KR20140052941A

KR20140052941A - 장, 혈액-뇌 장벽 투과성 검출 방법 및 테스트 물질

Info

Publication number: KR20140052941A
Application number: KR1020137022644A
Authority: KR
Inventors: 아리스토 보즈다니
Original assignee: 이뮤노사이언시스 랩. 인크.
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2014-05-07
Also published as: JP2014503829A; AU2016262726B2; IL227676A; CN105823887B; WO2012103324A3; EP2668498B1; IL250871A0; RU2607479C2; EP2668498A2; CA2964555C; HK1189938A1; IL227676A0; RU2016149216A; NZ614707A; CN105823887A; RU2013139476A; CA2964555A1; US8663911B2; US20140186855A1; BR112013019380A2

Abstract

본 발명은 장 및/또는 혈액-뇌 장벽 투과성 관련 항원 테스트를 위한 방법, 분석방법 및 장치에 관한 것이다. 예를들면, 혈액, 타액 또는 기타 체액은 (1) 세균 독소 (바람직하게는 지질다당류)에 대한 결합 및 (2) (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나에서 선택된 조직 항원에 대한 결합이 테스트된다. 테스트 결과는 장 누수 증후군 관련 질환 (세포주위 또는 세포횡단 경로로 인한 것인지 여부, 및 세균 독소 또는 기타 원인으로 인한 것인지 여부) 및/또는 과다 혈액 뇌 장벽 투과성 관련 질환 검출 및 진단을 지원하기 위하여 사용되고, 신경염증 및/또는 신경자가면역병태, 특히 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 또는 말초 신경병증, 주요 우울증 중 하나 진단에 사용된다.

Description

장, 혈액-뇌 장벽 투과성 검출 방법 및 테스트 물질{METHOD FOR DETECTINON OF INTESTINAL, AND BLOOD-BRAIN BARRIER PERMEABILITY AND TESTING MATERIALS THERETO}

본원은 전체가 참조로 통합되는 2011.1.28자 출원된 미국임시출원번호 제61/437,244호의 이익을 주장한다. 본 발명은 장 및 혈액-뇌 장벽 투과성 검출 및 진단을 위한 방법, 분석장치 및 키트에 관한 것이다.

인체의 다른 세포 기관에 비해, 장 상피세포는 섭취 식품, 효모, 세균 및 바이러스로부터 유래하는 거대한 수의 항원에 노출된다. 일부 세균 항원은 점막 면역시스템에 위협은 아니지만 다른 것은 숙주에 유해할 수 있다. 장내 면역시스템은 조절 T 세포 기능이나 이러한 항원에 대한 내성을 유발시키기 위해 소량의 분자들이, 점막 및 전신 면역 체계와 상호 작용하는 상피세포를 침투할 수 있도록 함으로써, 장 내강에서 이러한 세균 항원을 감시한다. 그러나, 이러한 세균 항원에 장내 면역시스템이 부적절하거나 과도하게 노출되면 조절 기전 붕괴의 원인이 되고 위장 질환이 발병할 수 있다 (1). 따라서 항원 흡수의 생리학적 이해는 염증 및 자가면역반응을 포함하여 질병 병인을 이해하는데 핵심이다 (2).

이들 및 본원에서 논의된 다른 모든 외재성 물질은 전체가 참조에 의해 본원에 통합된다. 통합되는 참조문헌에서 용어 정의 또는 사용이 불일치하거나 본원에서 제공하는 용어 정의와 배치되는 경우, 본원에서 제공되는 용어 정의가 적용되고 참조문언에서의 해당 용어 정의는 적용되지 않는다.

장 투과성 증가는 여러 자가면역질환 발병에 선행하는 초기 단계로 이해된다 (3-6). 이러한 이유로, 최근 위장관 뿐 아니라 신경계 등의 장외 기관을 대상으로 다양한 병적 상태의 병인으로 장 장벽 기능 이상 역할에 대한 관심이 증가하고 있다 (7). 염증, 자가면역 및 암에 대한 생물학적 진입구로서 장 장벽 기능의 조절 이상은 Fasano 문서에서 논의되었다 (7). 이전 Fasano 문서 (4)뿐 아니라 본 문서에서, Fasano는 위장관 주요 기능은 전통적으로 소화 및 영양소 흡수와 전해질 및 물 항상성에 제한되어 인식되었다는 것을 강조했다. 위장관 해부학적 및 기능적 구성에 대한 더욱 세심한 분석으로, 본 기관의 또 다른 매우 중요한 기능은 장벽 기전을 통해 환경과 호스트 사이에 거대분자의 수송을 조절할 수 있다는 것을 제안한다. 장-관련 림프조직 및 신경 내분비망과 함께, 장 상피 장벽은, 세포간 융합막과, 자기 항원에 대한 내성 및 면역 사이 균형을 조절한다.

조눌린 / 오클루딘은 거대분자 수송에 관여하는 세포주위 융합막 (tight junction)의 생리 조절자이고 따라서 면역 반응과 내성 간 균형을 이룬다 (7). 환경 요인에 유전적으로 취약한 개인에서 미세 조절되는 장 장벽 단백질이 조절이상이 오면, 만성소화장애증, 크론병 및 궤양성 대장염과 같은 장 질환, 및 과 같은 여분의 장자가 면역 질환 관절염, 루푸스, 갑상선, 당뇨병. 및 심지어 다발성 경화증 (MS), 악성 종양 및 주요 우울증과 같은 장외 자가면역질환 발생 가능성이 있다 (8-14). 장 및 뇌 장벽 기능 장애의 병태 생리, 따라서 장 및 장외 자가면역에서의 관여하는 중요한 환경 요인 중 하나는 세균성 지질다당류 (LPS)이다. 장 미생물총의 장내세균불균형 및 세균 이동으로, LPS는 상피세포의 톨-유사 수용체 활성화 및 염증반응 활성화에 기여하고 이 결과 먼저 장 장벽 다음으로 혈액-뇌 장벽 기능이상을 유발한다 (14). "장 누수" 및 "뇌 누수" 증후군 유도에 대한 LPS 역할은 도 1에 도시된다.

도 1은 GI 관 이상이 장 장벽 온전성을 손상시키고 따라서 혈액 순환에 소화되지 않은 항원의 침입을 증가시켜 면역시스템에 위협이 된다는 것을 강조한다. 이러한 항원에 대한 반응은 면역 및 염증 반응을 활성화하는 것이고, 이 결과 염증성 시토카인, 항체 어레이 생성 및 장 장벽 투과성 증가 (또는 "장 누수" 증후군)으로 이어진다. 장 장벽 조절이상이 치료되지 않고 남아있는 경우, 결과는 신경염증, 신경침투 및 신경퇴행을 유발할 수 있다.

따라서 혈액-뇌 장벽을 개방시키고 이후 신경염증 및 신경퇴행을 유발하는 염증을 포함한 면역시스템에 위협적인 거대 항원 분자의 장 투과성의 측정을 위한 비 침습적 방법, 장치, 및 분석장치에 대한 필요성은 존재한다. 본 발명은 이러한 필요성 및 기타 요구사항을 위한 것이다.

본 발명은 장 및/또는 혈액-뇌 장벽 투과성의 검출 및 진단을 지원하기 위해 테스트 할 수 있는 장치, 시스템, 분석장치 및 방법을 제공한다.

본 발명의 특정 측면에서, 샘플의 하나 이상의 분량은 (1) 세균 독소에 대한 결합,및 (2) (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나에서 선택된 천연 항원에 대한 결합이 테스트된다. 어떤 측면에서, 세균 독소는 유리하게는 지질다당류를 포함한다.

장 투과성을 테스트할 때, 천연 장-관련 항원은 바람직하게 (1) 장 구조 단백질; (2) 융합막 단백질; (3) 융합막 단백질에 대한 결합 수용체; 및 (4) 세포 경계 단백질로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 특정 측면의 실시예에서, 액틴/액토미오신, 오클루딘 및/또는 조눌린, 장 ZOT 수용체 및 기질 금속단백질분해효소-3 (matrix metalloproteinase-3) (MMP-3) 중 하나 이상에 대한 항체 테스트가 진행된다.

혈액 뇌 장벽의 투과성을 테스트할 때, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 바람직하게 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP); (4) 뇌 ZOT 결합 단백질; (5) 뇌 ZOT 수용체; (6) 칼프로텍틴; 및 (7) 수초 염기성 단백질로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 특정 측면의 실시예에서 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP) 중 하나 이상에 대한 항체 테스트가 진행된다.

진단의 관점에서, 상기 설명한 방법 중 하나 이상의 테스트 결과 분석은 장 누수 증후군 및/또는 과도한 혈액 뇌 장벽의 투과성과 관련된 질환 검출 및/또는 진단지원에 적용될 수 있다.

본 발명의 소정 측면에서, 각각의 성분에 대한 결합 샘플 검출은 면역분석으로 수행되며, 제한되지는 않지만, ELISA 분석, RIA 분석, 라텍스 응집, 비드 분석, 단백질 분석 및 기타 당업자에게 알려진 면역분석법을 포함한다.

본 발명의 특정 측면에서, 면역분석용 테스트 플레이트 및 키트가 제공되며, 예를들면, 개선된 테스트 플레이트는 결합 펩티드로서 (1) 세균 독소, 및 (2) (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 천연 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나로 구성되는 천연 항원을 가진다.

장 누수 증후군과 관련된 질병을 검출 및 진단하거나 식별을 지원하는데 사용되는 특히 바람직한 테스트 플레이트에서, 장-관련 항원은 바람직하게는 (1) 장 구조 단백질; (2) 융합막 단백질; (3) 융합막 단백질에 대한 결합 수용체; 및 (4) 세포 경계 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.

과도한 혈액 뇌 장벽의 투과성과 관련된 질병을 진단하거나 식별하는데 특히 바람직한 테스트 플레이트에서, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 바람직하게는 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP); (4) 뇌 ZOT 결합 단백질; (5) 뇌 ZOT 수용체; (6) 칼프로텍틴; 및 (7) 수초 염기성 단백질로 이루어진 군에서 선택된다.

장 누수 증후군과 관련된 제1조의 항원 및 과도한 혈액 뇌 장벽 투과성과 관련된 제2조의 항원 모두에 대해 집합적으로 테스트할 수 있는 하나 이상의 플레이트를 포함하는 테스트 키트가 고려된다.

더욱 일반적인 관점에서, 해부학적 장벽의 과도한 투과성과 관련된 질병의 검출 및 진단을 지원하는 방법 및 장치가 본원에 고려되고, 이는, 환자 샘플이 세균 독소, 및 (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 천연 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나에서 선택되는 천연 항원과의 결합으로 인한 신호를 발생시키는 항체 테스트 패널로부터 테스트 결과를 얻고 분석하는 단계로 구성된다.

본원에서 고려되는 이들 모든 방법 및 장치에서, 샘플은 임의의 적합한 신체 샘플을 포함하고, 예를들면 전혈 샘플, 혈청 샘플, 타액 샘플 또는 기타 체액 샘플을 포함한다.

본원에서 고려되는 방법 및 장치는 (1) 장 미생물총의 장내세균불균형, 및 (2) 장 장벽 붕괴와 관련된 질병에 대한 구별 진단 진원에 적용될 수 있다. 예를들면, 장 미생물총의 장내세균불균형 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 진단된다.

또한 세포주위 경로 및 세포횡단 경로로 인한 장 장벽 붕괴 구별 진단을 지원할 수 있다.

세포주위 경로 붕괴와 관련하여, 세균 항원에 의한 장 장벽 붕괴 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 또는 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 진단된다. 반대로 세균 항원 이외로 인한 장 장벽 붕괴 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 또는 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 진단된다.

세포횡단 경로 붕괴와 관련하여, 세균 항원에 의한 장 장벽 붕괴 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 진단된다.

또한 본원에 논의된 발견에 의하면, 세균 독소에 의한 장 및 혈액 뇌 장벽 온전성 모두의 붕괴 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 진단된다.

반대로, 세균 독소 이외의 인자에 의한 장 및 혈액 뇌 장벽 모두의 붕괴 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 진단된다.

또한 장 미생물총 장내세균불균형은 장 장벽 온전성 붕괴가 아닌 혈액 뇌 장벽 온전성 붕괴로 유발될 수 있다. 예를들면 이러한 경우 장 미생물총 장내세균불균형 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 진단된다.

유사하게, 장 장벽 또는 장 미생물총 장내세균불균형과 관련 없는, 혈액 뇌 장벽 온전성 붕괴, 신경염증 및 신경자가면역 관련 진단은, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 진단된다.

특정 질병과 관련하여, 본원에서 고려되는 테스트 결과 분석은 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 또는 말초 신경병증, 주요 우울증을 검출하고 진단을 지원하기 위해 사용할 수 있다. 이러한 병태는, 테스트 결과, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 진단된다.

본 발명의 다양한 목적, 특징, 양태 및 장점은 첨부 도면 및 표와 함께 바람직한 실시태양의 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 장 누수 (leaky gut)와 뇌 누수 증후군 유도에 대한 LPS의 역할을 보여주는 도면이다.
도 2는 LPS의 염증 반응 유도, 시토카인 생성 및 Th17 양성세포 증가: 염증 및 신경면역성 질환의 병인에서 염증 및 Th17 림프구 활성화 유도에 대한 LPS 역할을 보여주는 도면이다.
도 3은 치료되지 않는 경우 점막 내성 상실이, 장 장벽 기능장애, 전신 염증, 신경염증, 신경침투 및 신경퇴행을 유도할 수 있는, 장 내지 뇌 기능이상의 병인을 보이는 도면이다.
도 4는 비정상적인 장 투과성과 혈액 뇌 투과성이 장 투과성 식별 (IPI) 및/또는 혈액 뇌 투과성 식별 (BBPI)에 사용될 수 있는 본 발명의 제안 시나리오를 보이는 도면이다.
도 5는 본 발명의 특정 측면에 따라 자가면역질환 병인에서 제안된 비정상적인 장 투과성의 역할을 보여주는 도면이다.
도 6은 본 발명의 특정 측면에 따른 12 개의 상이한 항원 및 펩티드를 가지는 12 행 미세적정 플레이트인 면역분석용 샘플 미세적정 플레이트의 배치를 보이는 도면이다.
도 7은 본 발명의 특정 측면에 따른 샘플 미세적정 플레이트의 배치를 나타내는 도면이고, 장 및 BBB 단백질 및 관련 조직항원인 12 개의 상이한 항원 또는 펩티드 (결합된 항원 및 펩티드는 투명)에 대하여 IgG/IgM/IgA가 측정된다.
도 8은 본 발명의 특정 측면에 따른 샘플 미세적정 플레이트의 배치를 나타내는 도면이고, 정성 조절 목적으로 음성 및 양성 대조군으로 IgG/IgM/IgA가 매주 측정된다 (결합된 항원 및 펩티드는 투명).
도 9는 건강한 기증자 및 위장 자가면역 환자의 세균 지질다당류 및 오클루딘/조눌린에 대한 IgG, IgM, 및 IgA를 비교한 것이다. 건강한 기증자의 세균 지질다당류에 대한 IgG, IgM, IgA 및 IgG + IgM + IgG 수준 상승은 좌측 그래프에서 밝은 막대로 표시되고, 위장 자가면역 환자의 경우 평균 이상의 2 표준 편차 범위로 어두운 막대와 같이 표시된다. 건강한 기증자의 오클루딘/조눌린에 대한 IgG, IgM, IgA 및 IgG + IgM + IgG 수준 상승은 우측 그래프에서 밝은 막대로 표시되고, 위장 자가면역 환자의 경우 평균 이상의 2 표준 편차 범위에서 어두운 막대로 표시된다.
표 1은 본 발명 특정 측면에 따라, 3 건강 개체들 (샘플 1-3)의 제1조에서 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 2는 본 발명 특정 측면에 따라, 3 건강 개체들 (샘플 4-6)의 제2조에서 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 3은 본 발명 특정 측면에 따라, 3 건강 개체들 (샘플 7-9)의 제3조에서 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 4는 본 발명 특정 측면에 따라, 만성소화장애증 및 장 투과성의 3 환자들 (샘플 10-12)의 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 5는 본 발명 특정 측면에 따라, 글루텐 실조인 3 환자들 (샘플 13-15)의 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 6은 본 발명 특정 측면에 따라, 다발성 경화증 (MS) 3 환자들 (샘플 10-12)의 환경 장 인자 (LPS), 장 및 BBB 단백질 및 관련된 항원을 나타내는 12 개의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM, IgA 항체 수준을 보인다.
표 7은 본 발명 특정 측면에 따라, 혈액에서 LPS, 오클루딘/조눌린과 액토미오신 망상조직에 대한 특정 항체에 관한 임상 해석을 보인다.
표 8은 본 발명 특정 측면에 따라, 타액에서 LPS, 오클루딘/조눌린과 액토미오신에 대한 특정 항체 수준 상승에 관한 임상 해석을 보인다.
표 9는 본 발명 특정 측면에 따라, 혈액에서 LPS, 오클루딘/조눌린, 혈액 뇌 장벽단백질 및 신경세포 항원에 대한 특정 항체 수준 상승에 관한 임상 해석을 보인다.

항원 침투 증가는 질환 발병의 전제 조건이다. 많은 병태에서 장 투과성이 증가되고 따라서 항원 흡수가 증가하는 것으로 알려져 있다. 내강에서 면역원 분자 또는 항원 흡수로 면역-매개 활성이 있어나고, 장내에서는 IgA 및 IgM 형태로, 장외에서는 항원 특이적 IgA, IgM, IgG 및 면역복합체가 생성된다 (26, 27).

I. 혈액-뇌 장벽 교반 및 신경염증 유도에 대한 세균 독소 및 염증 시토카인의 효과

혈액-뇌 장벽 (BBB)??은 내부 환경 및 중추신경계 안정성을 유지한다. BBB의 구조 및 기능적 변화는 자가면역질환, 특히 다발성 경화증과 같은, 특히 신경자가면역 질환의 원인이 될 수 있다 (28).

BBB는 일반적으로 감염, 독소, 흥분독성, 또는 외상 과 같은 환경 요인에 대한 응답으로 일어날 수 있는 괴사성 세포사멸이 발생하는 뇌 실질 (parenchyma)과, 의 괴사성 손상에 대하여 통상 응답하는 혈액 백혈구를 분리한다 (23). BBB는 두 개의 층으로 구성된다. 첫 번째 층은 장 상피 세포와 구조적으로 유사한 풍부한 융합막을 가지는 혈관 내피 세포로 구성된다 (24, 28). 두 번째 층은 신경아교세포 족양돌기에 의해 형성되는 신경아교세포의 경계이다 (29). 내피세포와 성상세포 사이의 혈관 주위 공간은 미성숙 수지상 세포처럼 거동하는 대식세포로 채워진다(29). 따라서 상피 TJ 장벽을 열수 있는 요소는 BBB와 신경조직 모두를 파괴할 수 있다 (30-33). 이것은 세균 독소, 염증성 시토카인, 효소 및 효과기 세포 Th1, Th17를 포함하고, 중추 신경계 염증에 필수적이다 (29, 34-35).

독소, 시토카인, 케모카인, 부착 분자, 및 기타에 의한 BBB 붕괴, 및 전신구획에서 중추 신경계로 T-세포 수송은 MS 병변 진행에 중요한 역할을 한다 (36-38). 그러나 인간 TH1 대 Th17 림프구를 비교할 때, 인간 Th17 림프구가 TH1 림프구보다 BBB를 더욱 신속하게 통과한다. 실제로 다수의 IL-17- 및 IL-22-발현 CD4+CD45RO+ 기억 림프구가 BBB 통해 이동하여 IL-17+ 및 IL-22+ 마커를 발현하고, 이는 체외 및 생체에서 BBB를 통과할 수 Th17 림프구 기능을 확인하는 것이다 (35). BBB 내피세포는 IL-17R 및 IL-22R을 발현하고, 이는 Th17 림프구에 의해 사용되어 BBB 내피 세포 (ECS)를 침투시킨다. IL-17, IL-22가 인간 BBB-ECS의 단층에 첨가될 때 BBB에 걸쳐 소 혈청 알부민 (BSA), 거대분자 등의 세포 또는 항원이 확산이 크게 높아진다. 이러한 BBB-ECS의 투과성 상승은 두 가지 중요한 융합막 단백질인 오클루딘 및 조눌린의 발현 감소와 상관 관계가 있다 (39).

이러한 결과는 혈관-뇌 장벽 내피세포에서 Th17 림프구의 IL-17 및 IL-22 수용체 발현 활성화를 유발시키는 LPS 및 기타 세균독소에 의한 염증은 Th17 및 BBB 융합막 결합으로 이어질 수 있다는 것을 강하게 시사한다. 이것은 융합막을 교란시켜, Th17 및 자가반응성 T 세포의 BBB 횡단 이행, 신경세포 파괴로 이어지는 Th17에 의한 그랜자임-B 및 CD4 세포에 의한 인터페론-감마 방출, 순환계로 신경세포 항원 및 BBB 단백질의 방출 (IL-17 및 IL-22 작용으로 IL-17, IL-22 및 그랜자임 B 를 공동-발현하는 세포)로 이어지고 BBB 유도 및 파괴, 순환 CD4+ 림프구 및 수용성 분자로의 BBB 침투성 이에 따른 CNS 염증에 중요한 역할을 한다 (40-44). 염증성 및 신경면역성 질환 병인에서 Th17 림프구 역할은 도 2에 도시된다. 이러한 작용 기전에 따라, 장 투과성 세균독소 유도 및 BBB 단백질 구조 교란은 LPS에 대해서만 아니라 융합막 단백질 및 BBB 단백질에 대한 항체 생성으로 이어진다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에 따라 신경염증에 대한 도전은 LPS, 오클루딘, 클라우딘, BBB 단백질, 융합막 단백질, 효소 예컨대 기질금속단백질분해효소 및 관련 수용체 항체에 대한 테스트로 개시되고, 이에 따라 의료진은 위장 장벽 기능이상 회복, 전신염증 완화 및 혈관-뇌 장벽 회복으로 이어지는 계획이 가능하다.

혈관-뇌 장벽 내피세포에서 IL-17 및 IL-22 수용체 발현으로 Thl7 세포는 BBB 융합막에 결합된다. 이에 따라 융합막이 교란되고, 자가반응성 CD4 세포 및 신경퇴행으로 이어진다. 이후 Thl7 세포는 BBB를 횡단 이송되고, 그랜자임 B 방출로 뉴런 괴사 단계에 이른다. 이러한 신경세포 항원 방출은 신경자가면역 및 신경퇴행의 악성 순환을 낳는다.

여기에 제시된 정보를 바탕으로, 장은 많은 신경퇴행성 질환 시작점이라고 가정한다. 불균형한 미생물총에서 시작되어, 다량의 지질다당류 (LPS) 방출로 이어진다. 다량의 LPS 내독소는 친 염증성 시토카인 TNF-알파 및 IL-l베타를 상향 조절하여, TJ 및 오클루딘 및 조눌린을 포함한 이들 단백질 분해 또는 분리로 이어진다. 이후 BBB로 이행하는 혈액 흐름에 염증이 생긴다. 염증은 BBB를 개방시켜, 신경-침윤, 신경염증, 신경자가면역 및 최종적으로, 신경퇴행을 유발시킨다. 도 3은 신경퇴행으로 이어지는 병태생리를 보인다; 환자의 장 장벽 기능이상이 치료되지 않으면, 신경염증 및 시간 경과에 따라 잠재적으로 신경퇴행으로 발전할 수 있다. 많은 자가면역 질환은 다중 촉발, 증상 및 전선 기능이상을 포함한다. 신경자가면역의 경우, LPS, TJ, 및 BBB 단백질에 대한 고수준의 항체를 생성하는 많은 환자의 경우, 면역시스템 및 신경계가 관여된다. 이들 두 시스템에 대한 공통 원인은 GI 관이고, 이에 대한 중요성이 언급되었다 (43).

따라서, 본 발명의 특정 측면에서, TJ 단백질 예컨대 오클루딘, 세균 내독소 예컨대 LPS, 및 BBB 단백질에 대한 항체 검출 및 측정은 GI 및 장 장벽 온전성 평가뿐 아니라, 전신 염증, 신경염증, 신경침투 및 신경퇴행의 근본원인을 결정 및/또는 진단하는 최선의 방법이다. 또한, 임의의 장 상피 병변은 즉시 치료되어야 한다. 그렇지 않으면, 이것은, 식이단백질, 공생 및 병원성 세균이 순환계로 침투하는 것을 방치하는 것이고, 염증성 반응을 촉진시켜 복합 자가면역 및 신경면역 질환으로 이어진다.

II. 작은 당 대 거대 항원성 분자의 투과성 측정

장 투과성 평가를 위한 현재 방법은 락툴로오스 및 만니톨을 이용하는 것이다. 지난 40년간, 이것은 유용한 임상 방법이었다. 락툴로오스 흡수는 장 장벽 열상을 의미하였고, 따라서 장 투과성으로 보았다. 일반적인 신념과는 달리, 이러한 소분자의 흡수는 사실은 열상이라고 보다는 미세 누출을 의미한다. 락툴로오스는 상대적으로 소분자이고, 이러한 물질의 장막 횡단 이송은 식품 또는 기타 단백질 이송 및 이들에 대한 면역반응 상황을 반영하지 않는다. 더욱이, 락툴로오스/만니톨 테스트는 세포주위를 통과하는 소분자만을 측정하는 것이고 세포횡단 경로를 통한 소분자 이송에 대하여는 그렇지 않다.

따라서, 거대 분자 장 투과성 식별 (LMIPI)는 거대 분자 예컨대 항원성이고 면역시스템에 위협적인 세균 내독소 (식이 단백질 크기와 동등)를 이용하여야 한다. 더욱이, BBB 투과성과 관련하여, BBB 투과성 변화는 MS 및 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에서 주요 개시 인자라는 몇몇 증가가 있지만 (45-50), BBB 투과성 측정을 위한 혈액 테스트를 인지되지 않았다. 그러나, 동물실험에서 장벽 손상 장애를 측정하기 위하여 조눌린/오클루딘을 이용하여 BBB의 형태학적 및 기능적 변화가 입증되었다 (7, 11, 28).

도 4에 도시된 바와 같이, 본 방법은 항원성이고, 장벽에서 방출되면, 면역계에 위협적인, 이에 따라 특이적 IgG, IgM 및/또는 IgA 항체를 생성하는 거대 분자에 초점이 있고, 이것은 혈액, 혈청 및/또는 타액 샘플에서 검출될 수 있다.

거대 항원성 분자 예컨대 세균 내독소 및 식이 단백질에 대한 장 장벽 투과성 평가는 위장 및 자가면역 질환의 병인 이해에 중요하다. 많은 위장 및 자가면역 질환은 내독소 및 기타 장벽을 통과하는 호기성 및 염기성 세균의 세균독소의 수송 증가를 동반한다는 과학적 증가가 있다 (7, 51-55). 이러한 수송 증가 및 이와 관련된 염증은 융합막 단백질 분해 및 융합막 단백질 예컨대 오클루딘/조눌린 및 세균 내독소 예컨대 LPS에 대한 면역반응을 유도한다. 실제로, exposed to 세균독소 또는 글리아딘에 노출된 래트 및 인간 상피세포는 상당량의 조눌린을 분비한다. 이러한 조눌린 방출은 융합막 복합체에서 단백질 ZO-1 분리로 이어지고, 세포주위 경로를 통한 장 투과성이 유발된다 (7, 51). 많은 만성 질환은 LPS 및 기타 병원성 세균 항원에 대한 혈청의 고수준 IgA 및 IgM가 동반된다 (24, 25). 이러한 병태는 장 염증 및 점막 장벽 투과성을 유도하고, 이에 따라 장벽 세포들 사이 공간이 확장되고 융합막 단백질 분리로 액토미오신 망상구조 및 보호 장벽 상실로 이어진다. 이러한 보호 장벽 상실로 세균 이송이 증가되고 따라서 혈청 내독소, 융합막 단백질, 및 액토미오신 농도가 증가된다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, LPS, 융합막 단백질 (오클루딘/조눌린) 및 액토미오신에 대한혈청 IgA 및 IgM 증가는 장 장벽 투과성 및 장벽을 통한 거대분자 이송을 의미한다. 세균 내독소는 T 림프구에 대한 초항원으로 작용하는 세균독소를 통해 또는 분자모방이라 칭하는 기전을 통해 자가면역을 일으킬 수 있다. 많은 세균은 신경조직을 포함한 인간 조직 항원과 매우 유사한 항원성 부위를 가진다. 장 장벽 투과성이 확인되지 않고 방치되면, 항원 및 이에 대하여 생성되는 항체의 염증성 반응은 이번에는 여러 조직들에서 먼저 염증 이후 신경자가면역을 포함한 자가면역을 촉발시킨다. 따라서, 항원성 장 장벽 투과성은 진행이 허용되고, 계속적인 퇴행으로 전신 염증, 이어 항원성 및 세포성 혈액 뇌 장벽 투과성 유도가 촉발되고, 동시에 추가적인 면역반응이 진행되어 결국 신경염증, 신경침투 및 신경퇴행에 이른다.

따라서, 본 발명의 특정 측면에 따르면, 만성 염증성 및 자가면역 병태를 가지는 환자는 세균 LPS, 융합막 단백질 및 액토미오신에 대한 IgA, IgG 및/또는 IgM을 측정하여 거대 항원성 분자에 대한 장 투과성 존재 여부를 확인하여야 한다. 마지막으로, LPS 및 오클루딘/조눌린에 대한 IgA, IgG 및/또는 IgM 항체 측정 외에, 신경면역 질환을 가지는 환자는 또한 BBB 단백질, 효소, 관련 수용체, 및 신경세포 항원에 대한 이들 항체가 측정되어야 한다. 세균독소에 의한 이러한 다중-단계 TJ 분해 및 TJ 단백질, LPS 및 조직 손상 및 자가면역에 이를 수 있는 기타 세균 항원 방출에 대한 항체 생성이 도 5에 도시된다.

본 발명의 특정 측면에 따르면, TJ 단백질 및 LPS에 대한 타액에서 IgA 및 IgM 검출 및 측정 및 혈액에서 IgG, IgM 및 IgA 검출 및 측정은 장 장벽 기능 평가의 최선의 분석이고, 혈액에서 LPS, 오클루딘/조눌린 및 기타 융합막 단백질, 더불어 BBB 단백질 및 신경세포 항체 (IgG, IgM 및 IgA) 검출 및 측정은 장/BBB 투과성 및 신경자가면역 평가를 위한 최선의 방법이다.

세균 항원 (LPS)은 융합막 분해 및 조눌린 방출을 유도하고, 융합막 개방 및 오클루딘 및 LPS의 융합막 통과 및 연속하여 점막하층으로 이송을 유발시키고, 여기에서 오클루딘 및 LPS는 대식세포 및 수지상 세포에게 제시된다. 대식세포는 이들 항원을 T 및 B 세포에게 제시하고; 체액성 (오클루딘 및 LPS에 대한 IgA, IgM 및 IgG 항체) 및 세포성-매개 이상 면역반응이 이어진다. 체액성 및 세포성-매개 면역 사이 이러한 상호 작용은 궁극적으로 장 상피 및 기타 조직 항원을 목표로 자가면역 프로세스를 담당하고, 자가면역 질환의 전형적인 조직손상으로 이어진다.

일부 테스트 환자들에 대한 하기 예시적 분석, 이용 및 평가가 기재된다. 본원에 기재된 것과 유사 또는 균등한 기타 재료 및 방법이 본 발명의 구현 또는 시험에 적용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 본 발명을 더욱 설명하기 위하여 예시적 기재에 설명될 것이다.

ELISA 분석

A. 재료 및 방법 - 플레이트 및 샘플 제조:

대장균 (E. coli) 055:85; 대장균 K-235, 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 장염균 (Salmonella enteritidis), 쥐티푸스균 (Salmonella typhimurium), 폐렴간균 (Klebsiella pneumonia), 모르가넬라모르가니균 (Morganella morganii), 하프니아 알베이 (Hafnia alvei), 시트로박터균 (Citrobacter koseri)의 지질다당류, 액틴, 액토미오신, 수초 염기성 단백질 및 α-B 크리스탈린은 Sigma/Aldrich (세인트 루이스, MO)에서 구입하였다. 신경아교섬유산성단백질 (GFAP)을 Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN)에서 구입하였다. 또한 사용 물질은 조눌린 펩티드 1, 2, 3, 장 ZOT 수용체, 수초 염기성 단백질 펩티드 87-106, 세포경계 단백질, 기질금속단백질분해효소-3, 본 연구에서 S100-B로 명명된 칼슘-결합 영역, BBB-1 MSELEKAMVA LIDVFHQYSG REGDKHKLKK, BBB-2 SELKELINNE LSHFLEEIKE QEVVDKVMET, BBB-3 LDNDGDGECD FQEFMAFVAM VTTACHEFFE HE, 뇌 ZOT 결합 단백질- 1, -2, 칼프로텍틴 (MRP-8), 및 뇌 ZOT 수용체.

90% 이상의 순도를 가지는 모든 펩티드 HPLC 등급은 EZ Biolab (Carmel, IN)에서 합성되었다. 본원에서 문맥상 반대로 명시되지 않는 한, 본원에 제시된 모든 범위는 끝점을 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 개방 범위는 상업적으로 실제 값을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 비슷하게 문맥상 반대로 표시하지 않는 한, 모든 목록 값은 중간 값을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

항원 및 펩티드를 1.0 mg/ml의 농도로 메탄올에 용해하고, 0.1M 탄산-중탄산염 버퍼, pH 9.5, 및 50ul에 1:100으로 희석하고, 도 6과 같이 바닥이 평평한 폴리스티렌 ELISA 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

플레이트는 4°C에서 하룻밤 배양하고, 0.05% 트윈 20 (pH 7.4)을 포함한 트리스-완충식염수 (TBS) 200ul로 3 회 세척하였다. TBS 중의2% 송아지알부민혈청 (BSA) 200mL를 첨가하여 면역글로불린의 비-특이적 결합을 방지하고, 4 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 플레이트를 세척하고 및 정량 관리 (QC)를 실시 한 후 사용할 때까지 4°C에 보관하였다.

포함된 효소 접합체: 친화성 정제 항체 포스파타제-표지 염소 항- 인간 IgG (Jackson ImmunoResearch, Cat #109-055-008); 친화성 정제 항체 포스파타제-표지 염소 항-인간 IgA (Jackson ImmunoResearch, Cat #109-055 -011) 및 친화성 정제 항체 포스파타제-표지 염소 항-인간 IgM (Jackson ImmunoResearch, Cat.#109-055-043).

본원에 기재된 방법에 포함된 다른 추가적인 시약 및 재료는 다음을 포함한다: 인산완충식염수 분말 (시그마, Cat # P3813-10PAK), 송아지 혈청 알부민 (Biocell, Cat # 3203-00) 아지드화나트륨 (시그마, Cat # S-2002), 트윈 20 (시그마, Cat # P1379-1000ML), 글리세롤 (시그마, Cat #G5516-500ML), 수산화나트륨 (시그마, Cat #S-5881), 염화마그네슘 (시그마, Cat #8266), 디에탄올아민 (시그마, Cat #D-8885), 1.0 N 염산 용액 (시그마, Cat #H3162-1GA), 5mg 기질 정제 (tablets): p-NPP (파라-니트로페닐인산염) (시그마, Cat #S-0942) 및 증류수 (D. H₂O).

마이크로 웰 플레이트는 도 6에 도시된 바와 같이 12 개의 상이한 장-뇌-관련 항원 또는 펩티드로 코팅하였다. 교정자 (calibrator) 및 양성 대조군 및 환자 희석 샘플을 웰에 첨가하고, 다른 항원을 인식하는 자가항체는 제1 배양 과정에서 결합한다. 모든 비-결합 단백질을 제거하기 위하여 웰을 세척한 후, 정제된 알칼리성 포스파타제-표지화 토끼 항-인간 IgG/IgM/IgA 비-결합 접합체는 추가 세척 과정에서 제거되었다.

결합 접합체는 황색 반응생성물을 주는 파라-니트로페닐인산염 (PNPP) 기질로 가시화되고, 강도는 샘플 중 자가항체의 농도에 비례한다. 반응을 중지하기 위해 수산화나트륨을 각 웰에 첨가하였다. 색의 강도는 405 nm에서 판독되었다.

소정의 측면에서, 다른 샘플 채집장치가 본 분석에서 고려될 수 있지만, 밝은 적색 또는 레드 타이거 탑 (SST 튜브)이, 표본 채집을 위해 사용되었다.

혈액 샘플은 무균 정맥천자기술을 사용하여 채혈하고 표준 절차를 적용하여 혈청을 얻었다. 소정 측면에서, 분석용으로 혈액의 약 1ml 이상에 해당하는 최소 약 100ul의 혈청이 바람직하다.

B. 테스트 분석 절차

LPS, 장 및/또는 BBB 단백질에 대한 IgG, IgM 또는 IgA 항체 분석 절차를 설명한다. 일부 양태에서, 모든 시약은 테스트 분석 시작 전에 실온에 도달하도록 방치한다. 테스트 분석 절차는 원하는 개수 및 유형의 항원 및/또는 펩티드의 원하는 개수로 코팅된 웰 또는 플레이트를 준비하는 것을 포함한다. 미량역가 웰이 준비되면, 1:100 희석된 대조 교정자 100ul를 다중 채널 피펫을 사용하여 도 7에 도시된 바와 같이 미량역가 플레이트의 행 A와 B에 첨가한다. 도 7에서와 같이 약 100ul의 1:100 희석된 환자의 테스트 샘플, 여기에서는 혈청을, 임상 검체 1에 대하여는 행 C 및 D에, 임상 검체 2에 대하여는 행 E 및 F에, 임상 검체 3에 대하여는 행 G 및 H에 중복 첨가한다.

도 8과 같이 별도의 플레이트에 임상 검체와 유사하게 주기적으로 (예를들면 주마다) 음성 및 양성대조군이 실시되었다.

플레이트는 실온에서 60분 배양하였다. 배양 후, 월을 비우고, ELISA 세척기를 이용하여 PBS로 4회 세척하였다. 최적의 희석된 알칼리성 포스파타제-표지 염소 항-인간 IgA 100ul를 IgA 플레이트에 첨가하고 또는 효소-표지 IgG 100ul를 최적의 희석 상태에서 IgG 플레이트에 첨가하고 항-IgM을 IgM 플레이트에 최적 희석상태에서 첨가하였다.

각각의 플레이트를 실온에서 30-60분 배양하였다. 결합-배양이 끝나기 약 10 분 전에, p-니트로페닐인산염 정제 5mg를 기질 완충액 5ml와 혼합하고 정제가 완전히 용해될 때까지 혼합하여 기질 용액을 제조하였다. ELISA 세척기를 이용하여 PBS로 4회 세척을 반복하였다. 이후 기질 용액 약 100ul를 각 웰l에 첨가하였다. 플레이트를 직사광선 노출을 피해 실온에서 30분 배양하였다. 반응은 3N NaOH를 약 50ul 첨가하여 반응을 중지시켰다. 블랭크 웰에 대하여 405 nm에서 미량역가 플레이트 리더를 사용하여 웰의 색 강도를 판독하고, 교정자, 대조군 및 미지 샘플 흡광도 값을 기록하였다.

C. 계산 결과

405 nm에서 플레이트를 판독하여 광학밀도값 (OD₄₀₅)를 얻은 후, 음성 대조군 평균 OD, 양성 대조군 평균 OD, 각각의 임상 검체의 평균 OD를 행 A 및 B의 교정자 평균 OD로 나누어 각각의 인덱스 값 (IV)를 얻었다.

각 항체에 대한 인덱스 값 (IV)는 12 개의 상이한 항원에 대하여 각각의 이중 샘플의 평균OD를 교정자 대조 값의 평균 OD로 나누어 계산하였다 (예를들면, 웰 C1 및 D1의 평균 OD를 웰 A1 및 B1의 평균 OD로 나누고, 웰 C2 및 D2의 평균 OD를 웰 A2 및 B2의 평균 OD로 나누고, 웰 C3 및 D3의 평균 OD를 웰 A3 및 B3의 평균 OD로 나누는 등)

결과는 설정된 기준 범위와 비교한다.

조눌린/오클루딘 항원 인덱스 계산

Cal 1 (OD) 0.48, Cal 2 (OD) 0.50, 샘플 3A (OD) 3.4, 샘플 3 B (OD) 3.2

인덱스 6.7

D. 결과 해석

i. 만성소화장애증, 글루텐 면역 반응성 및 과민성, 및 크론병 환자의 IgG/IgM/IgA 항체 패턴:

9명의 건강한 개체 (표 1-3) 및 만성소화장애증 및 장 투과성의 3명의 환자 (표 4), 글루텐 실조 3명의 환자 (표 5), 및 다발성 경화증 3명의 환자 (표 6)에 대한 IgG, IgM, and IgA 항체 패턴 및 비교가 각각 표 1-6에 제시된다.

만성소화장애증 및 글루텐 면역 반응성/과민성/자가면역 사이 데이터 해석 및 실험실 차이가 표 7-9에 제시된다.

ii. 만성소화장애증 및 장 투과성, 글루텐 실조 환자, 및 MS 환자의 장, BBB 단백질 및 관련 항원에 대한 IgG, IgM 및 IgA 항체 패턴.

계산된 인덱스에 기초하여, 9 명의 건강한 개체 (표 1-3), 3 명의 만성소화장애증 및 장 투과성 환자 (표 4), 3 명의 글루텐 실조 환자 (표 5), 및 3 명의 다발성 경화증 환자 (표 6)의 IgG, IgM 및 IgA 항체 패턴이 표 1-6에 각각 제시된다. 모든 건강한 개체에서, 항체 인덱스가 1.5보다 클 수 있지만 2.0보다 크게 높지 않은 LPS 및 MBP을 제외하고, 다른 항원에 대한 항체 인덱스는 1.5보다 낮거나 아주 낮다 (표 1-3).

만성소화장애증 환자에서 탈아미드화 α-글리아딘 33-메르 펩티드, 조직 트랜스글루타미나제 (tTg), 및 글리아딘-tTg 복합체에 대한 IgG 및 IgA에서 확인되듯이, 항체 패턴은 환자마다 다르다.

예를들면, 표 4 샘플 10에서, 이들 항체는, LPS, 조눌린/오클루딘, 장 ZOT 수용체, 세포경계 단백질, MMP-3, α-B 크리스탈린, 및 수초 염기성 단백질에 대하여는 크게 상승되고, 이것은 장 투과성이 높아진 것 외에도 환자는 BBB 투과성이 있다는 것을 의미한다. 표 4의 샘플 11은 세포경계 단백질 및 장 ZOT 수용체에 대한 상당한 항체 상승, 및 LPS에 대한 완만한 상승, 그러나 BBB 단백질 및 신경세포 항원에 대하여는 그렇지 않은데, 이것은 만성소화장애증 외에도 환자는 장 투과성, BBB 투과성, 신경자가면역, 및 잠재적으로 다른 자가면역을 앓고 있다는 것을 의미한다.

3 명의 글루텐 실조 환자 (샘플 13-15)에서 장-내지-뇌를 나타내는 12 종의 상이한 항원에 대한 IgG, IgM 및 IgA 항체 수준은 표 5에 제시된다. 글루텐 실조는 탈아미드화 α-글리아딘 33-메르 펩티드, tTg-2, 글리아딘-tTg 복합체, tTg-6 및 소뇌 항원에 대한 IgG 및 IgA 항체 존재로 확인된다. 이들 환자에서 항체 패턴은 ZOT-결합 단백질, 뇌 ZOT 수용체, α-B 크리스탈린, 칼프로텍틴, GFAP, 및 세포경계 단백질에 대하여 상당히 높고, 이것은 장벽 손상 장애를 확인하는 것이다.

3 명의 MS 환자 (샘플 16-18)에서 12 종의 피검 항원에 대한 항체 수준은 표 6에 요약된다. 비정상 MRI외에도, MS 진단은 MBP, 마이엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG), α-B 크리스탈린, 단백지질 단백질, 림프구 활성화 및 친염증성 시토카인 생성에 대한 항체 검출로 가능하다 (44). 신경세포 항원, BBB 단백질 및 조눌린/오클루딘에 대하여 상당히 높은 수준으로 항체가 검출된다. 이것은 사실 MS 환자가 BBB 기능이상을 겪고 있다는 것을 의미한다.

iii. 위장 자가면역 환자에서 세균 지질다당류 및 오클루딘/조눌린에 대한 IgG, IgM 및 IgA 항체 측정.

위장 자가면역 질환에서 장 투과성은 심각하다 (4). 도 9는 건강한 대조군 및 위장 자가면역 환자와의 세균 내독소 (지질다당류) 및 융합막 구조 (오클루딘/조눌린)에 대한 항체 상승을 비교한 것이다.

장 상피를 거쳐 항원성 거대분자가 과도하게 진입하면 다중 염증성 시토카인 및 전신 만성 염증 발생 및 점진적 증가가 계속된다 (56). 궁극적으로 자가면역 질환에 이르는 3중 인자의 필요한 것으로 보인다 (유전적 취약성, 환경 노출, 및 장 투과성).

본 발명의 특정 측면에 따르면, LPS, 오클루딘/조눌린 및 액토미오신 망상구조에 대한 항체 상승은 건강한 장 장벽 붕괴를 식별하는 생물표지이고, LPS, 오클루딘/조눌린, 기타 세포경계 단백질, BBB 단백질 더불어 신경세포 항원 (예를들면, MBP, α-B 크리스탈린, GFAP, 칼프로텍틴, 및 뇌 ZOT 단백질)에 대한 항체는 건강한 장 장벽뿐 아니라 BBB 온전성 붕괴를 의미한다.

본 발명의 특정 측면에 따르면 타액에서 LPS, 오클루딘/조눌린 및 액토미오신에 대한 상승된 항체 수준에 관한 임상적 해석은 표 8에 제시된다.

본 발명의 특정 측면에 따르면 혈액에서 LPS, 오클루딘/조눌린, 혈액 뇌 장벽 단백질 및 신경세포 항원에 대한 상승된 항체 수준에 관한 임상적 해석은 표 9에 제시된다.

사례 연구 실시예

만성소화장애증 환자 및 다발성 경화증 환자의 두 가지 사례를 하기한다.

A. 사례 보고서 # 1: 만성소화장애증 및 장 장벽 기능이상 환자

변비, 설사, 전신통증 등의 위장 장애 및 섬유군통증-유사증후군 및 체중감소 (지난 6 개월 동안 매달 1-2 파운드 감소)를 겪은 키 5'4" 체중 106 파운드의 38세 여성이 내과 검사를 받았다. 실험실 결과 헤모글로빈 9.9 g/dl, MCV 77 fL, 적혈구 침강 속도54mm/첫 1시간 및 엽산과 비타민 B-12의 낮은 농도, 그러나 높은 수준의 간 효소 및 고감도 C-반응성 단백질로 비정상적인 CBC를 보였다. ANA, 류마티스 인자, T3, T4 및 TSH 수치를 포함한 상세한 생화학적 및 면역학적 프로파일은 정상 범위 내에 있었다. GI 불편이 반복되고, 미열 및 두통이 있어, GI 평가를 의뢰하였다. 대장과 십이지장 생검을 수행하고 면역조직학적 평가는, 습지 (Marsh) III 분류의 총체적 융모 위축으로 나타났다. 이 시점에서 글리아딘과 트랜스글루타미나제에 대한 IgG 및 IgA 농도를 확인하였다. 글리아딘과 트랜스글루타미나제에 대한 IgG 및 IgA 모두 기준 범위보다 3-5 배 높았다.

융모 위축 관점에서, 만성소화장애증의 글리아딘과 트랜스글루타미나제 양성 진단을 받았다. 환자는 항 염증 약물이 첨가된 혈액 수혈 및 무-글루텐 다이어트를 개시하였다. 3 개월 후, 전체적인 GI 불쾌감은 개선되었고 체중이 4 파운드 늘었지만, CRP는 여전히 높았고, 신체 통증과 미열이 계속되었다. 이러한 관점에서 및 염증과 미열 근본 원인을 확인하기 위하여, LPS, 조눌린/오클루딘, 세포경계 단백질에 대한 항체를 조사하였다. 표 4 샘플 10 에 제시된 결과는 건강한 개체에 비해, 환자 (샘플 10)는 LPS, 조눌린/오클루딘, 세포경계 단백질에 대한 IgG, IgM 및 IgA 항체 수준이 3-6 배 높았고, 이는 만성소화장애증뿐만 아니라 환자는 세균 전위, 융합막 손상 및 대형 항원 분자에 대한 장 누수 증후군을 앓고 있다는 것을 의미한다.

따라서, 무-글루텐 다이어트 이외에, 환자는 무-렉틴 다이어트 더불어 생균성 글루타민, N-아세틸시스테인, EPA/DHA, 비타민 D, 락토페린, 자일리톨, 및 보스웰 산으로 장 누수 증후군을 치료하였다. 생균성 요법과 더불어 무-렉틴 및 무-글루텐 다이어트 30일 후, 환자의 임상 상태가 크게 호전되었다: 발열은 37℃ 아래로 떨어졌고 추가로 체중이 6 파운드 늘었다. 60 일 후 장 누수의 치료는 생균제로만 줄었지만, 무-글루텐 다이어트는 계속되었다. 일년 후에 모든 실험실 테스트를 반복하고, 글리아딘, 트랜스글루타미나제, CRO, LPS 및 조눌린/오클루딘에 대한 반복 테스트 결과는 정상 범위에 있었고, 이는 만성소화장애증 및 장 누수 증후군 환자에 있어서 장 누수 관리와 더불어 무-글루텐 다이어트가 효과가 있다는 것을 의미한다.

토론: 만성소화장애증 환자의 대다수는 융모 위축뿐만 아니라 장 누수 증후군 환자라는 것이 문헌에 실려있다. 이러한 이유로, 만성소화장애증을 가진 환자의 약 50 %만이 무-글루텐 다이어트로 치료 6 개월 후 융모 구조가 정상화되어 개선된다. 만성소화장애증에서 장 누수 증후군이 유도되는 기전은 몇몇 개인에서 특이적 글리아딘 펩티드가 상피세포와 결합하고 융합막 단백질을 손상시키는데 원인이 있고, 이는 조눌린/오클루딘 및 클라우딘을 점막하층에서 혈액으로 방출시킨다. 이러한 특별한 경우에, 환자의 증상 중 일부는 무-글루텐 다이어트로 개선되지만, 무-글루텐 다이어트로는 LPS 이송 및 높아진 장 침투성에 의해 유도되는 염증 반응을 개선시키지는 못한다. 그러나 무-글루텐 다이어트와 더불어 융합막 단백질회복을 위한 자연 치료를 시행 한 30~90일 후 (57-61), 임상 증상 및 실험실 검사 결과는 모두 정상으로 돌아왔다. 따라서, 만성소화장애증 환자는 항원성 거대분자에 대한 장 누수에 대하여 선별되어야 하고 만성소화장애증뿐만 아니라 장 장벽을 회복하기 위한 치료도 병행되어야 한다. 본 발명의 주제는 이러한 기능을 제공하는 것이다.

B. 사례 보고서 # 2: 다발성 경화증, 장 및 뇌-혈관 장벽 투과성 환자

사지 쇠약으로 3 주간 진행성 목, 등 및 근육 통증이 있는 높이 키 5'8" 체중 182 파운드의 38세 남성이 신경과 치료를 받았다. 치료 전날, 계단을 올라갈 수 없을 정도로 몸통과 다리에 따끔거림 및 감각 장애가 있어 소변이 어려웠다. 2 년 이상, 환자는 가족 문제도 매우 우울하였고, 이에 대한 어떠한 도움을 받지 않았다. 전체적인 이력은 비타민 B-12, 철 보충제로 치료한 정체 불명의 가벼운 작은 적혈구 빈혈을 제외하고 특이사항은 없었다.

환자가 가벼운 뇌졸중인지 및 신경학적 또는 면역장애인지 여부를 명확히 하기 위해, 일련의 면역학적 프로파일 및 신경학적 검사가 시작되었다.

실험실 검사 결과는 10.8 g/DL의 헤모글로빈 결과로 정상적인 화학수치 및 CBC을 보였다. ANA, 류마티스 인자, 면역 복합체, 총 면역글로불린, 심장지질 항체 및 갑상선 기능 검사 등의 면역학적 프로파일은 정상 범위 내에 있었다.

추가 검사에서 뇌척수액과 혈액을 채취하여 결핵균, 보렐리, CMV, EBV, 헤르페스 타입-6, HTLV-1, -2, 매독 검사는 모두 음서이었다. CSF 단백질은 0.7g/L, 및 포도당 2.3mMol/L 이었다

신경학적 검사는 정상적인 안구 운동을 보였고 좌안 및 우안 교정시력 6/48 및 6/36으로 낮았다. 환자는 약간 보행에 있어 두 다리에 추체 쇠약을 가지고 있었다. 단자 검사는 양쪽에 D10 이하의 편감각 수준을 보였다.

뇌의 MRI 검사는 MS 환자에서 관찰되는 약한 일반적 위축과 함께 약한 백질 이상을 보였다.

글루텐 과민성, 만성소화장애증과 장 누수 증후군의 가능성 조사를 위하여, AGA, tTg 항체 및 락툴로오스/만니톨 테스트를 진행하였다. 만성소화장애 선별에서 IgG및 IgA 항-글리아딘 항체가 모두 기준범위 3-6 배 이상이었지만, 트랜스글루타미나제에 대한 IgG 및 IgA는 음성이었다. 또한, 락툴로오스/만니톨 테스트 결과는 매우 비정상이었다. 따라서, 다음과 같은 추가 검사가 수행되었다: LPS, 조눌린/오클루딘, 장 ZOT 수용체, 세포경계 단백질, MMP-3, 뇌 ZOT 결합 단백질, 뇌 ZOT 수용체, 칼프로텍틴, GFAP, α-B 크리스탈린, BBB 단백질, 및 MBP에 대한 IgG, IgM 및 IgA 항체 검사. 표 6에 샘플 17에 요약된 결과는 MBP와 GFAP에 대한 항체 수준에서 유의한 상승을 보이고, 비정상적 MRI 결과와 일치하게 MS 진단을 확인하였다. 또한, 조눌린/오클루딘, 칼프로텍틴 및 BBB 단백질에 대한 항체의 상당한 상승은 GI의 장 및 BBB 투과성 상승을 의미한다 (표 6). 이러한 테스트 결과를 바탕으로, 5 일 동안 1g 메틸프레디니솔론을 정맥 투여 받았고 임상적 개선이 있었다. 이 시점에서 환자는 베타-세론을 투여 받았고 15일 이후 상당한 개선을 보였다. 또한, 손상된 BBB 및 장 장애 회복을 위하여 200 mg의 미노사이클린 IV 글루타티온과 함께 생균성 글루타민, N-아세틸시스테인, EPA / DHA, 비타민 D, 락토페린, 자일리톨, 및 보스웰 산을 투여하였다. 이러한 요법 3개월 후 환자의 전반적인 건강은 크게 개선되었다.

본원에 기재된 것 외에도 많은 변형들이 본원에 발명 개념을 벗어나지 않고 가능하다는 것은 당업자에게 명백하다. 따라서 본 발명은 청구범위 주제를 제외하고는 제한되어서는 아니된다. 또한, 명세서 및 청구범위를 해석함에 있어서, 모든 용어는 문맥과 일치하는 최대한으로 광의로 해석되어야 한다. 특히, "구성하는" 및 "포함하는"은 비-배제적 방식으로 요소, 성분 또는 단계를 지칭하는 것으로 해석되어야 하고, 이는 참고된 요소, 성분 또는 단계는 명시되지 않은 다른 요소, 성분 또는 단계와 존재, 또는 활용 또는 조합될 수 있다는 것을 의미한다. 명세서 청구범위가 A, B, C ... N으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 언급하면, 본 문장은 A와 N, 또는 B와 N 등이 아닌 군의 단 하나의 요소를 필요로 하는 것으로 해석되어야 한다.

참고문헌

Claims

인간에게 유래한 샘플의 테스트 방법에 있어서,
샘플의 제1 분량과 세균 독소에 대한 결합으로 인한 제1 신호를 측정하는 단계; 및
샘플의 제2 분량과 (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나에서 선택된 천연 항원에 대한 결합으로 인한 제2 신호를 측정하는 단계로 이루어진, 인간에게 유래한 샘플의 테스트 방법.
제1항에 있어서, 세균 독소는 지질다당류를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 천연 장-관련 항원은 (1) 장 구조단백질; (2) 융합막 단백질; (3) 융합막 단백질에 대한 결합 수용체; 및 (4) 세포경계단백질에서 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
제3항에 있어서, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP); (4) 뇌 ZOT 결합 단백질; (5) 뇌 ZOT 수용체; (6) 칼프로텍틴; 및 (7) 수초 염기성 단백질에서 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
제2항에 있어서, 장 구조항원은 액틴/액토미오신인 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 융합막 항원은 오클루딘 및 조눌린으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
제2항에 있어서, 결합수용체는 장 ZOT 수용체를 포함하는, 방법.
제2항에 있어서, 구조단백질은 기질금속단백질분해효소-3 (MMP-3)를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성 단백질 (GFAP); 및 (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP)로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
장 누수 증후군 관련 질환진단방법에 있어서,
제1항의 방법을 이용한 실험실 테스트를 주문하는 단계; 및
테스트 결과를 분석하는 단계로 구성되는, 장 누수 증후군 관련 질환진단방법.
혈액 뇌 장벽 투과성 관련 질환진단방법에 있어서,
제1항의 방법을 이용한 실험실 테스트를 주문하는 단계; 및
테스트 결과를 분석하는 단계로 구성되는, 혈액 뇌 장벽 투과성 관련 질환진단방법.
테스트 플레이트에 있어서, 결합 펩티드로서 (1) 세균 독소, 및 (2) (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 천연 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나로 구성되는 천연 항원을 가지는, 테스트 플레이트.
제12항에 있어서, 장-관련 항원은 (1) 장 구조단백질; (2) 융합막 단백질; (3) 융합막 단백질에 대한 결합 수용체; 및 (4) 세포 경계 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 테스트 플레이트.
제13항에 있어서, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP); (4) 뇌 ZOT 결합 단백질; (5) 뇌 ZOT 수용체; (6) 칼프로텍틴; 및 (7) 수초 염기성 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 테스트 플레이트.
제12항에 있어서, 혈액 뇌 장벽-관련 항원은 (1) 혈액 뇌 장벽 단백질; (2) 신경아교섬유산성단백질 (GFAP); (3) 기질금속단백질분해효소 (MMP); (4) 뇌 ZOT 결합 단백질; (5) 뇌 ZOT 수용체; (6) 칼프로텍틴; 및 (7) 수초 염기성 단백질로 이루어진 군에서 선택되는, 테스트 플레이트.
해부학적 장벽의 과도한 투과성 관련된 질병의 진단을 지원하는 방법에 있어서,
환자 샘플이 세균 독소, 및 (a) 장-관련 항원 및 (b) 혈액 천연 뇌 장벽-관련 항원 중 적어도 하나에서 선택되는 천연 항원과의 결합으로 인한 신호를 발생시키는 항체 테스트 패널로부터 테스트 결과를 얻는 단계; 및 테스트 결과 분석 단계로 구성되는, 해부학적 장벽의 과도한 투과성 관련된 질병의 진단을 지원하는 방법.
제16항에 있어서, 샘플은 혈액 샘플인, 방법.
제16항에 있어서, 샘플은 타액 샘플인, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 장 미생물총의 장내세균불균형 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 또는 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 세포주위 경로를 통한, 세균 항원에 의한 장 장벽 붕괴 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 또는 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 세포주위 경로를 통한, 세균 항원 이외로 인한 장 장벽 붕괴 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 모든 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 및 액토미오신에 대한 IgG 결과가 네가티브일 때 세포횡단 경로를 통한, 세균 항원에 의한 장 장벽 붕괴 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 세균 독소에 의한 장 및 혈액 뇌 장벽 온전성 모두의 붕괴 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 세균 독소 이외의 인자에 의한 장 및 혈액 뇌 장벽 모두의 붕괴 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 장 장벽 온전성 붕괴 및 혈액 뇌 장벽 온전성 붕괴 없이 장 미생물총 장내세균불균형 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 지질다당류의 세균 독소에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 오클루딘 및 조눌린에 대한 각각의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 네가티브, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 장 장벽 또는 장 미생물총 장내세균불균형과 관련 없는, 혈액 뇌 장벽 온전성 붕괴, 신경염증 및 신경자가면역 관련으로 진단되는, 방법.
제16항에 있어서, 테스트 결과 분석 단계는, 테스트 결과, 혈액 뇌 장벽 단백질에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브, 및 신경세포 항원에 대한 임의의 IgA, IgM, 및 IgG 결과가 포지티브일 때 근위축성 측색 경화증, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 또는 말초 신경병증, 주요 우울증 중 하나로 진단되는, 방법.