CN111999495A

CN111999495A - 一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN111999495A
Application number: CN202010833169.0A
Authority: CN
Inventors: 徐悦
Original assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Current assignee: BEIJING BEIER BIOENGINEERING CO LTD
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-11-27

Abstract

本发明实施例涉及免疫检测领域，具体涉及一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法。所述试剂盒包括：酶标工作液、磁珠悬浮液、样本稀释液、校准品和发光底物液；其中，酶标工作液包括辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原，磁珠悬浮液包括偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒；所述柯萨奇B组病毒抗原包括重组抗原A、重组抗原B或重组抗原C中的一种或多种；所述重组抗原A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列；所述重组抗原B的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示序列；所述重组抗原C的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示序列。本发明实施例提供的试剂盒，提高了灵敏度和线性范围，且特异性、准确性好。

Description

一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法。

背景技术

柯萨奇病毒是非常严重的人类疾病的致病病原，1948年由Dolldorf和Sickles在美国纽约Coxsackie镇从临床诊断为脊髓灰质炎的患者粪便标本中分离出来的一组病毒,属小RNA病毒,可引起从上呼吸道到中枢神经系统感染的许多疾病。该病毒分为A、B两组，其中柯萨奇B组(Coxsackievirus group B，CVB)病毒属于小RNA病毒科的肠道病毒属，有6个血清型，是引起人类病毒性心肌炎、无菌性脑膜炎和新生儿全身性感染等疾病的主要病原，可在世界各地散发或暴发流行，近年来其发病呈显著上升趋势。故重视柯萨奇病毒感染的多样性和早期诊断柯萨奇病毒感染不容忽视。

目前临床和科研用柯萨奇B组病毒诊断主要包括病原学诊断、分子生物学诊断及免疫学诊断等，病原学诊断主要通过细胞培养的方法分离鉴定临床尿液、血液等标本中的病原体，病原学诊断具有较高的特异性，技术操作难度大，操作繁琐，分离周期较长，主要应用在科研教学方面，并不适合大规模，快速，准确的临床检测需求，有一定条件限制，而且耗时较长。分子生物学主要检测病原体核酸，该方法对标本的采集要求严格，如时间、部位等，并对实验技术要求较高，容易产生假阳性结果。免疫学诊断主要检测血清中的抗体，包括胶体金法、酶联免疫吸附法。胶体金法一般通过手工进行实验操作，最终通过肉眼进行定性判定，该技术灵敏度低，易出现假阳性，人为主观因素影响较大，酶联免疫吸附法的灵敏度较胶体金法有所提升，但仍然较低，并且线性范围窄，反应时间也较长，仍然不能很好满足临床的应用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒(CVB)IgM抗体的试剂盒及其制备方法。本发明实施例提供的试剂盒，使用磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体，与传统的胶体金法和酶联免疫吸附法相比，提高了灵敏度和线性范围，且特异性、准确性好。本发明的试剂盒，酶标工作液中HRP上标记的是经过特别选择的柯萨奇B组病毒基因工程抗原，提高了试剂盒的反应的灵敏度；磁微粒上标记的是鼠抗人IgM单克隆抗体，可提高试剂盒的特异性。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：酶标工作液、磁珠悬浮液、样本稀释液、校准品和发光底物液；

其中，酶标工作液包括辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原，

磁珠悬浮液包括偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒；

所述柯萨奇B组病毒抗原包括重组抗原A、重组抗原B或重组抗原C中的一种或多种；

所述重组抗原A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列；

所述重组抗原B的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示序列；

所述重组抗原C的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示序列。

CVB的基因组由单链线状RNA分子组成，基因组全长约7400bp，为正链性质，包裹于病毒核酸表面的是一20面体的病毒外壳，由60个病毒蛋白壳粒组成，而在每一壳粒又含有病毒核酸编码的四种壳蛋白VP1-VP4。重组抗原A、B、C来源于壳蛋白VP1。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原A的核苷酸序列包括SEQ IDNO.4所示序列。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原B的核苷酸序列包括SEQ IDNO.5所示序列。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，编码重组抗原C的核苷酸序列包括SEQ IDNO.6所示序列。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述柯萨奇B组病毒抗原包括重组抗原A。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，酶标工作液包括牛血清白蛋白(BSA)，新生牛血清，磷酸盐缓冲液(PBS)和辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原(CVB-Ag-HRP)；可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：牛血清白蛋白(BSA)2-5g/L，新生牛血清80-120mL/L，氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠4-8g/L，磷酸二氢钠0.4-1g/L和辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原0.8-1.2μg/mL；进一步可选地，酶标工作液包括下述终浓度的组分：牛血清白蛋白(BSA)2.4-2.6g/L，新生牛血清95-105mL/L，氯化钠7.5-8.5g/L，磷酸氢二钠5.5-6.0g/L，磷酸二氢钠0.55-0.65g/L和辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原1μg/mL。

本领域通用的辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原的标记比例为1mgHRP上标记1mg柯萨奇B组病毒抗原。本发明试剂盒中，CVB-Ag-HRP的终浓度以柯萨奇B组病毒抗原的质量计，即“CVB-Ag-HRP 0.8-1.2μg/mL”指以柯萨奇B组病毒抗原的质量计，酶标工作液中CVB-Ag-HRP的终浓度为0.8-1.2μg/mL。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒(以磁微粒的质量计)0.8-1.2mg/mL，其中，1mg磁微粒上偶联有30-50μg的鼠抗人IgM抗体；可选地，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒(以磁微粒的质量计)1mg/mL，其中，1mg磁微粒上偶联有40μg的鼠抗人IgM抗体。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，磁微粒为超顺磁性微粒。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，所述磁微粒使用活化剂碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化；可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和2.3-2.7mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和9.8-10.2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化；进一步可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲液活化。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品包括梯度稀释的柯萨奇B组病毒IgM抗体；可选地，校准品包括20、40、80、160、320、640AU/mL的柯萨奇B组病毒IgM抗体。所述柯萨奇B组病毒IgM抗体为高值血清。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，校准品用校准品稀释液稀释，所述CVB-IgM校准品稀释液包括下述终浓度的组分：Na₂HPO₄·12H₂O 5-6g/L，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5-0.7g/L，NaCl 6-10g/L，BSA2-3g/L，pH 7.1-7.3。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，样本稀释液为pH值为7.0-7.2的生理盐水。

上述试剂盒在一种可能的实现方式中，发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A包括鲁米诺或鲁米诺钠盐；化学发光底物B液包括过氧化脲。

本发明实施例还提供了利用上述试剂盒的组分制备磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体试剂盒的制备方法。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，酶标工作液、样本稀释液、校准品和发光底物液按照本领域常规的溶液配制方法配制即可。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：将磁微粒用碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化后，加入鼠抗人IgM抗体；可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和2.3-2.7mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和9.8-10.2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化；进一步可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲液活化。

上述制备方法在一种可能的实现方式中，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：

取100mg磁微粒，磁分离去上清，用10mL偶联缓冲液重悬，磁分离去上清，重复数次，置换磁微粒液体环境；向去上清的磁微粒加入9mL偶联缓冲液重悬，再加入1.0mL新配制的含有浓度为4.80-5.20mg/mL的EDC和4.80-5.20mg/mL的NHS的偶联缓冲液，室温振荡混悬，使磁珠充分活化；磁分离，去上清，用偶联缓冲液重悬，加入3.5-4mg鼠抗人IgM抗体，使磁微粒浓缩液总体积为10mL，2-8℃振荡混悬8-12h；磁分离，去上清，用10mL储存液重悬，室温条件下混匀，再磁分离，去上清，重复数次，清洗磁微粒液体环境中游离抗体；向去上清的磁微粒加入10mL储存液重悬；室温条件下混匀后，使超声，将聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态；

室温条件下混匀后，加入储存液90mL，得到所述磁珠悬浮液；所述磁珠悬浮液中磁微粒的浓度为0.8-1.2mg/mL；

其中，偶联缓冲液包括下述终浓度的组分：2-吗啉乙磺酸3-3.5g/L，pH 5.90-6.10；

储存液包括下述终浓度的组分：Tris 1-1.3g/L，NaCl 8.5-9g/L，牛血清白蛋白0.8-1.2g/L，pH 7.30-7.50。实际制备中，改变磁微粒的用量，其余试剂用量相应调整。

本发明实施例还提供了上述试剂盒的使用方法，所述使用方法包括下述步骤：

将校准品梯度稀释；在全自动化学发光仪的反应杯中，每孔分别加入样本稀释液，校准品或待测样本，磁珠悬浮液，酶标工作液，发光底物液；检测发光强度，输出检测结果；

计算：以校准品发光强度RLU值建立定标曲线，将待测样本的RLU值代入定标曲线中计算待测样本中柯萨奇B组病毒IgM抗体的含量。

本发明的试剂盒的检测原理为：将待测样品、样本稀释液和磁珠悬浮液混合温育，样品中的CVB-IgM抗体与磁珠悬浮液中的鼠抗人IgM单克隆抗体结合，CVB-IgM抗体被吸附到磁微粒表面；随后加入酶标工作液并混合温育，此时，辣根过氧化物酶标记柯萨奇B组病毒抗原与已经结合在磁珠上的CVB-IgM抗体特异性结合；随后，HRP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样品中CVB-IgM浓度呈正比，通过RLU即可从标准曲线上计算出待测样品的CVB-IgM含量。

有益效果

(1)本发明实施例提供的试剂盒，使用磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体，与传统的胶体金法和酶联免疫吸附法相比，提高了灵敏度和线性范围，且特异性、准确性好。

本发明的试剂盒，酶标工作液中HRP上标记的是经过特别选择的柯萨奇B组病毒基因工程抗原，提高了试剂盒的反应的灵敏度。

本发明的试剂盒，磁微粒上标记的是鼠抗人IgM单克隆抗体，可提高试剂盒的特异性。

经验证，本发明的试剂盒可成功避免与抗核抗体、类风湿因子阳性样本以及柯萨奇病毒A组16型IgM抗体(CA16-IgM)阳性血清、肠道病毒71型IgM抗体(EV71-IgM)阳性血清、单纯疱疹病毒1型IgM抗体(HSV1-IgM)阳性血清、单纯疱疹病毒2型IgM抗体(HSV2-IgM)阳性血清、水痘-带状疱疹病毒IgM抗体(VZV-IgM)阳性血清、A群轮状病毒IgM抗体(Rota-IgM)阳性血清、风疹病毒IgM抗体(RV-IgM)阳性血清、麻疹病毒IgM抗体(MV-IgM)阳性血清、人类巨细胞病毒IgM抗体阳性血清(HCMV-IgM)、流行性腮腺炎病毒IgM抗体阳性血清(MuV-IgM)、乙型肝炎病毒核心抗体IgM(HBc-IgM)阳性血清、甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)阳性血清、人细小病毒B19IgM抗体(B19-IgM)阳性血清、弓形虫IgM抗体(TOX-IgM)阳性血清等相关疾病抗体阳性样本的交叉反应，特异性强。

(2)本发明实施例提供的试剂盒，对柯萨奇B组病毒基因工程抗原进一步进行了选择，使用重组抗原A的试剂盒的反应灵敏度和特异性进一步提高。

本发明的试剂盒，对磁微粒的活化条件进行了进一步选择，使用本发明的活化条件活化后的磁微粒，标记鼠抗人IgM抗体效果更好，进一步用于本发明的试剂盒时，试剂盒的检测灵敏度和特异性进一步提高。

本发明试剂盒的磁微粒为高分散性的超顺磁性微粒，可保证磁微粒在保存和使用过程中完全不会发生聚集。并且，使用HRP催化发光底物发光，1分钟即达发光反应平台期，并保持平稳的光信号，可保证高检测精度和效率。

此外，本发明的试剂盒，酶标工作液、磁珠悬浮液、样本稀释液、校准品和发光底物液搭配使用，发明人对各组分组成及用量进行了特定选择，为试剂盒的使用效期及检测性能提供了有力保障。

(3)本发明实施例提供的试剂盒的制备方法，步骤简单，生产成本低。

(4)本发明实施例提供的试剂盒的使用方法，配合全自动化学发光免疫分析仪实现全自动使用，具有操作简便，结果判断客观等优点，对于临床诊断具有重要价值，应用前景广阔。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为本发明磁微粒化学发光法原理图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

下述实施例中，除特别说明的，所述原料均为市售商品；其中，重组抗原A、B、C可根据抗原氨基酸序列直接人工合成，或使用下述方法制备得到：

1.重组抗原A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原A的基因序列，如SEQ ID NO.4所示；按照pET43.1a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原A的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原A基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入1μmol/mL IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

2.重组抗原B，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原B的基因序列，如SEQ ID NO.5所示；按照pET43.1a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原B的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原B基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入1μmol/mL IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

3.重组抗原C，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；其通过下述方法制备得到：

针对大肠杆菌表达偏好密码子对其进行密码子优化，得到编码重组抗原C的基因序列，如SEQ ID NO.6所示；按照pET43.1a(+)载体的多克隆位点序列信息，在重组抗原C的基因序列的上游设计NcoI酶切位点，下游加上6个组氨酸、终止密码子及XhoI酶切位点，化学合成，克隆至原核表达载体pET43.1a(+)中，转化大肠埃希菌BL21(DE3)，然后将含有重组抗原C基因的大肠杆菌菌株在LB中培养过夜，A600值为0.6-0.9时加入1μmol/mL IPTG诱导4小时收集菌体，用含0.1％Tritonx-100的20mmTris(pH8.0)收集菌体；超声后高速离心收集上清进行亲和层析和离子交换层析，分离及收集纯化蛋白抗原，-20℃保存备用。

4.商购或自制获得柯萨奇B组病毒重组抗原后，使用本领域通用方法进行辣根过氧化酶标记，具体如下：

取4mg HRP，加入1mL水，0.2mL高碘酸钠，避光搅拌30min；加入80μL乙二醇，避光搅拌30min；加入4mg柯萨奇B组病毒重组抗原，混匀后使用50mM的碳酸盐缓冲液透析，4℃避光透析24h；加入硼氢化钠1mg，混匀后静置6h，加入丙三醇2mL，即得；-20℃储存备用。

5.所用的校准品(640AU/mL的柯萨奇B组病毒IgM抗体高值血清)通过下述方法获得：

收集柯萨奇B组病毒IgM抗体阳性高值血清，用实施例1提供的试剂盒进行测试，将检测发光值大于5000万的血清混合备用。

收集柯萨奇B组病毒IgM抗体阴性血清，用实施例1提供的试剂盒进行测试，将检测发光值小于2万的血清混合备用。

640AU/mL的校准品制备方法为：先用阴性血清稀释柯萨奇B组病毒IgM抗体高值血清，稀释比例4倍、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍、2048倍、4096倍、8192倍；使用实施例1提供的试剂盒检测稀释后的混合血清，混合血清的检测值接近发光底物液的检测值时，则将该稀释后的混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体的浓度定为0AU/mL；例如，稀释8192倍的混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体的浓度定为0AU/mL时，此浓缩的上一个浓度(稀释4096倍)时混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体浓度就定为5AU/mL，稀释2048倍的混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体的浓度就定为10AU/mL，稀释1024倍的混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体的浓度就定为20AU/mL；依次类推，稀释32倍的混合血清的柯萨奇B组病毒IgM抗体浓度就定为640AU/mL。以20-640AU/mL的抗体混合血清为校准品，使用实施例1提供的试剂盒检测阳性血清10例，阴性血清10例，如均检测准确则符合要求；如果符合要求，将此批号的混合血清稀释32倍，即得柯萨奇B组病毒IgM抗体浓度为640AU/mL的校准品。

实施例1

1、一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：

酶标工作液、磁珠悬浮液、样本稀释液、校准品和发光底物液；

其中，酶标工作液包括下述终浓度的组分：牛血清白蛋白(BSA)2.5g/L，新生牛血清100mL/L，氯化钠8.0g/L，磷酸氢二钠5.8g/L，磷酸二氢钠0.593g/L和辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原1μg/mL；

磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒(以磁微粒的质量计)1mg/mL，其中，1mg磁微粒上偶联有40μg的鼠抗人IgM抗体；磁微粒为超顺磁性微粒；每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为5mg/mL的EDC和5mg/mL的NHS的缓冲液活化；

校准品包括20、40、80、160、320、640AU/mL的柯萨奇B组病毒IgM抗体高值血清；

样本稀释液为pH值为7.0-7.2的生理盐水；

发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，其中发光底物液A包括下述终浓度的组分：Tris 0.02g/L，盐酸0.006ml/L，鲁米诺0.003g/L；发光底物液B包括下述终浓度的组分：磷酸二氢钠0.2g/L，磷酸氢二钠2.9g/L，过氧化脲0.01g/L，氯化钠9g/L；

所述柯萨奇B组病毒抗原为重组抗原A。

2、上述试剂盒的制备方法包括下述步骤：

(1)制备校准品：

配制校准品稀释液：加800mL纯化水和5.8g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.593g的NaH₂PO₄·2H₂O到容器中，搅拌混合均匀，再加8.0g的氯化钠，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.10-7.30，加2.5g的BSA到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7.10-7.30，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述校准品稀释液保存在2-8℃待用；

用上述校准品稀释液将柯萨奇B组病毒IgM抗体高值血清分别配制为20、40、80、160、320、640AU/mL共6个浓度点，得到所述校准品。

(2)制备样本稀释液

加800mL纯化水和9.0g的氯化钠于1L容器中，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.00-7.20，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，得到样本稀释液。

(3)制备酶标工作液

配制酶稀释液：加800mL纯化水和5.8g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.593g的NaH₂PO₄·2H₂O到容器中，搅拌混合均匀，再加8.0g的氯化钠，搅拌至完全溶解，将pH值调为7.10-7.30，加2.5g的BSA和100mL的新生牛血清到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7.10-7.30，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的酶稀释液保存在2-8℃待用；

将辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原(1mg/mL)用所述酶稀释液以1:1000比例稀释，得到所述酶标工作液。

(4)制备磁珠悬浮液

配制偶联缓冲液：加800mL纯化水和3.2g的2-吗啉乙磺酸到容器中，搅拌至完全溶解，将pH值调为5.90-6.10，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述偶联缓冲液保存在2-8℃待用；

配制储存液：加800mL纯化水和1.2114g的Tris到容器中，搅拌混合均匀，再加8.766g的氯化钠，搅拌至完全溶解，用盐酸将pH值调为7.30-7.50，加1.0g的牛血清白蛋白到容器中，搅拌至完全溶解，再将pH值调为7.30-7.50，用纯化水定容至1L，使用0.2μm滤器过滤，将获得的所述储存液保存在2-8℃待用；

配制CVB-IgM浓缩磁微粒：取100mg磁微粒，磁分离去上清，取用偶联缓冲液10mL重悬，磁分离去上清，此步骤重复三次，置换磁微粒液体环境；向去上清的磁微粒加入9mL偶联缓冲液重悬，再加入1.0mL新配制的含有浓度为5mg/mL的EDC和5mg/mL的NHS的偶联缓冲液，室温振荡混悬30min，使磁珠充分活化，磁分离，去上清，用偶联缓冲液重悬；加入4mg鼠抗人IgM单克隆抗体，使磁微粒浓缩液总体积为10mL，2-8℃振荡混悬12小时；磁分离，去上清，取用储存液10mL重悬，室温条件下混匀30min，再磁分离，去上清，此步骤重复两次，清洗磁微粒液体环境中游离抗体；向去上清的磁微粒加入10mL储存液重悬，室温条件下混匀2h后，使用超声振荡仪将混悬液中聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态，得到所述CVB-IgM浓缩磁微粒，保存在2-8℃待用。

配制磁珠悬浮液：将CVB-IgM浓缩磁微粒，室温条件下混匀2h后，加入储存液90mL，得到磁珠悬浮液。

实施例2

1、一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒同实施例1，区别在于：

所述柯萨奇B组病毒抗原为重组抗原B。

2、所述试剂盒的制备方法同实施例1。

实施例3

所述柯萨奇B组病毒抗原为重组抗原C。

2、所述试剂盒的制备方法同实施例1。

实施例4

1、一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒，所述试剂盒同实施例1，区别在于：每100mL磁微粒分别使用1mL下述活化剂活化：

a.含有浓度为5mg/mL的EDC和0mg/mL的NHS的缓冲液；

b.含有浓度为5mg/mL的EDC和2.5mg/mL的NHS的缓冲液；

c.含有浓度为5mg/mL的EDC和10mg/mL的NHS的缓冲液。

2、所述试剂盒的制备方法同实施例1，区别在于：配制CVB-IgM浓缩磁微粒时，分别加入1.0mL新配制的下述偶联缓冲液：

a.含有浓度为5mg/mL的EDC和0mg/mL的NHS的偶联缓冲液；

b.含有浓度为5mg/mL的EDC和2.5mg/mL的NHS的偶联缓冲液；

c.含有浓度为5mg/mL的EDC和10mg/mL的NHS的偶联缓冲液。

效果例1

利用中航赛维生物生产的VI-200全自动化学发光仪对实施例提供的磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒进行检测，所述检测方法包括下述步骤：

1.将试剂盒中的样本稀释液，酶标工作液，磁珠悬浮液分别放置于分析仪试剂舱中；

2.在仪器软件上进行定标曲线，将校准品放到仪器测试位置，得到由全自动化学发光免疫分析仪输出拟合曲线；

3.如果仪器提示拟合通过，则在仪器软件上进行质控品测试申请，将质控品放到仪器指定位置，得到由全自动化学发光仪输出质控品测试发光值和通过标准曲线拟合得到的质控品的浓度值；

4.如果质控测值在预定范围内，即可进行样品测试申请；将待测样品放到仪器测试位置，由全自动化学发光仪输出待测样品测试发光值和通过标准曲线拟合得到的浓度值。

全自动化学发光仪检测步骤具体如下：

步骤1)加10μL校准品或质控品或待测样本至检测管中；本发明的试剂盒，待测标本需要量仅为10μL，降低了试剂盒的成本；

步骤2)加100μL的样本稀释液和20μL的磁珠悬浮液至步骤1)所述检测管中，混匀后，37±0.5℃温育15min，进行磁分离去上清；磁珠悬浮液参与反应时间仅为15min，可大限度地避免非特异性吸附；

步骤4)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离去上清；

步骤5)重复步骤4)三遍；

步骤6)加100μL的酶标工作液至检测管中，混匀后，37±0.5℃温育15min，进行磁分离去上清；

步骤7)加300μL的清洗液至检测管中，混匀，进行磁分离去上清；

步骤8)重复步骤7)三遍；

步骤9)加50μL的化学发光底物A液和50μL的化学发光底物B液至检测管中，混匀，检测发光强度。

本发明磁微粒化学发光法的原理见图1；将待测样品、所述CVB-IgM样本稀释液和磁珠悬浮液混合温育，样品中的CVB-IgM抗体与磁珠悬浮液中的鼠抗人IgM单克隆抗体结合，CVB-IgM抗体被吸附到磁微粒表面；随后加入酶标工作液并混合温育，此时，辣根过氧化物酶标记柯萨奇B组病毒抗原与已经结合在磁珠上的CVB-IgM抗体特异性结合；随后，HRP催化底物发光，测定相对发光强度(RLU)。在一定范围内RLU与样品中CVB-IgM浓度呈正比，通过RLU即可从标准曲线上计算出待测样品的CVB-IgM含量。

使用上述检测方法对实施例1提供的试剂盒进行性能评价：

1.灵敏度测定

10例阳性血清收集于河南省人民医院、陕西省人民医院、福州军区医院经临床验证的CVB-IgM抗体阳性血清(其中阳性血清包括柯萨奇B组病毒1型阳性样本2例，柯萨奇B组病毒2型阳性样本1例，柯萨奇B组病毒3型阳性样本2例，柯萨奇B组病毒4型阳性样本1例，柯萨奇B组病毒5型阳性样本1例)，用北京新兴四寰生物技术有限公司生产的柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)进行复检筛选，得到的CVB-IgM抗体阳性血清建立为阳性质控品。

使用实施例1提供的试剂盒分别检测10份阳性质控品，将阳性质控品的发光值代入定标曲线计算浓度值，根据浓度值进行判断，样本浓度值<20AU/mL判为阴性；浓度值≥25AU/mL判为阳性；20AU/mL≤浓度值<25AU/mL判为可疑，建议1～2周后重新取样检测或用其他检测方法进行确认，结果见表1。由表1可知，10份阳性质控品符合率为10/10。

表1：阳性参考品符合率数据统计表(AU/mL)

2.特异性测定

10例阴性血清收集于河南省人民医院、陕西省人民医院、福州军区医院经临床验证的CVB-IgM抗体阴性血清，用北京新兴四寰生物技术有限公司生产的柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)进行复检筛选，得到的CVB-IgM抗体阴性血清建立为阴性质控品。

使用实施例1提供的试剂盒分别检测10例阴性质控品，将阴性质控品的发光值代入定标曲线计算浓度值，根据浓度值进行判断，结果见表2；由表2可知，10份阴性质控品符合率为10/10。

表2：阴性参考品符合率数据统计表(AU/mL)

使用本发明实施例1提供的试剂盒检测20例类风湿因子阳性血清样本、10例抗核抗体阳性血清样本、10例柯萨奇病毒A组16型IgM抗体(CA16-IgM)阳性血清、10例肠道病毒71型IgM抗体(EV71-IgM)阳性血清、10例单纯疱疹病毒1型IgM抗体(HSV1-IgM)阳性血清、10例单纯疱疹病毒2型IgM抗体(HSV2-IgM)阳性血清、10例水痘-带状疱疹病毒IgM抗体(VZV-IgM)阳性血清、10例A群轮状病毒IgM抗体(Rota-IgM)阳性血清、10例风疹病毒IgM抗体(RV-IgM)阳性血清、10例麻疹病毒IgM抗体(MV-IgM)阳性血清、10例人类巨细胞病毒IgM抗体阳性血清(HCMV-IgM)、10例流行性腮腺炎病毒IgM抗体阳性血清(MuV-IgM)、10例乙型肝炎病毒核心抗体IgM(HBc-IgM)阳性血清、10例甲型肝炎病毒IgM抗体(HAV-IgM)阳性血清、10例人细小病毒B19IgM抗体(B19-IgM)阳性血清、10例弓形虫IgM抗体(TOX-IgM)阳性血清，均为阴性，表明以上干扰因子不会造成本发明试剂盒的假阳性，本发明试剂盒的特异性优异。

3.使用本发明实施例1提供的试剂盒与北京新兴四寰生物技术有限公司生产的柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)，对1070例人血清样品进行了对比实验，结果见表3。

表3：与新兴四寰酶联免疫试剂的对比检测结果

阳性符合率＝[143/144]×100％＝99.30％

阴性符合率＝[923/926]×100％＝99.68％

总符合率＝[(143+923)/(1070)]×100％＝99.63％

所有数据利用SPSS软件进行配对卡方得P＝0.625>0.05，Kappa值＝0.984≥0.75，表明本试剂盒与酶联免疫试剂盒具有高度一致性，并且灵敏度略高于酶联免疫试剂盒。

效果例2

对使用不同柯萨奇B组病毒抗原的实施例1-3提供的试剂盒进行评价：

以10例阳性血清、10例阴性血清(收集于河南省人民医院、陕西省人民医院、福州军区医院经临床验证的CVB-IgM抗体阳性血清、阴性血清，用北京新兴四寰生物技术有限公司生产的柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)进行复检筛选，得到的CVB-IgM抗体阳性血清、阴性血清建立为阳性质控品、阴性质控品，分别作为为测试样品。

使用实施例1-3的试剂盒分别对上述阳性质控品和阴性质控品进行检测，结果见表4；由表4可见，本发明实施例1提供的试剂盒，检测得到的阳、阴性质控品的P/N比值最高，表明实施例1提供的试剂盒中使用重组抗原A标记的磁微粒，灵敏度和特异性优于重组抗原B和重组抗原C。

表4：不同序列柯萨奇B组病毒抗原标记的磁微粒检测结果

效果例3

对实施例1和实施例4提供的使用不同活化剂活化磁微粒的试剂盒进行评价：

以10例阳性血清、10例阴性血清(收集于河南省人民医院、陕西省人民医院、福州军区医院经临床验证的CVB-IgM抗体阳性血清、阴性血清，用北京新兴四寰生物技术有限公司生产的柯萨奇B组病毒IgM抗体检测试剂盒(酶联免疫法)进行复检筛选，得到的CVB-IgM抗体阳性血清、阴性血清建立为阳性质控品、阴性质控品)，为测试样品。

分别使用实施例1和实施例4提供的试剂盒对上述阳性质控品和阴性质控品进行测试，结果见表5；由表5可知，实施例1提供的(活化剂为EDC 5mg/mL和NHS 5mg/mL)试剂盒，测得的阳、阴性质控品的P/N比值最高；表明以EDC 5mg/mL和NHS 5mg/mL条件活化的CVB-IgM磁微粒，检测灵敏度和特异性优于其他活化条件。

表5：不同浓度的CVB-IgM磁微粒的活化剂活化磁微粒检测结果

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京贝尔生物工程股份有限公司

<120> 一种磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体的试剂盒及其制备方法

<130> 190503F

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 285

<212> PRT

<213> Coxsackievirus B

<400> 1

Met Gly Pro Val Glu Asp Ala Val Thr Ala Ala Ile Gly Arg Val Ala

1 5 10 15

Asp Thr Val Gly Thr Gly Pro Thr Asn Ser Glu Ala Ile Pro Ala Leu

20 25 30

Thr Ala Ala Glu Thr Gly His Thr Ser Gln Val Val Pro Gly Asp Thr

35 40 45

Met Gln Thr Arg His Val Lys Asn Tyr His Ser Arg Ser Glu Ser Thr

50 55 60

Val Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys Val Tyr Phe Thr Glu Tyr

65 70 75 80

Glu Asn Ser Gly Ser Lys Arg Tyr Ala Glu Trp Val Val Thr Thr Arg

85 90 95

Gln Ala Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ile Arg

100 105 110

Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe Val Ile Thr Ser Thr Gln Gln Pro Ser

115 120 125

Thr Thr Gln Asn Gln Asp Ala Gln Ile Leu Thr His Gln Ile Met Tyr

130 135 140

Val Pro Pro Gly Gly Pro Val Pro Asp Lys Val Asp Ser Tyr Ala Trp

145 150 155 160

Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Asn Ala Pro

165 170 175

Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe Leu Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Ser Asn

180 185 190

Phe Tyr Asp Gly Trp Ser Glu Phe Ser Arg Asn Gly Val Tyr Gly Ile

195 200 205

Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Tyr Ala Arg His Val Asn Thr

210 215 220

Gly Ser Thr Gly Pro Ile Lys Ser Thr Ile Arg Ile Tyr Phe Lys Pro

225 230 235 240

Lys His Val Lys Ala Trp Ile Pro Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln Tyr

245 250 255

Glu Lys Ala Lys Asn Val Asn Phe Gln Pro Ser Gly Val Thr Thr Thr

260 265 270

Arg Gln Ser Ile Thr Ala Met Thr Asn Thr Gly Ala Phe

275 280 285

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> Coxsackievirus B

<400> 2

Met Gly Gln Thr Arg His Val Lys Asn Tyr His Ser Arg Ser Glu Ser

1 5 10 15

Thr Val Glu Asn Phe Leu Cys Arg Ser Ala Cys Val Tyr Phe Thr Glu

20 25 30

Tyr Glu Asn Ser Gly Ser Lys Arg Tyr Ala Glu Trp Val Val Thr Thr

35 40 45

Arg Gln Ala Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ile

50 55 60

Arg Phe Asp Leu Glu Leu Thr Phe Val Ile Thr Ser Thr Gln Gln Pro

65 70 75 80

Ser Thr Thr Gln Asn Gln Asp Ala Gln Ile Leu Thr His Gln Ile Met

85 90 95

Tyr Val Pro Pro Gly Gly Pro Val Pro Asp Lys Val Asp Ser Tyr Ala

100 105 110

Trp Gln Thr Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Asn Ala

115 120 125

Pro Pro Arg Met Ser Ile Pro Phe Leu Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Ser

130 135 140

Asn Phe Tyr Asp Gly Trp Ser Glu Phe Ser Arg Asn Gly Val Tyr Gly

145 150 155 160

Ile Asn Thr Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Tyr Ala Arg His Val Asn

165 170 175

Thr Gly Ser Thr Gly Pro Ile Lys Ser Thr Ile Arg Ile Tyr Phe Lys

180 185 190

Pro Lys His Val Lys Ala Trp Ile Pro Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln

195 200 205

Tyr Glu Lys Ala Lys Asn Val Asn Phe Gln Pro Ser Gly Val Thr Thr

210 215 220

Thr Arg Gln Ser Ile Thr Ala Met Thr Asn Thr Gly Ala Phe

225 230 235

<210> 3

<211> 203

<212> PRT

<213> Coxsackievirus B

<400> 3

Met Gly Ser Lys Arg Tyr Ala Glu Trp Val Val Thr Thr Arg Gln Ala

1 5 10 15

Ala Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ile Arg Phe Asp

20 25 30

Leu Glu Leu Thr Phe Val Ile Thr Ser Thr Gln Gln Pro Ser Thr Thr

35 40 45

Gln Asn Gln Asp Ala Gln Ile Leu Thr His Gln Ile Met Tyr Val Pro

50 55 60

Pro Gly Gly Pro Val Pro Asp Lys Val Asp Ser Tyr Ala Trp Gln Thr

65 70 75 80

Ser Thr Asn Pro Ser Val Phe Trp Thr Glu Gly Asn Ala Pro Pro Arg

85 90 95

Met Ser Ile Pro Phe Leu Ser Ile Gly Asn Ala Tyr Ser Asn Phe Tyr

100 105 110

Asp Gly Trp Ser Glu Phe Ser Arg Asn Gly Val Tyr Gly Ile Asn Thr

115 120 125

Leu Asn Asn Met Gly Thr Leu Tyr Ala Arg His Val Asn Thr Gly Ser

130 135 140

Thr Gly Pro Ile Lys Ser Thr Ile Arg Ile Tyr Phe Lys Pro Lys His

145 150 155 160

Val Lys Ala Trp Ile Pro Arg Pro Pro Arg Leu Cys Gln Tyr Glu Lys

165 170 175

Ala Lys Asn Val Asn Phe Gln Pro Ser Gly Val Thr Thr Thr Arg Gln

180 185 190

Ser Ile Thr Ala Met Thr Asn Thr Gly Ala Phe

195 200

<210> 4

<211> 878

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

ccatgggtcc ggttgaagac gctgttaccg ctgctatcgg tcgtgttgct gacaccgttg 60

gtaccggtcc gaccaactct gaagctatcc cggctctgac cgctgctgaa accggtcaca 120

cctctcaggt tgttccgggt gacaccatgc agacccgtca cgttaaaaac taccactctc 180

gttctgaatc taccgttgaa aacttcctgt gccgttctgc ttgcgtttac ttcaccgaat 240

acgaaaactc tggttctaaa cgttacgctg aatgggttgt taccacccgt caggctgctc 300

agctgcgtcg taaactggaa ttcttcacct acatccgttt cgacctggaa ctgaccttcg 360

ttatcacctc tacccagcag ccgtctacca cccagaacca ggacgctcag atcctgaccc 420

accagatcat gtacgttccg ccgggtggtc cggttccgga caaagttgac tcttacgctt 480

ggcagacctc taccaacccg tctgttttct ggaccgaagg taacgctccg ccgcgtatgt 540

ctatcccgtt cctgtctatc ggtaacgctt actctaactt ctacgacggt tggtctgaat 600

tctctcgtaa cggtgtttac ggtatcaaca ccctgaacaa catgggtacc ctgtacgctc 660

gtcacgttaa caccggttct accggtccga tcaaatctac catccgtatc tacttcaaac 720

cgaaacacgt taaagcttgg atcccgcgtc cgccgcgtct gtgccagtac gaaaaagcta 780

aaaacgttaa cttccagccg tctggtgtta ccaccacccg tcagtctatc accgctatga 840

ccaacaccgg tgctttccac caccaccacc accactaa 878

<210> 5

<211> 737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ccatgggtca gacccgtcac gttaaaaact accactctcg ttctgaatct accgttgaaa 60

acttcctgtg ccgttctgct tgcgtttact tcaccgaata cgaaaactct ggttctaaac 120

gttacgctga atgggttgtt accacccgtc aggctgctca gctgcgtcgt aaactggaat 180

tcttcaccta catccgtttc gacctggaac tgaccttcgt tatcacctct acccagcagc 240

cgtctaccac ccagaaccag gacgctcaga tcctgaccca ccagatcatg tacgttccgc 300

cgggtggtcc ggttccggac aaagttgact cttacgcttg gcagacctct accaacccgt 360

ctgttttctg gaccgaaggt aacgctccgc cgcgtatgtc tatcccgttc ctgtctatcg 420

gtaacgctta ctctaacttc tacgacggtt ggtctgaatt ctctcgtaac ggtgtttacg 480

gtatcaacac cctgaacaac atgggtaccc tgtacgctcg tcacgttaac accggttcta 540

ccggtccgat caaatctacc atccgtatct acttcaaacc gaaacacgtt aaagcttgga 600

tcccgcgtcc gccgcgtctg tgccagtacg aaaaagctaa aaacgttaac ttccagccgt 660

ctggtgttac caccacccgt cagtctatca ccgctatgac caacaccggt gctttccacc 720

accaccacca ccactaa 737

<210> 6

<211> 632

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ccatgggttc taaacgttac gctgaatggg ttgttaccac ccgtcaggct gctcagctgc 60

gtcgtaaact ggaattcttc acctacatcc gtttcgacct ggaactgacc ttcgttatca 120

cctctaccca gcagccgtct accacccaga accaggacgc tcagatcctg acccaccaga 180

tcatgtacgt tccgccgggt ggtccggttc cggacaaagt tgactcttac gcttggcaga 240

cctctaccaa cccgtctgtt ttctggaccg aaggtaacgc tccgccgcgt atgtctatcc 300

cgttcctgtc tatcggtaac gcttactcta acttctacga cggttggtct gaattctctc 360

gtaacggtgt ttacggtatc aacaccctga acaacatggg taccctgtac gctcgtcacg 420

ttaacaccgg ttctaccggt ccgatcaaat ctaccatccg tatctacttc aaaccgaaac 480

acgttaaagc ttggatcccg cgtccgccgc gtctgtgcca gtacgaaaaa gctaaaaacg 540

ttaacttcca gccgtctggt gttaccacca cccgtcagtc tatcaccgct atgaccaaca 600

ccggtgcttt ccaccaccac caccaccact aa 632

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：酶标工作液、磁珠悬浮液、样本稀释液、校准品和发光底物液；

磁珠悬浮液包括偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒；

所述重组抗原A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1所示序列；

所述重组抗原B的氨基酸序列包括SEQ ID NO.2所示序列；

所述重组抗原C的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，编码重组抗原A的核苷酸序列包括SEQID NO.4所示序列；

和/或，编码重组抗原B的核苷酸序列包括SEQ ID NO.5所示序列；

和/或，编码重组抗原C的核苷酸序列包括SEQ ID NO.6所示序列。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述柯萨奇B组病毒抗原包括重组抗原A。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒使用活化剂碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化；可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和2.3-2.7mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化，或含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和9.8-10.2mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的活化剂活化；进一步可选地，每100mL磁微粒使用1mL含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的缓冲液活化。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，酶标工作液包括下述终浓度的组分：牛血清白蛋白2-5g/L，新生牛血清80-120mL/L，氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钠4-8g/L，磷酸二氢钠0.4-1g/L和辣根过氧化物酶标记的柯萨奇B组病毒抗原0.8-1.2μg/mL；

和/或，磁珠悬浮液包括下述终浓度的组分：偶联有鼠抗人IgM抗体的磁微粒(以磁微粒的质量计)0.8-1.2mg/mL，其中，1mg磁微粒上偶联有30-50μg的鼠抗人IgM抗体；

和/或，磁微粒为超顺磁性微粒。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，校准品包括梯度稀释的柯萨奇B组病毒IgM抗体；

和/或，样本稀释液为pH值为7.0-7.2的生理盐水；

和/或，发光底物液包括发光底物液A和发光底物液B，发光底物液A包括鲁米诺或鲁米诺钠盐；化学发光底物B液包括过氧化脲。

7.利用权利要求1所述的试剂盒的组分制备磁微粒化学发光法检测柯萨奇B组病毒IgM抗体试剂盒的制备方法。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：将磁微粒用碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化后，加入鼠抗人IgM抗体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，磁珠悬浮液的制备方法包括下述步骤：取100mg磁微粒，磁分离去上清，用10mL偶联缓冲液重悬，磁分离去上清，重复数次，置换磁微粒液体环境；向去上清的磁微粒加入9mL偶联缓冲液重悬，再加入1.0mL新配制的含有浓度为4.80-5.20mg/mL的碳二亚胺和4.80-5.20mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的偶联缓冲液，室温振荡混悬，使磁珠充分活化；磁分离，去上清，用偶联缓冲液重悬，加入3.5-4mg鼠抗人IgM抗体，使磁微粒浓缩液总体积为10mL，2-8℃振荡混悬8-12h；磁分离，去上清，用10mL储存液重悬，室温条件下混匀，再磁分离，去上清，重复数次，清洗磁微粒液体环境中游离抗体；向去上清的磁微粒加入10mL储存液重悬；室温条件下混匀后，使超声，将聚集成团的磁珠分散成单颗粒状态；

室温条件下混匀后，加入储存液90mL，得到所述磁珠悬浮液；

储存液包括下述终浓度的组分：Tris 1-1.3g/L，NaCl 8.5-9g/L，牛血清白蛋白0.8-1.2g/L，pH 7.30-7.50。

10.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括下述步骤：