MX2013008746A - Metodo para la deteccion de permeabilidad intestinal y de la barrera hemato-encefalica y materiales de prueba para este. - Google Patents

Abstract

Métodos, ensayos y aparatos se describen para la prueba de antígenos asociados con la permeabilidad de la barrera intestinal yo hemato-encefálica. Por ejemplo, la sangre, la saliva u otros fluidos corporales pueden ser probados para unirse (1) a una toxina bacteriana (preferiblemente un lipopolisacárido) y (2) unirse a los antígenos del tejido seleccionados de al menos uno de (a) un antígeno relacionado con el intestino y (b) un antígeno relacionado con la barrer hemato-encefálica. Análisis de los resultados de la prueba pueden utilizarse para ayudar a detectar y diagnosticar enfermedades asociadas con el síndrome de intestino permeable (ya sea por vía paracelular o transcelular y debido a las toxinas bacterianas o alguna otra causa) y/o a enfermedades asociadas con la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica excesiva, que se contemplan en el presente documento para incluir las condiciones de neuro-inflamación y/o de neuro-autoimmunidad y especialmente la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, o neuropatía periférica y depresión mayor.

Description

METODO PARA LA DETECCION DE PERMEABILIDAD INTESTINAL Y DE LA SOLICITUD RELACIONADA La presente solicitud reclama el beneficio ! de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/437,244 presentada el 28 de enero de 2011, que se incorpora aquí en su totalidad por referencia. · : i ' ; CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a métodos, énsáyos y kits para ayudar en la detección y el diagnóstico de permeabilidad intestinal y la barrera hemato-encefálica . ¦ ANTECEDENTES DE LA INVENCION i : ¦ 1 En comparación con los otros órganos celulares en el cuerpo humano, las células epiteliales intestinales están expuestas a un enorme número de antigenos que se originan de alimentos ingeridos levaduras, bacterias y virus. Algunos de estos antigenos bacterianos no representan una amenaz . al sistema inmune mucosal, mientras que otros pueden ser ; i per udiciales para el huésped. El sistema inmune intestinal I supervisa estos antígenos bacterianos en el lumen intestinal permitiendo unas moléculas que impregnan el epitelio,; donde interactúan con el sistema inmune de mucosa y sistémico, con el fin de desarrollar la función de la célula T reguladora o tolerancia para estos antigenos. Sin embargo, la exposición inadecuada o excesiva del sistema inmune intestinal a estos antigenos bacterianos puede causar la ruptura de este mecanismo de regulación y llevar a enfermedad gastrointestinal (1). Por lo tanto, un entendimiento de la fisiología de la absorción del antígeno es central' para' una apreciación de la patogénesis de la enfermedad, incluyendo reacciones inflamatorias y autoinmunes (2) .

Estos y todos los otros materiales extrínsecos discutidos aquí están incorporados por referencia en su totalidad. Donde una definición o el uso de un término en una referencia incorporada es inconsistente o contrario; a la definición de este término provisto aquí, la definición de este término provisto aquí se aplica y no se aplica la definición de este término en la referencia. i ! Permeabilidad intestinal incrementada se- cree que es una etapa temprana que precede al comienzo de varios trastornos autoinmunes (3-6) . Por esta razón, recientemente ha habido un interés incrementado en el papel de la disfunción de la barrera intestinal en la patogénesis de muchas condiciones patológicas dirigidas al i tracto gastrointestinal asi como órganos extra-intestinales, incluyendo el sistema nervioso (7). Esta desregulación dé la i función de barrera intestinal como la puerta biológica a la inflamación, autoinmunidad y cáncer fue discutida ¡en un articulo de revisión por Fasano (7). En este articuilo de revisión, asi como un articulo Fasano anterior (4) , Fasano enfatiza que las funciones primarias del1 ¡tracto gastrointestinal tradicionalmente han percibido que son I 1 limitadas a la digestión y absorción de nutrientes y a la homeostasis de agua y electrolitos. Un análisis más -atentó de la disposición anatómica y funcional del tracto gastrointestinal, sin embargo, sugiere que otra función extremadamente importante de este órgano es su capacidád para regular el tráfico de macromoléculas entre el medió ambiente : i y el huésped a través de un mecanismo de barrera. Junto con el tejido linfoide asociado con el intestino y la ; red neuroendocrina, la barrera epitelial intestinal, con sus uniones intercelulares estrechas, controla el equilibrio entre la tolerancia y la inmunidad a los no auto-antigehos,.

Zonulina/ocludina son moduladores fisiológicos> de í ; uniones paracelular estrechas que están involucradas en el tráfico de macromoléculas y por lo tanto en el equilibrio entre la respuesta inmune y tolerancia (7). Cuando las proteínas de la barrera intestinal mejoradas finamente: son desreguladas en aquellos individuos genéticamente susceptibles a factores ambientales, surge la posibilidad para ambos trastornos intestinales tal como la e 1nfeir'meidad ; i ¡ celiaca, enfermedad de Crohn y colitis ulcerósaj y enfermedades autoinmunes extra-intestinales t!al como artritis, lupus, tiroiditis, diabetes, e incluso ése .erósis múltiple (EM) , malignidades y depresión mayor (8-14). Uno de I intestinal y luego la disfunción de la barrerá Hemáto-encefálica (14). El papel de LPS en la inducción del síjndrome de "intestino aguj en la figura 1.

Figura 1 puede comprometer aumentar la entrada de antigenos no digeridos en circulación, i I 1 desafiando asi el sistema inmune. Reacción a estos ¡antiígénos activa cascadas inmunes e inflamatorias, resultando jen¡ la producción de citoquinas pro-inflamatorias, una gran variedad de anticuerpos y permeabilidad de la barrera intestinal incrementada (o síndrome de "intestino agujereado"). Si se deja la disfunción de la barrera intestinal no administrada, el resultado podría ser neuro-inflamación, neuro-invasión y neuro-degeneración .

I Por lo tanto, existe una necesidad de un método no-invasivo, aparatos y ensayos para la medición de la permeabilidad intestinal a grandes moléculas antigénioas que pueden desafiar el sistema inmune, induciendo la inflamación, que puede resultar en la abertura de las barreras hemáto-encefálicas primero, seguido por neuroinflamación ' y neurodegeneración después de esto (15-25) . Se cumplen! estas necesidades y otras por medio de la invención.

BEREV DESCRIPCION DE LA INVENCION j La materia objeto inventiva de la \ presente invención proporciona aparatos, sistemas, ensayos y métodos en los cuales una muestra de un ser humano puede ser probada para ayudar en la detección y el diagnóstico de permeabilidad de barrera hemato-encefálica e intestinal. ; ! i En ciertos aspectos de la presente invención, una o más fracciones de una muestra es/son probados para , la unión (1) a una toxina bacteriana, y (2) unir a un antígeno nativo seleccionado de al menos uno de (a) un antígeno relacionado con el intestino y (b) un antigeno relacionado con la barrera hemato-encefálica . En ciertos aspectos, la toxina bacteriana puede comprender ventajosamente de un lipopolisacárido .

Cuando se prueba para permeabilidad intestinal, el antigeno relacionado con intestino nativo es preferentemente seleccionado de la lista que consiste de: (1) una proteina estructural intestinal; (2) una proteina de unión estrecha; (3) un receptor de unión a la proteina de unión estrecha; y (4) una proteina de unión celular. En ejemplos de ¿ieirtos aspectos de la presente invención, se produce la prueba, para anticuerpos contra uno o más de actina/actomiosina, oéludina y/o zonulina, receptor ZOT intestinal y metaloproteinasa-3 de matriz (MMP-3) .

Cuando se prueba para una permeabilidad de la barrera hemato-encefálica, el antigeno relacionado con la barrera hemato-encefálica preferentemente es seleccionado de la lista que consiste de: (1) una proteina de barrera hém to-encefálica; (2) una proteina ácida fibrilarmerite '¦ glial (GFAP) ; (3) una metaloproteinasa de matriz (MMP) (( ) ; una proteina de unión ZOT del cerebro; (5) un receptor ¾OT del cerebro; (6) una calprotectina ; y (7) una proteina : ásica de mielina. En ejemplos de ciertos aspectos de la: presente invención, las pruebas ocurre para anticuerpos contra una o más de (1) una proteina de barrera hemato-encefálica; ( 2 ) '< una proteina ácida fibrilarmente glial (GFAP) ; y : (3) ; una metaloproteinasa de matriz (???) .

Desde una perspectiva de diagnóstico, análisis de resultados de las pruebas de uno o más de los métodos descritos anteriores pueden utilizarse para ayudar . en, la detección y/o diagnóstico de una enfermedad asociada con el síndrome del intestino agujereado y/o permeabilidad , de; la barrera hemato-encefálica excesiva.

En ciertos aspectos de la presente invención, la detección de las muestras de unión a los componentes respectivos puede realizarse con un inmuno-ensayo, incluyendo pero no limitado a ensayo ELISA, ensayo RIA, aglutinación de látex, ensayo de perlas, análisis proteómico y otros inmunoensayos conocidos por aquellos de experiencia i en la técnica. ¦ i ; En ciertos aspectos de la presente invención, placas de prueba y kits para la realización del inmuno-ensayo puede también ser proporcionados, incluyendo por ejemplo una placa de prueba mejorada que tiene como péptidos ¡dé Unión: (1) una toxina bacteriana; y (2) un antígeno nativo que comprende al menos uno de (a) un antígeno relacionado con el intestino y (b) un antígeno relacionado con ik barrera hemato-encefálica nativa.

En placas de prueba particularmente preferidas usadas para ayudar en la detección y diagnostico; o de lo contrario identificar una enfermedad asociada con el síndrome de intestino agujereado, el antigeno relacionado con el intestino ventajosamente puede ser seleccionado de la; lista 1 i ¦ que consiste de: (1) una proteina estructural intestinal;' (2) una proteina de unión estrecha; (3) un receptor de Unión a la proteina de unión estrecha; y (4) una proteina .de unión celular.

En placas de prueba particularmente preferidas usadas para diagnosticar o de lo contrario identificar¦ una enfermedad asociada con la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica excesiva, el antigeno relacionado con la barrera hemato-encefálica puede ser ventajosamente seleccionado de la lista que consiste de: (1) una proteina de barrera hemato-encefálica; (2) una proteina ; ácida fibrilarmente glial (GFAP) ; (3) una metaloproteinasa de matriz (MMP) , (4) una proteina de unión ZOT del cerebro; (5) I un receptor ZOT del cerebro; (6) una calprotectina; :y (¡7) una proteina básica de mielina. 1 Se contempla que los kits de prueba pueden incluir una o más placas que prueba colectivamente para ' ambos un primer conjunto de antigenos asociados con el síndrome del intestino agujereado y un segundo conjunto de 'antígenos asociados con la permeabilidad de la barrera: hemato-encefálica excesiva.

Desde una perspectiva más general, los métodos y aparatos se contemplan aquí para ayudar en la detección y el diagnóstico de una enfermedad asociada con la excesiva permeabilidad de una barrera anatómica, que comprende: obtener y analizar los resultados de prueba de un; panel de prueba de anticuerpos que produce señales de unión ¡de ; una muestra del paciente a una toxina bacteriana, y un antigeno nativo seleccionado de al menos uno de (a) un añtígeno relacionado con el intestino y (b) un antigeno relacionado con la barrera hemato-encefálica nativa.

En todos estos métodos y aparatos contemplados, las muestras pueden comprender cualquier muestra córpbral adecuada, incluyendo por ejemplo una muestra de Sangre entera, una muestra de suero de sangre/suero, una muestra de saliva o una muestra de otros fluidos corporales. | Se contempla adicionalmente aún que los métodos y aparatos contemplados aquí pueden utilizarse para 'ayudar en las enfermedades diagnosticadas diferencialmente relacionadas con (1) una disbiosis de la flora intestinal y (2) una ruptura de la barrera intestinal. Por ejemplo, como actualmente se contempla, un diagnóstico relacionado ¡con la disbiosis de flora intestinal tendería a ser indicado cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, Ig e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y los resultados negativos para! todos de IgA, IgM e IgG para ocludina y zonulina y un ¦ resultado negativo para IgG a actomisina. 1 Diagnóstico diferencial también está contemplado para ser ayudado para distinguir entre una ruptura , de la barrera intestinal debido a una via paracelular y una vía transcelular . 1 Con respecto a la ruptura a través de . las vías paracelulares, un diagnóstico relacionado con la ruptura de la barrera intestinal por antigenos bacterianos tiendeft ai ser indicado cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e : IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido y resultados 1 positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG para ocludina o zonúliha y un resultado negativo para IgG a actomisina. En contraste, un diagnóstico relacionado con la ruptura de la barrera intestinal que por los antigenos bacterianos tendería a: ser indicado cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado negativo para todos de IgA, IgM e IgG en : la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG apara ocludina o zonuliná, y un resultado negativo para IgG a actomisina.

Con respecto a la ruptura a través de i las vías transcelular, un diagnóstico relacionado con la ruptura de la barrera intestinal por antígenos bacterianos tienden, a ser indicado cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e ' IgG á la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados, negativos para todos de IgA, IgM e IgG para ocludina y zonul'inav y un resultado positivo para IgG a actomisina.

También de acuerdo con los descubrimientos discutidos aqui, un diagnóstico relacionado con i ambas rupturas en la integridad de la barrera hemato-encefálica e intestinal inducido por la toxina bacteriana tendería a ser indicado donde los resultados de la prueba incluyen' un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido y resultados positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG para ocludina y 1 zoftülina, un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e. IgG a proteínas de la barrera hemato-encefálica, y un j resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para : antígenos neuronales. ; i ¡ En contraste, un diagnóstico relacionado icori ambas rupturas en integridad de barrera hemato-encefálica e intestinal inducido por factores que la toxina bacteriana es probable donde los resultados de la prueba incluyen un resultado negativo para cada uno de IgA, IgM e '¦ IgG á ^a toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados : positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG a ocludina y zonülina; un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM ; e i IgG a proteínas de la barrea hemato-encefálica, y un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para ; antígenos neuronales.

Se contempla que adicionalmente que la disbiosis de flora intestinal puede ocurrir sin la ruptura 'en/ la integridad de la barrera intestinal, pero con la ruptura de la integridad de barrera hemato-encefálica . Por e emplo; un diagnóstico relacionado con la disbiosis de flora int stinal en esa situación puede tender a ser indicado donde los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados negativos para cada uno de IgA, IgM e IgG para ocludina y zonulina, un ¡ resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a proteínas de barrera hemato-encefálica, y un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para antígenos neuronalés/ De manera similar, un diagnóstico relacionado con la ruptura en la integridad de la barrera hemato-eñcefalica, ; í [ neuroinflamación y neuroautoinmunidad, sin asociación con la barrera intestinal o disbiosis de flora intestinal son probable donde los resultados de la prueba incluyen: un resultado negativo para cada uno de IgA, IgM e ' IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y los resultados negativos para cada uno de IgA, IgM e IgG para ocludina y zonulina, un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a proteínas de barrera hemato-encefálica y un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para antigenos neuronalés.

Con respecto a enfermedades especificas, análisis de resultados de las pruebas contempladas aquí puede utilizarse para ayudar en la detección y diagnóstico de esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad Parklnson, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, o neuropatía periférica y depresión mayor. Tales condiciones se cree que es probable que los resultados de la prueba incluyan un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a proteínas de la barrera hemato-encefálica, y un ' resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para : antígenos neuronales . : ¡ Varios objetivos, características, aspectos y ventajas de la materia objeto inventiva de la! presente invención llegarán a ser más evidentes de la \ siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas,, junto con las figuras dibujadas acompañantes y cuadros. : BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 es un diagrama de la técnica previa : que muestra un papel actualmente entendido de LPS en la : inducción 1 de intestino agujereado y síndrome cerebro agujereado. : Figura 2 es un diagrama la técnica previa que muestra un papel actualmente entendido de inducción : LP$ de la inflamación y la activación de los linfocitos Thl7 en la patogénesis de trastornos inflamatorios y neuroinmunológicos trastornos: inducción de LPS de la respuesta inflamatoria, producción de citoquinas, y aumento en el número de células positivas Thl7 en circulación.

Figura 3 es un diagrama de la técnica previa ' que muestra una etiología actualmente entendida del intestino a la disfunción cerebral -- como la pérdida de la tolerancia de la mucosa, si no se maneja, puede desencadenar una cascada que induce la disfunción de la barrera intestinal, inflamación sistémica, neuroinflamación, neuroinvasion y neurodegeneración . : ; Figura 4 es un diagrama que muestra un ' escenario propuesto de la presente invención en el cual acciónadorés y mecanismos involucrados en la permeabilidad intestinal i i anormal y la permeabilidad hemato-encefálica puede : ser utilizada para una nueva generación de pruebas: para la identificación de la permeabilidad intestinal ;(IPI) y/o identificación de permeabilidad hemato-encefálica (BBPlj) . · Figura 5 es un diagrama que muestra . un, papel ' i propuesto de permeabilidad intestinal anormal 'en la patogénesis de la enfermedad autoinmune de acuerdo i con ciertos aspectos de la presente invención. ' i Figura 6 es un diagrama que muestra el 'diseño de una placa de microtitulación de muestra para la realización i ; de un inmunoanálisis , la placa de microtitulación ' que tiene I 12 filas diferentes con 12 diferentes antigenos y péptidos de : j . ; acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. \ · ; Figura 7 es un diagrama que muestra el diseñó de . I : una placa de microtitulación de muestra de acuerdó i con ciertos aspectos de la presente invención, en el cual se mide IgG/IgM/IgA contra 12 diferentes antigeno proteina intestinal y BBB y antigenos de (antigerios unidos y péptidos son transparentes) . i . 1 Figura 8 es un diagrama que muestra el jdis,eñó de una placa de microtitulación de muestra de acüeriio ; con ciertos aspectos de la presente invención, en el cuál je mide IgG/IgM/IgA con controles positivos y negativos j semanales para fines de control de calidad (antigenos unidos y : péiptidos i ; son transparentes) . ¦ i ' 1 i ' Figura 9 es un diagrama que muestra una cómpárabión ! j ' i de IgG, IgM e IgA contra lipopolisacárido bacteriano y ocludina/zonulina en donadores sanos y pacieinteis '¡ con i 1 barras de luz en el gráfico a la derecha y pacientes con autoinmunidad gástrica en dos desviaciones estándar por encima de la media que se muestra en las barras oscuras en la gráfica a la derecha. i j El cuadro 1 muestra los niveles de anticuerpos de IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antigenos que representan el factor ambiental (LPS) , proteina intestinal y BBB y antigenos asociados en un primer conjunto de tres sujetos sanos (muestras 1-3), de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención.

El cuadro 2 muestra los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antigenos ; que representan el factor ambiental (LPS), proteina intestinal y BBB y antigenos asociados en un segundo conjuntó de tres sujetos sanos (muestras 4-6), de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. ; ; El cuadro 3 muestra los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antigenos que representan el factor ambiental (LPS) , proteina intestinal y BBB y antigenos asociados en un tercer conjunto de tres sujetos sanos (muestras 7-9) , de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. ; El cuadro 4 muestra los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antigenos 1 que representan el factor ambiental (LPS ) , proteina intestinal y BBB y antigenos asociados en tres pacientes (muestras ! 10-12 ) con enfermedad celiaca y permeabilidad intestinal, de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. : j ; El cuadro 5 muestra los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antígenós : que representan el factor ambiental (LPS) , proteina intestinal y BBB y antigenos asociados en tres pacientes (muestras 13-15) con ataxia de gluten, de acuerdo con ciertos aspectos dé la presente invención.

El cuadro 6 muestra los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA probados contra 12 diferentes antigenos que representan el factor ambiental (LPS), proteínas intestinal y BBB y antígenos asociados en tres pacientes (muestras 16-18) con esclerosis múltiple (EM) , de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención.

El cuadro 7 muestra una interpretación clínica de i 1 ! ciertos anticuerpos contra LPS, ocludina/zonulina ¡y ,red de actomiosina en sangre, de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. i: ! ! El cuadro 8 muestra una interpretación clínica de niveles elevados de ciertos anticuerpos contra1 LPS, ocludina/zonulina y actomiosin en fluido oral, de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención. : j ¦ : El cuadro 9 muestra una interpretación clínica de niveles elevados de ciertos anticuerpos contra LPS, ocludina/zonulina, proteina de la barrera hemato-encefálica y los antígenos neuronales en sangre, de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LOS DIBUJOS Una absorción incrementada de antigenos es un prerrequisito para el desarrollo de la enfermedad. 'Se conoce un número de condiciones para aumentar la permeabilidad1 del intestino y por lo tanto aumentar la absorción del antigeno. Es probable que la absorción de moléculas inmunogénicas o antigenos del lumen pueden resultar en actividad mediada inmunológica, tanto dentro del intestino en la forma dé IgA e IgM y más allá del intestino con la producción del antigeno especifico IgA, IgM, IgG y los complejos inmunes (26', 27).: I. El efecto de las toxinas bacterianas citoquinas inflamatorias en la inducción de interrupción de la barrera hemato-encefálica y neuroinflamación | La barrera hemato-encefálica (BBB) mantiene el ambiente interno y la estabilidad del sistema; nervioso central. Cambios estructurales y funcionales a la BBB pueden resultar en enfermedades autoinmunes, en particular, enfermedades neuroautoinmunes tal como la esclerosis múltiple (28). ! La BBB separa los leucocitos de la sangre, que normalmente responden a las lesiones necróticas, , desdé el parénquima cerebral donde la muerte celular necrótica podría tener lugar en respuesta a factores ambientales ¡ tal ;como infecciones, toxinas, excitotoxicidad o trauma (23). La BBB se compone de dos capas. La primera capa consiste de células ; i ¡ endoteliales microvasculares, que tienen abundantes uniones estrechas con similitud estructural con la de las células epiteliales intestinales (24, 28) . La segunda capa es la glia limitante, que se forma por procesos de pie glial' (29) . El espacio perivascular entre las células endoteliales y astrocitos está poblado por los macrófagos, que se ¡ comportan como células dendríticas inmaduras (29) . Por lo tanto, factores capaces de abrir la barrera epitelial TJ son cáp¡aces de destruir el tejido BBB y neuronal (30-33) . Esto incluye las endotoxinas bacterianas, citoquinas proinflamatór;ias , enzima y células efectoras Thl, Thl7, que son esenciales para la inflamación del sistema nervioso central (29, 34-Í35) .

Está firmemente establecido que la interrupción de la BBB por endotoxinas, citoquinas, quimioquinas, 'moléculas de adhesión y otros y el tráfico de células T auto^reactivas del compartimiento sistémico en el sistema nervioso central, juega un papel importante en el desarrollo de lesiones MS (36-38) . Sin embargo, cuando se hace una comparación ehtre Thl humano versus linfocitos Thl7, linfocito humanos Thl7 emigraron más rápido a través de la BBB que los linfocitos Thl . De hecho, un número significativo de linfocitos1 de i memoria CD4+CD45RO+ gue expresan IL-17 e IL-22 en su' mijgráción a través de marcadores IL-17+ e IL-22+ expresados con BBB, que confirman la capacidad de los linfocitos Thl7 para ; cruzar el BBB in vitro e in vivo (35) . Las células endoteliaíes de BBB expresadn IL-17R e IL-22R, que son utilizados' por ¦ los linfocitos Thl7 para infiltrarse en las células endoteliaíes de BBB (ECS) . Esta difusión de células o de antígenós, . tal como albúmina de suero bovino (BSA) , una macromíolécula a través de la BBB mejoró significativamente cuando IL-17 y IL-22 fueron añadidos a las monocapas de BBB-ECS humana. Esta permeabilidad mejorada de BBB-ECS se correlaciona con una disminución en la expresión de ocludina y zonulina;, las; dos proteínas de unión estrecha importante (39) . i j ; Estos resultados sugieren fuertemente; que; la inflamación inducida por LPS y otras toxinas bacterianas que causan la activación de la expresión de linfoticó Thl7 de receptores IL-17 e IL-22 sobre la barrera hemato-encefálica resulta en la unión de uniones estrechas de Thl7 a! BBB. Esto altera a las uniones estrechas, llevando a la transmigración de Thl7 y células T auto-reactivas a través de la BBB, liberación de granzima-B por la Thl7 y el interferón-gamma por las células CD , resultando en la destrucción de células I neuronales, liberación de antígenos de células neúronalés y proteínas BBB en la circulación (la co-expresión de células IL-17, IL-22 y granzima B a través de la acción de IL-17 e IL-22) juegan un papel importante en la inducc'iónj y el incumplimiento en la BBB y la permeabilización de; BBB a la circulación los linfocitos' CD4+ y moléculas solubles, que resultan en inflamación de CNS (40-44). El papel de linfocitos Thl7 en la patogenesia de trastornos inflamatorios y neuroinmunológicos se muestra en la figura 2. Basado en este mecanismo de acción, la inducción de la ¦ toxina bacteriana de la permeabilidad intestinal y la alteración de la estructura de proteína BBB pueden resultar en la producción de anticuerpos no sólo contra LPS, sirio también contra las proteínas de unión estrecha y proteínas' BBB. Por lo tanto, pasos para abordar la neuroinflamación de acuerdo con ciertos aspectos de la presente invención comienzan; con pruebas para LPS, ocludina, claudinas, proteínas BBB, proteína de unión estrecha, enzimas tal ¦ coriio 1 la metaloproteinasa de matriz y los anticuerpos del: receptor asociado, basados en que los médicos pueden planificar la reparación de la disfunción de la barrera gastrointestinal, seguida de humedecimiento de la inflamación sistémíca1 y; que ; i ; termina con la restauración de la barrera hemato-encefálica .

Expresión de los receptores IL-17 e IL-22 en ; las i células endoteliales de la barrea hemato-encefálica r sultan de la unión de las células Thl7 a las uniones estrechas de i BBB. Esto altera a las uniones estrechas, llevando a la neurodegeneracion y a células auto-reactivas CD4. Células Thl7 entonces trans-emigran a través de la BBB, preparando el paso para la muerte de las neuronas por la liberación de granzima B. Esta liberación de antigenos de células neuronales resulta en un circulo vicioso ' de neuroautoinmunidad y neurodegeneracion. : Basado en la información presentada aquí, se presume que el intestino es el punto de partida para · muchos trastornos neurodegenerativos. Comenzando con la microflora desequilibrada, que libera grandes cantidades de lipopolisacárido (LPS) . Las abundantes endotoxinas ¦ LPS inducen la sobre-regulación de las citoquinas pro-inflamatorias TNF-alfa e IL-lbeta, resultando en la degradación o disociación de TJs y sus proteínas, incluy!endo < I ocludina y zonulina. Esto es seguido por inflamación en el torrente sanguíneo que viaja a la BBB. La inflamación abre la BBB, causando neuro-infiltración, neuro-inflamación, neuroautoinmunidad y finalmente, la neurodegeneracion. Figura t 3 representa la patofisiología que lleva1 'a la neurodegeneracion; si no se aborda la disfunción ; de: la i '· barrera intestinal de una persona, la persona ; puede desarrollar neuroinflamación y posible neurodegeneracion con el tiempo. Muchos trastornos autoinmunes tienen : múltiples factores desencadenantes , síntomas y disfuncionéis j del sistema. En los casos de neuroautoinmunidad, donde muchos de los individuos producen niveles altos de anticuerpos a los LPS, TJ y a la proteina BBB, el sistema nervioso e ¡ inmune está involucrado. El terreno común para estos dos sistemas es el tracto gastrointestinal, cuya importancia ha sido abordada (43). i : ¡ Por lo tanto, en ciertos aspectos de la presente invención, la detección y medición de anticuerpos contra las proteínas TJ tal como ocludina, endotoxinas bacteriarías '¦ tal como LPS, y proteínas de BBB es la mejor manera no : sólo para evaluar GI y la integridad de la barrera intestinal, sino también para determinar y/o diagnosticar la causa de raíz de la inflamación sistémica, neuroinflamación, neuroinvasión y neurodegeneración . También, deben ser reparadas rápidamente las lesiones del epitelio intestinal. De lo contrarió, ;esto permitiría la penetración de las proteínas dietéticas, bacterias de comensales y patógenas en la circulación, conduciendo una cascada inflamatoria que pueden resultar en complejo autoinmune y trastornos neuroinmunes . 1 ! II. Medición de permeabilidad a azúcares pequeñas versus grandes moléculas antigénicas ' i ! i La metodología actual para evaluar la permeabilidad intestinal utiliza la lactulosa y el manitol. En los últimos 40 años, ha sido una herramienta clínica útil. Abéorcióh de lactulosa sugiere un desgarro en la barrera intestinal, y por lo tanto, permeabilidad intestinal. Contra la creencia popular, la absorción de esta pequeña molécula eri realidad indica una fuga minuto en lugar de una lágrima. Lactulosa tiene tamaño molecular relativamente bajo, y la transferencia de esta sustancia a través de las membranas del intestino no refleja la situación para la transferencia de alimentos u otras proteínas, y la respuesta inmune contra elloá. Además, prueba de lactulosa/manitol mide la transferencia : de moléculas pequeñas a través de paracelular pero ó vía transcelular . ; Por lo tanto, identificación de permeabilidad intestinal de molécula grande (LMIPI) debe 1 evaluarse utilizando las moléculas grandes tal como las endotoxinas bacterianas (comparables al tamaño de las ¦ proteínas alimentarias) , que son antigénicas y desafían e|l sisítema inmune. Además, en cuanto a la permeabilidad de BBB, ' aunque varias líneas de evidencia han revelado que las alteraciones en la permeabilidad de la BBB son un factor de inicio primario en MS y la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) (45-50), no hay actualmente prueba de sangre reconocida 1 i 1 para la medición de permeabilidad BBB. Sin embargo, ¡ en animales modela cambios morfológicos y funcionales :en ;la BBB han sido demostrados usando zonulina/ocludina paraj medir el deterioro del daño de barrera (7, 11, 28) . j ' Como se muestra en la figura 4, el énfasis de la metodología de la presente invención está en grandes moléculas que son antigénicas y que, tras su liberación de las barreras, tienen la capacidad de desafiar el sistema inmune, lo que resulta en la producción de anticuerpos IgG, IgM y/o IgA específicos contra estos, que son detectados en la sangre, suero de sangre y/o muestras de saliva. ; Evaluación de la permeabilidad de la barrera \ i '¦ intestinal a moléculas antigénicas grandes tal| como endotoxinas bacterianas y proteínas dietéticas se está convirtiendo importante en el entendimiento de la patogénesis de enfermedades autoinmunes y gastrointestinales. La evidencia . científica indica que muchos trastornos gastrointestinales y autoinmunes son acompañados, por ' una translocación incrementado de endotoxinas y otras toxinas bacterianas de bacterias aerobias y anaerobias a través dé la pared intestinal (7, 51-55). Esta translocación incrementada y la inflamación asociada con esto pueden inducir, la degradación de las proteínas de unión estrecha y una respuesta inmune posterior contra las proteínas Ide; unión i ' ; estrecha tal como ocludina/zonulina y endotoxinas bacterianas 1 ? ! tal como LPS. De hecho, células epiteliales humanas iy de rata se exponen a toxinas bacterianas o gliadina secretan j una cantidad significativa de zonulina. Esta liberación de zonulina es seguida por la separación de la proteína ZO-1 del complejo de unión estrecha, resultando en la permeabilidad intestinal a través de la vía paracelular (7, 51). Y muchas condiciones crónicas son acompañadas por los ni eles | del suero incrementados de IgA e IgM contra LPS y otros [ antígenos de bacterias patógenas (24, 25). Estas condiciones causan inflamación intestinal y la permeabilidad de la barrerá de la mucosa, con lo cual espacios alargados entre las células de la pared intestinal y la disociación de las proteínas de unión estrecha pueden inducir pérdidas en la red; de actomiosina y la barrera de protección. Esta pérdida de barrera protectora puede aumentar la translocación bacteriana y así aumentar la concentración de endotoxinas 1de ,¡ su1ero.,' proteínas de unión estrecha y actomiosina. ¡ Según ciertos aspectos de la presente invención, el suero creciente de IgA e IgM contra LPS, proteína; dé unión estrecha (ocludina/zonulina) y actomiosina indican · la presencia de permeabilidad de la · barrera intestinal y el tráfico de macromoléculas a través de las barrarais. : Las endotoxinas de las bacterias pueden estar causando; la autoinmunidad a través de la toxina bacteriana, actuando como un superantígeno a los linfocitos T, o por un ¡ mecanismo llamado mimetismo molecular. Muchas bacterias tienen sitios antigénicos muy similares a los antígenos de tejido humano, incluyendo el tejido neuronal. Si la permeabilidad1 de la i i' barrera intestinal queda sin verificar, entonces la castada inflamatoria de los antígenos y los anticuerpos producidos contra ellos irán a su vez en diversos tejidos y activárán la primera inflamación y luego la autoinmunidad, incluyendo neuroauto-inmunidad . Por lo tanto, si se permite la permeabilidad de la barrera intestinal antigénica se permite correr su curso, la degeneración continua puede desencadenar la inflamación sistémica, seguida de la inducción de la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica antigénica y celular, trayendo reacciones inmunitarias concomitantes adicionales que resultan en la neuroinflaínación, neuroinvasión y la neurodegeneracion. ' Asi, según ciertos aspectos de la 1 présente invención, los pacientes con enfermedades 1 crónicas inflamatorias y autoinmunes deben checarse por la existencia de la permeabilidad intestinal mayor a grandes ; moléculas antigénicas por medición de IgA, igG y/o IgM cpntra ; LPS bacteriano, proteínas de unión estrecha y actomiósina. Finalmente, además de la medición de los anticuerpos IgA,; IgG o IgM contra LPS y ocludina/zonulina, estos anticuerpos I también deben ser medidos contra proteínas ??? , '. enzimas, receptores asociados y antígenos neuronales en pacientes; con trastornos neuroinmunes . Este proceso de varios , pasos de degradación TJ por toxinas bacterianas y la producción de anticuerpos contra las proteínas liberadas TJ, LPS y otros antígenos bacterianos, que conduce al daño tisular y ' í 'i autoinmunidad, se ilustran en la figura 5.

Según ciertos aspectos de la presente invención, la detección y medición de IgA e IgM en los fluidos orales y de IgG, IgM e IgA en la sangre contra las proteínas , TJ y LPS sería el mejor ensayo para la evaluación de la función dé la barrera intestinal, mientras que la detección y medición de LPS, ocludina/zonulina y otras proteínas de unión j estrecha, además de proteínas BBB y anticuerpos neurales (IgG,. IgM e I ; ! IgA) en la sangre sería el mejor método para la evaluación de la permeabilidad intestinal/BBB y neuroauto-inmunidad.

Antígenos bacterianos (LPS) inducen degradación de uniones estrechas y liberación de zonulina, causando la abertura de las uniones estrechas y el pasaje de ocludina y LPS a través de las uniones estrechas y subsecuente ; migración en la submucosa, donde se presentan la ocludina y LPS en macrófagos y células dendríticas. Los macrófagos ¡presentan estos antígenos a las células T y B; esto es seguido por la respuesta aberrante inmune, tanto humoral (anticuerpos IgA, IgM e IgG contra ocludina y LPS) y mediada por células. Esta interacción entre la inmunidad humoral y mediada por células es en última instancia responsable por el proceso utóinfnune de direccionamiento del epitelio intestinal y otros : anttígénos de tejido, llevando al daño de tejido típico de enfermedades autoinmunes. : Las siguientes son descripciones ejemplares de ensayos, y su uso y análisis con respecto á algunos pacientes. Aunque otros materiales y métodos similares o equivalentes a los descritos en este documento , pueden utilizarse en la práctica o la prueba de la! presente invención, el método preferido y materiales ahora descritos en la descripción ejemplar de ensayos para ilustrar! además la presente invención según ciertos aspectos.

Ensayo ELISA 1 1 A. Materiales y métodos - placa y preparación de la1 muestra: Los lipopolisacáridos de E. coli 055:85; . COli K- 235, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, neumonía Klebsie:lla, Morganella morganii, Hafnia alvei, Citrobacter kos!eri, ' i , ' actina, actomiosina, proteina básica de mielina ;y ; a-b cristalino fueron comprados de Sigma - Aldrich, St. Loiuis, MO. La proteína ácida fibrilar glial (GFAP) fue adquirida de Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. También se usaron zonulina péptidos 1, 2, 3, receptor intestinal ZOT, péptido de proteína básica de mielina 87-106, proteína ¡ de unión ! ; I celular, metaloproteinasa-3 de matriz, región de; unión de calcio de S100-B nombrado en este estudio, BBB-1 MSELEKAMVA LIDVFHQYSG REGDKHKLKK, BBB-2 SELKELINNE LSHFLEEIKE QEVVDKVMET, BBB-3 LDNDGDGECD FQEFMAFVAM VTTACHEFFE : HE, proteína-1 de unión ZOT cerebral, -2, calprotectina (MRP-8) y el receptor ZOT cerebral.

Todos los péptidos de grado HPLC con una '' pureza superior al 90% fueron sintetizados por EZ Biolab de Carmel, IN. A través de esta aplicación, a menos que el contexto dicte lo contrario, todos los rangos establecidos en el presente deben ser interpretados como siendo inclusivos de sus extremos, y los rangos de extremo abierto: deben interpretarse para incluir valores prácticos comercialmente . ¡ '¦ i Asimismo, todas las listas de valores deben ser consideradas como inclusivas de los valores intermedios a menüs qué el contexto indique lo contrario.

Los antigenos y péptidos fueron disueltos en metanol en una concentración de 1.0 mg/mL, luego se ' diluyeron 1:100 en regulador de pH carbonato-bicarbonato 0.1M pH 9¡.5 y 50 µ? fueron agregados a cada uno de los pozos de 1! unai p'laca ELISA de poliestireno de fondo plano, como se muestra en la figura 6. ' Las placas fueron incubadas durante la noche a 4°C y luego se lavaron tres veces con 200 µ? de regulador dé pH Tris salino (TBS) que contiene 0.05% Tween 20 (pH; 7.|4) La unión inespecifica de inmunoglobulinas fue prevenida i por añadir 200 mL de albúmina sérica bovina 2% (BSA) en:TB$, y se incubó durante la noche a 4°C. Las placas fueron ¡lavadas y después central de calidad (QC) se mantuvieron a 4°G hasta su uso.

Los conjugados de enzima incluyen: anti-humano marcado con fosfatasa de anticuerpos purificados dé afinidad de cabra IgG (Jackson ImmunoResearch, CAT #109÷-O55-0D8 ) ; anti-humano de cabra marcado con fosfatasa anticuerpo purificado de afinidad IgA (Jackson ImmunoResearch, CAT#109-055-011) ; y anti-humano de cabra marcado con fosfatasa de anticuerpo purificado de afinidad IgM ' (Jackson ImmunoResearch, Cat #1109-055-043) .

Otros reactivos adicionales y los materiales incluidos en el método como se describe en este documento, incluyen: polvo salino amortiguado con fosfato (Sigma, Cat #P3813-10PAK) , albúmina sérica bovina (Biocell, Cat #3203- 00), azida de sodio (Sigma, Cat #S-2002), Tween Cat #P1379-1000ML) , glicerol (Sigma, Cat #G5516-500ML) , hidróxido de sodio (Sigma, Cat #S-5881), cloruro de magnesio (Sigma, Cat #8266), dietanolamina (Sigma, Cat 0 N solución de ácido clorhídrico (Sigma, Cat #H3162-1GA) , sustrato 5mg comprimidos: p-NPP (para-nitofenil ; fosfato) (Sigma, Cat #S-0942) y agua destilada (D. H20) . 1 ¡ Las placas de micropozos fueron preparadas y recubiertas con 12 diferentes antígenos asociados a intestino-cerebro o péptidos, como se muestra en la i figura 6. Calibradores y controles positivos y las muestras diluidas de I pacientes se añaden a los pozos y auto-anticuerpos reconociendo diferentes antigenos de unión durante la primera incubación. Después de lavar los pozos para quitar ; todas! las proteínas no unidas, fosfatasa alcalina purificada etiquetada anti-humano conjugado de IgM/IgG/IgA conejo no unido fueron removidos por un paso de lavado adicional.

Conjugado unido fue visualizado con sustrato de fosfato (PNFF) paranitrofenilo, que ofrece un producto de reacción amarillo, la intensidad del que es proporcional 'a la concentración de auto-anticuerpos en la muestra. Hidróxido de sodio fue agregado a cada pozo para detener la reacción. La intensidad del color fue leída a 405 nm.

Los frascos rojos llanos o frascos de Tigre rojo : ¡ i (tubos SST) fueron utilizados para la recogida de muestxas , aunque en ciertos aspectos, otros aparatos de colección de muestra son contemplados para este ensayo. ; Se recolectaron muestras de sangre : mediante técnicas de venopunción aséptica y suero se obtuvieron mediante procedimientos estándar. En ciertos aspectbs,: es ' I preferible un mínimo de 100 microlitros de suero para el ensayo, que por lo tanto corresponde a aproximadamente 1 mi o más de sangre.

Procedimiento de ensayo de prueba B ¡ ¡ ¡ El procedimiento analítico para el anticuerpo IgG, igM y/o igA contra LPS, proteínas intestinales ;o BBB se discute ahora. En algunos aspectos, fue permitido que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes ¦ de: que se inicie el análisis de la prueba. El procedimiento! del ensayo de prueba incluye preparar el número deseadó de pozos recubiertos o placas con el número deseado y el tipo de antigenos y/o péptidos. Una vez preparados los pozos de microtitulación, cerca de 100 µ? de calibrador de control diluido 1:100 se agregan a las filas A y B de la placa de microtitulación como se muestra en la figura 7, qué sé puede hacer utilizando una pipeta multicanal. Cerca de '100 µ? de 1:100 de muestra de prueba del paciente diluida, aquí suero de la sangre, se añadió por duplicado a los pozos de filas C y D para la primera muestra clínica filas E y F de la segunda muestra clínica y filas G y H para la tercera muestra clínica como se muestra en la figura 7. : i ; i En un separado placa, los controles positivos y negativos periódicos (es decir, semanal) similares a ¡ las muestras clínicas en duplicados se realizaron, ; como, se muestra en la figura 8.

Entonces, las placas se incubaron durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, los pozos fueron luego vaciados y lavados cuatro vecejs con PBS usando una lavadora ELISA. Cerca de 100 µ? de ahti'-humano óptimamente diluido cabra marcado con fosfatasa alcalina IgA fue agregado a la placa de IgA o cerca de 100 µ? de IgG marcado con enzima ha sido añadido a la placa IgG y anti-IgM fue añadido a la placa de IgM en la dilución óptima.! í Las placas respectivas luego se incubaron durante aproximadamente 30 a unos 60 minutos a temperatura ambiente. Unos diez minutos antes de que termine la incubación del conjugado, una solución de sustrato fue preparada mezclando unos 5 mg de la tableta de p-nitrofenil fosfato j con aproximadamente 5 mi de regulador de pH de substrato, '. qué se mezcló bien hasta que la tableta se disuelva completamente. Se lavó cuatro veces con PBS usando la lavadora1 ELISA se repitió. Luego, alrededor de 100 µ? de solución de; substrato fue agregado a cada pozo. Entonces, la placa se : incubó durante unos 30 minutos a temperatura ambiente Con1 la evitación de cualquier exposición a la luz solar directa:. La reacción fue detenida mediante la adición de unos 50 µ? de 3 N NaOH. La intensidad del color de los pozos íue leída utilizando un lector de placas de microtitulación i a 405 nm contra un pozo en blanco, con los valores de absorbañciá de i i calibradores, controles y muestras desconocidas siendo grabadas.

. C. Cálculo de resultados ; i 1 Después que la placa fue leída a 405Í nín para l i obtener los valores de densidad óptica (OD405) las1 OD promedio de los controles negativos, las OD promedio de los controles positivos y las OD medio de cada muestra clínica estaban divididos por las OD promedio de calibradores en; las filas A y B para obtener cada valor del índice (IV) .: j I Se calculó el valor de índice (IV) para cada anticuerpo contra los 12 antígenos diferentes dividiendo la Op promedio de cada muestra por duplicad por la OD promedio del valor del control del calibrador (por ejemplo, dividir la OD promedio de pozos Cl y DI por la OD promedio de los pozos Al y,Bl:, la OD promedio de pozos C2 y D2 por la OD promedio de pozos A2 y B2 la OD promedio de los pozos C3 y D3 por la OD promedio de los pozos A3 y B3, etc.) . 1 Entonces, los resultados fueron comparadds con los rangos de referencia establecidos. ' índice = OD promedio de pacientes OD promedio de calibradores D. Interpretación de resultados i. Patrón de anticuerpos IgG/IgM/IgA en , pacientes con enfermedad celiaca, reactividad y sensibilidad 1 inmune al gluten y enfermedad de Crohn: [ '¦ Ejemplos de IgG, IgM y patrones de anticuerpos; IgA de 9 sujetos sanos (cuadros 1-3) y su comparación ;con los 3 pacientes con enfermedad celiaca y permeabilidad intestinal (cuadro 4), 3 pacientes con ataxia de gluten (cuadro 5) y 3 pacientes con esclerosis múltiple (cuadro 6) se muestran en los cuadros 1-6, respectivamente.

La interpretación de datos y diferenciación en laboratorio entre la enfermedad celiaca y reactividad /sensibilidad/autoinmunidad inmune al gluten se muestran en los cuadros 7-9. i ¡ ; 1 Patrón de IgG, IgM y anticuerpos IgA contra proteínas intestinales, BBB y antígenos asociados ; en pacientes con enfermedad celiaca y permeabilidad intestinal, ataxia de gluten y los pacientes con MS i Basado en el cálculo de índices, el patrón de IgG, IgM y anticuerpos IgA en los nueve sujetos sanos de control (cuadros 1-3), 3 pacientes con enfermedad celíacá y permeabilidad intestinal (cuadro 4), 3 pacientes con ! ataxia de gluten (cuadro 5) y 3 pacientes con esclerosis múltiple (cuadro 6) se muestra en los cuadros 1-6, respectivamente. Tenga en cuenta que en todos los sujetos sanos, apairte de LPS y MBP, los índices de anticuerpos de los cuales pueden1 ser superior a 1.5 pero no significativamente mayor qué 2.0,, los índices de anticuerpos contra otros antígenos son inferiores o muy inferiores a 1.5 (cuadros 1-3) .

En pacientes con enfermedad celíaca según lo confirmado por IgG e IgA contra a-gliadina desamidáda 33-mer péptido, transglutaminasa tisular (tTg) y cortiplejo de gliadina-tTg, el patrón de anticuerpos varía de paciente a paciente.

Por ejemplo, la muestra 10 en el cuadro, 4, estos anticuerpos son significativamente elevados contra LPS, zonulina/ocludina, receptor ZOT intestinal, proteíná dé unión i 1 i ; celular, MMP-3, -B cristalino y proteína básica dé mieljina, indicando que además de aumentar la permeabilidad intestinal el paciente puede sufrir de permeabilidad BBB. La muestra 11 en la cuadro 4 muestra una elevación significativa de anticuerpos contra la proteína de unión celular y receptor ZOT intestinal y elevación moderada contra LPS,; pero no contra proteínas BBB y antígenos neuronales, indicando ; que además de la enfermedad celíaca el paciente pueden sufrir de la permeabilidad intestinal, permeabilidad BBE¡, ne'uro-autoinmunidad y posiblemente otras auto-inmunidades.! El nivel de anticuerpos IgG, IgM e IgA contra 12 diferentes antigenos representando intestino-a-cerebro én 3 ¦pacientes (muestras 13-15) con ataxia de gluten se muestra en ! ! el cuadro 5. Ataxia de gluten en estos paciénté$ ¡ fue confirmada por la presencia de anticuerpos IgG e ígA cóntra -gliadina desamidada 33-mer péptido, tTg-2, i complejo gliadina-tTg, tTg-6 y antigenos cerebelares. ¡En estos pacientes el patrón de anticuerpos fue significativamente mayor contra la proteina de unión ZOT, receptor de cerebro ZOT, a-B cristalino, calprotectina, GFAP y proteina dé unión celular, confirmando la debilitación de daño de la barrera.

El nivel de estos anticuerpos contra 12 : antigenos probados en 3 pacientes (muestras 16-18) con S se 1 resume en la cuadro 6. Además de un MRI anormal, un diagnóstico de MS fue hecho basado en la detección de anticuerpos contra MBP, ! i i glicoproteina de mielina oligodendrocito (MÓG) ; j a-B cristalino, proteina de proteolipido, activación i de linfocitos y producción de citoquinas pro-inflamatorias (44). Se detectó una elevación significativa en el ; nivel de anticuerpos contra antigenos neuronales, proteínas BBB y zonulina/ocludina . Esto es indicativo de que en efecto los pacientes con MS sufren de disfunción BBB. ; j iii. Medición de anticuerpos IgG, IgM e IgA contra lipopolisacárido bacteriano y ocludina/zonulina en; pacientes con autoinmunidad gástrica La permeabilidad intestinal es significativa en la enfermedad autoinmune gastrointestinal (4). La . figura 9 muestra diagramas que comparan la elevación de anticuerpos contra las endotoxinas bacterianas ( lipopolisacáridos ) y la estructura de las uniones estrechas (ocludina/zonulina)' en controles sanos y pacientes con autoinmunidad gástrijco.; La entrada exagerada de macromoléculas antigéríicas a través del epitelio intestinal puede iniciar la producción de y perpetuar un aumento continuo en múltiples pitoquinas inflamatorias e inflamación crónica sistémica (56) . Esto parece ser un componente necesario para el trio dé factores que conducen a la eventual enfermedad autoinmune (vulnerabilidad genética, exposición ambiental y permeabilidad intestinal). ! Según ciertos aspectos de la presente invención, se presume en el presente documento que los anticuerpos elevados a LPS, ocludina/zonulina y la red de actomiosina son biomarcadores que identifican la averia de una barrera intestinal saludable y que los anticuerpos elevados ¡a ;LPS, ocludina/zonulina, otras proteínas de unión de células , proteínas BBB más antígenos neuronales (por ejemplo MBP, ; a-B cristalino, GFAP, calprotectina y proteína ZOT del cerebro) no sólo indican la ruptura de una barrera intestinal saludable, sino también una falla en la integridad BBB.

La interpretación clínica de elevado nivel de anticuerpos contra LPS, ocludina/zonulina y actomiosina en los fluidos orales según ciertos aspectos de la presente invención se muestra en el cuadro 8.

La interpretación clínica de nivel elevado en la sangre de los anticuerpos contra LPS, ocludina/zonulina, proteína de barrera sanguínea cerebral y antígenos neuroñales según ciertos aspectos de la presente invención se muestra en el cuadro 9.

EJEMPLOS DE ESTUDIO DE CASO Dos informes de casos diferentes, el primero en un paciente con enfermedad celíaca y el segundo con esclerosis múltiple se proporcionan como sigue.

A. Informe del caso #1: Paciente con enfermedad celíaca y J. disfunción de la barrera intestinal 'I ' Una mujer de 38 años con 5'4"de altura 1\ y icori1 un peso de 106 libras con trastorno GI incluyendo estreñimiento, diarrea y dolor en todo el cuerpo, con síndrome tipo fibromialgia y pérdida, de peso (1-2 libras por mes durante los últimos seis meses) fue examinado por ún médico internista. La investigación en laboratorio reveló CBC anormal con hemoglobina de 9.9 g/dl, MCV de 77 fL, tasa de sedimentación eritrocitica de 54 mm/la hr, 'con ;baja concentración de folato y vitamina B-12 pero alto; nivel de las enzimas hepáticas y proteina C reactiva de alta sensibilidad. Perfiles bioquímicos e inmunológicos ¡detallados incluyendo ANA, factor reumatoide, niveles T3, :T4 y TSH fueron realizados y todas las pruebas estuvieron dentro; del rango normal. Después de repetidas denuncias sobre i molestias GI, febrícula y dolor de cabeza, se refirieron al paciente para la evaluación de GI . Colonoscopia y biopsi duodenal fueron realizados y evaluación inmunohistológica reveló atrofia veloositaria total con clasificación de Marsh III. En este punto se verificaron las concentraciones de ;IgG e^ IgA contra la gliadina y transglutaminasa . Tanto IgG e IgA; contra i ' ! la gliadina y transglutaminasa fueron 3-5 veces mayor ' que el rango de referencia.

Debido a la atrofia de las vellosidades, gliadina y diagnosis de positividad de transglutaminasa de la enfermedad celíaca fue hecha. El paciente era transfundido cón sangre, con medicación antiinflamatoria y comenzó una dieta libre de i ! ; gluten. Tres meses más tarde, aunque su general malestar GI había mejorado y había ganado 4 libras, su CRP fue todavía elevado y continuaba el dolor de cuerpo y fiebrej baja, En vista de esto y para determinar la causa de la inflamación y la fiebre de grado bajo, los anticuerpos contra LPS, zonulina/ocludina y proteínas de unión celular fueron examinados. Resultados presentados en el cuadro 4 la muestra 10 demostró que en comparación con sujetos sanos, el paciente (muestra 10) tenía un aumento del doble 3-6 en los niveles de anticuerpos IgG, IgM e IgA contra LPS, zonulina/ocludina y proteínas de unión celular, indicando que además de la enfermedad celíaca el paciente estaba sufriendo 1 de translocación bacteriana, daño de la unión estrecha y síndrome intestinal permeable a grandes moléculas antigénicas. ; Por consiguiente, además de la dieta : libre; de gluten, trataron al paciente para el síndrome intestinal permeable con la implementación de una dieta 1 libre de lectinas más probióticos glutamina, N-acetilcisteína, EPA/DHA, vitamina D, lactoferrina , xilitol y ácido oswélico. Treinta días después del comienzo de este régimen; de probióticos más la dieta libre de gluten y lectinas,: la condición clínica del paciente había mejorado considerablemente: su fiebre se redujo hasta 37°C y había ganado unas 6 Ib adicionales. Sesenta días después ¡ del i ; I tratamiento para intestino permeable se redujo a sólo ¡ los probióticos, pero continuó la dieta libre de glutejn. ·??< año más tarde se repitieron todas las pruebas de laboratorio y las pruebas de la repetición para gliadina, transglutaminasa, CRO, LPS y zonulina/ocludina estuvieron dentro .del rango normal, que era un indicio adicional que el tratamiento; del intestino permeable además una dieta libre de gluten 1 fue eficaz en el tratamiento de este paciente que suf.ria dé la enfermedad celiaca y el síndrome de intestino permeable.

La discusión: se ha establecido en la literatura que, además de atrofia vellosa, la mayoría de los ¡ pacientes con enfermedad celiaca, también sufren de síndrome; de intestino permeable. Por esta razón, aproximadamente sólo el 50% de los pacientes con enfermedad celiaca mejoran en una dieta libre de gluten, con la estructura de sus vellosidades, volviendo a la normalidad después de seis |meses de tratamiento. El mecanismo por el cual el síndrome de intestino permeable es inducido en la enfermedad celiaca es debido a que en algunos péptidos de gliadina específicos de individuos se unen a la célula epitelial y causan dañó a; las proteínas de la unión estrecha, causando la liberación de zonulina/ocludina y claudinas de la submucosa en la sangre. En este caso en particular, algunas de la sintomatologías: del paciente mejoró en la dieta sin gluten, pero la dieta libre de gluten no mejoró la cascada inflamatoria inducida !por la i I i translocación de LPS y permeabilidad del intestino mayor. i Sin embargo, 30-90 días después de la implementáción : del tratamiento más dieta sin-gluten para la reparación de : las proteínas de la unión estrecha usando remedios naturales (57- 61), ambas sintomatologías clínicas y resultados de laboratorio regresaron a la normalidad. Por lo 'tanto, se concluye que los pacientes con enfermedad celíaca ¡deben! ser analizados para intestino permeable por grandes moléculas que son antigénicas y tratados no sólo para la enfermedad celíaca sino también para la reparación de la barrera intestinal!. La materia inventiva de la presente invención proporciona esta capacidad. i ! I B. Informe del caso #2: Paciente con esclerosis múltiple, permeabilidad del intestino y la barrera hemato-encefálica j ¡ Un hombre de 38 años de 5' 8 "de altura; con peso del82 libras después de una historia de tres semanas de cuello progresivo, espalda y dolor muscular con debilidad de las extremidades se refirieron a un neurólogo. El j día antes de la remisión, él desarrolló dificultad en orinar con disturbio sensorial y hormigueo en su tronco y las | piernas a un nivel donde fue incapaz de subir escaleras. Sólo dos ¡años antes de la admisión, el paciente tenía problemas familiares y había llegado a estar muy deprimido, para la cual, él no había solicitado ayuda. Su historia general pasada erá de otra manera no remarcable excepto para anemia microcítica leve inexplicable que había sido tratada con suplementos de hierro y de vitamina B-12. ; rango normal. ¡ j j I ¡ ' Durante una inves igación adicional sangré y; fluido cefalorraquídeo' fue recogido y examinado para Borrelia, CMV, EBV, Herpes tipo 6, HTLV-1 y todos los cuales fueron negativos. Proteína CSF glucosa 2.3 m ol/L.

La examinación neurológica reveló visual corregida reducida de 6/48 en el ojo derecho i y 6/3:6 en el ojo izquierdo con los movimientos de ojo normal.; El paciente tenía debilidad piramidal en ambas piernas cón paso base suavemente. La examinación de pinchazo demostró un nivel I ; ! hemosensorial inferior DIO en ambos lados. ¡ ] | Una exploración de MRI del cerebro j demostró anormalidades suaves de la materia blanca con leVe átrbfia generalizada, que se ha observado en pacientes con escíérpsis múltiple. i ¡ : Sin embargo, para excluir la posibilidad de sensibilidad de gluten, enfermedad celiaca y el síndrome de intestino permeable, AGA, anticuerpo iTg y lactulosa/manitol fueron realizadas pruebas. Un tamiz celiaco reveló tanto IgG e IgA anticuerpos antitTG 3-6 veces por encima del rango de referencia pero fue totalmente negativa para IgG e IgA contra transglutaminasa . Además, el resultado de la prueba' de lactulosa/manitol era altamente anormal. En consecuencia1, se realizaron las siguientes pruebas adicionales: IgG, j IgM e1 IgA anticuerpo contra LPS, zonulina/ocludina, receptor ' ZOT intestinal, proteina de unión celular, MMP-3, ¡ proteína cerebral de unión ZOT, receptor de cerebro ZOT, calprotectina, GFAP, cristalino oc-B, proteína BBB y MBP. Resultados resumidos en el cuadro 6, la muestra 17 muestra una elevación significativa en los niveles de anticuerpos contra MBP y GFAP, confirmando los resultados anormales de MRI y una diagnosis de la esclerosis múltiple. Además, una elevación significativa de anticuerpos específicos contra zonulina/ocludina, calprotectina y proteína BBB indicáron la implicación del tracto gastrointestinal con . intestino mejorada y permeabilidad de BBB en este paciente (cuadro; 6).

Basado en estos resultados de la prueba, el paciente iréqibió 1 g de metilprednisolona intravenosa durante cinco'; días; con cierta mejoría clínica resultante. En este punto el paciente fue puesto en ß-seron, mostrando una mejoría significa iva en quince días más tarde. Además, 200 mg glutatión, más probióticos glutamina, EPA/DHA, vitamina D, lactoferrina, xilitol y ácidoi bo.swé'lico fueron dados para reparar el dañado BBB y barreras 1 del intestino. Tres meses después de este régimen I dé\ salud i ' ! general del paciente ha mejorado significativamente.! i ! Debería ser evidente para aquellos espebializados en la técnica que muchas modificaciones además de ;las ya I I descritas son posibles sin apartarse de los conceptos i ' inventivos en el presente. La materia inventiva, por lo ¡ i , tanto, no debe ser restringida, excepto en el alcance J de las reivindicaciones anexadas. Por otra parte, ! én ; la interpretación tanto la especificación ; y i las reivindicaciones, todos los términos deben interpr Ietarse de i 1 la manera más amplia posible coherente con el contexto. En í i particular, los términos "comprende" y "que comprende'' : deben interpretarse como una referencia a los plejnéntos , J i componentes, o pasos de manera no exclusiva, indicando' que j los elementos que se hace referencia, componentes cj pasos ¡ j ¦ pueden estar presentes, o utilizarse o combinarse icón otros elementos, componentes o pasos que expresamente no se hace j j 1 referencia. Cuando las reivindicaciones de especificadión se N, o B más N, etc.

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Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: ! i ¡ 1. - Un método para probar una muestra de ün humano, i que comprende: ¡ medir una primera señal derivada de unión de una primera fracción de la muestra a una toxina bacteriana;1 y medir una segunda señal derivada de unión de una segunda fracción de la muestra a un antigeno nativo, seleccionado de al menos uno de (a) un antigeno rélacitínado con el intestino y (b) un antigeno relacionados con la barrera hemato-encefálica . ) ¡ j 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la toxina bacteriana comprendé un lipopolisacárido . I 1 i 3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el antigeno relacionado con1 el intestino nativo es seleccionado de la lista que consiste: de: (1) una proteina estructural intestinal; (2) una proteína de ! : i unión estrecha; (3) un receptor de unión a la protéíná de i unión estrecha; y (4) una proteína de unión celular.; A.- El método de conformidad con la reivindlca'ción 3, caracterizado porque el antígeno relacionado i i hemato-encefalica es seleccionado de la lista que! consiste de: (1) una proteina de barrera hemato-encefálica; (2) una I proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ; (3) una metaloproteinasa de matriz (MMP) , (4) una proteinal de unión ¡ ZOT cerebral; (5) un receptor ZOT cerebral; j (6) una calprotectina; y (7) una proteína básica de mielina.1 , 5.- El método de conformidad con la reivindicación I I 2, caracterizado porque el antígeno estructural intestinal comprende actina/acetomiosina . ¡ 6.- El método de conformidad con la reivi ndicacbión 2, caracterizado porque el antígeno de unión estrecha se selecciona del grupo que consiste de ocludina y zonulina. 7. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el receptor de unión comprende el receptor ZOT intestinal. i 8. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína estructural ¡comprende I ! metaloproteinasa-3 de matriz (MMP-3) . j i 9. - El método de conformidad con la reivindicación i 1, caracterizado porque el antígeno relacionado con barirera hemato-encefálica es seleccionado de la lista quej consiste de: (1) una proteína de barrera hemato-encefálica (2) una proteína ácida fibrilar glial (GFAP); y ¡(3) 'una i i metaloproteinasa de matriz (MMP) . ! : ! i ' i 10.- Un método de diagnóstico de una enfermedad asociada con el síndrome del intestino agujereado, 'que comprende : ordenar de un laboratorio una prueba utilizando el método de conformidad con la reivindicación 1; y j analizar los resultados de la prueba. ! 11. - Un método de diagnóstico de una enfermedad asociada con la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica, que comprende: 1 , ! Ordenar de un laboratorio una prueba utiljizando el ¡ j método de conformidad con la reivindicación 1; y 1i ¦ ' analizar los resultados de la prueba. '· 12. - Una placa de prueba que tiene como! péptídos unidos: (1) una toxina bacteriana; y (2) un antígeno nativo que comprende al menos uno de (a) un antígeno relacionado ; con i 1 el intestino y (b) un antígeno relacionado con la barrera hemato-encefálica . j : - ¡ 13. - La placa de prueba de la reivindicación 12, caracterizada porque el ¡ antígeno I relacionado con intestino se selecciona de la j.ista que i comprende de: (1) una proteína estructural intestinal; : (2) una proteina de unión estrecha; y (3) a la proteína de unión estrecha; y (4) ón celular. j 14. - La placa de prueba de conformidad con' la reivindicación 13, caracterizada porque el ¡ antígeno relacionado con la barrera hemato-encefálica es seleccionado de la lista que consiste de: (1) una proteina de barrera hemato-encefálica; (2) una proteina ácida fibrilar glial (GFAP) ; (3) una metaloproteinasa de la matriz (MMP) (4) 'una proteina ZOT cerebral; (5) un receptor ZOT cerebral!; (.6) una calprotectina; y (7) una proteina básica de mielina. j 15.- La placa de prueba de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el i antigeno relacionado con la barrera hemato-encefálica es seleccionado de la lista que consiste de: (1) una prote hemato-encefálica ; (2) una proteína ácida (GFAP); (3) una metaloproteinasa de la matriz (MMP) > ('4) luna proteína de unión ZOT cerebral; (5) un receptor ZOT ¡cerebral; (6) una calprotectina; y (7) una proteína básica de . 16.- Un método de ayudar en el diagnóstico de juna enfermedad asociada con la permeabilidad excesiva de ¡una barrera anatómica, que comprende: obtener de resultados de prueba desde un j panel de prueba de anticuerpo que produce señales de unión de luna muestra del paciente a una toxina bacteriana, y nativo seleccionado de al menos uno de (a) relacionado con el intestino y (b) un antígeno con la barrera hemato-encefálica; y analizar los resultados de la prueba. 17. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra es una muestra de sangre. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la muestra es una muestra de saliva. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los résulítados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con disbiosis de la flora intestinal que es probablemente cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido y resultados negativos , para todos de IgA, IgM e IgG a ocludina y zonulina, y un resultado negativo para IgG a actomisina. ; 20. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura en la barrera intestinal por antigenos bacterianos, a través de la vía paracelular, que · es probablemente cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG ;¾ la toxina bacteriana de lipopolisacárido y resultados positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG a ocludina y zonulina, y un resultado negativo para IgG a actomisina. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura de la barrera intestinal por otros antigenos bacterianos, a través de una via paracelular, probablemente donde los resultados de la prueba incluyen un resultado negativo para todos de IgA, IgM e IgG a la toxina báctériana de lipopolisacárido, y resultados positivos para cualquiera de IgA, IgM e IgG para ocludina o zonulina, y un resultado negativo para IgG a actomisina. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura de la barrera intestinal por antigenos bacterianos, a través de una via trans-celular, probablemente donde los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados negativos ¡para todos de IgA, IgM e IgG para ocludina y zonulina, yi un resultado positivo para IgG a actomisina. ¡ 23. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura en la integridad de la barrera intestinal y hemato-encefálica inducida por la toxina bacteriana 1 qué es probable cuando los resultados de la prueba incluyen ' un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados positivos para cualquiera de IgAIgM e IgG ocludina y zonulina un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e I¾G a proteínas de la barrera hemato-encefálica, y un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para antíijjenos neuronales. 24.- El método de conformidad con la reivindicáción 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura en la integridad de la barrera intestinal y hemato-encefálica por factores ajenos a la toxina bacteriana para ser probablemente cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado negativo para cada uno de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido, y resultados positivos para cualquiera de IgAIgM e IgG a ocludina y zonulina, un resultado positivo para cualquiera de IgÁ, IgM e IgG a proteínas de la barrera hemato-encefálica, y;, un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para antígenos neuronales. ; 25.- El método de conformidad con la reivindicáción 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relaciónado con la disbiosis de la flora intestinal sin rompimiento eñ la integridad de la barrera intestinal y con rompimiento en la integridad de la barrera hemato-encefálica para ] ser probablemente cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, Ig e ígG a la toxina bacteriana de lipopolisacérido, y resultados negativos para cada uno de IgAIgM e IgG a ocludina y zonuliná, un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM é IgG a proteínas de la barrera hemato-encefálica, y un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG para antígenos neuronales . · 26. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico relacionado con la ruptura en la integridad de la barrera heitiato-encefálica, neuro-inflamación y neuro-inmunidad, : sin asociación con la barrera intestinal o disbiosis de flora intestinal para ser probablemente cuando los resultados de la prueba incluyen un resultado negativo para cada uno de IgA, IgM e IgG a la toxina bacteriana de lipopolisacárido;, y resultados negativos para cada uno de IgAIgM e IgG a ocluidina y zonulina, un resultado positivo para cualquiera de IgA, ; IgM e IgG a proteínas de la barrera hemato-encefálicá, y: un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e ÍgG ; para antígenos neuronales. , 27. - El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el paso de analizar los resultados de la prueba comprende considerar un diagnóstico de uno de la esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkihson, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, o neuropatía periférica y depresión mayor que es probablemente donde los resultados de la prueba incluyen un resultado positivo para cualquiera de IgA, IgM e IgG a proteínas de la ' barrera hemato-encefálica y un resultado positivo para cualquiera de IgAIgM e IgG a antígenos neuronales.