JP2014503829A

JP2014503829A - 腸および血液脳関門の透過性を検出する方法、およびその試験材料

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Publication number: JP2014503829A
Application number: JP2013551330A
Authority: JP
Inventors: ヴォジダニ，アリスト
Original assignee: イミュノサイエンシスラブ，インコーポレイテッド
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2012-01-26
Publication date: 2014-02-13
Anticipated expiration: 2032-01-26
Also published as: EP2668498A2; IL250871A0; CN103460044B; US20120196299A1; IL227676A0; US20140186855A1; AU2016259430A1; AU2016262726B2; RU2607479C2; WO2012103324A3; IL250871B; IL227676A; CN105823887A; WO2012103324A2; US8663911B2; NZ614707A; RU2016149216A; KR20140052941A; CA2964555C; BR112013019380A2

Abstract

腸管バリアおよび／または血液脳関門透過性に関連する抗原の試験のための、方法、アッセイおよび装置を開示する。例えば、（１）細菌毒素（好ましくはリポ多糖）への結合および（２）（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液脳関門関連抗原の少なくとも１つから選択される組織抗原への結合について、血液、唾液または他の体液を試験することができる。腸管壁浸漏症候群（傍細胞であれ経細胞経路であれ、および細菌毒素であれ、ある他の原因であれ）と関連がある疾患および／または過剰な血液脳関門透過性と関連がある疾患（神経炎症および／または神経自己免疫状態の両方および特に筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病または末梢神経障害および大うつを含むことが本明細書中で企図される）の検出および診断を支援するために、試験結果の解析を使用することができる。
【選択図】図４

Description

関連出願
本願は、２０１１年１月２８日出願の米国仮出願第６１／４３７，２４４号の利益を請求し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、腸管および血液脳関門浸透性の検出および診断における支援のための方法、アッセイ、およびキットに関する。

人間の体内の他の細胞器官と比べて、腸上皮細胞は、摂取した食品、酵母、細菌およびウイルスに由来する抗原の膨大な数にさらされている。これらの細菌抗原の一部は、他のものが宿主にとって有害なのに対し、粘膜免疫系に対して脅威とならない。これら抗原のために調製性Ｔセル機能または寛容を発達させるために、粘膜および全身性免疫系と相互作用する上皮を、いくつかの分子が浸透させることにより、腸管免疫系は腸管内腔におけるこれら細菌抗原を監視する。しかしながら、これら抗原に対する腸管免疫系の不適当または過度の暴露は、調製性メカニズムの破壊を引き起こし、胃腸疾患（１）を導くことになる。したがって、抗原接種の生理機能の理解は、炎症や自己免疫反応（２）を含む、疾患の病因の理解の中心となる。

本明細書で説明するこれらの外部資料および全ての他の外部資料は、参照によりその全体が組み込まれる。組み込まれる参考文献中の用語の定義または使用は、本明細書に提供する用語の定義と矛盾しているか、または反している場合には、本明細書に提供するその用語の定義が適用され、参考文献中のその用語の定義は適用されない。

腸管透過性の向上は、いくつかの自己免疫疾患（３−６）の始まりに先行する初期段階であると考えられている。この理由から、最近では消化管並びに神経系（７）を含む腸管外器官を対象とする、多くの病態の病因における腸管バリア機能障害の役割への関心が高まってきている。炎症、自己免疫およびがんへの生物学的出入口として、腸管バリア機能のこの調整不全は、Ｆａｓａｎｏ（７）によりレビュー記事で論じられた。このレビュー記事ならびに以前のＦａｓａｎｏの記事（４）でＦａｓａｎｏは、消化管の主要な機能は、これまで伝統的に、栄養および電解質の消化と吸収、そして水分の恒常性に限って理解されてきたことを強調した。しかしながら、消化管の解剖学的および機能的な配置のより注意深い分析は、この臓器の極めて大事なもう１つの機能は、バリアメカニズムを介した、環境と宿主との間の巨大分子の輸送を調製するその能力であることを示している。
消化管関連リンパ系組織および神経内分泌ネットワークと共に、細胞間のタイトジャンクションを伴う腸上皮のバリアは、非自己抗原に対する寛容と免疫の均衡を制御する。

ゾヌリン／オクルジンは、巨大分子の往来に関わり、したがって、免疫反応と寛容（７）間のバランスに関わる細胞間タイトジャンクションの生理的モジュレーターである。細かく調整された腸管バリアタンパク質が、環境要因に対し、個々の遺伝子的影響を受けやすい中で調節不全される場合、可能性は、セリアック病、クローン病および潰瘍性大腸炎、および関節炎のような腸外自己免疫疾患、狼瘡、甲状腺炎、糖尿病、さらには多発性硬化症（ＭＳ）、悪性腫瘍及び大うつ（８−１４）のような、腸管疾患の両方で発生する。腸および脳関門機能障害の病態生理学に寄与することができる、したがって、腸管および腸管外自己免疫に関与にする主な環境要因の１つは、細菌性リポ多糖である（ＬＰＳ）。腸微生物叢異常生命および細菌転移により、ＬＰＳは、最初に腸バリアおよび次いで血液脳関門機能不全（１４）をもたらす、上皮細胞および炎症カスケードの活性化上において、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化のために明らかに責任がある。“腸管壁浸漏”および“脳浸漏”症候群の誘導におけるＬＰＳの役割は、図１に示されている。

図１は、消化管異常が腸バリアの完全性を損なうことができ、循環に未消化抗原の侵入を増やし、その結果免疫系に挑戦することを強調している。これら抗原に対する反応は、炎症促進性サイトカインの生産、抗体の配列、および増加した腸管バリア透過性（あるいは“腸管壁浸漏”症候群）をもたらす、免疫および炎症性カスケードを活性化する。仮に、腸管バリア機能障害が調製されてない場合、結果は神経炎症、神経侵襲および神経変性になり得る。

したがって、最初に血液脳関門の開口、続いて、神経炎症および神経変性（１５−２５）をもたらす可能性がある炎症を含む、免疫系に挑戦できる巨大抗原分子に対する腸管透過性の測定のための非侵襲的方法、装置、アッセイのための必要性がある。これら必要性およびその他は、本発明によって満たされる。

本発明の独創性のある主題は、ヒト由来の試料が、腸管および／または血液脳関門透過性の検出および診断を支援するために検査することができる、装置、システム、アッセイおよび方法を提供する。

本発明の特定の様態において、試料の１つまたは複数の部分は、細菌毒素への結合（１）および、（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液脳関門関連抗原の少なくとも１つから選択されるネイティブ抗原への結合（２）について試験される。特定の態様では、細菌毒素は有利にリポ多糖類を含むことができる。

腸管透過性の検査の場合、ネイティブ腸関連抗原は、（１）腸管構造タンパク質；（２）タイトジャンクションタンパク質；（３）タイトジャンクションタンパク質への結合受容体；および（４）細胞間結合タンパク質からなる一覧から好ましくは選択される。本発明の特定の様態の実施例では、検査は、アクチン／アクトミオシン、オクルジンおよび／またはゾヌリン、腸管ＺＯＴ受容体、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ−３）の１つまたは複数の抗体を発生する。

血液脳関門透過性の検査の場合、血液脳関門関連抗原は好ましくは、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；（３）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（４）脳ＺＯＴ結合タンパク質、（５）脳ＺＯＴ受容体；（６）カルプロテクチン；および（７）ミエリン塩基性タンパク質からなる一覧から選択される。本発明の特定の様態の実施例では、検査は、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；および（３）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の１つまたは複数の抗体を発生する。

診断の観点から、上記に記載された方法の１つまたは複数からの検査結果の分析は、腸管壁浸漏症候群または／および過度の血液脳関門透過性に関連する疾患の検出または／および診断を支援するために使用することができる。

本発明の特定の様態において、各成分に結合する試料の検出は、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ、ラテックス凝集、ビーズアッセイ、プロテオミクスアッセイ、および当業者に周知の他の免疫測定法が含まれるが、これらに限定されない免疫測定法を用いて実行することができる。

本発明の特定の様態において、例えば、結合ペプチドとして：（１）細菌毒素、（ａ）血液脳幹関連抗原および（ｂ）血液脳幹関連抗原の少なくとも１つを含む（２）ネイティブ抗原を有する改善された試験プレートを含む、イノムアッセイを実施するための試験プレートおよびキットも提供されることができる。

腸管壁浸漏症候群に関連した疾患の検出、診断、または別の方法で識別するために使用される特に好ましい検査板では、腸関連抗原は、（１）腸構造タンパク質；（２）タイトジャンクションタンパク質；（３）タイトジャンクションタンパク質への結合受容体；および（４）細胞間結合タンパク質からなる一覧から有利に選択されることができる。

過度の血液脳幹透過性に関連した疾患の検出、診断、または別の方法で識別するために使用される特に好ましい検査板では、血液脳関門関連抗原は、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；（３）マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、（４）脳ＺＯＴ結合タンパク質；（５）脳ＺＯＴ受容体；（６）カルプロテクチン；および（７）ミエリン塩基性タンパク質からなる一覧から有利に選択されることがきできる。

検査キットは、腸管壁浸漏症候群に関連する抗原の第一のセット、および過度脳血液関門浸透性に関連する抗原の第二のセット両方のために集合的に検査する、１つまたは複数の板を含むことができると企図されている。

より一般的な観点から、方法および装置は、細菌毒素および（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液自然脳関門関連抗原の少なくとも１つから選択されるネイティブ抗原に対し患者由来試料の結合からシグナルを生成させるシグナルを生成させる抗体検査パネルから、検査結果を取得し解析することを含む、解剖学的バリアの過剰な透過性が関連する疾患の検出および診断を支援するために本明細書で企図されている。

これら企図された方法、装置の全てにおいて、試料は、例えば全血試料、血清／血清試料、唾液試料、または他の体液に由来する試料を含む、任意の適切な生体試料を含むことができる。

本明細書で企図された方法および装置は、（１）腸内微生物叢腸内毒素症および（２）腸管バリアの破壊に関連する疾患の差動的な診断を支援するために使用することができることが、またさらに企図されている。例えば、近年企図されているように、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧのいずれかの陽性結果および、オクルジンおよびゾヌリン対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧのすべての陰性結果と、アクトミオシンに対するＩｇＧの陰性結果を含む場合、腸内細菌毒素症に関連する診断が示される傾向があり得る。

鑑別診断はまた、傍細胞経路が原因の腸管バリアの破壊と経細胞経路間とを鑑別することにより支援されるように企図されている。

傍細胞経路を介した破壊に関しては、検査結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果および、オクルジンまたはゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧすべての陰性結果と、アクトミオシンに対するＩｇＧの陰性結果を含む場合、細菌抗原による腸管バリアの破壊に関する診断が示される傾向にある。これとは対照的に、検査結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧすべての陰性結果および、オクルジンまたはゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、アクトミオシンに対するＩｇＧの陰性結果を含む場合、細菌抗原以外のものによる腸管バリアの破壊に関する診断が示される傾向にある。

経細胞経路を介した破壊に関しては、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果および、オクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧのすべての陰性結果と、アクトミオシンに対するＩｇＧの陽性結果を含む場合、細菌抗原による腸管バリアの破壊に関する診断が示される傾向にある。

また、本明細書に記載の発見によれば、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果および、オクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、ニューロン抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果を含む場合、細菌毒素によって誘発される腸管および血液脳関門完全性の両方の破壊に関する診断が示される傾向にある。

これとは対照的に、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧそれぞれの陰性結果および、オクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、ニューロン抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果を含む場合、細菌毒素以外によって誘発される腸管および血液脳関門の完全性の両方の破壊に関する診断があり得る。

腸内微生物叢腸内毒素症は、腸管バリア整合性における破壊を伴わずに生じることができるが、血液脳関門整合性における破壊はこれを伴うことがさらに企図されている。例えば、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果および、オクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧそれぞれの陰性結果と、血液脳関門に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果および、ニューロン抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果を含む場合、そのような状況での腸内微生物叢腸内毒素症に関する診断が示される傾向がある。

同様に、例えば、診断結果が、リポ多糖類の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧそれぞれの陰性結果ならびに、オクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧそれぞれの陰性結果と、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、ニューロン抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果を含む場合、腸管バリアまたは腸内微生物叢腸内毒素症との関連性を伴わない血液脳関門整合性、神経炎症、神経自己免疫における破壊に関する診断があり得る。

特異的疾患に関して、本明細書で企図されている検査結果の比較は、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病、または末梢神経障害、および大うつの検出および診断を支援するために使用されることができる。検査結果が、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果と、ニューロン抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＧいずれかの陽性結果を含む場合、そのような条件があり得ると考えられている。

本発明の独創性のある主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、添付の図面および表と共に、以下の発明を実施するための形態からより明らかになるであろう。

腸管壁浸漏および脳浸漏症候群の誘導におけるＬＰＳの現在理解されている役割を示す先行技術の図である。炎症および神経免疫疾患の病因におけるＴｈｌ７リンパ球の炎症および活性化のＬＰＳの現在理解されている役割（炎症反応のＬＰＳ誘導、サイトカインの生産、および循環におけるＴｈｌ７陽性細胞数の増加）を示す先行技術の図である。脳機能障害に対する腸の現在理解されている病因を示す先行技術の図である。これは、どのように粘膜免疫寛容の損失が、もし調製されていないとすれば、腸管バリア機能障害を誘発するカスケード、全身性炎症、神経炎症、神経侵襲および神経変性を引き起こすことができるか、ということを示している。異常な腸管透過性および血液脳関門透過性に関わるトリガーおよびメカニズムが、腸管透過性識別（ＩＰＩ）および／または血液脳関門透過性識別（ＢＢＰＩ）のための検査の次世代のために使用されることができる、本発明の提案されたシナリオを示す図である。本発明の特定の態様に係る自己免疫疾患の病因における異常な腸管透過性の提案された役割を示す図である。免疫測定法を行うための試料マイクロタイタープレートのレイアウトを示す図であり、マイクロタイタープレートは、本発明における特定の態様に係る１２種類の抗原およびペプチドを備える１２種類の列を有する。腸管およびＢＢＢタンパク質由来の１２種類の異なる抗原もしくはペプチドおよび関連組織抗原（抗原またはペプチドは透明である）に対するＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡを測定する、本発明における特定の態様に係る試料マイクロタイタープレートのレイアウトを示す図である。品質管理の目的で、陰性対照および陽性対照を用いてＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡを毎週測定する、本発明の特定の態様に係る試料マイクロタイタープレートのレイアウトを示す図である（抗原またはペプチドは透明である）。胃の自己免疫を備える健康なドナーおよび患者における、細菌リポ多糖類およびオクルジン／ゾヌリンに対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの比較を示す図である。健康なドナーの細菌リポ多糖類に対するＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ＋ＩｇＭ＋ＩｇＧのパーセント上昇は、左のグラフのライトバーに、平均値を超えた２つの標準偏差での胃の自己免疫を備えた患者は、右のグラフのダークバーに示されている。

表１は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、３人の健常者（試料１−３）の最初のセット中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して検査されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表２は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、３人の健常者（試料４−６）の第二のセット中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して検査されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表３は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、３人の健常者（試料７−９）の第３のセット中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して検査されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表４は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、セリアック病や腸透過性を備える３人の患者（試料１０−１２）中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して検査されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表５は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、グルテン失調を備える３人の患者（試料１３−１５）中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して検査されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表６は、本発明の特定の様態によれば、環境要因（ＬＰＳ）、腸管およびＢＢＢタンパク質と、多発性硬化症（ＭＳ）を備える３人の患者（試料１６−１８）中の関連抗原を表わす、１２種類の抗原に対して試験されたＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体値を示す。

表７は、本発明の特定の様態によれば、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリンおよび血液中のアクトミオシンネットワークに対する特定の抗体の臨床的解釈を示している。

表８は、本発明の特定の様態によれば、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリン、口腔液中のアクトミオシンに対する特定の抗体の上昇したレベルの臨床的解釈を示している。

表９は、本発明の特定の様態によれば、ＬＰＳおよびオクルジン／ゾヌリン、血液脳関門タンパク質と血液中のニューロン抗原に対する特定の抗体の上昇したレベルの臨床的解釈を示している。

抗原の増加した摂取は、発病には必要条件である。条件の数は、腸管の透過性を増やし、ひいては抗原接種を増加することで知られている。内腔に由来する免疫分子または抗原の摂取は、免疫介在活動、ＩｇＡおよびＩｇＭ抗体の形態の腸内および、抗原特異的ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧおよび免疫複合体（２６、２７）の製造を備える腸外の両方をもたらすかもしれない可能性がある。

Ｉ．血液脳関門分裂および神経炎症の誘導上の細菌毒素および炎症性サイトカインの影響
血液脳関門（ＢＢＢ）は、中枢神経系の内部環境と安定性を維持する。ＢＢＢへの構造的および機能的変化は、自己免疫疾患をもたらすことがあり、特に、多発性硬化症（２８）のような神経系の自己免疫疾患である。

ＢＢＢは、感染症、毒素、興奮毒性、または外傷（２３）のような、環境要因に応じて壊死性細胞死が起こることがある脳実質に由来する壊死性傷害に通常は応じる白血球を分ける。ＢＢＢは、２層からなる。第１層は、腸上皮細胞（２４、２８）のそれとの構造的類似点を備える大量のタイトジャンクションを有する微小血管内皮細胞で構成されている。第２層は、グリア突起（２９）により形成されるグリア境界膜である。内皮細胞とアストロサイト間の血管周囲腔は、未熟樹状細胞（２９）のように作用するマクロファージによって取り込まれる。したがって、上皮ＴＪバリアを開くことができる因子は、ＢＢＢおよび神経組織（３０−３３）の両方を破壊することができる。これは、中枢神経系炎症（２９、３４−３５）に必須である、菌体内毒素、炎症性サイトカイン、酵素およびエフェクター細胞Ｔｈ１、Ｔｈｌ７を含む。

エンドトキシン、サイトカイン、ケモカイン、接着分子、およびそのほかによるＢＢＢの分裂、ならびに、中枢神経系の中への全身性コンパートメントに由来する自己反応性Ｔ細胞の輸送は、ＭＳ病変（３６−３８）の開発において重要な役割を果たすことが、堅く確立されている。しかしながら、ヒトＴｈｌ対Ｔｈｌ７リンパ球を比較した時、ヒトＴｈｌ７リンパ球は、Ｔｈ１リンパ球よりもＢＢＢを越え速く移動する。確かにＢＢＢを越えるその遊走時のＩＬ−１７−およびＩＬ−２２−発現ＣＤ４＜＋＞ＣＤ４５ＲＯ＜＋＞記憶リンパ球の膨大な量は、ＩｎｖｉｔｒｏおよびＩｎｖｉｖｏ（３５）でＢＢＢを通過するＴｈｌ７リンパ球の能力を確認したＩＬ−１７^＋およびＩＬ−２２^＋マーカーを発現した。ＢＢＢ内皮細胞（ＥＣＳ）を浸透させるＴｈｌリンパ球によって使用されるＢＢＢ内皮細胞は、ＩＬ−１７ＲとＩＬ−２２Ｒ発現した。血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＢＢを越えるウシ巨大分子のような、細胞または抗原のこの拡散は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２がヒトＢＢＢ−ＥＣＳの単層に添加されたとき、著しく強化された。ＢＢＢ−ＥＣＳのこの強化された透過性は、オクルジンおよびゾヌリン、２つの重要なタイトジャンクションタンパク質（３９）の発現での減少と相関していた。

これらの結果は、炎症が、ＢＢＢタイトジャンクションへのＴｈｌ７の結合をもたらす血液脳関門内皮細胞上のＩＬ−１７およびＩＬ−２２受容体のＴｈｌ７リンパ球発現の活性化を引き起こす、ＬＰＳおよび他の細菌毒素によって誘発されることを強く示唆している。これは、ＣＮＳ炎症（４０−４４）をもたらす循環性ＣＤ４＜＋＞リンパ球および可溶性分子に対するＢＢＢの透過処理およびＢＢＢの誘導とブリーチにおいて重要な役割を果たす、神経細胞破壊、循環中（ＩＬ−１７およびＩＬ−２２の作用を介した細胞共発現ＩＬ−１７、ＩＬ−２２およびグランザイムＢ）への神経細胞抗原およびＢＢＢタンパク質の放出をもたらす、ＣＤ４細胞によるインターフェロンガンマおよびＴｈｌ７によるグランザイムＢの放出、Ｔｈｌ７およびＢＢＢを越える自己反応性Ｔ細胞の遊出に至る、タイトジャンクションを破壊する。炎症性および神経免疫疾患の病因におけるＴｈｌ７リンパ球の役割は、図２に示されている。この作用機構に基づいて、腸透過性の細菌毒素誘導および、ＢＢＢタンパク質構造の分解は、ＬＰＳだけでなく、タイトジャンクションタンパク質およびＢＢＢタンパク質に対する抗体生産をもたらすことができる。したがって、本発明の特定の様態に係る神経炎症に取り組むための手順は、マトリックスメタロプロテアーゼおよび関連受容体抗体のような、ＬＰＳ、オクルジン、クローディン、ＢＢＢタンパク質、タイトジャンクション、酵素の検査とともに始まる。臨床医はそれに基づき、胃腸バリア機能障害の修復を計画でき、続いて、全身性炎症を湿し、血液脳関門上の修復とともに終了する。

血液脳関門内皮細胞上のＩＬ−１７およびＩＬ−２２受容体の発現は、ＢＢＢタイトジャンクションへのＴｈｌ７細胞の結合をもたらす。これは、自己反応性ＣＤ４細胞および神経変性に至るタイトジャンクションを分裂させる。Ｔｈｌ７細胞は次いで、ＢＢＢを越え、グランザイムＢの放出によるニューロンの殺害のための段階を設定する。神経細胞抗原のこの放出は、神経自己免疫および神経変性の悪循環をもたらす。

ここで提示された情報に基づいて、消化管が多くの神経変性疾患のための出発点であると仮定されている。それは、大量のリポ多糖類（ＬＰＳ）を放出する、不均衡なミクロフローラとともに始まる。大量のＬＰＳエンドトキシンは、オクルジンおよびゾヌリン含むＴＪとそれらのタンパク質の分解や解離をもたらす、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ−ｌｂｅｔａの発現上昇を誘導する。これは、ＢＢＢへ進む血流における炎症が続いている。炎症は、経浸潤、神経炎症、神経自己免疫、そして最後に、神経変性をもたらすＢＢＢを開く。図３は、神経変性に至る病態生理学を示す；人間の腸管バリア機能障害が対処されていない場合、人間は神経炎症と考えられる神経変性を、時間をかけて開発することができた。多くの自己免疫疾患は、複数のトリガー、症状、および神経系障害を有する。個々の多くが、ＬＰＳ、ＴＪｓ、およびＢＢＢタンパク質に対し高水準の抗体を生産する神経自己免疫の場合には、免疫および神経系が関係している。これら２つのシステムのための共通点は消化管で、その重要性は提示されている（４３）。

したがって、本発明の特定の様態において、オクルジンのようなＴＪタンパク質、ＬＰＳのような菌体内毒素、およびＢＢＢタンパク質に対する抗体の検出および測定は、ＧＩおよび腸管バリア完全性を評価するためだけでなく、全身性炎症、神経炎症、神経侵襲および神経変性の根本的な原因を判断および／または診断するための最善の方法である。また、腸上皮の病変は速やかに修復されるべきである。そうでなければ、これは、複雑な自己免疫疾患および神経免疫疾患をもたらし得る炎症カスケードを駆動する循環の中に食物タンパク質、共生および病原性細菌の浸透を可能にし得る。

ＩＩ．小糖分子対巨大抗原分子に対する透過性の測定
腸管透過性を評価するための現在の方法論は、ラクツロースとマンニトールを使用する。過去４０年間にわたって、それは便利な臨床ツールだった。ラクツロース吸収は、腸バリアにおける涙液を示唆しており、したがって、腸管透過性である。俗説に対し、この小分子の吸収は、涙液というより微小リークを実際には示している。ラクツロースは、比較的低い分子サイズを有し、腸管膜を介したこの物質の転移は、食品または他のタンパク質の転移およびそれらに対する免疫応答のための状況を反映しない。さらに、ラクツロース／マンニトール検査は、経細胞経路ではなく傍細胞経路のみを介した小分子の転移を測定する。

したがって、抗原であり、免疫系に挑戦する、細菌内毒素（食品タンパク質のサイズに匹敵する）のような巨大分子を使用して、巨大分子腸管透過性識別（ＬＭＩＰＩ）は評価されるべきである。さらに、ＢＢＢ透過性に関していくつかの証拠は、ＢＢＢ透過性における変化は、ＭＳおよび実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（４５−５０）の主要な誘発因子であることを明らかにしたものの、ＢＢＢ透過性の測定のための公認の血液検査は現在のところ存在しない。しかしながら、動物モデルにおいて、ＢＢＢの形態学的および機能的変化は、バリア損傷障害（７、１１、２８）を測定するためにゾヌリン／オクルジンを使用することによって実証された。

図４に示されるように、本発明の方法論の重点は、バリアからの解放に際し抗原となる巨大分子上にあり、血液、血清、および／または唾液試料で検出されるそれらに対する特異性ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ抗体の生産をもたらす免疫系に挑戦する能力を有する。

菌体内毒素や食物タンパク質のような巨大抗原分子に対する腸管バリア透過性の評価は、胃腸や自己免疫疾患の病因の理解において重要になってきている。科学的証拠は、多くの胃腸や自己免疫疾患は、エンドトキシンの増加した転移および腸壁（７、５１−５５）を介した好気性と嫌気性細菌に由来する他の細菌毒素を伴うことを示している。この増加した転移およびそれに関する炎症は、タイトジャンクションタンパク質の分解と、オクルジン／ゾヌリンのようなタイトジャンクションタンパク質およびＬＰＳのような菌体内毒素に対し、以降の免疫応答を誘発することがある。確かに、ラットおよびヒトの上皮細胞は、有意な量のゾヌリンを分泌する細菌毒素またはグリアジンにさらされる。ゾヌリンのこの放出は、傍細胞経路（７、５１）を介して腸管透過性をもたらす、タイトジャンクション複合体に由来するタンパク質ＺＯ−１の離脱が続いている。そして、多くの慢性疾患は、ＬＰＳおよび病原性細菌（２４、２５）の他の抗原に対するＩｇＡおよびＩｇＭの増加した血清値が伴う。これらの条件は、腸炎症および粘膜バリア透過性を引き起こし、それにより、腸壁の細胞およびタイトジャンクションタンパク質の解離間の拡大部は、アクトミオシンネットワークおよび防護壁の損失を誘発することができる。防護壁のこの損失は、細菌転移を増加させ、従って血清エンドトキシン、タイトジャンクションタンパク質、およびアクトミオシンの濃度を高める可能性がある。

本発明の特定の様態によれば、ＬＰＳ、タイトジャンクションタンパク質（オクルジン／ゾヌリン）およびアクトミオシンに対する増加した血清ＩｇＡおよびＩｇＭは、腸管バリア浸透性の存在およびバリアを越える巨大分子の輸送を示す。細菌のエンドトキシンは、Ｔリンパ球に対するスーパー抗原として作用する細菌毒素を介して、または、分子模擬態と呼ばれるメカニズムによって自己免疫を引き起こしている可能性がある。多くの細菌は、神経組織を含むヒト組織抗原に非常に類似する抗原部位を有する。腸管バリア透過性が放置されている場合、次いで、抗原の炎症性カスケードおよびそれらに対して生産された抗体は、順番に様々な組織の中に入り、最初の炎症および、次いで、神経自己免疫を含む自己免疫を誘発するだろう。したがって、抗原性腸管バリア透過性が、その経過を実行させる場合、継続的な変性は、抗原および、全身性炎症を引き起こすことができ、神経炎症、神経侵襲および神経変性をもたらす、付随する追加の免疫反応をもたらす、細胞性血液脳関門透過性の誘導が続く。

したがって、本発明の特定の様態によれば、慢性炎症や自己免疫性症状を備える患者は、細菌ＬＰＳ、タイトジャンクションタンパク質およびアクトミオシンに対するＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭの測定により、巨大抗原分子に対する増加した腸透過性の生存のために確認されるべきである。最後に、ＬＰＳおよびオクルジン／ゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭ抗体の測定に加え、これら抗体はまた、神経免疫疾患を備える患者における、ＢＢＢタンパク質、酵素、随伴性受容体および神経細胞抗原に対して測定されるべきである。細菌毒素および、組織損傷および自己免疫に至る、放出されたＴＪタンパク質、ＬＰＳおよび他の細菌抗原に対する抗体の生産によるＴＪ分解のこの多段階プロセスは、図５に図示されている。

本発明の特定の様態によれば、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリンおよび他のタイトジャンクションタンパク質、プラスＢＢＢタンパク質、血液中の神経細胞抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ）の検出および測定が、腸管／ＢＢＢ透過性および神経自己免疫の評価に最良な方法になり得るのに対し、口腔液中のＩｇＡ、およびＩｇＭならびに、ＴＪタンパク質およびＬＰＳに対する血液中のＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの測定および検出は、腸管バリア機能の評価に最良なアッセイになり得る。

細菌抗原（ＬＰＳ）は、オクルジンおよびＬＰＳがマクロファージおよび樹状細胞に提示される、タイトジャンクションおよびその後の粘膜下層への遊走を介した、タイトジャンクションの開口ならびにオクルジンおよびＬＰＳの継世を引き起こす、タイトジャンクションの分解およびゾヌリン放出を誘発する。マクロファージは、ＴおよびＢ細胞へこれらの抗原を提示する；これは異常な免疫応答、体液性（オクルジンおよびＬＰＳに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧ）および細胞性の両方が続く。体液性および細胞性免疫間のこの相互作用は、自己免疫疾患の典型的な組織損傷に至る、腸上皮組織およびその他の抗原を標的にする自己免疫プロセスのための最終的な原因である。

以下は、数人の検査患者についての代表的なアッセイの説明、ならびにそれらの使用および解析である。本明細書に記載の材料および方法と同様または同等の他の材料および方法は、本発明の実施または検査において使用することができるが、好ましい方法および材料については、特定の態様によれば、本発明をさらに説明するために、発明を例示的なアッセイの説明に記載されている。

ＥＬＩＳＡアッセイ
Ａ．材料および方法―プレートおよび試料調製：
Ｅ．ｃｏｌｉ０５５：８５由来のリポ多糖類；Ｅ．ｃｏｌｉＫ−２３５、緑膿菌、シュードモナス、サルモネラ腸炎、ネズミチフス菌、クレブシエラ肺炎、モルガネラ、ハフニアーアルベイ、シトロバクター・コセリ、アクチン、アクトミオシン、ミエリン塩基性タンパク質とａ−Ｂクリスタリンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（ＳＴ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入された。グリア原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）は、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入された。また、ゾヌリンペプチド１、２、３、腸ＺＯＴ受容体、ミエリン塩基性タンパク質８７−１０６、ペプチド８７−１０６、細胞間結合タンパク質、マトリックスメタロプロテアーゼ−３、本研究で命名されたＳ１００−Ｂのカルシウム結合領域、ＢＢＢ−１ＭＳＥＬＥＫＡＭＶＡＬＩＤＶＦＨＱＹＳＧＲＥＧＤＫＨＫＬＫＫ、ＢＢＢ−２ＳＥＬＫＥＬＩＮＮＥＬＳＨＦＬＥＥＩＫＥＱＥＶＶＤＫＶＭＥＴ、ＢＢＢ−３ＬＤＮＤＧＤＧＥＣＤＦＱＥＦＭＡＦＶＡＭＶＴＴＡＣＨＥＦＦＥＨＥ、脳ＺＯＴ結合タンパク質−１、−２、カルプロテクチン（ＭＲＰ−８）、および脳ＺＯＴレセプターも使用された。

９０％以上の純度を備えるすべてのペプチドＨＰＬＣグレードは、ＥＺＢｉｏｌａｂ社（Ｃａｒｍｅｌ、ＩＮ）により合成された。本願を通して、本文が逆の意味を支持しない限り、本明細書に記載のすべての範囲は、それらのエンドポイントを含むものとして解釈されるべきであり、また、オープンエンドの範囲は、商業的実用価値を含むように解釈されるべきである。同様に、本文が逆の意味を示さない限り、すべての値の一覧は、中間値を含むと考察するべきである。

図６に示されるように、抗原およびペプチドは、１．０ｍｇ／ｍＬの濃度でメタノールに溶解され、次いで、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．５で１：１００に希釈し、その５０μｌをポリスチレン平底ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加された。

プレートは、４℃で１晩インキュベートされ、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｐＨ７．４）を含むトリス塩酸緩衝液（ＴＢＳ）２００μｌで３回洗浄された。免疫グロブリンの非特異的結合は、ＴＢＳ中の２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）２００ＭＬの添加によって防止され、４℃１晩でインキュベートされた。プレートは洗浄され、品質管理（ＱＣ）を行った後、使用されるまで４℃に保たれた。

酵素コンジュゲートには以下のものが含まれていた：アフィニティー精製抗体ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号１０９−０５５−００８）；アフィニティー精製抗体ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号Ｌ０９−０５５−０１１）；および、アフィニティー精製抗体ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社、カタログ番号Ｌ０９−０５５−０４３）。

さらに本明細書に記載する方法に含まれる他の追加の試薬および材料には、以下のものが含まれていた：リン酸緩衝生理食塩水粉末（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｐ３８１３−１０ＰＡＫ）、ウシ血清アルブミン（Ｂｉｏｃｅｌｌ社、カタログ番号３２０３−００）、アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ−２００２）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｐ１３７９−１０００ＭＬ）、グリセロール（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｇ５５１６−５００ＭＬ）、水酸化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ−５８８１）、塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号８２６６）、ジエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｄ−８８８５）、１．０Ｎの塩酸溶液（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｈ３１６２‐ＩＧＡ）、基質錠：ｐ−ＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸）（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｓ−０９４２）５ｍｇ、および蒸留水（Ｄ．Ｈ_２０）。

図６に示されているように、マイクロウェルプレートは準備され、１２種類の腸脳関連抗原またはペプチドでコーティングされた。標準物質および陽性対照ならびに希釈した患者試料をこれらのウェルに添加し、異なる抗原を認識する自己抗体は最初のインキュベーション中に結合した。これらのウェルを洗浄し、全ての未結合蛋白質を除去した後、精製したアルカリホスファターゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ未結合コンジュゲートを、さらなる洗浄ステップにより除去された。

結合したコンジュゲートを、黄色の反応生成物を与えるパラニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）基質で可視化し、この強度は、試料中の自己抗体の濃度に比例する。水酸化ナトリウムは各ウェルに添加され、反応を停止させた。色の強度を４０５ｎｍで読み取った。

無地の赤の上端またはレッドタイガー（ｒｅｄｔｉｇｅｒ）の上端（ＳＳＴチューブ）を検体採取に用いられたが、特定の態様では、他の検体採取器具が、このアッセイのために企図される。

血液試料を、無菌静脈穿刺技術を用いて採取し、血清を、標準的な手順を用いて得た。特定の態様では、このアッセイのための血清は最小値が約１００μｌであることが好ましく、したがって、これは、血液の約１ｍｌ以上に相当する。

Ｂ．検査アッセイ手順
ＬＰＳ、腸管および／またはＢＢＢタンパク質に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＡ抗体のための分析手順について、これから説明する。いくつかの態様において、検査アッセイを開始する前に、全ての試薬を室温に戻した。この検査アッセイ手順には、所望の数および所望の種類の抗原ならびに／またはペプチドでコーティングした所望の数のウェルもしくはプレートの準備が含まれる。マイクロタイターウェルを準備した後、１：１００で希釈された対照標準物質約１００μｌは、マルチチャネルピペッターを用いて行うことができ、図７に示すように、マイクロタイタープレートのＡ列およびＢ列に添加された。図７に示すように、１：１００で希釈された患者の検査試料（ここでは血清）約１００μｌは、第１臨床検体のＣ列およびＤ列、第２臨床検体のＥ列およびＦ列、ならびに第３臨床検体のＧ列およびＨ列の２つ組のウェルに添加された。

図８に示すように、別々のプレート上で、２つ組の臨床検体と同様に周期的な（すなわち毎週）陰性対照および陽性対照の実験が行われた。

次いで、これらのプレートは室温で約６０分間インキュベートされた。インキュベーション後、ウェルを次いで空にして、ＥＬＩＳＡ洗浄器を用いてＰＢＳで４回洗浄された。最適に希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＡ約１００μｌは、ＩｇＡプレートに添加され、酵素標識ＩｇＧ約１００μｌはＩｇＧプレートに添加され、抗ＩｇＭはＩｇＭプレートに最適な希釈で添加された。

次いで、各プレートは室温で約３０〜約６０分間インキュベートされた。コンジュゲートのインキュベーション終了約１０分前に、基質溶液は、錠剤が完全に溶解するまでよく混合された基質緩衝液約５ｍｌとｐ−ニトロフェニルリン酸錠剤の約５ｍｇを混合することによって調製された。ＥＬＩＳＡ洗浄器を使用して、ＰＢＳでの洗浄を４回繰り返した。次いで、基質溶液約１００μｌは各ウェルに添加された。次いで、プレートは、直射日光への暴露を回避しながら、室温で約３０分間インキュベートされた。反応は、３ＮのＮａＯＨ約５０μｌを添加することにより停止された。これらのウェルの色の強度を、マイクロタイタープレートリーダーを用いてブランクウェルに対して４０５ｎｍで読み取り、標準物質、対照および未知試料の吸光度値を記録した。

Ｃ．結果の計算
４０５ｎｍでプレートの読み取りを行い、光学密度値（ＯＤ_４０５）を得た後、列ＡおよびＢにおいて、陰性対照の平均ＯＤ、陽性対照の平均ＯＤおよび各臨床検体の平均ＯＤを標準物質の平均ＯＤで除し、各指標値（ＩＶ）を得た。

各２つ組試料の平均ＯＤを標準物質対照値の平均ＯＤにより除することによって、１２種類の異なる抗原に対して各抗体に対する指標値（ＩＶ）を計算した（例えば、ウェルＣ１およびＤ１の平均ＯＤをウェルＡ１およびＢ１の平均ＯＤで、ウェルＣ２およびＤ２の平均ＯＤをウェルＡ２およびＢ２の平均ＯＤで、ウェルＣ３およびＤ３の平均ＯＤをウェルＡ３およびＢ３の平均ＯＤで除する、など）。

次に、確立された参照範囲と結果を比較した。
指標＝患者の平均ＯＤ／標準物質の平均ＯＤ

Ｄ．結果の解釈
ｉ．セリアック病、グルテン免疫反応性および感受性ならびにクローン病患者におけるＩｇＧ／ＩｇＭ／ＩｇＡ抗体のパターン
９名の健常対象者（表１から３）のＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体パターンの例およびセリアック病および腸管透過性のある３名の患者（表４）、グルテン運動失調のある３名の患者（表５）および多発性硬化症の３名の患者（表６）とのそれらの比較をそれぞれ表１−６で示す。

セリアック病およびグルテン免疫反応性／感受性／自己免疫との間のデータ解釈および臨床検査による鑑別を表７から９で示す。

ｉｉ．セリアック病および腸管透過性、グルテン運動失調がある患者およびＭＳ患者における、腸、ＢＢＢタンパク質および関連抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体のパターン
指標の計算に基づき、９名の健常対照者（表１から３）、セリアック病および腸管透過性のある３名の患者（表４）、グルテン運動失調のある３名の患者（表５）および多発性硬化症の３名の患者（表６）のＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体のパターンをそれぞれ表１−６で示す。健常対象全員において、抗体指標が１．５より高いかもしれないが、２．０よりも著しく大きくはないであろうＬＰＳおよびＭＢＰを除き、他の抗原に対する抗体指標は、１．５よりも小さいかまたはきわめて小さいことに留意されたい（表１−３）。

セリアック病患者において、脱アミド化α−グリアジン３３マーペプチド、組織トランスグルタミナーゼ（ｔＴｇ）およびグリアジン−ｔＴｇ複合体に対するＩｇＧおよびＩｇＡにより確認した場合、抗体のパターンは患者によって変動する。

例えば、表４の試料１０で、これらの抗体は、ＬＰＳ、ゾヌリン／オクルジン、腸管ＺＯＴ受容体、細胞間結合タンパク質、ＭＭＰ−３、α−Ｂクリスタリンおよびミエリン塩基性タンパク質に対して顕著に高いが、このことから、腸管透過性亢進に加えて、患者がＢＢＢ透過性を抱えている可能性があることが示唆される。表４の試料１１は、細胞間結合タンパク質および腸管ＺＯＴ受容体に対する抗体の顕著な上昇を示し、ＬＰＳに対して中程度の上昇を示したが、ＢＢＢタンパク質および神経抗原に対しては上昇せず、このことから、セリアック病に加え、患者が腸管透過性、ＢＢＢ透過性、神経自己免疫およびおそらく他の自己免疫を有し得ることが示唆される。

３名のグルテン運動失調患者（試料１３から１５）におけるガット・トゥ・ブレイン（ｇｕｔ−ｔｏ−ｂｒａｉｎ）に相当する１２種類の異なる抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体のレベルを表５で示す。これらの患者におけるグルテン運動失調は、脱アミド化α−グリアジン３３−マーペプチド、ｔＴｇ−２、グリアジン−ｔＴｇ複合体、ｔＴｇ−６および小脳抗原に対するＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の存在により確認した。これらの患者において、抗体のパターンは、ＺＯＴ結合タンパク質、脳ＺＯＴ受容体、α−Ｂクリスタリン、カルプロテクチン、ＧＦＡＰおよび細胞間結合タンパク質に対して顕著により高く、バリア損傷障害が確認される。

３名のＭＳ患者（試料１６から１８）における１２種類の試験抗原に対するこれらの抗体のレベルを表６でまとめる。ＭＳの診断は、異常なＭＲＩに加え、ＭＢＰ、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、α−Ｂクリスタリン、プロテオリピドタンパク質、リンパ球活性化および炎症性サイトカイン産生に対する抗体検出に基づいて行われた（４４）。神経抗原、ＢＢＢタンパク質およびゾヌリン／オクルジンに対して抗体レベルの顕著な上昇を検出した。これは、実際にＭＳ患者においてＢＢＢ機能不全があることを示すものである。

ｉｉｉ．消化管自己免疫を有する患者における細菌性リポ多糖およびオクルジン／ゾヌリンに対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体の測定
腸管透過性は胃腸自己免疫疾患で顕著である（４）。図９は、健常対照および消化管自己免疫がある患者における、細菌エンドトキシン（リポ多糖）およびタイトジャンクションの構造（オクルジン／ゾヌリン）に対する抗体の上昇を比較する図表を示す。

腸上皮全域にわたる抗原性巨大分子の過剰な侵入によって、複数の炎症性サイトカインの産生が開始され、全身性慢性炎症が起こり始め、その継続的向上が持続し得る（５６）。これは、最終的な自己免疫疾患に導く３要因（遺伝的脆弱性、環境曝露および腸管透過性）にとって必須の要素と思われる。

本発明のある態様によれば、本明細書中で、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリンおよびアクトミオシンネットワークに対する抗体上昇が、健康な腸管バリアの破壊を同定するバイオマーカーであり、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリン、他の細胞間結合タンパク質、ＢＢＢタンパク質＋神経抗原（例えば、ＭＢＰ、α−Ｂクリスタリン、ＧＦＡＰ、カルプロテクチンおよび脳ＺＯＴタンパク質）に対する抗体上昇が、健康な腸管バリアの破壊だけでなく、ＢＢＢ完全性の破綻も示すという仮説が立てられる。

本発明のある態様による、口腔液中のＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリンおよびアクトミオシンに対する抗体レベル上昇の臨床的解釈は表８で示す。

本発明のある態様による、ＬＰＳ、オクルジン／ゾヌリン、血液脳関門タンパク質および神経抗原に対する抗体の血中レベル上昇の臨床的解釈を表９で示す。

症例
２つの異なる症例報告、第一にセリアック病患者および第二に多発性硬化症患者の症例を次のとおり与える。

Ａ．症例報告＃１：セリアック病および腸管バリア機能不全の患者
身長５’４”、体重１０６ｌｂｓで、線維筋痛様の症候群および体重減少（過去６ヶ月中、月に１から２ｌｂｓ）を伴い、便秘、下痢および全身にわたる疼痛を含むＧＩ障害のある３８歳女性を内科医が診察した。実験室研究から、ＣＢＣが異常であり、ヘモグロビン９．９ｇ／ｄＬ、ＭＣＶが７７ｆＬ、赤血球沈降速度５４ｍｍ／１^ｓｔｈｒであり、葉酸およびビタミンＢ１２濃度は低いが、肝臓酵素レベルおよび高感度Ｃ−反応性タンパク質が高いことが明らかとなった。ＡＮＡ、リウマチ因子、Ｔ３、Ｔ４およびＴＳＨレベルを含む詳細な生化学および免疫学的プロファイルを調べたところ、全ての試験が正常範囲内であった。胃腸の不快感、軽度の発熱および頭痛について繰り返し訴えた後、ＧＩ検査のために患者を専門機関に紹介した。

大腸内視鏡検査および十二指腸生検を行い、免疫組織学的評価から、全体的な絨毛萎縮があり、ＭａｒｓｈＩＩＩ分類であることが明らかとなった。この時点で、グリアジンおよびトランスグルタミナーゼに対するＩｇＧおよびＩｇＡ濃度を調べた。グリアジンおよびトランスグルタミナーゼに対するＩｇＧおよびＩｇＡの両者とも、参照範囲よりも３から５倍高かった。

絨毛萎縮を考慮して、セリアック病のグリアジンおよびトランスグルタミナーゼ陽性診断を行った。本患者に輸血し、抗炎症薬を処方し、グルテン不含食を開始した。３ヵ月後、本患者の全体的な胃腸不快感は改善し、体重が４ポンド増加したものの、本患者のＣＲＰは高いままであり、身体の疼痛および軽度発熱が継続した。これを考慮し、炎症および軽度発熱の根本的原因を判定するために、ＬＰＳ、ゾヌリン／オクルジンおよび細胞間結合タンパク質に対する抗体を調べた。表４、試料１０で与えられる結果から、健常対象と比較して、本患者（試料１０）ではＬＰＳ、ゾヌリン／オクルジンおよび細胞間結合タンパク質に対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体レベルが３から６倍高いことが示され、このことから、セリアック病に加えて、本患者において細菌移行、タイトジャンクション損傷および大きな抗原性分子に対する腸管壁浸漏症候群があることが示唆された。

したがって、グルテン不含食に加え、レクチン不含食＋プロバイオティクス・グルタミン、Ｎ−アセチルシステイン、ＥＰＡ／ＤＨＡ、ビタミンＤ、ラクトフェリン、キシリトールおよびボスウェル酸の実行を進め、本患者に腸管壁浸漏症候群に対する治療を行った。このプロバイオティックレジメ＋レクチンおよびグルテン不含食の開始から３０日後、本患者の臨床状態は顕著に改善し、発熱が３７℃に低下し、さらに６ｌｂｓ体重が増加した。６０日後、腸管壁浸漏症候群に対する治療をプロバイオティクスのみに減らしたが、グルテン不含食は継続した。１年後、全ての臨床検査を繰り返し、グリアジン、トランスグルタミナーゼ、ＣＲＯ、ＬＰＳおよびゾヌリン／オクルジンに対する反復試験は正常範囲内となったが、これは、腸管壁浸漏に対する管理＋グルテン不含食がセリアック病および腸管壁浸漏症候群に罹患したこの患者の治療に有効であったことをさらに示すものであった。

考察：絨毛萎縮に加えて、セリアック病の患者の大多数が腸管壁浸漏症候群にも罹患していることが文献において確立されている。このため、グルテン不含食で改善するのはセリアック病患者のおよそ５０％のみであり、患者らの絨毛構造が正常に戻ったのはこのような治療の６ヶ月後であった。腸管壁浸漏症候群がセリアック病において誘導されるメカニズムは、一部の患者では、特異的なグリアジンペプチドが上皮細胞に結合し、タイトジャンクションタンパク質に対して損傷を生じさせ、ゾヌリン／オクルジンおよび粘膜下から血液へのクローディンの放出を引き起こすという事実によるものである。この特定の場合において、本患者の症状の一部はグルテン不含食で改善したが、グルテン不含食は、ＬＰＳ移行および消化管透過性亢進により誘導される炎症性カスケードを改善しなかった。しかし、グルテン不含食＋自然療法を用いたタイトジャンクションタンパク質修復のための治療（５７から６１）の実行から３０−９０日後、臨床症状および臨床検査の結果の両方が正常に戻った。したがって、セリアック病患者については、抗原性である大きな分子に対する腸管壁浸漏についてスクリーニングし、セリアック病に対してだけでなく、消化管バリアを修復するための治療も行うべきであると結論付けられる。本発明の発明の主題は、この能力を提供する。

Ｂ．症例報告＃２：多発性硬化症、消化管バリアおよび血液−脳関門透過性がある患者
身長５’８”、体重１８２ｌｂｓの３８歳男性は、四肢脱力を伴う３週間の進行性の頸部、背部および筋肉痛という病歴後、神経科医を紹介された。紹介前日、本患者は、刺痛を伴う排尿困難ならびに階段を昇ることができないほどの胴部および肢の知覚障害を発症した。入院の僅か２年前、本患者には家族の問題があり、非常に落ち込んでいたが、それに対して何ら助けを求めなかった。本患者の全体的な既往歴は、他に、ビタミンＢ１２および鉄サプリメントで治療を受けた原因不明の軽度の小球性貧血を除き、特になかった。

本患者が軽微な脳卒中に罹患していた可能性があるか否かまたはある種の神経もしくは自己免疫障害に罹患していた可能性があるか否かを明らかにするために、一連の免疫学的プロファイルおよび神経学的検査を開始した。

臨床検査から、化学およびＣＢＣ検査が正常であり、ヘモグロビンの結果が１０．８ｇ／ｄＬであることが明らかになった。ＡＮＡ、リウマチ因子、免疫複合体、総免疫グロブリン、カルジオリピド（ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｄ）抗体および甲状腺機能試験を含む免疫学的プロファイルは正常範囲内であった。

さらなる試験中、脳脊髄液および血液を回収し、マイコバクテリウム、ボレリア菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ＣＭＶ、ＥＢＶ，ヘルペス６型、ＨＴＬＶ−１および−２および梅毒について試験したところ、全て陰性であった。ＣＳＦタンパク質は０．７ｇ／Ｌ、グルコースは２．３ｍＭｏｌ／Ｌであった。

神経学的検査から、矯正視力が低下し、右眼で６／４８、左眼で６／３６であり、眼球運動は正常であることが明らかとなった。本患者は、両肢に錐体筋衰弱があり、歩行が緩徐であった。ピン刺激痛覚検査から、両側でＤ１０以下の片側感覚レベルであることが分かった。

脳のＭＲＩスキャンから、ＭＳ患者で観察されている、軽度の全身性萎縮を伴う軽度の白質の異常が示された。

しかし、グルテン感受性、セリアック病および腸管壁浸漏症候群の可能性を排除するために、ＡＧＡ、ｔＴｇ抗体およびラクツロース／マンニトール試験を行った。セリアックスクリーニングから、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗−グリアジン抗体の両方が参照領域の３から６倍高いが、トランスグルタミナーゼに対するＩｇＧおよびＩｇＡに対して完全に陰性であることが明らかになった。さらに、ラクツロース／マンニトール試験結果は極めて異常であった。結果的に、次のさらなる試験を行った：ＬＰＳ、ゾヌリン／オクルジン、腸管ＺＯＴ受容体、細胞間結合タンパク質、ＭＭＰ−３、脳ＺＯＴ結合タンパク質、脳ＺＯＴ受容体、カルプロテクチン、ＧＦＡＰ、α−Ｂクリスタリン、ＢＢＢタンパク質およびＭＢＰに対するＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体。表６、試料１７でまとめた結果から、ＭＢＰおよびＧＦＡＰに対する抗体レベルの顕著な上昇が示され、これにより異常なＭＲＩ知見およびＭＳの診断が裏付けられた。さらに、ゾヌリン／オクルジン、カルプロテクチンおよびＢＢＢタンパク質に対する抗体の顕著な上昇から、本患者において消化管およびＢＢＢ透過性亢進を伴うＧＩ管病変が示唆された（表６）。これらの試験結果に基づき、本患者に１ｇの静脈内メチルプレドニゾロンを５日間にわたり与えたところ、幾分臨床的改善が見られた。この点で、本患者にβ−セロンを処方したところ、１５日後に顕著な改善が見られた。さらに、損傷のあるＢＢＢおよび消化管バリアを修復するために２００ｍｇのミノサイクリンＩＶグルタチオン＋プロバイオティクス・グルタミン、Ｎ−アセチルシステイン、ＥＰＡ／ＤＨＡ、ビタミンＤ、ラクトフェリン、キシリトールおよびボスウェル酸を与えた。この治療計画から３ヵ月後、患者の全身的健康は顕著に改善した。

当業者にとって当然のことながら、既に記載されたものの他に、本明細書中の発明の概念から逸脱することなく多くのさらなる変更が可能である。したがって、発明の主題は、付属の特許請求の範囲を除き、限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を読み取る際、用語は全て、内容と適合する最も広く可能なように解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、包括的に要素、構成要素または段階を指すものと解釈すべきであり、これは、参照の要素、構成要素または段階が存在し得るかまたは利用され得るかまたは、明確には言及されていない他の要素、構成要素または段階と組み合わせられ得ることを指す。明細書、特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つを指す場合、その文章は、Ａ＋ＮまたはＢ＋Ｎなどではなく、その群からの１つの要素のみを必要とするように解釈されるべきである。

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Claims

ヒトの試料を試験する方法であって、
細菌毒素に対する前記試料の第一の分画の結合からの第一のシグナルを測定することと；
（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液脳関門関連抗原の少なくとも１つから選択されるネイティブ抗原に対する前記試料の第二の分画の結合からの第二のシグナルを測定することと、を含む、方法。
前記細菌毒素がリポ多糖を含む、請求項１に記載の方法。
前記ネイティブ腸関連抗原が、（１）腸管構造タンパク質；（２）タイトジャンクションタンパク質；（３）タイトジャンクションタンパク質に対する結合受容体；および（４）細胞間結合タンパク質からなる一覧から選択される、請求項２に記載の方法。
前記血液脳関門関連抗原が、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；（３）マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、（４）脳ＺＯＴ結合タンパク質；（５）脳ＺＯＴ受容体；（６）カルプロテクチン；および（７）ミエリン塩基性タンパク質からなる一覧から選択される、請求項３に記載の方法。
前記腸管構造抗原がアクチン／アクトミオシンを含む、請求項２に記載の方法。
前記タイトジャンクション抗原がオクルジンおよびゾヌリンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
前記結合受容体が、腸管ＺＯＴ受容体を含む、請求項２に記載の方法。
前記構造タンパク質がマトリクスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭＰ−３）を含む、請求項２に記載の方法。
前記血液脳関門関連抗原が、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；および（３）マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）からなる一覧から選択される、請求項１に記載の方法。
請求項１に記載の方法を用いた試験を実験室から指示することと、
試験結果を解析することと、
を含む、腸管壁浸漏症候群が関連する疾患を診断する方法。
請求項１に記載の方法を用いた試験を実験室から指示することと、
試験結果を解析することと、
を含む、血液脳関門透過性が関連する疾患を診断する方法。
（１）細菌毒素；ならびに（２）（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液脳関門関連抗原の少なくとも１つを含むネイティブ抗原を結合ペプチドとして有する、試験プレート。
前記腸関連抗原が、（１）腸管構造タンパク質；（２）タイトジャンクションタンパク質；および（３）タイトジャンクションタンパク質に対する結合受容体；および（４）細胞間結合タンパク質からなる一覧から選択される、請求項１２に記載の試験プレート。
前記血液脳関門関連抗原が、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；（３）マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、（４）脳ＺＯＴ結合タンパク質；（５）脳ＺＯＴ受容体；（６）カルプロテクチン；および（７）ミエリン塩基性タンパク質からなる一覧から選択される、請求項１３に記載の試験プレート。
前記血液脳関門関連抗原が、（１）血液脳関門タンパク質；（２）グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）；（３）マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、（４）脳ＺＯＴ結合タンパク質；（５）脳ＺＯＴ受容体；（６）カルプロテクチン；および（７）ミエリン塩基性タンパク質からなる一覧から選択される、請求項１２に記載の試験プレート。
細菌毒素ならびに（ａ）腸関連抗原および（ｂ）血液脳関門関連抗原の少なくとも１つから選択されるネイティブ抗原に対する患者由来試料の結合からシグナルを生成させる抗体試験パネルから試験結果を得ることと、
前記試験結果を解析することと、
を含む、解剖学的バリアの過剰な透過性が関連する疾患の診断を支援する方法。
前記試料が血液試料である、請求項１６に記載の方法。
前記試料が唾液試料である、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、腸内微生物叢腸内毒素症に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧの全てについての陰性結果およびアクトミシン（ａｃｔｏｍｙｓｉｎ）に対するＩｇＧについての陰性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、傍細胞経路を介する細菌性抗原による腸管バリアの破壊に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびオクルジンまたはゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびアクトミシン（ａｃｔｏｍｙｓｉｎ）に対するＩｇＧについての陰性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、傍細胞経路を介する細菌性抗原以外による腸管バリアの破壊に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧの全てについての陰性結果およびオクルジンまたはゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびアクトミシン（ａｃｔｏｍｙｓｉｎ）に対するＩｇＡについての陰性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、経細胞経路を介する細菌性抗原による腸管バリアの破壊に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧの全てについての陰性結果およびアクトミシン（ａｃｔｏｍｙｓｉｎ）に対するＩｇＡについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、細菌毒素により誘導される腸管バリアおよび血液脳関門の完全性の破壊に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果および神経抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
細菌毒素以外の要因による腸管バリアおよび血液脳関門の完全性の破壊に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのそれぞれについての陰性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果および神経抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、腸管バリアの完全性の破壊を伴わず、血液脳関門の完全性の破壊を伴う腸内微生物叢腸内毒素症に関する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのそれぞれについての陰性結果、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果および神経抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、腸管バリアまたは腸内微生物叢腸内毒素症を伴わない、血液脳関門の完全性の破壊、神経炎症および神経自己免疫に関連する診断を、前記試験結果が、リポ多糖の細菌毒素に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのそれぞれについての陰性結果およびオクルジンおよびゾヌリンに対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのそれぞれについての陰性結果、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果および神経抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。
前記試験結果を解析する段階が、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー病または末梢神経障害および大うつのうち１つの診断を、前記試験結果が、血液脳関門タンパク質に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果および神経抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧのいずれかについての陽性結果を含む場合であり得ると考察することを含む、請求項１６に記載の方法。