CN1382989A - 柯萨奇病毒b抗原酶免试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柯萨奇病毒B1－6混合型抗原试剂盒。该试剂盒用CoxB病毒B1－6混合型单克隆抗体包被,免抗CoxB1－6病毒抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体,检测血清中的CoxB病毒B1－6混合型抗原。本发明的试剂盒灵敏度和特异性高。本发明提供了制备方法。

Description

柯萨奇病毒B抗原酶免试剂盒及制备方法

本发明涉及生物技术产品，具体涉及一种柯萨奇病毒(Cox)B1-6混合型抗原试剂盒及制备方法。

柯萨奇病毒B1-6对易感人群具有高度的传染性，儿童是最敏感的人群，病毒流行期儿童的感染率通常为10-20％家庭中所有敏感成员通常都被感染，因此，柯萨奇病毒B感染所致的相关疾病发病率较高，尤其柯萨奇病毒性心肌炎对儿童具有很大威胁和危害。临床的早期诊断和有效治疗有很重要意义。以往柯萨奇病毒B感染和致病的病原学确诊法是病毒分离和心肌荧光染色，但这两种方法的标本采集和处理较复杂，病毒分离和取心肌荧光染色程序烦琐，实验时间很长，于临床确诊越早其疗效越好。因此病毒分离技术和取心肌荧光法的临床早期诊断优势不大。CoxB1-6病毒符合一般病毒感染后抗原和抗体(IgM、IgG)出现规律。病毒(抗原)血症期，首先在患者血中检测到病毒(抗原)，此期可持续1个月左右。病毒(抗原)出现1-2周后，出现CoxB1-6 IgM(可持续1-2周)，而后大约2周出现CoxB1-6-IgG，因此CoxB1-6混合抗原(CoxB1-6Ag)试剂盒能从血清中直接检测病毒是病毒早早期感染和复制的最主要标志。

本发明的目的在于克服以往方法的不足之处，研制一种灵敏度高和特异性高的能直接检测出CoxB1-6型病毒感染诊断试剂盒，可以比CoxB1-6IgM和IgG更早的确诊病原。

本发明提供了一种CoxB1-6-Ag ELISA试剂盒，该试剂盒用CoxB病毒B1-6混合型单克隆抗体包被，兔抗CoxB1-6病毒抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，试剂盒由下列组成：

预包被反应条    48孔/96孔    酶标记液       1瓶(3ml)

样品稀释液      1瓶(6ml)     阳性对照       1支(200μl)

阴性对照        1支(200μl)  20倍浓洗涤液   1瓶(13ml)

显色剂A         1瓶(3ml)     显色剂B        1瓶(3ml)

终止液          1瓶(3ml)

本发明的另一目的是提供了上述柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤：一、原材料及其规格

(一)试剂盒制备用的原料病毒B1-6混合单克隆(Mc)抗体1∶10000阳性对照：诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20

      ℃备用。阴性对照：选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用。酶标抗体：兔抗CoxB1-6病毒IgG-HRP，辣根过氧化物酶，RZ＞3.0

      Sigma进口酶标记兔抗CoxB1-6病毒IgG，双扩散1∶64。其它试剂：

    Na₂CO₃                         A.R

    NaHCO₃                          A.R

    小牛血清                         杭州四季清厂生产

    Na₂HPO₄.12H₂O                 A.R

    NaH₂PO₄.2H₂O                  A.R

    NaCL                              A.R

    Tweel-20                          化学纯

    甘油                              化学纯

    H₂O₂                            A.R

    柠檬酸.H₂O                       A.R

    TMB                               熔点：168℃

    EDTA                              A.R

    H₂SO₄                          A.R

    Tris                              A.R

蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求：

(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)

(2)新西兰大白兔   2公斤左右二、包被抗体(CoxB病毒1-6混合单克隆抗体)的制备。(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源：昆明生物所(2)Hela细胞来源：中科院细胞所(3)细胞传代：①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含：

          牛血清10％

青霉素4万单位

链霉素4万单位

6％NaHCO₃ 4ml

3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分

            散、消化细胞。③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观

       察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分

       瓶培养培养3-5天。(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定。病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微

      量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加

      入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病

      毒的TCID50；病毒的鉴定：应用免疫电镜法及应用中和试验方法(微量滴定法)

病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化：①病毒灭活；②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；④病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的

                分光光度计进行蛋白含量的测定；

(二)CoxB病毒1-6型混合单克隆(Mc)抗体的制备

(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；

(2)SP2/0骨髓瘤细胞培养准备；

(3)细胞融合、筛选、克隆；

(4)单克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗体IgG鉴定，滴度＞10^-6，特异性符合要求。三、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG的制备

用已制备、浓缩和纯化好的CoxB病毒1-6型制备兔抗体IgG

(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐剂钵中研磨乳化。

(2)每只兔颈背部多点皮内注射，每两周1次共5-6次。

(3)双扩散效价达1∶64以上时采集血清。

(4)辛酸法纯化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量。四、酶标记抗体制备

用过碘酸钠法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)。五、兔抗CoxB病毒1-6型抗体IgG浓度测定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000六、预包被抗体板及试剂盒原料的制备(1)包被

Na₂CO₃           0.6g

Na₂HCO₃          1.58g

重蒸水             500ml

加入适量CoxB病毒1-6混合型Mc抗体，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。(2)洗涤

Tris               2.42g

重蒸水             1000ml

加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。(3)封闭

蔗糖               100g

羊血清             25ml

0.1MPBS            1000ml

加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。(4)阳性对照制备

诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装。(5)阴性对照的制备

正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装。(6)酶标记抗体配制

                      30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP  50％0.15MPBS

                      20％甘油

                                    →稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液

小牛血清              30ml

0.15MPBS              50ml

甘油                  20ml

20％Tween-20          2.5ml

调PH至7.2(8)显色剂A

Na₂HPO₄·12H₂O    1.7g

柠檬酸·H₂O         0.5g

3％H₂O₂            200ul

重蒸水               100ml

调PH至5.0(9)显色剂B

EDTA                 17.5mg

柠檬酸.H₂O          0.5g

重蒸水               100ml

加入10mlDMSO   含60mg TMB的溶液25ul(10)终止液

浓H₂SO₄           10ml

蒸馏水               80ml(11)20X洗涤液

Tris                 4.84g

重蒸水               100ml(12)CoxB1-6混合抗原检测流程夹心法如下：

①予包板Mc板

②加待测患者血清

③酶标记兔抗CoxB1-6混合病毒抗体IgG

④加显色剂A、B

⑤450nM波长读O.D值

⑥结果判定七、半成品的检定(1)包被板的检定：CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定：①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定

试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置12个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内。②试剂盒37℃稳定性检定

装配前一星期将兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型IgG-HRP检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用。(3)特异性检定：

用62份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清42份允许出现阳性1份，阳性参比血清20份允许出现阴性1份。

阴性质控血清组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CoxB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清。42份特异性血清应允许1份为阳性。

阳性质控血清20份组成：Y1-20 CoxB1-6抗原阳性血清，20份阳性血清，应允许1份为CoxB1-6抗原阴性，其余19份应检测为阳性。(4)灵敏度检定①组成：L1#按以下稀释度稀释：

1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀：

1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀：

1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准：L1#灵敏度应检测到1∶64L2#灵敏度应检测到1∶128L3#灵敏度应检测到1∶32(5)精密度测定

将同一样品平行加样10孔，其检测值的变异系数小于15％(CV％＜15)。(6)酶标抗体稀释液，显色剂经过37℃细菌培养试验，发现无菌生

长。八、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后GMP车间中超净分

装。(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2

支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，

48T/96T。九、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏。②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰。③药盒试剂(酶标抗体稀释液，显色剂A，显色剂B，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清。(2)稳定性检定：完全同半成品检定(3)特异性检定：完全同半成品检定。(4)灵敏度：完全同半成品检定。(5)精密性：完全同半成品检定。(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库。

3个试剂盒

4℃  2个  隔一个月测定1次

37℃ 1个  第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表。

2个试剂盒留库备查十、保存与有效期

保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为12个月。

柯萨奇病毒于1948年在美国柯萨奇地区分离而得名，属小RNA病毒，分为A、B两组，其中B组病毒(称CoxB1-6病毒)在人类病毒性心肌炎，呼吸道感染等疾病中占有重要地位，为了进一步认识人CoxB1-6病毒感染的特征，特作临床应用。

本发明的柯萨奇B1-6病毒ELISA检测试剂盒经第二军医大学附属长海医院临床结果如下：1.试剂盒：

《CoxB1-6病毒混合型抗原检测试剂盒》和《CoxB1-6混合型抗体IgM检测试剂盒》均由上海新新医学生物工程公司生产、提供。

检测CoxB1-6型混合抗原(Ag)系采用夹心ELISA法，检测CoxB1-6IgM抗体系采用间接ELISA法。2.血清标本：

本院儿科经院患儿148例和体检正常儿童30例的血清标本。3.检测结果3.1.CoxB1-6病毒Ag和抗CoxB1-6IgM阳性检出率见表1

      表1  CoxB抗原和抗CoxB IgM抗体阳性率诊断        例数  CoxB-Ag(+) 阳性率(％)  CoxB IgM抗体(+)  阳性率(％)呼吸道感染  80      19         23.8             31          38.8心肌炎      51      12         23.5             19          37.3非感染疾患  17      0          0                1           5.9正常儿童    30      0          0                0           0

经数据统计分析，呼吸道感染与心肌炎间的CoxB抗原和IgM抗体阳性检出率无明显差异，但这二组的二项指标阳性率明显高于非感染疾患组和正常儿童组，P＜0.01。在病程观察中，发现凡CoxB1-6病毒Ag(+)的血清标本均出现了CoxB1-6病毒IgM抗体阳性，而有部分CoxB1-6 IgM抗体阳性血清抗原检测为阴性，这说明该公司生产的CoxB1-6病毒抗原和抗体检测试剂盒测定结果较可靠。3.2.CoxB1-6病毒Ag持续时间的检测结果见表2

            表2  两组CoxB Ag动态观察结果诊断       例数   ＜2W消失      2-3W消失    ＞3W仍阳性

               n    ％      n    ％      n    ％呼吸道感染  19     12   2       6    31.6    1    5.3心肌炎      12     3    25.0    6    50.0    3    25.0

检测结果显示，大约有一半病例的CoxB1-6病毒Ag阳性，可以在二周内转阴(15/31例，48.4％)，超过3周，仍未转阴的病例占12.9％(4/31)，在呼吸道感染和心肌炎这二种疾病中，前者的2周转阴率明显高于后者，这也与疾病的病程相一致。4.讨论

动物实验资料显示，CoxB1-6病毒感染后2-3天出现病毒血症，15天后血液中病毒开始消退，一个月后消退90％以上。但临床上如何监测CoxB1-6病毒感染状态？CoxB1-6病毒IgM指标能反映有近期感染，对CoxB病毒感染的诊断有价值，但该指标并不能直接说明CoxB1-6病毒是否存在于机体之中。病毒分离和病毒PCR技术因方法复杂，耗时太长以及后者特异性又不甚理想等原因，现一般无法在临床常规中应用，国内也未见有其它检测CoxB1-6病毒Ag试剂盒供应。因此，上海新新医学生物工程公司生产的CoxB1-6病毒Ag和Ab试剂盒为柯萨奇感染性疾病的诊断提供了有效的检测手段。本研究结果显示，在131例心肌炎和呼吸道感染病例中，CoxB1-6病毒Ag(+)31例，阳性率23.7％，而47例非感染患者和正常儿童中，CoxB1-6病毒Ag全部阴性。对CoxB1-6病毒Ag(+)病例的追踪观察结果表明，其中48.4％病例该指标在2周内转阴，持续3周以上仍阳性的病例占12.9％。心肌炎与呼吸道感染相比较，前者的CoxB1-6病毒Ag二周内转阴率明显比后者低，这与疾病的病程规律相符。检测结果说明上海新新医学生物工程公司生产的CoxB1-6病毒Ag和IgM抗体ELISA试剂盒质量较好。

经第二军医大学附属长征医院临床结果如下：一、材料和方法1.标本

本院儿科住院病人172例，其中心肌炎30例，上呼吸道感染29例，下呼吸道感染113例。2.试剂盒

《柯萨奇B1-6Ag和IgM抗体ELISA试剂盒由上海新新医学生物工程公司生产提供。检测CoxB1-6病毒Ag为ELISA夹心法，检测CoxB1-6病毒IgM为ELISA间接法。按试剂盒说明书严格操作。3.统计学处理：

组间阳性率显著性比较采用X2检验。二、结果：1.心肌炎病例中CoxB1-6病毒阳性例数见表3

表3

	CoxB1-6病毒IgM
				CoxB1-6Ag	+-	+     -3     77     13	合计1020
	合计	10    20	30

如表1所示，在30例心肌炎病例中，检测血清CoxB1-6病毒IgM抗体(+)者10例，血清CoxB1-6病毒Ag(+)者也是10例，因此，CoxB1-6病毒抗原和抗体的阳性率各为33.3％，但CoxB1-6病毒Ag(+)CoxB1-6病毒IgM(-)及CoxB1-6病毒Ag(-)CoxB1-6病毒IgM(+)者各有7例，由此，CoxB1-6病毒抗原或抗体一项以上阳性的病例共17例(56.5％)，这17例可确诊为病毒性心肌炎。呼吸道感染CoxB1-6病毒Ag和IgM的阳性检出率见表4

表4呼吸道感染CoxB1-6病毒Ag和抗体IgM阳性检出率诊断          例数    CoxB1-6  Ag   CoxB1-6  IgM    共同(+)  ％    一项以  ％

                  (+)      ％    (+)      ％                    上(+)上呼吸道感染   29     8       27.6   10       34.5   4       13.8    14    48.3下呼吸道感染   113    23      20.4   40       35.4   10      8.8     53    46.9X2                    0.7            0.008           0.63            0.017P                     ＞0.05         ＞0.05          ＞0.05          ＞0.05

表4中说明，在上、下呼吸道感染中有48.3％和46.9％病例伴有CoxB1-6病毒感染，且它们各有27.6％和20.4％的病例血清中CoxB1-6病毒Ag(+)，但两组的各项阳性率经X2检验处理，差异均不显著。三、讨论

1.从表3和表4可以看出，心肌炎和呼吸道感染中均存在部分CoxB1-6病毒Ag(+)而CoxB1-6病毒IgM(-)的病例，因此CoxB1-6病毒Ag的检测使CoxB1-6病毒感染的诊断的正确性更加提供，在30例心肌炎病例中，若单检测CoxB1-6病毒IgM指标，其阳性率为33.3％，同时再检CoxB1-6病毒Ag指标，使CoxB1-6病毒感染的总阳性率为56.6％，同样对上下呼吸道感染。CoxB1-6病毒IgM(+)各为34.5％和35.4％，而结合CoxB1-6病毒Ag指标，CoxB1-6病毒感染的阳性率各为48.3％和46.9％。国内尚未见有其它公司生产CoxB1-6病毒Ag检测试剂盒。因此，上海新新医学生物工程公司研制的CoxB1-6病毒Ag试剂盒对研究CoxB1-6病毒在多种疾病的发病机理有重要意义。

2.呼吸道感染属急性感染性疾病入院较早，病程较短，但在上下呼吸道感染中各有34.5％和35.4％已出现CoxB1-6病毒IgM(+)，但此时同时存在CoxB1-6病毒Ag(+)只有13.8％和8.8％，也即各有20.7％和26.6％是处于CoxB1-6病毒IgM(+)而CoxB1-6病毒Ag(-)，由此可推断在柯萨奇感染中CoxB1-6病毒的病毒血症期较短。

3. 80年代以来，呼吸道合胞病毒已替代腺病毒成为小儿呼吸道感染的首位病毒病原体，其它常见的呼吸道病毒是流感，副流感和鼻病毒等。但近年来研究小儿呼吸道感染的病毒谱已远远超出上述范围，国内已有急性上呼吸道炎合并CoxB1-6病毒感染的报导，而对下呼吸道感染与CoxB1-6病毒关系的研究较少，在血液中检测到CoxB1-6病毒Ag或CoxB1-6病毒IgM均可视为CoxB1-6病毒感染，本组142例上下呼吸道感染中的阳性率各为48.3％和46.9％，提示CoxB1-6病毒感染在小儿呼吸道感染中占有重要地位。

经上海华东医院临床结果如下：

1998年4月至2000年3月期间我们使用上海新新医学生物工程公司的CoxB1-6病毒Ag和CoxB1-6IgM抗体酶标试剂盒对852例门诊和住院病例进行了血清CoxB1-6病毒检测，结果见表5和表6。

         表5 CoxB1-6病毒抗原和抗体检测阳性率诊断         例数  CoxB1-6Ag(+)  (％)    CoxB1-6IgM(+)  (％)上感          72       24         33.3       21         29.2急性支气管炎  48       12         25.0       10         20.8慢性支气管炎  90       3          3.3        18         20.0支气管肺炎    35       8          22.8       11         31.4肝炎          27       1          4.2        5          18.5冠心病        112      4          3.6        20         17.9心律失常      75       0          0          8          10.7高血压        83       1          1.2        7          8.4糖尿病        47       0          0          2          4.2脑血管意外    21       0          0          1          4.8其它疾病      24.2     11         4.5        18         7.4合计          852      64         7.5        121        14.2

        表6  同份血清CoxB1-6Ag和CoxB1-6 IgM阴阳性分析诊断         例数   Ag(+) (％)   Ag(+)  (％)   Ag(-) (％)  总阳性数  (％)

               IgM(+)       IgM(-)        IgM(+)上感          72     15   20.8    9     12.5    6     8.3     30    41.7急性支气管炎  48     8    16.7    4     8.3     2     4.2     14    29.2慢性支气管炎  90     3    3.3     0     0       15    16.7    18    20.0支气管肺炎    35     5    14.3    3     8.5     6     17.1    14    40.0肝炎          27     1    3.7     0     0       4     14.8    5     18.5冠心病        112    3    2.6     1     0.89    17    15.2    21    18.8分析和评价：

1.CoxB1-6病毒Ag和IgM阳性是CoxB1-6病毒现行感染的指标，表5结果说明多种疾病同时伴有CoxB1-6病毒感染，尤其是感染性疾病同时伴发CoxB1-6感染的阳性率较高，非感染性疾病出现CoxB1-6感染的阳性率较低。

2.急性感染性疾病的CoxB1-6Ag阳性率与CoxB1-6 IgM阳性率接近、如上感、急性气管炎和急性支气管肺炎。而对病程较长的疾病，CoxB1-6Ag阳性率明显低于CoxB1-6IgM阳性率。

3.在急性感染性疾病中，由于发病较早，病程较短，故有部分病例出现CoxB1-6Ag(+)而CoxB1-6IgM(-)，如上感、急性支气管炎和支气管肺炎，这种情况的阳性率分别为12.5％、8.3％和8.5％，使CoxB1-6病毒的总阳性率高于CoxB1-6Ag及CoxB1-6IgM单项阳性率，而对病程较长的疾病，CoxB1-6Ag(+)而CoxB1-6IgM(-)的阳性率几乎接近于0；也即入院检测时，CoxB1-6病毒已经消失，使CoxB1-6病毒的总阳性率不明显高于CoxB1-6IgM单项阳性率，由此提示，CoxB1-6Ag的检测对急性感染性疾病的诊断较重要，而对慢性疾病意义不大。

4.国内尚未见，其它公司有CoxB1-6Ag检测试剂盒，而上海新新公司生产的该试剂盒，在急性感染性疾病中阳性率较高，而在慢性感染性疾病以及非感染性疾病中的阳性率很低，表5中有3种疾病计143例阳性率为0，这说明该试剂盒的特异性较好，对CoxB病毒感染的诊断有很高的价值。

本申请的柯萨奇病毒B1-6抗原ELISA试剂盒。其检测方法简便快速，收费低廉，灵敏度和特异性均较高，可以直接检测出CoxB1-6型病毒，它是柯萨奇病毒B感染疾病早早期诊断的鉴别诊断的可靠病原学指标，对于越早明确病原治疗效果越好的CoxB病毒感染，临床应用价值较CoxB-IgM和CoxB-IgG试剂盒更高，有明显的社会和经济效益。

实施例检测CoxB1-6混合型抗原试剂盒的制备。一、主要原材料

1.Hela细胞                            中科院细胞所

2.Na2HPO4.12H2O                       上海新华化工厂

3.Nacl                                上海试剂一厂

4.Kcl                                 江苏常熟化工厂

5.Cacl2                               江苏常熟化工厂

6.葡萄糖                              成都化学试剂厂

7.EDTA                                上海试剂一厂

8.水解乳蛋白                          上海试剂二厂

9.谷氨酸                              上海试剂二厂

10.谷氨酰胺                           上海化学试剂分装厂

11.L赖氨酸                            上海生化所

12.L精氨酸L组氨酸L蛋氨酸上海试剂二厂

13.小牛血清                           杭州四季青生物材料工程公司

14.胰蛋白酶                           美国Sigma公司

15.氯化铯                             美国Sigma公司

16.辣根过氧化物酶                     美国Sigma公司

17.TMB                                上海东风试剂厂

18.高碘酸钠                           上海化学试剂分装厂

19.硼氢化钾                           上海试剂一厂

20.酶标板                             华东理工大学新分离技术研究室二、CoxB1-6包被病毒抗体的制备(一)CoxB1-6病毒抗原的制备1.CoxB病毒1-6型毒种来源：昆明生物所2.Hela细胞来源：中科院细胞所3.细胞传代：①培养剂配制：

PRMI1640基础培养剂过滤除菌，200ml基础培养剂中含：

      牛血清      10％

      青霉素      4万单位

      链霉素      4万单位

      6％NaHCO3   4ml

      3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制：

用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞。③细胞传代：

将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，即倒去DT，加入营养液后，分瓶培养3-5天。4.病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞，至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定：

用10倍的倍比稀释方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50，本法培养病毒效价为TCID50＞10-5。病毒的鉴定：

A.应用免疫电镜法；

B.应用中和试验方法(微量滴定法)

病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(二)抗原的制备、浓缩和纯化：

1.病毒灭活；

2.去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；

3.初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；

4.病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；(三)CoxB病毒1-6型混合单克隆(MC)抗体的制备；

1.CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；

2.SP2/0骨髓瘤细胞培养，准备；

3.细胞融合(瘤细胞与Balb/C小鼠融合)筛选，克隆得MC-IgG；

4.单克隆鼠抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG鉴定，滴定＞10^-6，

特异性符合要求。三、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG制备①1mg/ml CoxB1-6混合抗原加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。②每只兔颈背部多点注射3mg抗原，2周—1个月1次，共5-8次，双扩效价达1∶64以上时采集血清。③辛酸法纯化CoxB1-6混合抗原抗血清IgG部份，蛋白定量。四、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG酶标记物的制备。1.称5mg辣根过氧化物酶加0.5ml蒸馏水，再加0.5ml 60mM过碘酸钠液氧化15’4℃中。2.加0.16M乙二醇0.5ml中止氧化，4℃30’。3.加10mg/ml兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG 0.5ml，装袋对碳酸钠缓冲液透析过夜。4.加5mg/ml硼氢化钾0.2ml，4℃3h再装透析袋对PH7.2 0.01M PBS透析24h，换液4-5次。5.取出兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG-HRP作工作浓度测定，配成1mg/ml浓度时的工作效价为1∶2000。五、阴，阳性对照血清配制。

从病毒攻击的细胞保护试验筛选阴性和阳性对照血清，并将阴阳性血清定值。六、显色剂配制

A液：1.各称磷酸氢二钠18.4克，柠檬酸5克，PM50mg放入容量瓶中，加双蒸水至1000ml，搅拌溶解后再加30％双氧水400ul。2.过滤除菌后分装小瓶。

B液：1.称EDTA150mg加入1000ml双蒸水中，加热溶解。2.上液冷却后加柠檬酸1.05克，再加用二甲亚砜溶解的TMB250mg。3.分装入黑色小瓶中备用。七、CoxB1-6混合抗原检测方法的建立1.CoxB1-6病毒混合McAb包被用20mM Tris-Hcl液稀释CoxB1-6病毒混合Mc IgG为1∶1000浓度，各反应微孔中加0.1置4℃中24h，弃去上清液，拍干；2.取出已包被条孔，插入支架上，用胶布固定，以防脱落；3.各孔中分别加待检血清50μl，同时做阳性对照1孔，阴性对照1孔(各加50μl)，空白对照1孔(孔含蒸馏水100μl)；除空白对照孔外每孔滴加酶标记液1滴(50μl)，置37℃中反应1小时。4.取出反应板甩去孔内液体先在草纸上拍2-3下，然后用洗涤液洗5次，每次加满后停留30分钟，每次甩去洗涤液后都要在草纸上拍干，以便洗涤彻底(10倍浓洗涤液1ml+9ml蒸馏水即为工作浓度)。5.各孔滴加显色剂A、B各1滴，置37℃中反应10-15分钟再每孔

滴加终止液1滴，置酶标仪中450nm波长读数；6.结果判定：阴性对照A值×2.5＝临界值，凡待检标本孔A值大于临

界值即为阳性。阴性对照小于0.08按0.08计算；八、灵敏度、特异性精密度试验和稳定性试验1.灵敏度测定

将细胞中和实验中滴定为效价64u/0.1ml(640u/ml)，16u/0.1ml(160u/ml)及2u/0.1ml(20u/ml)的3份阳性血清用样品稀释液作不同浓度的稀释后，按实验操作方法作灵敏度测定，结果如下：方法灵敏度测定：检测                             抗体效价(u/ml)血清      640     320  160   80    40    30    20    15    10    5     2.5阳性血清1 ＞2*    ＞2  1.91  1.53  1.06  0.63  0.41  0.27  0.15  0.11  0.08阳性血清2              ＞2   1.88  1.72  1.13  0.93  0.64  0.41  0.24  0.13阳性血清3                                0.63  0.44  0.29  0.16  0.09  0.07*450值阴性血清测定值：

1       2       3       4       5       6

0.09    0.08    0.10    0.07    0.09    0.11

A阴性平均值为0.09，阳性临界值＝0.09×2.5＝0.225

则本检测方法对3份阳性血清的检测灵敏度分别为15u/ml，5u/ml和15u/ml，平均为11.7u/ml2.特异性测定：

将细胞中和实验中判为阴性的血清20份按实验操作方法测定，结果如下：待检血清测定值：1     2     3     4     5     6     7     8     9     100.07  0.13  0.08  0.07  0.12  0.11  0.14  0.06  0.05  0.1111    12    13    14    15    16    17    18    19    200.04  0.09  0.10  0.08  0.07  0.05  0.07  0.12  0.11  0.09

用6份小牛血清液按实验操作方法测定的A值分别为：

     0.10    0.11    0.09    0.10    0.04    0.07

平均值为0.085  阳性临界值＝0.085×2.5＝0.213

则上面20份细胞中和实验阴性血清用本ELISA法测定也全部阴性，特异性100％。3.精密度测定

取实验吸光度分别为高中低A值的3份阳性血清做精密度试验，批内试验为每份血清同时做10个复孔，批间试验为每份血清间隔2-3天，实验1次，共测定6次，结果如下：

批内试验：

1     2     3     4     5     6     7     8     9     10    X      S      CV(％)1  1.27  1.30  1.25  1.24  1.31  1.25  1.23  1.32  1.26  1.33  1.276  0.036   2.82  0.76  0.65  0.66  0.68  0.71  0.73  0.70  0.69  0.74  0.77  0.709  0.041   5.73  0.36  0.38  0.36  0.37  0.37  0.41  0.35  0.40  0.37  0.34  0.371  0.021   5.7

平均批间CV＝4.73％批间试验：

1       2       3       4       5       6       X      S        CV(％)1  1.29    1.40    1.10    1.30    1.32    1.15    1.26   1.113     8.92  0.77    0.62    0.65    0.81    0.73    0.61    0.715  0.071     103  0.35    0.40    0.37    0.34    0.33    0.40    0.365  0.030     8.3

平均批间CV＝9.1％

4.CoxB1-6混合型抗原三批试剂盒置37℃温箱中保存的稳定性试验。

第980519批试剂盒

A450	0天	一天	二天	三天	四天	五天	六天	七天
									药盒阴性对照药盒阳性对照	0.0710.803	0.0680.808	0.0660.801	0.0630.789	0.0600.785	0.0590.768	0.0510.761	0.0480.761

第980603批试剂盒

A450	0天	一天	二天	三天	四天	五天	六天	七天
									药盒阴性对照药盒阳性对照	0.0780.852	0.0700.847	0.0710.838	0.0650.830	0.0630.823	0.0580.814	0.0550.801	0.0540.789

第980615批试剂盒

A450	0天	一天	二天	三天	四天	五天	六天	七天
									药盒阴性对照药盒阳性对照	0.0751.126	0.0741.130	0.0701.128	0.0681.101	0.0650.987	0.0660.975	0.0630.971	0.0640.965

CoxB病毒1-6型混合抗原试剂盒的灵敏度高、特异性好、精密度高和稳定性好。

Claims (2)

1.一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒用CoxB病毒B1-6混合型单克隆抗体包被，兔抗CoxB1-6病毒抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，试剂盒由下列组成：

预包被反应条    48孔/96孔     酶标记液         1瓶(3ml)

样品稀释液      1瓶(6ml)      阳性对照         1支(200μl)

阴性对照        1支(200l)     20倍浓洗涤液     1瓶(13ml)

显色剂A         1瓶(3ml)      显色剂B          1瓶(3ml)

终止液          1瓶(3ml)

2.一种如权利要求1所述的一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：一、包被抗体(CoxB病毒1-6混合单克隆抗体)的制备(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源：昆明生物所(2)Hela细胞来源：中科院细胞所(3)细胞传代：①培养剂配制：PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含：

          牛血清10％；

青霉素4万单位

链霉素4万单位

6％NaHCO₃ 4ml

3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制：用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分

            散、消化细胞；③细胞传代：将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观

        察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分

        瓶培养培养3-5天；(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定：①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次；②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时；③补充培养液，在37℃培养；④逐日观察细胞：至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒；⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定；病毒滴定：用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微

      量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加

     入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病

     毒的TCID50；病毒的鉴定：应用免疫电镜法及应用中和试验方法(微量滴定法)

病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时；然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变；是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化：①病毒灭活；②去除病毒碎片：用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯：用PEG方法进行提纯；④病毒的进一步纯化：用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的

                分光光度计进行蛋白含量的测定；(二)CoxB病毒1-6型混合单克隆(Mc)抗体的制备(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；(2)SP2/0骨髓瘤细胞培养准备；(3)细胞融合、筛选、克隆；(4)单克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗体IgG鉴定，滴度＞10^-6，特异性符合要求；二、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG的制备

用已制备、浓缩和纯化好的CoxB病毒1-6型制备兔抗体IgG(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐剂钵中研磨乳化；(2)每只兔颈背部多点皮内注射，每两周1次共5-6次；(3)双扩散效价达1∶64以上时采集血清；(4)辛酸法纯化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量；三、酶标记抗体制备

用过碘酸钠法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)；四、兔抗CoxB病毒1-6型抗体IgG浓度测定

采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000五、预包被抗体板及试剂盒原料的制备(1)包被

Na₂CO₃     0.6g

Na₂HCO₃    1.58g

重蒸水             500ml

加入适量CoxB病毒1-6混合型Mc抗体，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干；

(2)洗涤

Tris               2.42g

重蒸水             1000ml

加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原；

(3)封闭

蔗糖               100g

羊血清             25ml

0.1MPBS           1000ml

加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃；

(4)阳性对照制备

诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装；

(5)阴性对照的制备

正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装；

(6)酶标记抗体配制

                      30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP  50％0.15MPBS

                      20％甘油

                                  →稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液

小牛血清          30ml

0.15MPBS          50ml

甘油              20ml

20％Tween-20      2.5ml

调PH至7.2(8)显色剂A

Na₂HPO₄·12H₂O 1.7g

柠檬酸·H₂O       0.5g

3％H₂O₂         200μl

重蒸水             100ml

调PH至5.0(9)显色剂B

EDTA                 17.5mg

柠檬酸.H₂O          0.5g

重蒸水               100ml

加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25μl(10)终止液

浓H₂SO₄            10ml

蒸馏水               80ml(11)20X洗涤液

Tris                 4.84g

重蒸水               100ml(12)CoxB1-6混合抗原检测流程夹心法如下：

①予包板Mc板

②加待测患者血清

③酶标记兔抗CoxB1-6混合病毒抗体IgG

④加显色剂A、B

⑤450nM波长读O.D值

⑥结果判定六、半成品的检定(1)包被板的检定：CV(％)＜10％(n-10)(2)稳定性检定：①阴性对照和阳性对照+4℃-+8℃的稳定性检定

试剂盒内设定阴性对照及阳性对照均+4℃-+8℃放置12个月，再用该试剂盒测定吸光度在正常范围内；②试剂盒37℃稳定性检定

装配前一星期将兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP(1+100)(同一批CoxB病毒1-6型IgG-HRP检测一次)置37℃，并于第1天，第3天，第5天，第7天各测定一次，并用兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP置-20℃作对照，测得质控血清7天基本不变，则可以使用；(3)特异性检定：

用62份质控参比血清来检测半成品，阴性参比血清42份允许出现阳性1份，阳性参比血清20份允许出现阴性1份；

阴性质控血清组成：T1-3：HAV抗体阳性血清，T4-6：HCV抗体阳性血清：T7-9：HEV抗体阳性血清，T10-14：HBV表面抗体阳性血清，T15-24：CoxB-IgM阴性血清，T25-27：类风湿因子阳性血清，T28-30：TB阳性血清，T31-33EBV阳性血清，T34-36CMV阳性血清，T37-39Hopl阳性血清，T40-42抗核抗体阳性血清；42份特异性血清应允许1份为阳性；

阳性质控血清20份组成：Y1-20 CoxB1-6抗原阳性血清，20份阳性血清，应允许1份为CoxB1-6抗原阴性，其余19份应检测为阳性；(4)灵敏度检定①组成：L1#按以下稀释度稀释：1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024L2#按以下稀释度稀：1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，1∶2048L3#按以下稀释度稀：1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512②判断标准：L1#灵敏度应检测到1∶64L2#灵敏度应检测到1∶128L3#灵敏度应检测到1∶32(5)精密度测定

将同一样品平行加样10孔，其检测值的变异系数小于15％(CV％＜15)；(6)酶标抗体稀释液，底物液经过37℃细菌培养试验，发现无菌生

长；七、试剂盒组装(1)上述制备步骤所用试剂用过滤器除菌过滤后GMP车间中超净分装；(2)试剂盒必需有外包装盒，海棉垫，塑料瓶6瓶，eppenkof管2支，包被板，说明书，内标签纸9张，外标贴纸1张，批号lot/EXP，48T/96T；八、成品检定(1)物理检查①药盒外包装，标签，批号，规格(48T/96T)有无遗漏；②药盒内试剂瓶完整无渗漏，试剂瓶数和说明书无欠缺，标签完整，有效期应清楚明晰；③药盒试剂(酶标抗体稀释液，底物液甲，底物液乙，洗涤液)核对PH值及溶液是否澄清；(2)稳定性检定：完全同半成品检定(3)特异性检定：完全同半成品检定；(4)灵敏度：完全同半成品检定；(5)精密性：完全同半成品检定；(6)抽样合格后，留下5个试剂盒剩余入库；3个试剂盒4℃ 2个  隔一个月测定1次37℃1个  第一次隔三天测定1次，以后每星期测定1次，记录数据，绘制图表；

2个试剂盒留库备查九、保存与有效期

保存于2-8℃，自检定后合格之日起有效期为12个月；