CN113358880A - 一种iii型前胶原n端肽的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种III型前胶原N端肽的检测试剂盒，属于医药试剂技术领域，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2，通过制备抗体胶乳颗粒加入到试剂R2中，采用胶乳增强免疫比浊法检测血清样本中III型前胶原N端肽的含量，检测无污染、操作便捷、灵敏度高、特异性强、成本较低，且检测所需样本量少，可进行急诊样本的测定。
Description
技术领域
本发明属于医药试剂技术领域，具体涉及一种III型前胶原N端肽( PIIINP)的检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
肝纤维化是慢性肝病的共同病理基础和向肝硬化发展的必经阶段。肝硬化是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病。慢性肝病的衍化与进展, 是致病因素的不断作用和机体的免疫功能失调共同导致肝细胞损害, 纤维组织不断增生的结果。在肝纤维化阶段,其主要病理特点是胶原蛋白、蛋白多糖及粘蛋白等多种细胞外基质在肝内的过度沉积, 长期以来依赖病理组织活检, 但因有创伤和痛苦, 患者难以接受。因此，肝纤维化的早期诊断是非常重要的。
III型前胶原N端肽是Ⅲ型胶原在细胞外形成原胶原前, 被相关酶切下后进入血液中的氨基端肽,与肝组织炎症和肝细胞损伤呈一定关系，被认为是肝纤维化的良好血清学指标。目前，临床常用作诊断肝纤维化的血清标志物。
现有技术中，III型前胶原N端肽的检测方法包括时间分辨荧光免疫分析方法，放射免疫分析法，酶联免疫吸附层析和化学发光法等。时间分辨荧光免疫分析方法需要用稀有金属进行标记；放射免疫分析法有放射性污染、操作复杂、测定结果不稳定；酶联免疫分析法克服了放射性污染，但是存在酶不稳定、灵敏度不高、不适合急诊样本的检测、难以定量、自动化程度低等不足之处；化学发光法灵敏度虽高，但检测成本较高，需要特定化学发光仪，这些原因导致其应用范围较小。
发明内容
本发明所要解决的问题是克服上述现有试剂盒所存在的缺陷，提供一种胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒，检测血清中III型前胶原N端肽的含量，操作便捷、灵敏度高、特异性强、成本较低，且检测所需样本量少，可进行急诊样本的测定。
为解决上述问题，本发明采取如下的技术方案：本发明所述的III型前胶原N端肽检测试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2。
所述的试剂R1包含以下浓度的组分：
缓冲液：20-100mmol/L；
无机盐离子：5-20g/L；
表面活性剂：0.1-2g/L；
促凝剂：5-30g/L
防腐剂：0.5-2g/L。
所述的试剂R2包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
抗体胶乳颗粒10-40mg/L；
稳定剂5-20g/L；
防腐剂：0.5-2g/L。
优选地，所述的试剂R1、试剂R2中的缓冲液是TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述的试剂R1中的无机盐离子是氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种。
优选地，所述的试剂R1中的表面活性剂是吐温-20、吐温-80、皂素、B66中的一种或多种。
优选地，所述的试剂R1中的促凝剂是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000和聚乙二醇-20000中的一种或多种。
优选地，所述的试剂R1、试剂R2中的防腐剂是PC300、NaN3中的一种。
优选地，所述的试剂R2中的稳定剂是牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种。
优选地，所述的试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
步骤一 活化：准备300-400nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用20-100mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为0.5-2%w/v得到胶乳颗粒溶液，加入10mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联30分钟，即得到活化后的胶乳颗粒；
步骤二 偶联：将III型前胶原N端肽用pH7.0的5-20mM/L HEPES稀释至终浓度为0.5-2%w/v得到抗体溶液后，将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联180分钟；
步骤三 封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液30mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
步骤四 储存：4℃ 10000转 离心取上清液用20-100mmol/LTRIS缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的III型前胶原N端肽胶乳颗粒。
其技术关键点在于制备抗体胶乳颗粒加入到试剂R2中，配制成独立包装的试剂R1和试剂R2，采用胶乳增强免疫比浊法检测血清样本中的III型前胶原N端肽，其检测无污染、操作便捷、灵敏度高、特异性强、成本较低，且检测所需样本量少，可进行急诊样本的测定。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1 制备III型前胶原N端肽检测试剂盒。
根据本发明制备的III型前胶原N端肽检测试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2。所述的试剂R1包含以下浓度的组分：
TRIS缓冲液：60mmol/L；
氯化钠：10g/L；
吐温-20：1g/L；
PEG6000：15g/L；
PC300：1g/L。
所述的试剂R2包含以下浓度的组分：
TRIS缓冲液：60mmol/L；
抗体胶乳颗粒：30mg/L；
海藻糖：5g/L；
PC300：1g/L。
优选地，所述的试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
步骤一 活化：准备351nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用pH5.0的50mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为1%w/v得到胶乳颗粒溶液，加入10mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联30分钟，即得到活化后的胶乳颗粒；
步骤二 偶联：将III型前胶原N端肽用pH7.0的5mM/L HEPES稀释至终浓度为0.1%w/v得到抗体溶液后，将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联180分钟；
步骤三 封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液30mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
步骤四 储存：4℃ 10000转 离心取上清液用pH8.0 50mmol/L TRIS缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的III型前胶原N端肽胶乳颗粒。
实施例2本发明试剂盒准确度分析。
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的III型前胶原氨基端肽酶联免疫检测试剂盒（由臻科生物生产）。
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪。
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline。
标准曲线的设定：分别将已知浓度的标准品，即0、10、20、40、80ng/mL放在校准盘里，设置校准品位置和浓度，得到以下数据：
表1（实施例1）
取20例不同浓度的临床样本与对比例平行进行检测，得到以下数据（表2）：
| 血清编号 | 实施例1 | 对比例 | 绝对偏差 | 相对偏差 | 相关系数 |
| 血清1 | 4.7 | 5.4 | -0.7 | -12.96% | 0.998572 |
| 血清2 | 1.9 | 3 | -1.1 | -36.67% | |
| 血清3 | 1.5 | 2.3 | -0.8 | -34.78% | |
| 血清4 | 11.2 | 12.6 | -1.4 | -11.11% | |
| 血清5 | 1.6 | 1.9 | -0.3 | -15.79% | |
| 血清6 | 1.8 | 1.6 | 0.2 | 12.50% | |
| 血清7 | 2.1 | 1.7 | 0.4 | 23.53% | |
| 血清8 | 2.4 | 3.2 | -0.8 | -25.00% | |
| 血清9 | 2.6 | 2.3 | 0.3 | 13.04% | |
| 血清10 | 2.6 | 2.3 | 0.3 | 13.04% | |
| 血清11 | 3.6 | 4.4 | -0.8 | -18.18% | |
| 血清12 | 21.1 | 23.1 | -2 | -8.66% | |
| 血清13 | 20.5 | 21.8 | -1.3 | -5.96% | |
| 血清14 | 37.4 | 42.4 | -5 | -11.79% | |
| 血清15 | 2.2 | 2 | 0.2 | 10.00% | |
| 血清16 | 2.3 | 2.2 | 0.1 | 4.55% | |
| 血清17 | 2.6 | 2.4 | 0.2 | 8.33% | |
| 血清18 | 3.6 | 3.3 | 0.3 | 9.09% | |
| 血清19 | 59 | 63 | -4 | -6.35% | |
| 血清20 | 5.4 | 5.2 | 0.2 | 3.85% |
表2的结果表明，本发明制备的试剂盒与对比例相关性较好，测值一致。
实施例3本发明试剂盒精密度分析
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的III型前胶原氨基端肽酶联免疫检测试剂盒（由臻科生物生产）。
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪。
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline。
通过校准后，测定同一血清样本，测10次，通过检测10次的浓度结果求得平均值、SD值，算出CV值。结果见表3：
| 实施例1 | 对比例 | |
| 1 | 22.9 | 24.0 |
| 2 | 23.5 | 23.1 |
| 3 | 24.0 | 22.0 |
| 4 | 23.9 | 24.5 |
| 5 | 24.3 | 21.9 |
| 6 | 24.4 | 23.0 |
| 7 | 24.0 | 25.0 |
| 8 | 24.4 | 24.0 |
| 9 | 24.2 | 23.0 |
| 10 | 24.1 | 22.1 |
| SD | 0.46 | 1.09 |
| 均值 | 23.97 | 23.26 |
| CV | 1.93% | 4.67% |
从表3数据可看出，实施例1对同一样本的测定结果，重复性优于对比例，说明本试剂测定样本具有很好的精密度。
实施例4本发明试剂盒线性分析。
测试试剂盒：实施例1的试剂盒、对比例的III型前胶原氨基端肽酶联免疫检测试剂盒（由臻科生物生产）。
测试仪器：日立7100全自动生化分析仪。
具体操作为，设置参数：测试方法：两点终点法；主波长：600nm；测光点：18-34；样本量：6；试剂量R1：R2=150：50；校准方法：spline。
使用接近线性范围上限80ng/mL的高浓度样品和接近线性范围下限的低浓度样品，混合成5个稀释浓度，分别测试试剂，每个稀释浓度测试3次取其平均值，计算与理论值的偏差及线性相关系数，结果见表4：
表4的数据结果可看出，实施例1线性上线的测定值稍高于对比例。
Claims (8)
1.一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其包含独立包装的试剂R1和试剂R2，所述的试剂R1包含以下浓度的组分：
缓冲液：20-100mmol/L；
无机盐离子：5-20g/L；
表面活性剂：0.1-2g/L；
促凝剂：5-30g/L
防腐剂：0.5-2g/L；
所述的试剂R2包含以下浓度的组分：
缓冲液：50-200mmol/L；
抗体胶乳颗粒10-40mg/L；
稳定剂5-20g/L；
防腐剂：0.5-2g/L。
2.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、试剂R2中的缓冲液是TRIS缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、的无机盐离子是是氯化钠、氯化钾、氯化镁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、的表面活性剂是吐温-20、吐温-80、皂素、B66中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、的促凝剂是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-8000和聚乙二醇-20000中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、试剂R2中的防腐剂是PC300、NaN3中的一种。
7.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R1、试剂R2中的稳定剂是牛血清白蛋白、蔗糖、海藻糖中的一种。
8.根据权利要求1所述的一种III型前胶原N端肽检测试剂盒，其特征在于，试剂R2中的抗体胶乳颗粒制备步骤为：
步骤一 活化：准备300-400nm的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒用20-100mM/L 2-（N-吗啡啉）乙磺酸稀释至终浓度为0.5-2%w/v得到胶乳颗粒溶液，加入10mg/L的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC），37℃ 220转/分钟偶联30分钟，即得到活化后的胶乳颗粒；
步骤二 偶联：将III型前胶原N端肽用pH7.0的5-20mM/L HEPES稀释至终浓度为0.5-2%w/v得到抗体溶液后，将抗体溶液缓慢加入到胶乳颗粒溶液中，37℃ 220转/分钟偶联180分钟；
步骤三 封闭：加入10%牛血清白蛋白溶液30mL，37℃ 220转/分钟封闭60分钟；
步骤四 储存：4℃ 10000转 离心取上清液用20-100mmol/LTRIS缓冲液重悬浮，室温搅拌1h混合均匀，得到质量体积浓度为1％的III型前胶原N端肽胶乳颗粒。
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