CN104531834A - 一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂，包括试剂1和试剂2，本发明对试剂1和试剂2进行了改进，使本发明与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且灵敏度高，抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的同型半胱氨酸检测试剂。

Description

一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂

技术领域

本发明涉及用于临床测定血清中同型半胱氨酸含量的检测试剂，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

同型半胱氨酸( homocyste ine, H cy) 亦称高半胱氨酸, 是甲硫氨酸代谢过程中产生的一种含硫氨基酸。20世纪60年代末, McCully从病理上发现高胱氨酸尿症和胱硫醚尿症患者早期即可发生全身动脉粥样硬化和血栓形成, 20世纪70 年代初又通过动物模型证实同型半胱氨酸在血中蓄积可导致血管损害, 80年代人们提出高同型半胱氨酸血症是动脉硬化和冠心病的1个独立危险因素。血清同型半胱氨酸逐渐成为多种疾病检测相关项目。

目前, 同型半胱氨酸的测定方法有很多种, 参考方法是高效液相色谱法(HPLC ), 虽然灵敏度、特异性好，但仪器价格昂贵而不能推广。高效液相色谱法（HPLC）是目前比较成熟且推广使用的方法，不足之处是样品处理、层析条件、样品检测及定量的诸多变异，使其难以标准化。离子色谱法与毛细管电泳法, 主要用于实验研究, 临床上较少使用; 酶联免疫分析法( EIA )是临床上测定同型半胱氨酸水平的常用方法, 特点是操作方便, 快捷, 重复性好, 但是大部分操作仍需要手工操作, 比较耗时, 不适合临床大批量标本同时测定; 目前, 临床上最常用的是荧光偏振免疫法, 虽可实现自动化分析, 但需专门仪器, 且试剂昂贵。

随着临床检验技术的发展，近年来国内外逐渐采用循环酶方法测定血清H cy, 该法可用于全自动生化分析仪, 操作方便快捷, 可以满足临床检验需要。但该方法所用试剂稳定性不佳，抗干扰能力差等缺点，需要进一步改善。

发明内容

本发明的目的提供一种同型半胱氨酸的检测试剂，一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒，其包试剂R1和试剂R2：

本发明采用液体双试剂比色法测试血清中的同型半胱氨酸的含量。与国内常见试剂盒相比，本试剂盒采用新的缓冲液和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性。此外，所采用新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力。试剂的准确度和稳定性良好，价格便宜，使用方便，完全可以满足临床需要。

一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂，包括体积比为240:65的试剂1和试剂2，试剂1和试剂2的组成及含量如下：

试剂1（R1）：

溶剂：     PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=8.0，25℃)                                                   

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                                             0.15 mmol/L

NADH                                                                      0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                                  0.6 mmol/L                

α－酮戊二酸                                                               5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                           1mmol/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                                       3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                           0.5g/L ；

试剂2（R2）：

溶剂：                       HEPES缓冲液(pH=7.0，25℃)                                                        

Hcy甲基转移酶（HMTase）                                          1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                                                   1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）                    3.0KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                                                    5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                             1g/L

牛血清白蛋白（BSA）                                                  1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                                     3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                          0.5g/L  。

本发明的有益效果如下：

1）双试剂比色法测定HCY，相比三试剂而言，使用更加方便快捷。

2）采用新的缓冲液和稳定剂，显著改善了试剂的稳定性。

3）采用新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，而且对维护体系的稳定，防止出现脂浊，效果明显，相比之前所用的TRITON X-405(曲拉通X-405)、TWEEN-20 (吐温20)，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力。

附图说明

图1为实施例1与市场常规试剂的相关性曲线图。

图2为不同表面活性剂对本发明的稳定性的影响图。

图3实施例1与常规试剂的稳定性图。

具体实施方式 

实施例1

本实施例所描述的同型半胱氨酸的检测试剂，包括

试剂1（R1）：

溶剂       PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=8.0，25℃)                                                      

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                                             0.15 mmol/L

NADH                                                                      0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                                 0.6 mmol/L                

α－酮戊二酸                                                             5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                        1mmol/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                                          3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                             0.5g/L ；

试剂2（R2）：

溶剂                        HEPES缓冲液(pH=7.0，25℃)

Hcy甲基转移酶（HMTase）                                1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                                          1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）      3.0KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                                            5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                      1g/L

牛血清白蛋白（BSA）                                      1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                        3g/L

叠氮钠（NaN3）                                           0.5g/L 。

本实施例试剂的使用方法：

本实施例描述的同型半胱氨酸检测试剂，在使用时采用具有双试剂功能的全自动生化分析仪，如东芝40全自动分析仪等，利用双试剂速率法进行测定。将R1和R2放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

表1实施例1试剂检测方法

计算：同型半胱氨酸含量（U/mL）＝（测定/min÷标准/min）×C标准。

实施例2

本实施例所描述的同型半胱氨酸的检测试剂盒，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：

试剂1（R1）：

溶剂      PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=8.0，25℃)                                                       

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                                             0.15 mmol/L

NADH                                                                      0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                                 0.6 mmol/L                 

α－酮戊二酸                                                             5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                        1mmol/L

曲拉通X-405（Triton X-405）                                         3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                          0.5g/L ；

试剂2（R2）：

溶剂                        HEPES缓冲液(pH=7.0，25℃)                                                        

Hcy甲基转移酶（HMTase）                                           1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                                                    1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）                     3.0KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                                                     5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                               1g/L

牛血清白蛋白（BSA）                                                    1g/L

曲拉通X-405（Triton X-405）                                      3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                      0.5g/L   。

实施例3

本实施例所描述的同型半胱氨酸的检测试剂盒，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：

试剂1（R1）：

溶剂        PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=8.0，25℃)                                                   

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                                            0.15 mmol/L

NADH                                                                     0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                                0.6 mmol/L                 

α－酮戊二酸                                                            5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                      1mmol/L

吐温20 (TWEEN-20)                                                    3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                        0.5g/L  ；

试剂2（R2）：

溶剂                       HEPES缓冲液(pH=7.0，25℃)

Hcy甲基转移酶（HMTase）                                         1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                                                   1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）                 3.0KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                                                 5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                          1g/L

牛血清白蛋白（BSA）                                               1g/L

吐温20 (TWEEN-20)                                                   3g/L

叠氮钠（NaN3）                                                       0.5g/L  。

实施例4

本实施例所描述的同型半胱氨酸的检测试剂盒，包试剂R1和试剂R2（检测方法同实施例1）：

试剂1（R1）：

溶剂          PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液(pH=8.0，25℃)                           

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）                                            0.15 mmol/L

NADH                                                                     0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP）                                 0.6 mmol/L                

α－酮戊二酸                                                             5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                       1mmol/L

叠氮钠（NaN3）                                                          0.5g/L  ；

试剂2（R2）：

溶剂                       HEPES缓冲液(pH=7.0，25℃)

Hcy甲基转移酶（HMTase）                                         1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶(GLDH)                                                     1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase）                 3.0KU/L

腺苷脱氨酶（ADA）                                                   5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                             1g/L

牛血清白蛋白（BSA）                                                 1g/L

叠氮钠（NaN3）                                                        0.5g/L  。

干扰性试验

取新鲜混合血清，分成10等份，然后将每等份再分成10等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别测定血清中HCY的含量,对照组测定结果与加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－对照样本的测定均值)/对照样本的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例1试剂在血氨≤60μmol/L、谷胱甘肽≤0.6mmol/L、胱硫醚浓度≤30μmol/L、腺苷≤160μmol/L、胆红素≤30mg/dL、血红蛋白≤1300mg/dL、甘油三酯≤2700mg/dL、抗坏血酸≤20mmol/L、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）≤30μmol/L、L-半胱氨酸≤2mmol/L时对测试结果没有明显干扰。而其他实施例试剂在上述浓度干扰物质存在时，受到明显干扰，这说明实施例1试剂的抗干扰性能远远优于其他实施例试剂。

表2不同实施例试剂抗干扰性能比较

 

精密度试验

取高、低值分别为42.5和15.8μmol/L的同型半胱氨酸标准品，用实施例1、2、3和4中所描述的试剂，连续检测20次，求出批内精密度。按照实施例1、2、3和4各配制10份试剂，每天分别对高、低值同型半胱氨酸标准品进行检测，连续检测10天，获得批间精密度.结果如表3和表4所示，实施例1试剂的批内CV为2.19-2.69%，批间精密度为2.29-3.60%，明显优于其他实施例试剂，并且远远满足试剂相关行业标准对精密度的要求（重复性CV≤10%；批间相对极差R≤10％）。

表3不同实施例试剂批内精密度检测结果对比

表4不同实施例试剂批间精密度检测结果对比

。

相关性实验

利用实施例1配方配制试剂，与市场常见的国家食品药品监督管理局认可的北京九强的同型半胱氨酸测定试剂盒进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表5所示。并获得了两种试剂的相关性曲线（如图1所示），通过检测结果显示，两个试剂盒的相关系数为0.9991，说明了两者有极大的相关性。

表5实施例1试剂与市场常见的同型半胱氨酸测定试剂盒对比检测结果

不同表面活性剂对试剂稳定性的影响试验

（1）2~8℃稳定性试验：

将如下4种试剂：

A试剂：按实施例1配方配制，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6.5 mL。

B试剂：按实施例2配方配制，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6.5 mL。

C试剂：按实施例3配方配制，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6.5 mL。

D试剂：除R1和R2中不加表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱外，其余均与实施例1相同，共13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6.5 mL。

放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天分别取出A、B、C、D中的一组来检测HCY高值质控品（靶值为42.5μmol/L），检测结果如图2所示：可以看出，加入表面活性剂可显著改善试剂的稳定性，但椰油酰胺丙基甜菜碱比TRITON X-405(曲拉通X-405)、TWEEN-20 (吐温20)、效果更好，试剂更稳定。

试剂的稳定性对比试验

对实施例1中的试剂，均匀分装13组，每组的试剂量为R1为24mL，R2为6.5 mL；并且取13组市场常见的国家食品药品监督管理局认可的北京九强的同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒作对照。放置到2-8℃冰箱中，每月的同一天取出一组试剂检测HCY高值质控品（靶值为42.5μmol/L），检测结果如图3所示，实施例1试剂在2-8℃储存条件下比市场常见的同型半胱氨酸（HCY）测定试剂盒更加稳定，说明新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱可以显著改善试剂的稳定性。

本发明具有的优点是：

1）采用双试剂比色法测定HCY，相比三试剂而言，使用更加方便快捷。

2）采用新型两性表面活性剂椰油酰胺丙基甜菜碱，不仅显著改善测定的性能，而且对维护体系的稳定，防止出现脂浊，效果明显，相比之前所用的TRITON X-405(曲拉通X-405)、TWEEN-20 (吐温20)，并且显著改善了试剂的稳定性和抗干扰能力。

通过验证，本试剂与同类检测试剂对比相关性好，临床检测样本结果一致，能够达到市场对产品的应用要求，并且灵敏度高，抗干扰性能好，是一种更加稳定、良好的同型半胱氨酸检测试剂。

Claims (1)

1.一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂，其特征在于，包括体积比为240:65的试剂1和试剂2，试剂1和试剂2的组成及含量如下：

试剂1

溶剂                             PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）缓冲液，pH=8.0，25℃

 S-腺苷甲硫氨酸                                                              0.15 mmol/L

NADH                                                                                   0.35 mmol/L

三（2羧乙基）膦氯化氢                                                 0.6 mmol/L                

α－酮戊二酸                                                                     5.3 mmol/L

乙二胺四乙酸二钠                                                                1mmol/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                                            3g/L

叠氮钠                                                                              0.5g/L ；

试剂2

溶剂                                           HEPES缓冲液，pH=7.0，25℃，

Hcy甲基转移酶                                                           1.5KU/L

谷氨酸脱氢酶                                                        1.8KU/L              

S-腺苷同型半胱氨酸水解酶                                   3.0KU/L

腺苷脱氨酶                                                                    5.5KU/L

聚乙二醇6000                                                                  1g/L

牛血清白蛋白                                                                1g/L

椰油酰胺丙基甜菜碱                                                        3g/L

叠氮钠                                                                             0.5g/L  。