ｒ）
は、以下の如くであった。 回帰直線式：Ｙ＝１．４７Ｘ＋１．１４ 相関係数（ｒ）：０．９７７ Ｘ：参考例１で得られた活性値 Ｙ：実施例２で得られた活性値
【００７１】この結果から明らかなように、本発明の２
−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシドを
基質として用いるα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定法によ
り得られるα−Ｌ−フコシダーゼ活性値は、文献記載の
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質として用
いる測定法により得られるそれと良好な相関関係を示す
ことが判った。
−クロロ−４−アセチルフェニル−α−Ｌ−フコシドを
基質として用いるα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定法によ
り得られるα−Ｌ−フコシダーゼ活性値は、文献記載の
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシドを基質として用
いる測定法により得られるそれと良好な相関関係を示す
ことが判った。
【００７２】実施例３ 直線性の検討
濃度既値のヒト胎盤由来α−Ｌ−フコシダーゼ（シグマ
社製）を生理食塩水で５段階に希釈したもの（希釈率１
／５〜１）を検体とし、実施例２の試薬を用いて同様の
操作を行って、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定
方法の検量線の検討を行った。その結果を図４に示す。
社製）を生理食塩水で５段階に希釈したもの（希釈率１
／５〜１）を検体とし、実施例２の試薬を用いて同様の
操作を行って、本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定
方法の検量線の検討を行った。その結果を図４に示す。
【００７３】図４の結果から明らかな如く、本発明のα
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法の検量線は原点を通る
良好な直線性を示していることが判った。
−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法の検量線は原点を通る
良好な直線性を示していることが判った。
【００７４】このように本発明の一般式［１］で示され
るα−Ｌ−フコース誘導体を用いて、α−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性測定を行うと、従来法で用いられていたエンド
ポイント法ではなくレイトアッセイ法により高感度、高
精度でα−Ｌ−フコシダーゼ活性値を測定することが可
能となる。
るα−Ｌ−フコース誘導体を用いて、α−Ｌ−フコシダ
ーゼ活性測定を行うと、従来法で用いられていたエンド
ポイント法ではなくレイトアッセイ法により高感度、高
精度でα−Ｌ−フコシダーゼ活性値を測定することが可
能となる。
【００７５】
【発明の効果】以上に述べた如く、本発明は、高い酵素
親和性を有する新規なα−Ｌ−フコース誘導体、これを
含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、これ
を用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法を提供する
ものであり、本発明のα−Ｌ−フコース誘導体を基質と
して用いてα−Ｌ−フコシダーゼの活性を測定した場合
には、遊離される４−アシルフェノール誘導体の有効波
長（極大吸収波長）が340ｎｍ付近であるため、試料中
に含まれる例えばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を
受け難い。従って、本発明を利用することにより、従来
行われていたエンドポイント法ではなく、レイトアッセ
イ法により例えばビリルビン、ヘモグロビン等の共存物
質による影響を受けることなく高感度、高精度でα−Ｌ
−フコシダーゼ活性値を測定することが可能となる為、
例えば自動分析方法等により効率よく、高精度且つ容易
に測定し得る。
親和性を有する新規なα−Ｌ−フコース誘導体、これを
含んで成るα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬、これ
を用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法を提供する
ものであり、本発明のα−Ｌ−フコース誘導体を基質と
して用いてα−Ｌ−フコシダーゼの活性を測定した場合
には、遊離される４−アシルフェノール誘導体の有効波
長（極大吸収波長）が340ｎｍ付近であるため、試料中
に含まれる例えばビリルビン、ヘモグロビン等の影響を
受け難い。従って、本発明を利用することにより、従来
行われていたエンドポイント法ではなく、レイトアッセ
イ法により例えばビリルビン、ヘモグロビン等の共存物
質による影響を受けることなく高感度、高精度でα−Ｌ
−フコシダーゼ活性値を測定することが可能となる為、
例えば自動分析方法等により効率よく、高精度且つ容易
に測定し得る。
【００７６】
【図１】 実施例１で得られた２−クロロ−４−アセチ
ルフェニル−α−Ｌ−フコシドのＩＲスペクトルを測定
した結果を示す。
ルフェニル−α−Ｌ−フコシドのＩＲスペクトルを測定
した結果を示す。
【図２】 実施例１で得られた２−クロロ−４−アセチ
ルフェニル−α−Ｌ−フコシドの１Ｈ-ＮＭＲスペクト
ルを測定した結果を示す。
ルフェニル−α−Ｌ−フコシドの１Ｈ-ＮＭＲスペクト
ルを測定した結果を示す。
【図３】 実施例２及び参考例１で得られた各検体の活
性測定値との相関図を示す。
性測定値との相関図を示す。
【図４】 本発明のα−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法
の検量線を示す。
の検量線を示す。
Claims (4)
- 【請求項１】 一般式［１］ 【化１】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体。 - 【請求項２】 一般式［１］ 【化２】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体を含んでなる、α−Ｌ
−フコシダーゼ活性測定用試薬。 - 【請求項３】 一般式［１］ 【化３】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体を用いることを特徴と
する、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法。 - 【請求項４】 α−Ｌ−フコシダーゼ含有試料と、一般
式［１］ 【化４】 （式中、Ｒは低級アルキル基又はアリール基を表し、Ｘ
はハロゲン原子を表し、ｎは１〜４の整数を表す。）で
示されるα−Ｌ−フコース誘導体とを接触させ、遊離す
る４−アシルフェノール誘導体を定量し、その変化量に
基づいてα−Ｌ−フコシダーゼ活性を算出することを特
徴とする、α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001190209A JP2003002894A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001190209A JP2003002894A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003002894A true JP2003002894A (ja) | 2003-01-08 |
Family
ID=19029021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001190209A Withdrawn JP2003002894A (ja) | 2001-06-22 | 2001-06-22 | α−Ｌ−フコシダーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα−Ｌ−フコシダーゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003002894A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112625075A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 华东理工大学 | 一种α-L-岩藻糖苷酶检测探针及其制备方法与应用 |
| CN112986164A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-06-18 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用 |
-
2001
- 2001-06-22 JP JP2001190209A patent/JP2003002894A/ja not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112625075A (zh) * | 2020-12-22 | 2021-04-09 | 华东理工大学 | 一种α-L-岩藻糖苷酶检测探针及其制备方法与应用 |
| CN112986164A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-06-18 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用 |
| CN112986164B (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-24 | 上海执诚生物科技有限公司 | 一种抗肝素稳定的α-L-岩藻糖苷酶检测试剂盒及其应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20080902 |