CN1153971C - 沙门氏菌抗原制剂和测定沙门氏菌抗体的试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌抗原制剂和测定沙门氏菌抗体的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种沙门氏菌抗原制剂，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖蛋白结合物，并且涉及一种用于抗肉汁、血清、蛋黄样品或者其它液体中样品的沙门氏菌抗体的检测试剂盒，它与一种免疫学方法，特别是异源的酶联免疫吸附试验结合使用。这里固相载体上附着了本发明中的用于与抗体免疫反应的沙门氏菌抗原制剂。

Description

沙门氏菌抗原制剂和测定沙门氏菌抗体的试剂盒
本发明涉及一种沙门氏菌抗原制剂和一种测定肉汁、血清、蛋黄样品或其它液体中沙门氏菌的抗体的试剂盒，它与一种免疫学测定方法，特别是异源性酶联免疫吸附试验结合使用。
人类的沙门氏菌源疾病特别是由污染的食品所引起。除了针对确定的动物或人的病原体之外，许多血清型可在人或动物体内诱发沙门氏菌病或感染。在兽医学、人类医学、食品监督和畜牧业领域，由于病例众多，为了保护消费者，越来越需要能快速准确地检测沙门氏菌的方法。检测和分析沙门氏菌有多种已知的方法，例如，在各种不同的培养基上培养细菌。利用在固体选择性培养基上进行选择增殖，可以进行血清型分类。这种方法总共要持续4-5天。
目前已知，应用免疫学测定方法，特别是异源性酶联免疫吸附试验也可以检测沙门氏菌抗体(Enzyme-linked immunosorbent assay forSalmonella serology using lipopolysaccharide antigen，J.Vet.Diagn.Invest.7：481-487(1995)；Bradford P.Smith，George W.Dilling，John K.House，Hans Konrad，Nadia Moore)。这里，一种沙门氏菌抗原被包被于微量反应板上。在对已包被在凹孔内的样品进行温育的过程中，特异性沙门氏菌抗体与抗原构成复合物。没有结合的物质经洗涤除去。抗结合抗原的抗体的酶标二抗与结合抗原的抗体相结合，而未被结合的复合物经洗涤除去。添加显色剂(底物)后，与抗体结合的酶导致显色反应(底物转化)。利用分光光度法，显色反应可以用于测定与显色反应呈比例关系的沙门氏菌抗体在样品中的含量。
在此使用脂多糖(LPS)，特别是鼠伤寒杆菌(STM)和猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌脂多糖(LPS)作为沙门氏菌抗原。这种沙门氏菌抗原难以固定于微量反应板，尤其难以达到自动化检测方法的要求。当附着的沙门氏菌抗原不足量或活性降低时，常要求检测板在检测前新鲜包被。为此，这种测定方法需要增加至少两天的时间。此方法的缺点是阳性对照的STM或SCS抗原与SCS及STM-LPS抗原的交叉反应高于30％。
经Kauffmann-White沙门氏菌血清型分类鉴定系统分类的血清型已知超过2000，因此使用现有技术难于进行诊断。根据诊断目的的不同，检测范围既可以尽可能广，如猪群的血清学检验；又可以仅注重某些血清型的检测，如在家禽中只需检测或排除鼠伤寒杆菌、肠沙门氏菌和鸡败血病杆菌-鸡腹泻杆菌。对应O抗原的沙门氏菌的脂多糖抗原用于酶联免疫吸附试验时必须附着在固相载体上，载体通常为微量反应板。然而，与固定蛋白质相比，酶联免疫吸附法固相载体固定脂多糖(LPS)的能力较差，包被较不均匀且较不稳定。当将不同的脂多糖制品附着在载体上时，置换、竞争性抑制、交叉反应或者抗原脱附都可使脂多糖本来就不好的附着性能更差，并且更难用于诊断性检验系统，或者几乎无法进行某些应用。
本发明旨在为各种沙门氏菌属血清型的血清学或免疫学检验，特别是抗沙门氏菌抗体的检测提供改良的试剂和方法。
根据本发明，当将含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-蛋白结合物的沙门氏杆菌抗原制剂和用于肉汁、蛋黄、血清样品中沙门氏菌抗体检测的试剂盒与异源性酶联免疫吸附试验结合使用时，前述宗旨可以得以实现。本发明中的沙门氏菌抗原被包被于载体之上用于待测抗体的免疫反应。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-血清白蛋白结合物。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-蛋白结合物，和至少另一种肠沙门氏菌的抗原制品或脂多糖制品。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有一种标准鼠伤寒杆菌(STM)的沙门氏菌抗原和一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有一种鼠伤寒杆菌的脂多糖-酪蛋白结合物、一种鼠伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌的脂多糖-酪蛋白结合物的脂多糖制剂组成的沙门氏菌抗原混合物。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原，以及鼠伤寒杆菌(STM)-LPS-血清白蛋白结合物，而且，SCS与STM脂多糖血清白蛋白结合物的比例为1∶10至1∶200。
所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，沙门氏菌-脂多糖-血清白蛋白结合物是沙门氏菌-LPS-牛血清白蛋白的结合物。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-血清白蛋白结合物的沙门氏菌抗原制剂。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物的沙门氏菌抗原制剂。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物和至少另一种肠沙门氏菌的抗原制品或脂多糖制品的沙门氏菌抗原制剂。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种标准鼠伤寒杆菌(STM)，以及标准猪霍乱杆菌(SCS)的脂多糖-血清白蛋白结合物构成的沙门氏菌抗原混合物。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种鼠伤寒杆菌的LPS-酪蛋白结合物，以及鼠伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌LPS-酪蛋白结合物的脂多糖制剂组成的沙门氏菌抗原混合物。
所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原，以及鼠伤寒杆菌(STM)脂多糖血清白蛋白结合物，而且SCS与STM脂多糖血清白蛋白的结合物的比例为1∶10至1∶200。
所述的试剂盒，其特征在于，沙门氏菌-脂多糖-血清白蛋白结合物是沙门氏菌LPS牛血清白蛋白的结合物。
所述的试剂盒，其特征在于，为了检验猪的样品中的抗沙门氏菌抗体，酶标二抗是一种抗猪免疫球蛋白-酶结合物。
所述的试剂盒，其特征在于，为了检验鸡的样品中的抗沙门氏菌抗体，酶标二抗是一种抗鸡免疫球蛋白过氧化酶结合物。
所述的试剂盒，其特征在于，使用由兽医监管的沙门氏菌阳性和阴性动物的对照血清作为对照血清。
用本发明的沙门氏菌抗原制剂可以产生非常良好附着力，固定于诊断用固相载体之上。通过偶联蛋白，蛋白质优越的附着性能转移到蛋白质上的沙门氏菌脂多糖，它们本身因附着性能不佳而不太适应于包被在诊断用固相载体上。因而，微量反应板上脂多糖抗原的包被稳定、均匀且灵敏。同时也发展了既可满足经典的沙门氏菌血清学要求，又可满足随任务不同而不同的抗沙门氏菌血清型抗体的检测要求的诊断系统。除了单独使用一种改性的偶联于蛋白的沙门氏菌LPS之外，还可以结合其它的沙门氏菌-LPS-蛋白结合物，和/或沙门氏菌抗原制品，并可同时与其它的细菌制品结合使用，例如LPS-蛋白与其它革兰氏阴性细菌的结合物。鉴于Kauffmann-White沙门氏菌血清型分类鉴定系统中列举的沙门氏菌属O-抗原的多样性和由此产生的诊断目的的多样性，可以为每个应用目的选出适宜的抗原组合，其单个成分或者组成可以偶联于本发明中的蛋白并附着于固相载体，从而可应用于诊断系统。在免疫测定试验系统中，由于其优越的特性，偶联在蛋白上的脂多糖结合物可以在固相载体上形成具有结合性的、均匀、灵敏、稳定的包被。
在本发明的一个优选实施例中，载体上附着了一种STM-LPS与牛血清白蛋白(BSA)结合物，和一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原。在此，根据本发明，当STM-LPS与BSA的偶联之比为1∶0.5至1∶3，且SCS与STM-LPS-BSA结合物的比例是1∶10至1∶200时，附着性最佳。
令人吃惊的是，本发明中的沙门氏菌抗原制剂除了具有优秀的附着特征之外还具有高存放稳定性。本发明中的沙门氏菌制剂无交叉反应性，并且，例如利用基于一种标准鼠伤寒杆菌(STM)的沙门氏菌抗原和一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原而形成的沙门氏菌-LPS-血清白蛋白结合物，可检验出至少90％最常见的已证实的血清型。本发明中的沙门氏菌抗原制剂在载体(如ELISA试验中的微量反应板)上附着非常良好。可以预制准备用于分析的载体，以令使用者省去包被过程。
在本发明的一个优选实施例中，载体上附着了一种STM-LPS与牛酪蛋白的结合物和一种STM-LPS。这里，根据本发明，当STM-LPS与牛酪蛋白的偶联比为1∶0.5至1∶3且STM-LPS的蛋白结合物与STM-LPS之比为1∶1时，附着性能十分良好。抗原制剂的这种特殊组成使抗与禽类相关的血清型肠沙门氏菌、鼠伤寒杆菌及鸡败血病杆菌-鸡腹泻杆菌的抗体的同时检验成为可能，且它对微量反应板的附着非常好，预制的微量反应板存放稳定性也很良好。
本发明中预制的检验系统可以按需要进行储存和使用，也可以如医学和农业领域内所要求的那样用高的样品数进行广泛的检查(筛选)。
除了包被了本发明中的沙门氏菌抗原制剂的载体之外，本发明的试剂盒还含有：各种对照血清、洗涤缓冲浓缩液、稀释缓冲液、酶标二抗、以及相应的底物和终止液。当检验抗猪血清沙门氏菌的抗体时，酶标二抗优选一种抗-猪免疫球蛋白-过氧化酶结合物，当检验抗鸡血清中沙门氏菌的抗体时，酶标二抗优选一种抗-鸡免疫球蛋白-过氧化酶结合物，并且用N-四甲基联苯胺(TMB)作底物溶液，用盐酸稀溶液作终止液。
STM/SCS沙门氏菌抗原由沙门氏菌培养得到，方法根据：Appelmelk，B.J.等，J.of Immunolog.Methods，82(1985)：199-207“An Enzyme-linked Immunosorbent Assay(ELISA)for the measurementof Antibodies to different parts of the gram-negative LipopolysaccharideCore Region”。然后，根据Galanos，C.，E.T.Rietschel，O.Luderitz，O.Westphal，1972，Eur.J.Biochem.31，230.所述的方法，把这种沙门氏菌-LPS与一种血清白蛋白偶联成沙门氏菌-LPS-血清白蛋白结合物。
通过在缓冲液中与本发明的抗原制剂温育，并利用一种蛋白质溶液封闭游离的结合位点，可以实现载体(如微量反应板)的包被。把如此制备的载体洗涤后干燥。
对照血清可以用沙门氏菌阳性和沙门氏菌阴性的无交叉反应的血清。沙门氏菌的抗体的检测特别优选将经野外感染或者疫苗接种免疫的沙门氏菌阳性动物的血清作为对照。
使待检验的样品与经本发明中的沙门氏菌抗原制剂包被的载体相接触。温育样品时，特异性的抗沙门氏菌的抗体在已包被的凹孔中与抗原构成复合物。未结合物通过吸取或者振荡并用洗涤缓冲液洗涤除去。接着，加入酶标二抗，未结合的酶标二抗通过吸取或甩出后用洗涤缓冲液洗涤除去。加入N-四甲基联苯胺(TMB)作底物，结合于抗体上的酶导致颜色变化(底物转换)。利用分光光度法，此颜色反应可用于测定样品中沙门氏菌的抗体的量，且与之成比例。
为了比较，用对照血清进行试验，并且把测得的对照血清的吸光度与其已知的浓度进行比较。以此为基础，借助计算出的回归线，利用测得的样品吸光度可计算出样品中沙门氏菌的抗体的浓度。或者，借助对照血清，用预定的截止公式算出阳性、阴性或者未知样品中抗原的含量。
借助于下面的实施例详细地说明本发明：
实施例1
制备抗原制剂和固相载体，并用于猪抗沙门氏菌的抗体的检测试剂盒
制备沙门氏菌-LPS-抗原
1.需要的沙门氏菌属血清型鼠伤寒杆菌和猪霍乱杆菌(可从Robert Koch-Institute，Federal Institute for Infections Diseases and Non-Infections Diseases，National Reference Center for Salmonella and OtherEnteritis Pathogens，P.O.Box 38843 Wernigerode得到)培养物可各自在50升的发酵器中经37℃培养8个小时制得。然后在培养物中加入505毫升的36％甲醛溶液，使培养物中甲醛的终浓度为1％，以达到杀死病原体的目的。在室温下培养则至少4个小时。
2.为每个培养物制备一个无菌的对照，培养24至48小时。
3.现在用切向过滤法浓缩培养物。
4.把细胞悬浮物在8000转/分转速下离心30分钟。
5.用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次细胞沉积物，在8000转/分转速下离心30分钟。
6.接着把此细胞沉积物1∶1地重新悬浮在无菌的蒸馏水中。
7.把细胞悬浮物放在三个2,000毫升的瓶中(每个瓶中约300毫升)。然后放在冰箱中过夜。
8.第二天，准备下一步用的丙酮：
把22份500毫升丙酮置于-22℃冷冻室中过夜。
9.在每个装细胞悬浮液的瓶中各加入1,500毫升冷丙酮。
10.把瓶子密封充分振摇，在-22℃冷冻室中放置2-3个小时。
11.小心地吸出上清液丢弃之。然后在每个瓶中加500毫升冷丙酮。再次把瓶子放在冰箱中2-3个小时。
12.然后重复两次步骤11，把瓶子放在-22℃冷冻室中过夜。
13.再次小心地吸出上清液丢弃之。
14.把沉积物分放在多个Petrie培养皿中，置于通风橱下过夜，以挥发残余的丙酮。
15.把干燥的细胞沉积物在研磨器中磨成粉，然后放在已称重的敞口三角瓶中过夜。
16.把磨碎的细胞以1∶1的比例溶于无菌蒸馏水。
17.把细胞悬浮液放在65℃水浴中温育5分钟。
18.现在需要与全部细胞悬浮液等量的90％的苯酚。为此用蒸馏水把苯酚直接溶入瓶中。把90％的苯酚溶液同样地加热到65℃温育5分钟。
19.把苯酚溶液和细胞悬浮液以1∶1的比例在2000毫升的圆底烧瓶中混合，用力振荡，然后进一步在65℃水浴摇床中温育20分钟。
20.把烧瓶在冰/水浴中冷却到4℃。
21.把150毫升的细胞/酚混合物放在250毫升的烧杯中用13000转/分的转速离心40分钟。
22.收集上清液放入3至4个渗析管中(15千道尔顿)，对软化水渗析过夜。
23.收集渗析管中的内含物，检查透明度，如果还有可见颗粒，在5000g离心力离心20分钟。
24.收集上清液或者渗析产物，保存于0.1％叠氮化钠中。
25.确定使用的抗原稀释度。
制备沙门氏菌属-LPS-BSA结合物
1.将得到的沙门氏菌-LPS-抗原溶解到含0.5％TEA(三乙醇胺)的蒸馏水中。
2.经再次充分的悬浮，液体在超声浴中温育30秒。
3.把抗原沙门氏菌-LPS的最终浓度调节到1毫克/毫升。
4.先前制备的于0.5％三乙醇胺中的BSA(牛血清白蛋白)悬浮液(10毫克/毫升)与等份的步骤3中制备的沙门氏菌-LPS-抗原悬浮液混合。
5.把得到的混合物分为1.0毫升/份，然后冷冻干燥。
6.把冷冻干燥的沙门氏菌-LPS-BSA混合物重新悬浮在1毫升0.5％TEA中。
7.重复步骤5三次、步骤6两次。
8.把如此获得的沙门氏菌-LPS-BSA结合物保存于2-8℃。包被微量反应板
用0.04毫克/升的SCS-LPS和4.0毫克/升的STM-LPS-BSA结合物水溶液制备沙门氏菌抗原混合物。对Nunc/Nunc Polysorb硬微量反应板的包被，通过将100微升/孔的沙门氏菌抗原混合物在7℃温育12小时得到。温育完成后，吸去未结合的沙门氏菌抗原混合物，然后用250微升/孔的纯净水洗板三次。用200微升的1％血清白蛋白的碳酸盐缓冲液(0.1M，PH9.6)在室温下封闭游离的结合位点15分钟。
然后用250微升/孔洗涤缓冲液(PBS-吐温)洗涤两次，再将已包被和封闭的微量反应板通风干燥12至14小时。
用于试剂盒中
猪抗沙门氏菌的抗体的检测试剂盒及检测方法
试剂盒含有以下的试剂：
试剂：                                              量：
1.洗涤缓冲浓缩液-含Tween 20的磷酸
盐缓冲食盐溶液，10倍浓缩，用乙基汞硫代水杨酸钠保存  30毫升
2.样品稀释缓冲液，用蛋白质缓冲，用叠氮化钠保存      2×30毫升
3.TMB底物溶液，可直接使用                           12毫升
4.终止液-1M盐酸                                     12毫升
5.二抗偶联物(兔抗猪-辣根过氧化酶结合物)
于含蛋白稳定剂的缓冲液中，用乙基汞硫代水杨酸钠保存  50微升
6.对照血清1号，沙门氏菌阳性，导致超免疫
猪的血清，经冷冻干燥                                300微升
7.对照血清2号，沙门氏菌阳性，导致超免疫猪的血清，
经冷冻干燥                                          300微升
8.对照血清3号，沙门氏菌阳性，导致超免疫猪的血清，
经冷冻干燥                                          300微升
9.对照血清4号，沙门氏菌阳性，导致超免疫猪的血清，
经冷冻干燥                                          300微升
10.对照血清5号，沙门氏菌阴性，具有低抗体效价猪血清，
经冷冻干燥                                          300微升
11.沙门氏菌抗原包被于微量反应板(失活)，
每板96孔                                               1
样品制备
*肉汁-通过把膈板或肌肉组织冷冻和解冻得到，按1∶30用样品稀释缓冲液稀释。
**血清样品按1∶400用样品稀释缓冲液稀释。
检验进行
在使用前把所有试剂保持至室温(18-23℃)然后轻轻摇匀。
1.在工作表上，相应双重测定中样品板的划分，记录对照和样品的位置，如K1＝A1/A2；K2＝B1/B2；K3＝C1/C2；K4＝D1/D2；K5＝E1/E2；双重测定中样品的其他位置。
2.用吸移器将100微升溶解的对照液或者预先稀释的样品分别移入微量反应板的凹孔中，给板加盖。
3.室温下温育60分钟，然后通过吸取或者甩出把孔清空。
4.各孔用200微升准备好的洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后倒掉缓冲液。
5.每个孔中各加100微升准备好的兔抗猪与辣根过氧化酶的结合物。
6.室温下温育60分钟，然后通过吸取或者甩出把孔清空。
7.各孔用200微升准备好的洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后倒掉缓冲液。
8.每个孔中各加100微升TMB底物溶液。
9.室温下温育七分钟
10.每个孔中各加100微升终止液终止反应。
11.用空气作空白值标定光度计，用450纳米波长时的值做为测量值，并且用630纳米波长时的值作参照。
评价
计算测得的对照血清吸光度与其给定的浓度的比例，然后以此计算出回归率，按照回归率由测得的样品吸光度可计算出样品的沙门氏菌抗体的浓度。
用已包被和封闭了的微量反应板进行为期6个月的比较试验。以94/板/月的样品检测量，得到2.29-8.7％的偏差系数CV。这个结果证实了根据本发明包被的微量反应板有很高的时间稳定性。对照试验证实所进行的测定具有高准确性。针对对照进行了与其反应性有关的试验，证实无交叉反应。
实施例2
制备抗原制剂和固相载体，并且用于禽抗沙门氏菌属抗体的检测试剂盒。
制备沙门氏菌-LPS-抗原
1.所需的沙门氏菌属血清型鼠伤寒杆菌按类似于实施例1的方法制备LPS-抗原。
制备沙门氏菌属-LPS-酪蛋白结合物
1.得到的沙门氏菌-LPS-抗原溶解到含0.5％TEA(三乙醇胺)的蒸馏水中。
2.经再次的完全悬浮后，悬浮液在超声浴中培养30秒。
3.把沙门氏菌-脂多糖-抗原的最终浓度调节到1毫克/毫升。
4.先前制备的于5％TEA中的酪蛋白(牛奶中得到)悬浮液(10毫克/毫升)与等份的步骤3中制备的沙门氏菌-LPS-抗原悬浮液混合。
5.把得到的混合物分为1.0毫升/份，然后冷冻干燥。
6.把冷冻干燥了的沙门氏菌-LPS-酪蛋白混合物重新悬浮在1毫升0.5％TEA中。
7.重复步骤5三次、步骤6两次。
8.把如此获得的沙门氏菌-LPS-酪蛋白结合物保存于2-8℃。制备固相载体
首先用1.0毫克/升的STM-LPS-酪蛋白和1.0毫克/升的STM-LPS水溶液制备比例为1∶1的沙门氏菌-LPS-酪蛋白/沙门氏菌-LPS混合物。Nunc/Nunc Polysorb微量反应板的包被通过把100微升/孔的沙门氏菌-LPS-酪蛋白/沙门氏菌-LPS混合抗原在7℃温育12小时实现。
温育后吸去沙门氏菌抗原混合物，然后用250微升/孔的纯净水洗板三次。
用200微升的1％酪蛋白的碳酸盐缓冲液(0.1M，pH9.6)在室温下封闭游离的结合位点。
然后进行250微升洗涤缓冲液(PBS-吐温)/孔的洗涤两次，再把包被和封闭了的微量反应板通风干燥。
禽抗沙门氏菌属抗体的检测试剂盒及检测方法
试剂盒含有以下的试剂：
1.用沙门氏菌抗原包被的微量反应板(失活)，
每板96孔                                       2
2.阳性对照，10倍抗体浓度，鸡抗沙门
氏菌血清于含蛋白稳定剂的缓冲液中，用稀
释缓冲液稀释后使用。                           100微升
3.阴性对照，10倍抗体浓度，不与STM
和SE反应的鸡血清于含蛋白稳定剂的缓冲液
中，用稀释缓冲液稀释后使用。                   100微升
4.样品稀释缓冲液，用蛋白缓冲，加入叠氮化钠
保存。                                         2×60毫升
5.洗涤缓冲浓缩液，含吐温20的磷酸盐缓冲食盐溶液，
十倍浓缩，加入乙基汞硫代水杨酸钠保存。            60毫升
6.抗体偶联物(抗-鸡-辣
根过氧化酶结合物)，浓缩于含蛋白稳定剂的
缓冲液中，用稀释缓冲液稀释后使用                  100微升
7.TMB(四甲基联苯胺)底物溶液，可直接使用           24毫升
8.终止液-1M盐酸                                   24毫升
样品制备
*血清样品按1∶400用样品稀释缓冲液稀释并且混合。
**蛋黄按1∶400用样品稀释缓冲液稀释并且混合。
检验进行
在使用前把所有试剂保持于室温(18-23℃)，然后轻轻摇匀。
1.在A1孔中移入100微升的稀释缓冲液作空白值。
2.在B1和C1孔中各移入100微升阳性对照液。
3.在D1和E1孔中各移入100微升阴性对照液。
4.在其它各孔中分别移入100微升稀释1∶400的样品，或90μl稀释缓冲液和10μl稀释1∶40的样品，给板加盖。
5.室温下温育60分钟，然后通过吸取或者振荡把孔清空。
6.各孔用200微升准备好的洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后倒掉缓冲液。
7.每个孔中各加100微升准备好的结合物。
8.室温下温育60分钟，然后通过吸取或者振荡把孔清空。
9.各孔用200微升准备好的洗涤缓冲液洗涤3次，每次洗涤后倒掉缓冲液。
10.每个孔中各加100微升TMB底物溶液。
11.室温下温育七分钟。为了正确地进行试验，必须使微量反应板的每个孔都准确地反应七分钟，就是说，必须以相同的次序移入底物和终止溶液。
12.每个孔中各加100微升终止液终止反应。
对A1位置的空白值标定光度计，用450纳米波长时的值作测量值，并且用630纳米波长时的值作参照。
评价
根据试剂盒中阳性和阴性对照的测量值，计算出截止值，并以此进行分析。有效的检验必须是阴性对照(NC)的中值(AV)≤0.3OD(光密度)且阳性对照(PC)的中值≥0.6OD。位置A1的空白值应当小于0.1OD，不得大于0.2OD。
A.野外感染
1.为测定阴性的样品，截止值由下式从OD值计算得出：
*阴性截止值：(AV PC-AV NC)/5+AV NC
有效检验中，OD值小于等于阴性截止值的样品为阴性。
1.为测定阳性的样品，截止值由下式从OD值计算得出：
*  阳性截止值：(AV PC-AV NC)/3+AV NC
有效检验中OD值大于等于阳性截止值的样品为阳性。
1.对于OD值介于阴性与阳性截止值之间的样品，可在反复采样后的晚些时候重复检验。
B.疫苗接种
由于存在不同的接种方法(吸收性疫苗、活疫苗)和疫苗供应因素，不可能有边值出现。野外感染用的截止值只有起定向辅助作用。各个实验室应当为监测其备有的疫苗确定自己的参数。
应用沙门氏菌抗原制剂可实现一种均匀、稳定并且在检验结果上高灵敏的抗原包被。由所述沙门氏菌抗原制剂包被的微量反应板的附着性和均匀性得到了改善，并且有可能用于标准的酶联免疫吸附试验系统的制备。包被有沙门氏菌抗原制剂并已封闭的微量反应板的储存期至少可以达7个月，且偏差系数CV＜＝10％。以本发明的抗原制剂，STM-LPS-酪蛋白结合物/STM-LPS混合抗原为基础制备的检测系统，使得抗肠沙门氏菌、鼠伤寒杆菌及鸡败血菌杆菌-鸡腹泻杆菌的抗体的同时检测成为可能。

Claims (19)

1.与异源性酶联免疫吸附试验结合使用的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-蛋白结合物。
2.如权利要求1所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-血清白蛋白结合物。
3.如权利要求1所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物。
4.如权利要求1所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-蛋白结合物，和至少另一种肠沙门氏菌的抗原制品或脂多糖制品。
5.如权利要求4所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有一种标准鼠伤寒杆菌(STM)的沙门氏菌抗原和一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原。
6.如权利要求4所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有一种鼠伤寒杆菌的脂多糖-酪蛋白结合物、一种鼠伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌的脂多糖-酪蛋白结合物的脂多糖制剂的沙门氏菌抗原混合物。
7.如权利要求5所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，它含有标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原，以及鼠伤寒杆菌(STM)-脂多糖-血清白蛋白结合物，而且，SCS与STM脂多糖血清白蛋白结合物的比例为1∶10至1∶200。
8.如权利要求5或7所述的沙门氏菌抗原制剂，其特征在于，沙门氏菌-脂多糖-血清白蛋白结合物是沙门氏菌-脂多糖-牛血清白蛋白的结合物。
9.一种测定沙门氏菌抗体的试剂盒，用于：一种免疫测定方法，检验肉汁、血清、蛋黄样品中的沙门氏菌的抗体，盒中载体包被了能与抗体进行免疫反应的抗原，并且盒中还含有各种对照血清、洗涤缓冲浓缩液、稀释缓冲液、酶标二抗及相应的底物和终止液，其特征在于，载体附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-蛋白结合物的沙门氏菌抗原制剂。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-血清白蛋白结合物的沙门氏菌抗原制剂。
11.如据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物的沙门氏菌抗原制剂。
12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了至少一种肠沙门氏菌的脂多糖-酪蛋白结合物和至少另一种肠沙门氏菌的抗原制品或脂多糖制品的沙门氏菌抗原制剂。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种标准鼠伤寒杆菌(STM)，以及标准猪霍乱杆菌(SCS)的脂多糖-血清白蛋白结合物构成的沙门氏菌抗原混合物。
14.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种鼠伤寒杆菌的脂多糖-酪蛋白结合物，以及鼠伤寒杆菌或鼠伤寒杆菌脂多糖-酪蛋白结合物的脂多糖制剂的沙门氏菌抗原混合物。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，载体上附着了一种标准猪霍乱杆菌(SCS)的沙门氏菌抗原，以及鼠伤寒杆菌(STM)脂多糖血清白蛋白结合物，而且SCS与STM脂多糖血清白蛋白的结合物的比例为1∶10至1∶200。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，沙门氏菌-脂多糖-血清白蛋白结合物是沙门氏菌脂多糖牛血清白蛋白的结合物。
17.如权利要求9至16任一所述的试剂盒，其特征在于，为了检验猪的样品中的抗沙门氏菌抗体，酶标二抗是一种抗猪免疫球蛋白-酶结合物。
18.如权利要求9至15任一所述的试剂盒，其特征在于，为了检验鸡的样品中的抗沙门氏菌抗体，酶标二抗是一种抗鸡免疫球蛋白过氧化酶结合物。
19.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，使用由兽医监管的沙门氏菌阳性和阴性动物的对照血清作为对照血清。
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