CN109212232B - 一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒及检测方法,试剂盒包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含缓冲液、还原剂、丝氨酸、辅酶防腐剂、表面活性剂,所述试剂R2包含缓冲液、表面活性剂、乳酸脱氢酶、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、胱硫醚β‑合成酶、胱硫醚β‑裂解酶,所述HCY液体校准液包含稳定剂、防腐剂、同型半胱氨酸。本发明通过在试剂盒中加入抗氧化剂,多方面的抑制了酶在各个干扰因素下的衰减,有效的提高了试剂盒在特殊环境下和效期保存中的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于医学体外诊断试剂领域,具体涉及到一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒及检测方法。
背景技术
血同型半胱氨酸(HCY)是卒中等心脑血管病的的危险因素,它的水平明显升高,可诊断“高同型半胱氨酸血症”,尤其还伴有高血压病史。许多学者认为血同型半胱氨酸升高已经成为动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子,并可引发多种疾病,因为它可影响还原型谷胱甘肽的合成与功能,对正常肝脏功能产生负面作用,这个指标对诊断慢性肝病的特异性和敏感性较常规检测好;另有一个新理念为,伴有血浆HCY升高(>10umol/L)的原发性高血压定义为H型高血压。
在我国各大医院均有对同型半胱氨酸的检测,可见已十分普及,在现有的技术下,有关HCY的实验室检测方法分别有以下几种:
1、同位素法,该方法通过14C标记的腺苷与HCY缩合后,经色谱分离,液体闪烁计数放射强度来测HCY浓度。该方法灵敏度高,特异性强,但操作繁琐且有放射污染,未能推广使用。
2、色谱法,1987年Stabler首先报道了气相色谱―质谱法测定同型半胱氨酸。该法可同时测定半胱氨酸、蛋氨酸、胱硫醚和甲基甘氨酸等多种物质。虽然灵敏度、特异性好,但仪器价格昂贵而不能推广应用。高效液相色谱法(HPLC)是目前比较成熟且推广使用的方法,不足之处是样品处理、层析条件、样品检测及定量的诸多变异,使其难以标准化。
3、ELISA方法:此方法实验时往预先包被HCY抗体的包被液体中依次加入标本、标准品、HPR标记的检测抗体,经温育后并彻底洗涤。在孔中加TMB底物液,与酶反应形成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色,颜色深浅与样品中的含量成正相关。该法虽然对仪器要求不高,且易普及,但结果准确度相对较差。
4、放射免疫法:使放射性标记抗原和待测物与不足量的特异性抗体竞争性地结合,反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。此方法结果准确,但有放射性污染,所以不常使用。
5、酶法:该法快速、准确、灵敏度高,使用全自动生化分析仪,适用于大批样本,简单快捷,在临床上应用广泛。如CN 103954774 B中利用S-腺苷同型半胱氨酸水解酶,对样本中的L-同型半胱氨酸反复循环反应,来检测样本中同型半胱氨酸的含量。但该酶法试剂盒中使用酶类较多,成本较高,且存在稳定性差等一些缺点。
现有的同型半胱氨酸试剂盒的稳定性较低,专利CN 104198726 B公开了一种稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒;由试剂R1及试剂R2组成,所述试剂R1包含的各组分为:缓冲液、硫醇类还原剂,乳酸脱氢酶,丝氨酸,还原性辅酶,表面活性剂,稳定剂,防腐剂;所述试剂R2包含的各组分为:缓冲液,胱硫醚β-合酶,胱硫醚β-裂解酶,表面活性剂,稳定剂,防腐剂;采用复合硫醇类还原剂使得结合型HCY更充分被还原,改善试剂的稳定性。专利CN106248666 A公开了一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂,试剂R1中主要包含缓冲液、NADH、LDH、丝氨酸、防腐剂、TCEP、保护剂、表面活性剂、乙二胺四乙酸二钠、底物稳定性;试剂R2中主要包含缓冲液、防腐剂、保护剂、表面活性剂、胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶;R2试剂通过使用三种保护剂协同保护酶类的活性,从而增强试剂的稳定性。但是上述两种试剂盒中胱硫醚β-裂解酶的衰减仍然较快,导致胱硫醚循环酶法的试剂盒在效期保存下的稳定性不佳。
发明内容
为了解决现有技术的问题,本发明提供了一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒及检测方法,通过在试剂盒中加入抗氧化剂,多方面的抑制了酶在各个干扰因素下的衰减,有效的提高了试剂盒在特殊环境下和效期保存中的稳定性。
为了达到上述目的,本发明提供以下技术方案:
一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含的各组分及浓度为:
所述试剂R2包含的各组分及浓度为:
所述HCY液体校准液包含的各组分及浓度为:
稳定剂 5-50mmol/L
防腐剂 5-50mmol/L
同型半胱氨酸 28umol/L
优选地,所述缓冲液包括三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液、N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的一种或几种。
优选地,所述缓冲液为三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液。
优选地,所述还原剂为巯基类还原剂。
优选地,所述还原剂为二硫苏糖醇、三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐或巯基乙醇中的一种。
优选地,所述还原剂为三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。
优选地,所述防腐剂为甲苯、对羟基苯甲酸、硫柳汞或Krovin系列中的一种。
优选地,所述防腐剂为Krovin 750。
优选地,所述表面活性剂为烷基酚聚氧乙烯醚、聚氧乙烯月桂醚、十二烷基苯磺酸钠、聚氧乙烯苯基醚中的一种。
优选地,所述表面活性剂为聚氧乙烯苯基醚。
优选地,所述抗氧化剂为特丁基对苯二酚、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯或苯多酚中的一种或几种。
优选地,所述抗氧化剂为丁基羟基茴香醚。
优选地,所述稳定剂为黄原胶、聚乙烯胺、EDTA.2Na、甘氨酸、乙二醇、钙离子中的几种混合物。
优选地,所述稳定剂为甘氨酸和EDTA.2Na的混合物。
所述一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒的检测方法为使用全自动生化分析仪利用速率法进行测定。
优选地,所述检测方法中试剂R1、试剂R2和样本的重量比为250:25:16。
本发明的试剂盒检测同型半胱氨酸的反应原理为样本中原先存在的结合型HCY被还原成游离型HCY后,游离型HCY在胱硫醚β-合酶催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚;L-胱硫醚在胱硫醚β-裂解酶催化下生成HCY、丙酮酸和NH3;该循环反应生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶的作用下,引起β-NADH转化为β-NAD+,340nm处吸光度变化与样品中HCY浓度成正比。
本发明中三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐用作还原剂可还原蛋白和多肽中的二硫键,防止蛋白半胱氨酸残基链间和链内的二硫键形成,且特异性强,增加了反应的分析灵敏度和准确度,所以还原剂优先选用三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐。防腐剂能够抑制微生物的生长,保证试剂的质量。Krovin系列的防腐剂的抑制微生物生长的效果更好,且对本发明的其它组分无影响,有助于本发明的检测试剂盒保持稳定性和灵敏度。现有的表面活性剂中,聚氧乙烯类的表面活性剂有极其优良的表面性能,极大程度上提高了试剂的稳定性。本发明使用的抗氧化剂,既具有良好的热稳定性,又具有杀菌、防霉的作用,多方面的抑制住了酶在各个干扰因素下的衰减,有效的提高了试剂盒在特殊环境下和效期保存中的稳定性。
采用上述技术方案,本发明实现的有益效果如下:
(1)通过在试剂中加入适量的抗氧化剂,对液体中的各个酶起到了更好的保护作用,在热破坏中提高其热稳定性,在开封和效期稳定性下,具有强有力的杀菌和防霉作用,高效的提高了检测试剂盒在各种极端条件下的热稳定性、开封稳定性和效期稳定性。
(2)通过选择合适的表面活性剂和稳定剂等,使得试剂盒具有较高的分析灵敏度和较好的稳定性。
(3)本发明使用自配的HCY液体校准液替代现有的外购校准品,配置简单方便,匹配性好,省去第三方校准的采购,节约成本,方便快捷。
(4)操作简单,任何生化分析仪均可检测,且减少酶的种类和用量,配制方便,便捷稳定,节约成本。
附图说明
图1为HCY液体校准液和外购校准品的相关性测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图进一步说明本发明。
实施例1
一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含的各组分及浓度为:
所述试剂R2包含的各组分及浓度为:
所述HCY液体校准液包含的各组分及浓度为:
EDTA.2Na 10mmol/L
Krovin 750 45mmol/L
同型半胱氨酸 28umol/L
实施例2
一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含的各组分及浓度为:
所述试剂R2包含的各组分及浓度为:
所述HCY液体校准液包含的各组分及浓度为:
EDTA.2Na 10mmol/L
Krovin 750 45mmol/L
同型半胱氨酸 28umol/L
利用实施例1-2描述的半胱氨酸检测试剂盒进行检测时,适用于各种全自动生化分析仪,以日立7080生化分析仪为例,利用速率法进行测定,具体步骤如下:加入250ul试剂R1和16ul样本,混匀,置于37℃孵育1-5min后,加入25ul试剂R2,混匀,置于37℃孵育90s,连续检测1-3min,计算△A/min,检测波长分别为主波长340nm、副波长405nm。采用上述测定方法,在日立7080生化分析仪上用HCY液体校准液进行标定,得到HCY试剂标准曲线,利用该曲线和样本△A/min,计算得到样本中HCY的含量。
1.同型半胱氨酸检测试剂盒的热稳定性研究
对比例1为去除实施例1组分中的抗氧化剂后得到的试剂盒,将配置完成的实施例1和对比例1试剂盒放入37℃水浴锅中进行破坏,分别在第0、1、3、5、7天的时候进行检测,分别检测低值质控品、中值质控品和高值质控品,计算靶值及与靶值的偏差,检测结果如表1和表2所示:
表1对比例1的热稳定性检测结果
表2实施例1的热稳定性检测结果
表1-表2的检测结果显示,不加入抗氧化剂的对比例1和加入抗氧化剂的实施例1的试剂结果均符合要求,靶值偏差符合要求;但是加入抗氧化剂的实施例1在37℃破坏7天后,实施例1与质控品的靶值偏差更小,结果变化波动更小。因此,加入抗氧化剂提高了实施例1试剂盒的热稳定性。
2.同型半胱氨酸检测试剂盒的开封稳定性研究
将配制完成的对比例1(不加入抗氧化剂)和实施例1(加入抗氧化剂)的试剂盒开封后放置于避光的试剂仓内(2-8℃),按时间每1周做一次测定,分别测试低值质控品、中值质控品和高值质控品,计算靶值及与靶值的偏差,检测结果如表3和表4所示:
表3对比例1的开封稳定性检测结果
表4实施例1的开封稳定性检测结果
表3-表4的检测结果显示,不加入抗氧化剂的对比例1和加入抗氧化剂的实施例1的试剂盒的结果均符合要求,靶值偏差符合要求;但是加入抗氧化剂的实施例1在开封环境下放置4周后靶值偏差更小,测试结果更好。因此,加入抗氧化剂提高了实施例1试剂盒的开封稳定性。
3.同型半胱氨酸检测试剂盒的效期稳定性研究
将配制完成的对比例1(不加入抗氧化剂)和实施例1(加入抗氧化剂)的试剂盒放置于2-8℃,按时间每隔一个月做一次测定,共做15个月,分别测试低值质控品、中值质控品和高值质控品,计算靶值及与靶值的偏差,检测结果如表5和表6所示:
表5对比例1的效期稳定性检测结果
表6实施例1的效期稳定性检测结果
表5-表6的检测结果显示,不加入抗氧化剂的对比例1和加入抗氧化剂的实施例1的试剂盒的结果均符合要求,靶值偏差符合要求;但是加入抗氧化剂的实施例1在放置15个月之后结果偏差更小。因此,加入抗氧化剂提高了实施例1试剂盒的效期稳定性。
4.HCY液体校准液的相关性测试
将实施例2的HCY液体校准液与外购的雅培校准品对HCY检测试剂盒进行标定,然后同时测试50例样本,分析样本测值相关性,具体数据见表7:
表7 HCY液体校准液与外购校准品的相关性测试结果
对表7的结果比对进行线性拟合,拟合曲线如图1所示。
由图1的曲线可以看出,线性拟合方程为y=0.9981x+0.0189,线性相关系数r=0.9997,相关性良好,即认为实施例2的HCY液体校准液与外购校准品标定试剂后的测值具有良好的一致性。上述结果说明本发明的HCY液体校准液的检测结果准确、可靠。
实施例3
一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含的各组分及浓度为:
所述试剂R2包含的各组分及浓度为:
所述HCY液体校准液包含的各组分及浓度为:
EDTA.2Na 60mmol/L
Krovin 750 50mmol/L
同型半胱氨酸 28umol/L
实施例4
一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液,所述试剂R1包含的各组分及浓度为:
所述试剂R2包含的各组分及浓度为:
所述HCY液体校准液包含的各组分及浓度为:
EDTA.2Na 5mmol/L
Krovin 750 5mmol/L
同型半胱氨酸 28umol/L
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明保护范围的限制,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (1)
1.一种便捷稳定的同型半胱氨酸检测试剂盒,其特征在于:由试剂R1、试剂R2和HCY液体校准液组成,所述试剂R1的各组分及浓度组成为:
缓冲液 10-200 mmol/L
三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐 3-20 mg/L
丝氨酸 1-10 mmol/L
辅酶 5-50 mmol/L
Krovin 750 5-50 mmol/L
聚氧乙烯苯基醚 0.5-3 mol/L
所述试剂R2的各组分及浓度组成为:
缓冲液 0.1-0.5 mol/L
聚氧乙烯苯基醚 0.5-3 mol/L
乳酸脱氢酶 5-50KU/L
稳定剂 5-60 mmol/L
丁基羟基茴香醚 50-500mmol/L
Krovin 750 5-50 mmol/L
胱硫醚β-合成酶 10-1000 mg/L
胱硫醚β-裂解酶 50-200 mg/L
所述HCY液体校准液的各组分及浓度组成为:
稳定剂 5-50 mmol/L
Krovin 750 5-50 mmol/L
同型半胱氨酸 28 umol/L
所述缓冲液为三羟甲基甲胺基丙磺酸缓冲液或三乙醇胺缓冲液;
所述稳定剂为甘氨酸和EDTA.2Na的混合物。
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GR01 | Patent grant | ||
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