CN114088692A - 一种hcy检测用还原试剂、试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及体外诊断检测领域,具体公开了一种HCY检测用还原试剂,试剂盒及其使用方法。本申请的一种HCY检测用还原试剂包括Tris‑HCl缓冲液、NaCl和Proclin300和还原试剂,还原试剂包括EDTA、维生素E、三(2‑甲酰乙基)膦盐酸盐和愈创木酚。本申请的还原剂组合的使用,确保与蛋白质通过二硫键结合的氧化型HCY还原为还原型HCY,便于后续的检测准确性,使得后续检测的假阳性率较低的优点。
Description
技术领域
本申请涉及体外诊断检测领域,更具体地说,它涉及一种HCY检测用还原试剂,试剂盒及其使用方法。
背景技术
同型半胱氨酸(Homocysteine,HCY)又称高半胱氨酸,是甲硫氨酸脱甲基后的分解代谢产物,血浆中的HCY浓度异常,可反映机体甲基化状态和转硫化的异常状态,是许多慢性疾病发生的独立危险因素或重要危险因素。目前,临床市场上最常用的HCY检测试剂盒多为采用生化循环酶法的国产试剂盒、采用化学发光法的进口试剂盒。
生化循环酶法试剂成本较低、检测方便,但其检测存在有受胆红素、血红蛋白等血液成分干扰的问题;大型全自动化学发光法检测准确、检测时间短,但进口试剂成本较高、尚存在外贸等政策风险;除了受上述因素影响外,HCY样本检测结果还受蛋白质结合状态的HCY解离情况的影响,对于通过二硫键与蛋白质结合的氧化型HCY,临床检验上通常采用巯基乙醇或二硫苏糖醇进行还原处理,将氧化型HCY还原为还原型HCY,但由于巯基乙醇还原性较差,因此易被空气中的氧气氧化失活,虽然二硫苏糖醇的还原性和稳定性均优于巯基乙醇,但其还原稳定性仍不高,导致最终检测HCY含量的准确性较低,检测结果的假阳性率较高。
发明内容
为了进一步提高HCY检测时相关试剂的还原稳定性,提出了一种HCY检测用还原试剂,为了进一步提高HCY检测试剂盒的检测准确性,从而降低假阳性率,本申请提供一种试剂盒及其使用方法。
第一方面,本申请提供的一种HCY检测用还原试剂,采用如下的技术方案:
一种HCY检测用还原试剂,包括Tris-HCl缓冲液、NaCl和Proclin300,其特征在于,所述还原试剂还包括EDTA、维生素E、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐和愈创木酚。
通过采用上述技术方案,本申请采用比传统巯基乙醇或二硫苏糖醇还原能力更强、稳定性更好的还原剂组合维生素E、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐与愈创木酚,确保与蛋白质通过二硫键结合的氧化型HCY还原为还原型HCY,便于后续的检测准确性,使得后续检测的假阳性率较低。
在配方中加入EDTA,EDTA可以螯合溶液中的金属离子,避免还原型HCY的游离巯基重新被氧化形成二硫键,延长了HCY检测试剂的有效期。
且本申请的HCY检测试剂盒,操作简便、即时检测、灵敏度高、特异性好、稳定性好,解决了目前临床上氧化型HCY的还原效果随时间延长而变差,导致HCY生化试剂检测准确性低、假阳性率高的问题,以及进口发光试剂费用昂贵的问题。
本申请的HCY检测试剂盒,还可以联合其他心血管标志物MPO、Lp-PLA2、CRP等,对于急性冠脉综合症患者心脏意外事件的早期预警、早发现早治疗具有重要的意义。
可选的,所述维生素E的重量与Tris-HCl缓冲液的体积比为0.5%-5%。
通过采用上述技术方案,适量的维生素E可以与三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、愈创木酚起到较好的协配效果,将蛋白质结合状态的氧化型HCY还原为还原型HCY时,还原稳定性较好。
可选的,所述三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的摩尔浓度为1-10mM。
通过采用上述技术方案,适量的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐可以与维生素E、愈创木酚起到较好的协配效果,则蛋白质结合状态的氧化型HCY被还原为还原型HCY的还原性较好。
可选的,所述愈创木酚的摩尔浓度0.01-0.1mM。
通过采用上述技术方案,还原试剂中添加适量的愈创木酚,使得还原试剂还原蛋白质结合状态的氧化型HCY的效果较好,则最终检测的血浆或血清中HCY的含量准确性高,假阳性率较低。
可选的,所述EDTA的摩尔浓度为1-5mM。
通过采用上述技术方案,合适浓度的EDTA,可以适当的螯合血浆或血清中的金属离子,避免还原型HCY的游离巯基重新被氧化形成二硫键,延长了HCY检测试剂的有效期。
第二方面,本申请提供一种试剂盒,采用如下的技术方案:
一种试剂盒,所述试剂盒包括检测试剂,检测试剂包括HCY检测用还原试剂。
通过采用上述技术方案,采用本申请HCY检测用还原试剂制成的试剂盒,最终检测得到血浆或血清中HCY浓度准确度高,假阳性率低。
可选的,所述检测试剂还包括合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液。
通过采用上述技术方案,通过使用HCY检测用还原试剂与合成试剂对含有HCY抗原的血浆或血清预处理,将蛋白质结合状态的氧化型HCY还原为还原型HCY,并在合成试剂中转化为SAH抗原;磁联抗原试剂为磁联SAH抗原,生成的SAH抗原与磁联SAH抗原竞争结合有限量的酶标抗体试剂,形成SAH抗原-酶标抗体复合物与磁联SAH抗原-酶标抗体复合物,进而通过化学发光底物引发化学发光,样本中HCY抗原含量与发光值对应的磁联SAH抗原含量成反比。最终检测得到血浆或血清中HCY浓度准确度高,假阳性率低。
可选的,所述合成试剂包括腺苷、EDTA、海藻糖和SAH水解酶。
通过采用上述技术方案,EDTA和海藻糖为SAH水解酶保护剂,用于维持SAH水解酶的稳定性,SAH水解酶用于催化还原型HCY转化为SAH抗原,以便于SAH抗原与磁联SAH抗原共同竞争酶标抗体试剂,最终检测得到血浆或血清中HCY浓度准确性较高,假阳性率较低。
可选的,所述合成试剂包括5-10mM腺苷、1-5mM EDTA、2%-5%(w/v)海藻糖和50-100U/mL的SAH水解酶。
通过采用上述技术方案,合适浓度的EDTA与海藻糖可以对SAH水解酶进行恰当好处的保护,使得SAH水解酶的稳定性较好,最终检测得到血浆或血清中HCY浓度准确性较高,假阳性率较低。
第三方面,本申请提供一种试剂盒的使用方法,采用如下技术方案:
一种试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
步骤S1:将HCY检测用还原试剂、合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液依次加到试剂条上;
步骤S2:滴加样品,进行检测,得到HCY的检测浓度。
可选的,一种试剂盒的使用方法,包括以下步骤:
步骤S1:将HCY检测用还原试剂、合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液依次加到试剂条上;
步骤S2:滴加校准品,进行检测,绘制校准曲线;
步骤S3:滴加样品,进行检测,根据校准品建立的校准曲线拟合计算得到HCY的检测浓度。
通过采用上述技术方案,将组成试剂条的各种试剂添加结束后,首先利用不同浓度的校准品进行发光值检测,并绘制校准曲线;然后进行样品的检测,根据样品检测的发光值依据校准曲线拟合计算样品中HCY的浓度。
通过采用上述技术方案,合适浓度的HCY检测用还原试剂、合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液,使得在竞争反应中,SAH抗原与磁联SAH抗原共同竞争酶标抗体试剂的效果较好,最终测得的血浆或血清中HCY的浓度较准确,假阳性率较低。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1、本申请中新型还原剂组合的使用,确保与蛋白质通过二硫键结合的氧化型HCY还原为还原型HCY,便于后续的检测准确性,使得后续检测的假阳性率较低;
2、本申请的HCY化学发光检测试剂盒,操作简便,即时检测,灵敏度高、特异性好、稳定性好,可以联合其他心血管标志物MPO、Lp-PLA2、CRP等,对于急性冠脉综合症患者心脏意外事件的早期预警、早发现早治疗具有重要的意义;
3、本申请中EDTA的加入,使得EDTA可以螯合溶液中的金属离子,避免还原型HCY的游离巯基重新被氧化形成二硫键,延长了HCY检测试剂的有效期。
附图说明
图1旨在显示试剂条的结构示意图。
具体实施方式
以下结合实施例与对比例对本申请作进一步详细说明。
提供以下实施例和对比例的原料来源:以下实施例原料均市售购得;进口HCY检测试剂盒,品牌:雅培试剂;健康样本、心绞痛样本和心肌梗死样本均来自于医院。
一种HCY检测用还原试剂
实施例1
还原试剂为200mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、5mM EDTA、0.1%(v/v)Proclin300、1%(w/v)维生素E、5mM三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、0.05mM愈创木酚(上述所有的w/v均指的是g/mL)。
实施例2
还原试剂为200mM pH7.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、1mM EDTA、0.1%(v/v)Proclin300、5%(w/v)维生素E、2mM三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐、0.1mM愈创木酚(上述所有的w/v均指的是g/mL)。
实施例3
与实施例1的不同之处在于:还原试剂中不添加EDTA。
一种试剂盒
实施例4
一种试剂盒,其使用方法为:
试剂盒由试剂条、校准品组成;所述试剂条包括至少1个样本孔(1#)、11个试剂孔(2#-12#)、1个避光检测杯;样本孔(1#)加载测试样本50μL;试剂孔2#加载还原试剂50μL;试剂孔3#加载合成试剂50μL;试剂孔4#-8#各加载工作洗液400μL;试剂孔9#、10#、11#分别装载酶标抗体试剂60μL、磁联抗原试剂50μL和化学发光底物液120μL;避光检测杯(13#)用于检测化学发光信号。
还原试剂,采用实施例1中的还原试剂;
合成试剂为200mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、5mM腺苷、5mM EDTA、0.1%(v/v)Proclin300、5%(w/v)海藻糖、50U/mL SAH水解酶(上述所有的w/v均指的是g/mL);
工作洗液为200mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、0.5%(v/v)TW-20、0.1%(v/v)Proclin300(上述所有的w/v均指的是g/mL);
酶标抗体试剂为酶标物稀释液稀释的ALP标记的小鼠抗人SAH抗体,体积比为1:1000;酶标物稀释液为200mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、3%(w/v)BSA、10%(v/v)稳定剂、0.1%(v/v)Proclin300(上述所有的w/v均指的是g/mL);磁联抗原试剂为磁珠稀释液稀释的偶联磁珠的SAH抗原,体积比为20:1;磁珠稀释液为200mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、30%(v/v)甘油、10%(w/v)明胶、5%(w/v)海藻糖、0.1%(v/v)Proclin300(上述所有的w/v均指的是g/mL);化学发光底物液为0.2mol/L pH9.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.5g/L 9-(4-氯苯基硫代苯酰氧亚甲基)-10-甲基-9,10-二氢化吖啶-二钠盐、0.3mg/L 5-(十四酰胺基)荧光素、0.5g/L芳基酰腙-9,10-吖啶衍生物、1.0mM MgCl2、1.0mM ZnCl2、5mg/L十六烷基三甲基氯化铵、0.5g/L Proclin300、0.5wt%Tween20;
校准品为SAH抗原用校准品稀释液按不同比例稀释,所述校准品稀释液为200mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、2%(w/v)牛血清白蛋白、5%(w/v)海藻糖、0.1%(v/v)Proclin300(上述所有的w/v均指的是g/mL);
检测时,首先将校准品加入样本孔(1#),并将试剂条放置到检测仪器中,检测化学发光强度值,以校准品中SAH抗原的不同浓度为横坐标,化学发光强度值为纵坐标,制作校准曲线;然后将样品加入样本孔(1#)中,并将试剂条放置到检测仪器中,检测化学发光强度值,根据线性关系推算得到样品中HCY的浓度。
实施例5
与实施例1的不同之处在于:还原试剂,采用实施例2中的还原试剂;
合成试剂为200mM pH7.4的Tris-HCl缓冲液,其中含有终浓度为0.9%(w/v)NaCl、10mM腺苷、1mM EDTA、0.1%(v/v)Proclin300、2%(w/v)海藻糖、100U/mL SAH水解酶(上述所有的w/v均指的是g/mL)。
对比例1
与实施例4的不同之处在于:采用实施例3中的还原试剂。
对比例2
采用生化循环酶法检测的国产HCY检测试剂盒。
对比例3
采用化学发光法检测的进口HCY检测试剂盒,品牌:雅培试剂,还原试剂为二硫苏糖醇缓冲液。
性能检测试验
A、(1)本申请的HCY检测试剂盒与HCY检测同类试剂盒检测健康样本、心绞痛及心梗样本中的HCY阳性检出率情况对比。
将本申请的HCY检测试剂盒(化学发光法)与国产HCY检测试剂盒(生化循环酶法)、进口HCY检测试剂盒(化学发光法)分别检测健康样本40例、心绞痛样本32例、心肌梗死样本30例,比较3种HCY检测试剂盒对于健康样本、心绞痛样本及心肌梗死样本的HCY阳性检出率情况,结果见表1。
表1
由表1可知,HCY的参考值15μmol/L,为正常人体中界定是否患有心绞痛、心肌梗死的HCY浓度,均值为多例样本检测的平均值,标准差为多例样本检测值的标准差,但人体样本也具有特异性,正常人体中会有少部分人体的HCY浓度超过15μmol/L,市场上对于健康样本的阳性率检出值低于10%的试剂盒就可以生产并使用,因此,本申请的HCY检测试剂盒满足正常使用条件,且阳性率检出值优于市场上对于HCY检测试剂盒的基本要求。
对于心绞痛样本组、心肌梗死样本组,本申请实施例1的阳性率与对比例3的阳性率接近,即,本申请的HCY检测试剂盒与进口HCY检测试剂盒在对于心绞痛样本组、心肌梗死样本组检测HCY具有相当的敏感性,但进口HCY检测试剂盒价格昂贵,本申请的HCY检测试剂盒较进口HCY检测试剂盒具有较大的成本优势,性价比高。
对于心绞痛样本组、心肌梗死样本组,本申请实施例1的阳性率高于对比例2中的阳性率;即,本申请的HCY检测试剂盒比国产HCY检测试剂盒检测阳性率高,对疾病的检出准确性高。
(2)本申请的HCY检测试剂盒与国产HCY检测试剂盒稳定性比较。
将本申请的HCY检测试剂盒(化学发光法)与国产HCY检测试剂盒(生化循环酶法)分别置于2-8度(储存一年)、37度3天、37度6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)的条件下,对3例正常值样本(样本1-3)、3例异常值样本(样本4-6)比较2-8度、37度3天和37度6天储存条件下的HCY检测试剂盒与国产HCY检测试剂盒对于上述样本的HCY检测值变化情况,结果见表2;相对标准偏差,结果见表3。
表2两种HCY试剂盒加速破坏后检测样本HCY情况
表2两种HCY试剂盒加速破坏后检测样本HCY情况
表3两种HCY试剂盒加速破坏后检测样本HCY情况(相对偏差)
由表2、表3可知,将本申请的HCY检测试剂盒在37度3天、6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)的条件下,检测上述6个样本,检测结果与2-8度保存试剂盒检测结果相对偏差小于15%,而国产HCY检测试剂盒在37度3天、6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)的条件下,检测上述6个样本,检测结果与2-8度保存试剂盒检测结果相对偏差在-13%~-27%,两种结果偏差较大,证明本申请的HCY检测试剂盒的检测稳定性比国产HCY检测试剂盒的检测稳定性好。
B、实施例1与实施例2制备的HCY检测试剂盒检测结果比较。
以本申请的实施例2制备的HCY检测试剂盒与实施例1制备的HCY检测试剂盒分别对3例正常值样本(样本1-3)、3例异常值样本(样本4-6)检测,比较两种试剂盒对于上述样本中的HCY检测值变化情况,结果见下表4。
表4两种技术方案制备试剂盒检测样本性能比较
由上表结果可知,实施例1与实施例2制备的HCY检测试剂盒检测3例正常值、3例异常值样本,其检测结果相对偏差在±5%的范围内;以不同的样本为横坐标,以检测的光度值为纵坐标,进行两组数据的线性关系拟合,得出相关方程,检测结果相关性大于0.99,表明两种HCY检测试剂盒检测相关性偏差较小,实施例1与实施例2制备的HCY检测试剂盒效果均较好。
C、实施例1与对比例1制备的HCY检测试剂盒检测结果比较将本申请的实施例1的HCY检测试剂盒与对比例1的HCY检测试剂盒(还原试剂中未添加EDTA)分别置于2-8度、37度6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)后,对3例正常值样本(样本1-3)、3例异常值样本(样本4-6)检测,比较2-8度和37度6天储存条件下,实施例1制备的HCY检测试剂盒与对比例2制备的HCY检测试剂盒对于上述样本中HCY检测值的变化情况,结果如表5所示,相对偏差如表6所示。
表5两种HCY试剂盒加速破坏后检测样本HCY情况
表6两种HCY试剂盒加速破坏后检测样本HCY情况(相对偏差)
由表5、表6可知,将本申请实施例1的HCY检测试剂盒在37度3天、6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)条件下,检测上述6个样本,检测结果与2-8度保存试剂盒检测结果的相对偏差小于15%,而对比例1的HCY检测试剂盒在37度6天(加速破坏试验,模拟2-8度储存1年条件)的条件下,检测上述6个样本,检测结果与2-8度保存试剂盒检测结果的相对偏差为-16%~-21%,两种结果偏差较大,则证明还原试剂中不添加EDTA,最终制得的HCY检测试剂盒稳定性差。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释,其并不是对本申请的限制,本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改,但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (9)
1.一种HCY检测用还原试剂,包括Tris-HCl缓冲液、NaCl和Proclin300,其特征在于,所述还原试剂还包括EDTA、维生素E、三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐和愈创木酚。
2.根据权利要求1所述的一种HCY检测用还原试剂,其特征在于,所述维生素E的重量与还原试剂的体积比为(0.5-5)g:100mL。
3.根据权利要求1所述的一种HCY检测用还原试剂,其特征在于,所述三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的摩尔浓度为1-10mM。
4.根据权利要求1所述的一种HCY检测用还原试剂,其特征在于,所述愈创木酚的摩尔浓度0.01-0.1mM。
5.根据权利要求1所述的一种HCY检测用还原试剂,其特征在于,所述EDTA的摩尔浓度为1-5mM。
6.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括检测试剂,检测试剂包括权利要求1-5任一所述的还原试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述检测试剂还包括合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述合成试剂包括5-10mM腺苷、1-5mMEDTA、2%-5%(w/v)海藻糖和50-100U/mL的SAH水解酶。
9.一种如根据权利要求6-8任一所述的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤S1:将HCY检测用还原试剂、合成试剂、酶标抗体试剂、工作洗液、磁联抗原试剂和化学发光底物液依次加到试剂条上;
步骤S2:滴加样品,进行检测,得到HCY的检测浓度。
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