CN1788017B - 炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸及其编码的多肽，它们的表达在正在经历血脑屏障功能性的早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。这类多肽在本文被称作脂多糖敏感性(LPSS)多肽。这些核酸和多肽可以用于控制需要这种生物学作用的哺乳动物血脑屏障性质的方法中。这包括血脑/视网膜屏障、脑(包括眼)疾病以及外周血管疾病的诊断和治疗。另外，本发明涉及抗LPSS多肽抗体或配体作为诊断探针、作为血脑屏障靶向剂或者作为治疗剂的应用，本发明还涉及LPSS多肽的表达、激活或生物活性的配体或调节剂作为诊断探针、治疗剂或药物输送增强剂的应用。
Description
发明领域
本发明涉及新的核酸及其编码的多肽，其表达在血脑屏障功能经历早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。这些多肽在本文被称作“脂多糖敏感性(lipopolysaccharide-sensitive)”多肽(LPSS多肽)。本发明还涉及用于在需要这种生物学作用的哺乳动物中控制血脑屏障性质的方法。这包括诊断和治疗血脑/视网膜屏障失调、脑(包括眼)疾病以及外周血管疾病。另外，本发明进一步涉及抗LPSS多肽抗体或配体作为诊断探针、作为血脑屏障靶向剂或者作为治疗剂的应用，以及LPSS多肽的表达、激活或生物活性配体或调节剂作为诊断探针、治疗剂或药物输送增强剂的应用。
发明背景
为了正确发挥功能，神经元需要紧密调节的胞外环境。这种基本的、适当的微环境是由称为星形胶质细胞(或星形胶质)的滋养脑细胞局部维持的。为应付血液和脑的胞外区室的成分之间显著及可变的不同，中枢神经系统(CNS)还通过许多血液-CNS屏障而与一般的血液循环隔离开，所述屏障即血脑屏障、血液脑脊液(CSF)屏障、软膜管(pial vessle)-CSF屏障、室管膜和神经胶质界限，以及血液-视网膜屏障、血液-神经屏障、血液-脊髓屏障。血脑屏障(BBB)被认为是最重要的血液-CNS屏障，因为与其它血液-CNS屏障相比其覆盖表面积大1000倍。BBB特征在于覆盖在CNS中毛细血管的独特的紧密的内皮细胞层。再者，星形胶质细胞通过在毛细管上伸出“神经胶质足(glialfoot)”而在这些内皮细胞中是BBB性质的主要诱导物。
特别地，BBB调节离子(Na+、K+、Ca2+)、水、营养素、代谢物、神经递质(谷氨酸、色氨酸)、血浆蛋白(白蛋白、血纤蛋白原、免疫球蛋白)、免疫系统的细胞及异生素(药物)进和出脑的运输。脑中的毛细管内皮与外周毛细管相比具有特殊的性质。其具有狭窄的紧密连接、没有透明斑、低胞饮活性及连续的基底膜。这种狭窄的紧密连接导致1500-2000 Ohm.cm2高电阻。另外，内皮细胞具有负表面电荷，排斥负电荷的化合物。它们具有许多线粒体和酶以分解化合物及具有多种选择性转运系统以将营养素及其它化合物主动转运至脑内和脑外。在健康状况下，BBB不仅调节药物或内源化合物进入脑，而且与外周器官相比细胞渗入也较低。正常的内皮细胞层提供了血栓抗性表面，防止血小板和白细胞粘附及任何凝固系统的激活。高度特化的脑微血管内皮细胞形成紧密的屏障，其将脑与免疫监视隔离并仅使少量单核的细胞(如激活的T细胞)迁移至CNS。主要组织相容性复合体抗原的低表达、健康CNS中抗原呈递细胞的低数目及CNS不是由充分发育的淋巴管系统适当引流的事实使得脑是“免疫隔离(immunosecluded)”部位。
目前关于BBB的解剖基础的理解是其作为被动态调节的器官起作用，受外周(例如皮质醇、肾上腺素)和局部激素(例如细胞因子、趋化因子)的影响。除了星形胶质细胞之外，一些其它细胞如周细胞、神经元和免疫系统的细胞影响其性质。接下来，内皮参与其它过程如凝固、血管紧张(vasotonus)的控制、抗原呈递及由例如通过生长因子对基底膜的控制。特别地，在病理状况如脑和大脑炎症、脑肿瘤中血管发生的情况下，激活的内皮起重要作用。
一般地，可认为BBB是保护脑稳态的器官。非令人惊奇地，BBB的功能异常在大量的脑病变中起关键作用。一些实例是：
i.脑血管性水肿(cerebral vasogenic edema)是由于疾病(炎症)导致的来自血液的血浆蛋白和水渗入脑组织所致。这是在病变如休克、脑部感染、头部外伤、脑肿瘤和多发性硬化中导致死亡和残疾的主要原因。水肿导致脑在颅骨的坚硬环境内膨胀。所引起的颅内压增高随后可导致脑疝及随后的脑的基本功能如呼吸功能丧失，如果不加治疗，则导致严重的残疾、昏迷甚至死亡。
ii.在多发性硬化中，激活的自身反应性T细胞穿过激活的BBB。在CNS中，这些T细胞诱导针对髓鞘质的炎症应答，其也导致BBB的破坏。自身抗体和补体因子穿过破坏的BBB，导致脱髓鞘。髓鞘质片段还通过破坏的BBB回渗入外周，在此其激活更多的自身反应性T细胞并增加更多的自身抗体产生。
iii.不能保证细胞外液中精密的离子和神经递质的平衡将导致神经元信号传递损害并因此损害认知功能、神经精神疾病或癫痫发作。
iv.毒性蛋白质穿过BBB进入血流的清除受损与神经退行性疾病如阿尔茨海默病和朊病毒病如克雅氏(Creutzfeldt-Jakob)病和BSE的发病机理相关。这种蛋白质的病理性积聚导致神经元细胞死亡及随后损害了认知功能。
因此治愈的功能异常的BBB展现了治疗脑病症的新方法。脑失调在西方世界是导致发病和残疾的主要因素。新LPSS多肽的鉴定和定性将被证明是符合这些需要的，所述新LPSS多肽的基因表达在血脑屏障功能性经历早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。
除了具有治愈BBB能力以治疗脑失调的所需药物之外，正确发挥功能的BBB也是阻断或降低介导免疫应答的淋巴细胞进入脑所必需的。同样也是转移的癌细胞进入脑所必需的。新LPSS多肽的鉴定和定性将被证明是符合这些需要的，所述新LPSS多肽的基因表达在血脑屏障功能性经历早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。
然而，BBB也限制异生素(如药物和诊断剂)输送至脑，这使得脑失调的传统药物治疗(即靶向神经元)变得复杂。因此还需要通过可逆性开放BBB而操纵BBB的通透性以将血液运载的膜不通透的药物输送至脑，或者通过内源性BBB转运系统选择性将药物靶向于脑。对经过血液-睾丸屏障和血液-胎盘屏障的药物输送也同样。新LPSS多肽的鉴定和定性将被证明是符合这些需要的，所述新LPSS多肽的基因表达在血脑屏障功能性经历早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。
也需要在除了血管失调中受影响的脑或眼之外的其它器官的微血管中操纵BBB的性质。在外周微血管中导入BBB性质对如下病症是有益的：(微)血管病、病理性血管发生、血液-睾丸屏障或血液-胎盘屏障失调及如肺水肿、细菌内毒素导致的休克、过度纤维蛋白溶解(hyperfibrinolysis)及过敏性休克等病症。新LPSS动态的鉴定和定性将被证明是符合这些需要的，所述新LPSS多肽的基因表达在血脑屏障功能性经历早期动态炎症诱导的改变的脑微血管内皮细胞中被调节。
长期以来已知脑星形胶质细胞在脑毛细管内皮细胞(BCEC)中通过伸出血管周足(perivascular end feet)而诱导BBB性质(Arthur et al.，1987，Brain Res.433：155-159；Janzer and Raff，1987，Nature 325：253-257)。长期以来也已知这种诱导是由可溶的因子带来的，因为星形胶质细胞条件化的培养基(ACM)可再现一些这样的诱导作用(Tio etal.，1990，Eur.J.Morphol.28(2-4)：289-300)。已经鉴别了一些候选分子，其能模拟在BCEC中ACM介导的屏障诱导现象，这些分子包括TGFβ、GDNF、bFGF、IL-6和类固醇。一些人员发现这种因子不是蛋白质或肽，其含有一种铁-氧化氮加成物(Federici et al.，1995，J.Neurochem.64(3)：1008-1015；Regina et al.，2001，Biochim.Biophys.Acta 1540(3)：233-242)。因此人们可推断尽管存在一些研究成果，但仍未鉴别可靠的星形胶质细胞衍生因子。
在先前的实验中，我们发现暴露于ACM的最初分离的BCEC在培养中保持许多基本的BBB性质(Gaillard et al.，2001，Eur J Pharm Sci.12(3)：215-222)。通过在细胞培养孔的底部导入最初培养的脑星形胶质细胞，则经过在滤膜插入物上培养的BCEC单层细胞的跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance，TEER)比在只有ACM中培养的BCEC单层细胞增加至大约150％。另外，当将星形胶质细胞在滤膜插入物的底部培养时，因此与BCEC非常接近，TEER倍增3-8倍。另外，荧光素钠(FLU，分子量376Da)和FITC标记的葡聚糖(FD4，分子量4kDa)的细胞旁(paracellular)转运降低至在只有ACM中培养的BCEC的大约50％。总之，BCEC的星形胶质细胞的接近性确定作用的程度，尽管它们不与BCEC物理性接触(Gaillard et al.，2001，如前)。
TEER是量化小离子通过BCEC之间紧密连接的通透性的一种灵敏的量度标准。TEER因此代表了紧密连接的功能性，其被认为是BBB的主要特点。TEER的绝对值主要依赖于细胞之间紧密连接的数量和复杂性。另外，其还是大的和亲水性化合物的旁细胞转运的限制因素。
在另外的研究中，我们发现在滤膜插入物的底部培养的星形胶质细胞：1)在第一次传代后在BCEC上保持(或(再)诱导)P-糖蛋白(Pgp，参与多种药物抗性的药物流出泵)的表达(Gaillard et al.，2000，Pharm.Res.17(10)：1198-1205)；2)降低长春花碱诱导的BBB破坏的敏感性(Pgp功能性分析)(Gaillard et al.，2000，如前)；3)尽管PgP在BCEC单层细胞中表达，星形胶质细胞诱导PgP底物从滤膜的基底外侧(CNS)主动转运至顶端(血液)，但这在BCEC单层细胞中观测不到(Gaillard etal.，2000，如前)；4)介导对LPS诱导的BCEC破坏的保护性应答(Gaillard，2000a，Ph.D.Thesis Leiden University，p 81-97)。这些作用无一是仅由ACM诱导的。显然，滤膜插入物的底部星形胶质细胞的物理性和最接近的存在当与只有ACM的情况对比时，在BCEC中诱导BBB性质方面是出众的。
因此需要另外的产物、方法和分析以提供控制BBB性质或者鉴定和调节对BBB功能性的早期动态炎症诱导的改变的细胞应答及对这种改变的组织应答的手段。这种产物、方法和分析在如上述那些众多的医学病症和程序中提供益处。
发明描述
定义
“多肽活性或稳态水平的改变”在本文是指与在健康个体中正常活性或稳态相比，多肽的生物学活性或蛋白质的稳态水平的任何可检测的变化。
“激动剂”在本文是指模拟生物学活性、优选一种多肽、受体或其配体的生物学活性的任何分子。拮抗剂是部分或完全阻断、抑制或中和这种生物学活性的任何分子。
术语血管病失调的“治疗”是指降低或减轻个体的一或多种症状，预防一或多种症状恶化或进展，促进康复或改善预后，和/或预防未患病个体患上疾病以及减慢或降低现有疾病的进展。对于给定的个体，症状的改善、其恶化、衰退或进展可以通过客观或主观量度标准而确定。治疗效力可以根据发病率或死亡率的改善而测定(例如对于选定的群体存活曲线的延长)。
内皮细胞/血管屏障的通透性增加使其更加渗漏(leaky)(即紧密性更低，通透性更高)。内皮细胞/血管屏障的通透性降低使其更加紧密(即渗漏性更低、通透性更低)。治疗血管失调因此意味着降低血管通透性，然而增加药物输送因此需要增加血管通透性。在BCEC-星形胶质细胞共培养物的BCEC中被上调的本发明LPSS多肽参与增加血管通透性。在BCEC-星形胶质细胞共培养物的BCEC中被下调的本发明LPSS多肽参与增加血管通透性。在BCEC单层细胞和BCEC-星形胶质细胞共培养物之间被差异上或下调的本发明的LPSS多肽参与从炎症刺激中恢复的能力(图2)。
内皮细胞通透性的调节
本发明的第一方面涉及一种调节内皮细胞通透性的方法。所述方法包括改变内皮细胞中LPSS多肽的活性或稳态水平，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列至少90％相同性的氨基酸序列。
序列相同性或相似性在下文描述。
所述内皮细胞优选是血管内皮细胞，更优选是微血管内皮细胞。最优选的内皮细胞是组成或者是血液-中枢神经系统(CNS)屏障的一部分的微血管内皮细胞，最优选的是脑微血管内皮细胞，所述屏障如血脑屏障、血液-视网膜屏障、血液-神经屏障、血液-脊髓屏障。
这种内皮屏障细胞可以在原位、离位(ex situ)(即在分离的毛细管中)或在体外通过例如特异性内皮细胞标记、特异性屏障标记鉴定，但也可以通过屏障功能分析而鉴定。更特别地，内皮细胞可以通过其原位形态学而鉴定，即直径为大约10-20微米的由单一的(或者不超过三个)连续连接的内皮细胞形成的管状结构，由连续的基板围绕，其中外周血管周细胞位于此并且星形胶质细胞终足在其上伸出。通过例如电子显微镜可观测到在原位和离位以及在体外，屏障样内皮细胞的厚度均在1-5微米之间，具有许多线粒体，通过紧密连接而连接，无细胞间缝隙，无穿孔及很少的胞饮泡。在体外，毛细管结构可以通过其在培养中的形态学而鉴定，即直径为大约10-20微米、长度在50-200微米之间的管状结构。通过例如相差显微镜可观测到在体外，内皮细胞可以通过其在培养中的形态学而鉴定，即鹅卵石形(当例如从毛细管中以簇生长时)和纺锤形(当铺满时)，居中有椭圆形核。它们也可以通过使用一组普通的内皮细胞特异性标记和功能而鉴定，例如分化(CD)抗原的内皮细胞特异性簇的表达(VCAM(CD106)、CD31、EN-4、ICAMs、E-选择蛋白(E-Selectin)、PECAM、RBA)、钙粘着蛋白、整联蛋白、肌动蛋白、波形蛋白、因子VIII相关抗原(vWF)、胶原蛋白I和IV、纤连蛋白、基质金属蛋白酶、金属蛋白酶的组织抑制剂；非凝血酶原性(non-thrombogenicity)；低白细胞粘附；血管活性化合物的释放(氧化氮、内皮缩血管肽-1和前列环素)；DiI-标记的-乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的吸收；凝集素结合；血管紧张素转换酶、碱性磷酸酶、单胺氧化酶和阴离子位点的存在。另外，可以使用典型的屏障标记和功能，如紧密连接或紧密连接相关蛋白(ZO-1)的观测及参考化合物(例如Evans蓝(结合白蛋白)、甘露醇、蔗糖、荧光素、葡聚糖、白蛋白、AIB)的限制旁细胞转运；没有囊泡转运；没有非屏障标记如PAL-E；γ-谷氨酰-转肽酶(γ-GTP)的表达；P-糖蛋白(Pgp)的表达和功能性、多重药物抗性蛋白1-7、葡萄糖转运蛋白、核苷转运蛋白、有机阴离子转运蛋白、大的和中性氨基酸转运蛋白；运铁蛋白受体、胰岛素-生长因子受体、清除剂受体；许多线粒体的边缘F-肌动蛋白定位及表达，尽管这些无一特异于内皮细胞。这些标记的(功能性)表达可以通过例如分子生物学、生物化学、(免疫)-组织(细胞)化学技术以及使用已知底物、配体和/或抑制剂进行功能分析而确定。这些标记已经在国际学术杂志上进行了描述和评述(de Boer etal.，1999，Eur J Pharm Sci.8(1)：1-4；Hofman et al.，2001，InvestOphthalmol Vis Sci.42(5)：895-901；Schlingemann et al.，1997，Ophthalmic Res.29(3)：130-8；Schlingemann et al.，1999，Diabetologia.42(5)：596-602；Vorbrodt et al.，1986，Brain Res.394(1)：69-79；Dai etal.，2002，Brain Res.954(2)：311-316)。
内皮细胞的通透性在本文中是指化合物(可以是离子(例如Na+、K+、Ca2+)、水、营养物质(例如葡萄糖、氨基酸)、代谢物、神经递质(例如谷氨酸、色氨酸)、激素、肽、血浆蛋白(例如白蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、细胞因子、生长因子)、细胞和异生素(例如药物、诊断标记))可以从腔至近腔室方向扩散或者(主动)转运或者穿过内皮细胞层(反之亦然)的能力的测量标准。内皮细胞通透性的改变也可以是给定化合物(可以是营养物质(例如葡萄糖、氨基酸)、代谢物、神经递质(例如谷氨酸、色氨酸)、激素、肽、血浆蛋白(例如白蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、细胞因子、生长因子)、细胞和异生素(例如药物、诊断标记))的内皮细胞生物转化的结果。通透性的调节包括增加或降低通透性。通透性可以如实施例所述常规地在体外通过确定跨内皮电阻(TEER)而确定。TEER是量化离子通过细胞之间紧密连接的通透性的一种灵敏的测量标准。在本发明的方法中，内皮细胞通透性的调节优选导致TEER变化为至少20％、50％、100％、300％或1000％(Gaillard et al.，2000b，Eur J Pharm Sci.12(2)：95-102)的调节。确定通透性的其它方法包括例如论证参与通透性控制的上述内皮细胞/屏障标记的(功能性)表达改变，通过例如分子生物学、生物化学、(免疫)-组织(细胞)化学技术或者通过使用转运系统的已知底物、配体和/或抑制剂的功能分析而进行。更特异地，通透性的改变可以通过紧密连接表达的丧失、细胞间缝隙的出现、穿孔和/或胞饮泡的数目和定位而确定，这可以通过例如电子显微镜观测(Hofman et al.，2001，如前)。参与内皮细胞通透性的内皮细胞标记的表达水平改变均是内皮细胞通透性改变的标示，所述内皮细胞标记如ZO-1、PAL-E、RBA、F-肌动蛋白、因子VIII相关抗原(vWF)、γ-GTP、Pgp、葡萄糖转运蛋白、PECAM、整联蛋白、钙粘着蛋白-5、运铁蛋白受体、凝集素结合位点或碱性磷酸酶(Gaillard et al.，2001，如前；de Boer et al.，1999，如前；Schlingemann et al.，1997，如前；Schlingemann et al.，1999，如前；Tio et al.，1990，如前；Vorbrodt et al.，1986，如前；Dai et al.，2002，如前)。对于参考化合物(例如甘露醇、蔗糖、荧光素、葡聚糖、白蛋白)的限制旁细胞转运、Pgp-底物(罗丹明123、长春花碱等)或运铁蛋白穿过内皮细胞层的极性和主动及可抑制的(用例如异搏定、PSC-833、温度)转运的功能分析是内皮细胞通透性改变的标示(Gaillard et al.，2000，如前；Gaillard et al.，2001，如前)。
体内内皮细胞的通透性可以如上述在体外情况中通过论证参与通透性控制的内皮细胞/屏障标记的(功能性)表达的改变而确定(通过例如分子生物学、生物化学、(免疫)-组织(细胞)化学技术或者通过使用转运系统的已知底物、配体和/或抑制剂进行功能性分析)。另外，内源(例如纤维蛋白原、IgG)或者(荧光或放射标记的)外源(例如Evans蓝(与白蛋白结合)、甘露醇、蔗糖、荧光素、葡聚糖、白蛋白、AIB)参考化合物的外渗可以通过(免疫)-组织(细胞)化学技术或通过一些体内取样方法确定，如脑吸收指数(BUI，Oldendorf.1970 BrainRes.24(2)：372-376)、脑外向通量指数(brain efflux index，BEI，Kakeeet al.，1996J Pharmacol Exp Therap.277(3)：1550-1559)、原位灌流(Takasato et al.，1984 Am J Physiol.247(3Pt 2)：H484-493)、单一或多重途径脑灌流(Brodie et al.，1960J Pharmacol Exp Ther.130：519-528)、CSF取样(单位脉冲应答，van Bree et al.，1989.J.Pharmacokin.Biopharm.17(4)：441-462)、正电子发射X线断层摄影术(PET，Hendrikse et al.，1998Br J Pharmacol.124(7)：1413-1418)、磁共振技术(MRI，MRS，Jenkins et al.，1999Ann N YAcad Sci.893：214-242)、定量放射自显影术(QAR，Smith，1989 In Implications of the blood-brainbarrier and its manipulation，vol.1：Basic science aspects.New York：Plenum Publ.Corp.，ed.EA Neuwelt，85-118)及脑内微量透析(de Langeet al.，2000Adv Drug Deliv Rev.45(2-3)：125-148)。
在本发明的方法中，优选LPSS多肽的活性或稳态水平可以在多肽自身的水平改变，例如通过将外源的LPSS多肽提供给内皮细胞，或者通过向内皮细胞加入LPSS多肽的拮抗剂或抑制剂如LPSS多肽的抗体而进行。为提供外源的LPSS多肽，LPSS多肽可以如下述常规地通过编码LPSS多肽的核酸在合适的宿主细胞中表达而产生。LPSS多肽的抗体可以如下述获得。
或者，LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过调节编码该多肽的核苷酸序列的表达水平而改变。优选地，核苷酸序列的表达水平在内皮细胞中被调节。LPSS多肽的表达水平可以通过将一种表达载体导入内皮细胞中而被上调，其中所述表达载体包含编码LPSS多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。LPSS多肽的表达水平也可以通过将一种表达载体导入内皮细胞中而被上调，其中所述表达载体包含编码能反式激活编码LPSS多肽的内源核苷酸序列的因子的核苷酸序列。
或者，LPSS多肽的表达水平可以通过为细胞提供一种反义分子而被下调，所述反义分子能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列的表达。所述反义分子可如此提供或者其可以通过将一种表达载体导入内皮细胞中而提供，其中所述表达载体包含能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列表达的一种反义核苷酸序列，而且所述反义核苷酸序列在能驱动该反义核苷酸在内皮细胞中表达的启动子的控制下。LPSS多肽的表达水平也可以通过将一种表达载体导入内皮细胞中而被下调，其中所述表达载体包含编码能反式抑制编码LPSS多肽的内源核苷酸序列的因子的核苷酸序列。
一般地，LPSS多肽的活性或稳态水平可因此如下修饰：
1.增加基因表达，例如通过提供：
(a)一种表达或基因治疗载体，其中编码LPSS多肽的核苷酸序列可操纵地与启动子连接；
(b)一种表达或基因治疗载体，其中编码LPSS多肽受体的核苷酸序列与启动子可操纵地连接；
(c)一种表达或基因治疗载体，其中编码LPSS多肽受体的激动剂的核苷酸序列与启动子LPSS可操纵地连接；
(d)一种表达或基因治疗载体，其中编码LPSS多肽受体的拮抗剂的核苷酸序列与启动子LPSS可操纵地连接。
2.通过提供任何功能性RNA分子而降低基因表达，例如最近Famulok et al.(2002，Trends Biotechnol.，20(11)：462-466)所述，所述RNA分子包括例如：
(a)针对编码LPSS多肽的核苷酸序列的反义核酸分子；
(b)针对编码LPSS多肽受体的核苷酸序列的反义核酸分子；
(c)针对编码LPSS多肽受体激动剂的核苷酸序列的反义核酸分子；
(d)针对编码LPSS多肽受体拮抗剂的核苷酸序列的反义核酸分子；
(e)一种表达或基因治疗载体，其中针对编码LPSS多肽的核苷酸序列的反义核酸序列与启动子可操纵地连接；
(f)一种表达或基因治疗载体，其中针对编码LPSS多肽受体的核苷酸序列的反义核酸序列与启动子可操纵地连接；
(g)一种表达或基因治疗载体，其中针对编码LPSS多肽受体激动剂的核苷酸序列的反义核酸序列与启动子可操纵地连接；
(h)一种表达或基因治疗载体，其中针对编码LPSS多肽受体拮抗剂的核苷酸序列的反义核酸序列与启动子可操纵地连接。
3.激动剂，包括例如：
(a)LPSS多肽的全部或部分激动剂，如
(i)天然配体；
(ii)LPSS多肽或其片段；
(iii)肽模拟物；
(iv)激动性抗体或抗体片段；
(v)小分子，或另一种药物；
(b)LPSS多肽受体的全部或部分激动剂，例如
(i)天然配体；
(ii)LPSS多肽或其片段；
(iii)肽模拟物；
(iv)激动性抗体或抗体片段；
(v)小分子，或另一种药物。
2.拮抗剂，包括例如：
(a)LPSS多肽的全部或部分拮抗剂，如
(i)天然拮抗剂；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模拟物；
(iv)拮抗或中和抗体或抗体片段；
(v)小分子，或另一种药物；
(b)LPSS多肽受体的部分或反向激动剂，例如
(i)天然配体；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模拟物；
(iv)抗体或抗体片段；
(v)小分子，或另一种药物；
(c)LPSS多肽受体的全部或部分拮抗剂，
(i)天然的LPSS多肽受体拮抗剂；
(ii)LPSS多肽片段；
(iii)肽模拟物；
(iv)拮抗或中和抗体或抗体片段；
(v)小分子，或另一种药物。
因此，在本发明的方法中，内皮细胞的通透性优选通过增加LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽具有与选自由SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更优选地，通透性通过增加LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过上述任何方式增加，例如通过将一种表达载体导入内皮细胞中，其中所述表达载体包含编码LPSS多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。
或者，在本发明的方法中，内皮细胞的通透性可以通过降低LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽具有与选自由SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更优选地，通透性通过降低LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。LPSS多肽的活性和稳态水平可以通过上述任何方式降低，例如LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过将一种表达载体导入内皮细胞而降低，所述表达载体包含能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列表达的反义核苷酸序列，且所述反义核苷酸序列在能驱动该反义核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。
在本发明的方法中，内皮细胞的通透性可以通过增加LPSS多肽的活性或稳态水平而增加，LPSS多肽具有与选自由SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更优选地，通透性通过降低LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过上述任何方式增加，例如通过将一种表达载体导入内皮细胞中，所述表达载体包含编码LPSS多肽的核苷酸序列，且所述核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。
或者，在本发明的方法中，内皮细胞的通透性可以通过降低LPSS多肽的活性或稳态水平而增加，LPSS多肽具有与选自由SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示的氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更优选地，通透性通过增加LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过上述任何方式降低，例如LPSS多肽的活性或稳态水平可以通过将一种表达载体导入内皮细胞中而降低，所述表达载体包含能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列表达的反义核苷酸序列，且所述反义核苷酸序列在能驱动该反义核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。
微血管通透性修饰失调(microvascular permeability modifyingdisorders)的治疗或预防
另一方面，本发明涉及治疗或预防患者微血管通透性修饰失调的方法。所述方法包括经药理学改变患者微血管内皮细胞中LPSS多肽的活性或稳态水平，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。优选地，所述改变足以降低微血管通透性修饰失调的症状。所述方法优选包括给予患者治疗有效量的一种药物组合物，所述药物组合物包含如上述具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含编码LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者有效修饰LPSS多肽的活性或稳态水平的另一实体。优选地，在本发明方法中，LPSS多肽是具有与SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列具有至少90％相同性的氨基酸序列的一种多肽。更优选地，通透性通过增加LPSS多肽的活性或稳态水平而降低，LPSS多肽选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ IDNO：23-25)。核酸分子优选是一种基因治疗载体，其中核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞优选在微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。
或者，所述治疗方法是包括给予患者一种治疗有效量的药物组合物的一种方法，所述药物组合物包含LPSS多肽的拮抗剂，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中优选所述拮抗剂是LPSS多肽的抗体。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQ ID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)、及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。相同的作用可以在包括给予患者治疗有效量的包含一种基因治疗载体的药物组合物的方法中达到。基因治疗载体优选包含能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列表达的反义核苷酸序列，LPSS多肽具有与选自由SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，其中所述反义核苷酸序列在能驱动该反义核苷酸序列在内皮细胞优选微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQ ID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ IDNO：21和22)。
在本发明的治疗方法中，微血管通透性失调优选选自神经退行性疾病，如脑血管意外(CVA)、阿尔茨海默病(AD)、血管相关性痴呆、克雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease，CJD)、牛海绵状脑病(BSE)、帕金森病(PD)、脑外伤、多发性硬化(MS)、肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、杭廷顿氏舞蹈症(Huntington′s chorea)；具有CNS成分的外周失调，如败血症休克、肝性脑病、(糖尿病性)高血压、糖尿病微血管病变(diabetic microangiopathy)、昏睡病、惠普耳病(Whipple disease)、杜兴氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)、天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglucosaminuria)、胆固醇酯贮积病、沃耳曼病(Wolman disease)、胱氨酸过多症、Danon病、法布莱氏病(Fabrydisease)、法伯脂肪性肉芽肿病(Farber lipogranulomatosis)、法伯病(Farber disease)、岩藻糖代谢病、半乳糖唾液酸沉积症(galactosialidosis)I/II型、Gaucher病I/II/III型、Gaucher病、球样细胞脑白质营养不良、克腊比病(Krabbe disease)、糖原贮积病II、庞帕氏病(Pompe disease)、GM1-神经节苷脂沉积症I/II/III型、GM2-神经节苷脂沉积症I型、泰萨二氏病(Tay Sachs disease)、GM2-神经节苷脂沉积症II型、山霍夫氏病(Sandhoff disease)、GM2神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷过多症I/II型、甘露糖苷过多症、异染色性脑白质障碍症、粘脂糖症I型、唾液酸沉积症1/11型粘脂糖症11/III型1-细胞(1-cell)病、粘脂糖症IIIC型假赫尔勒多种营养不良(pseudo-Hurlerpolydystrophy)、粘多糖代谢病I型、粘多糖代谢病II型、亨特氏综合征(Hunter syndrome)、粘多糖代谢病IIIA型、山菲立普综合征(Sanfilippo syndrome)、粘多糖代谢病IIIB型、粘多糖代谢病IIIC型、粘多糖代谢病IIID型、粘多糖代谢病IVA型、莫尔基奥综合征(Morquiosyndrome)、粘多糖代谢病IVB型莫尔基奥综合征、粘多糖代谢病VI型、粘多糖代谢病VII型、斯利综合征(Sly syndrome)、粘多糖代谢病IX型、多种硫酸酯酶缺陷(multiple sulphatase deficiency)、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN1巴腾病(Batten disease)、尼皮二氏病(Niemann-Pick disease)A/B型、尼皮二氏病、尼皮二氏病C1型、尼皮二氏病C2型、致密性成骨不全症、欣德勒病(Schindler disease)VII型、欣德勒病及唾液酸贮积症病、(先兆)子痫；神经精神失调，如抑郁症、孤独症、焦虑性注意缺陷多动障碍(anxiety attention deficithyperactivity disorder，ADHD)、神经精神性系统性红斑狼疮、双相性精神障碍(bipolar disorder)、精神分裂症及其它精神病；其它CNS失调，如脑瘤、癫痫、偏头痛、发作性睡病、失眠症、慢性疲劳综合征、高山病、脑炎、脑膜炎、AIDS相关性痴呆；及血管发生相关失调，如血管肿瘤、增生性玻璃体视网膜病(proliferative vitreoretinopathy)、类风湿性关节炎、克隆氏病(Crohn′s disease)、动脉粥样硬化、卵巢过度刺激(ovarian hyperstimulation)、牛皮癣、新血管化相关子宫内膜异位症、球囊血管成形术后再狭窄、疤痕组织过度增生、外周血管病、高血压、炎症性血管炎、雷诺氏病(Reynaud’s disease)、雷诺氏现象(Reynaud’s phenomenon)、动脉瘤、动脉再狭窄、血栓性静脉炎、淋巴管炎、淋巴水肿(lymphedema)、创伤愈合及组织修复、缺血性再灌注损伤、心绞痛、心肌梗塞、慢性心脏病、心力衰竭如充血性心力衰竭、年龄相关性黄斑变性及骨质疏松症。
另一方面，本发明涉及一种可逆性增加患者微血管通透性的方法。所述方法包括给予患者有效量的增加微血管通透性的一种药物组合物，该药物组合物包含具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含编码LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者有效修饰LPSS多肽的活性或稳态水平的另一实体。优选地，LPSS多肽是具有与选自SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一种多肽。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQ ID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。优选地，所述核酸分子是一种基因治疗载体，其中核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞优选微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。在这种方法中，微血管通透性增加的可逆性增加优选通过使用一种仅能瞬时表达该核苷酸序列的基因治疗载体实现(见下文)，和/或使用能驱动该核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子实现，优选该启动子是一种诱导型启动子。更优选地，所述诱导型启动子是通过给予小的有机或无机化合物而被诱导的启动子(见下文)。
或者，可逆性增加患者微血管通透性的方法也可以是包括给予患者治疗有效量的一种包含LPSS多肽的拮抗剂的药物组合物的方法，LPSS多肽具有与选自SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述拮抗剂优选是LPSS多肽的抗。更优选地，所述氨基酸序列选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。相似地，所述方法还包括给予患者治疗有效量的一种包含基因治疗载体的药物组合物，所述基因治疗载体包含能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列表达的反义核苷酸序列，LPSS多肽具有与选自SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反义核苷酸序列在能驱动反义核苷酸序列在内皮细胞优选微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。更优选地，所述氨基酸序列选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ IDNO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。
当想要输送血液运载的、膜不通透药物至脑时，可有利地应用可逆性增加患者微血管通透性的方法。该药物可以是在制药、兽医或诊断方面有益的任何化合物或者化合物的组合物，其通常不能透过或者至少不完全透过血脑屏障或其它生理学屏障。该药物的药理学性质是不重要的。本发明因此用于输送广泛的药物穿过生理学屏障如血脑屏障。然而，预期根据本发明的这个方面所输送的初步候选物是：抗肿瘤化合物，如氨甲蝶呤、阿霉素、顺铂，及下文所述的其它抗肿瘤制剂或胞毒性药物(见例如本文第24-28页)；生长因子，如NGF、RDNF和CNTF，其用于治疗神经退行性疾病；显影剂，尤其是基于抗体的那些制剂；及透不过血脑屏障的神经递质拮抗剂或激动剂(如某些NMDA受体阻断剂)。
对于除了美国之外的大多数国家而言，本发明的另一方面涉及了本发明的化合物在生产治疗或预防微血管通透性修饰失调的药物中的多种应用。例如在一个这样的方面中，本发明涉及LPSS多肽或者包含编码LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子或者有效修饰LPSS多肽的活性或稳态水平的另一实体在生产治疗或预防微血管通透性修饰失调的组合物中的应用，所述LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。优选地，LPSS多肽是具有与选自SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。更优选地，所述氨基酸序列选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ IDNO：23-25)。所述核酸分子优选是包含所述核苷酸序列的一种基因治疗载体，所述核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞中表达的启动子的控制下。具有与选自SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽的拮抗剂也可用于生产治疗或预防微血管通透性修饰失调的组合物，所述拮抗剂优选是LPSS多肽的抗体。更优选地，所述氨基酸选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQ ID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。
或者，一种包含反义核苷酸序列的基因治疗载体可用于生产治疗或预防微血管通透性修饰失调的组合物，所述反义核苷酸序列能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列的表达，LPSS多肽具有与选自SEQ IDNO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，所述反义核苷酸序列在能驱动反义核苷酸序列在内皮细胞优选在微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。
在本发明的化合物在生产治疗微血管通透性修饰失调的药物中的上述应用中，所述失调优选是如上述的微血管通透性修饰失调。
相似地，对于除了美国之外的大多数国家而言，本发明另一方面涉及本发明的化合物在生产可逆性增加患者微血管通透性的药物或组合物中的多种应用。优选地，所述化合物是具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽，或者包含编码LPSS多肽的核苷酸序列的核酸分子，或者如本文所列举的有效修饰LPSS多肽的活性或稳态水平的另一实体。优选地，LPSS多肽是具有与选自SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、21和22所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的一种多肽。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQID NO：5、12、15、16和17)、差异下调的信号转导途径(SEQ ID NO：18)及上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)。所述核酸分子优选是一种基因治疗载体，其中编码LPSS多肽的核苷酸序列在能驱动该核苷酸序列在内皮细胞优选微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。
或者，LPSS多肽的拮抗剂可以用于生产可逆性增加患者微血管通透性的组合物，LPSS多肽具有与选自SEQ ID NO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，优选所述拮抗剂是LPSS多肽的抗体。更优选地，所述氨基酸序列选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ IDNO：23-25)。或者包含一种反以核苷酸序列的基因治疗载体可用于生产可逆增加患者微血管通透性的组合物，所述反义核苷酸序列能抑制编码LPSS多肽的核苷酸序列的表达，LPSS多肽具有与选自SEQ IDNO：2、3、4、6、7、8、9、10、11、19、20、23、24和25所示氨基酸序列组成的一组中的氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列，且所述反义核苷酸序列在能驱动反义核苷酸序列在内皮细胞优选在微血管内皮细胞中表达的启动子的控制下。更优选地，所述氨基酸序列选自下调的分泌因子(SEQ ID NO：2、3、4和23)、下调的信号转导途径(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11)、差异上调的信号转导途径(SEQ ID NO：19)、下调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：20)及差异上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。优选地，所述基因治疗载体是瞬时表达的载体(见下文)和/或启动子优选是诱导型启动子。更优选地，所述诱导型启动子是可以通过给予小的有机或无机化合物而诱导的启动子(见下文)。
靶向微血管内皮屏障
另一方面，本发明涉及通过给予患有或处于发展CNS或微血管失调的危险中的患者一种治疗剂或诊断剂以治疗或诊断CNS或微血管失调的方法，所述治疗剂或诊断剂例如是一种神经活性剂(neuroactiveagent)，通过将该制剂或其药物可接受的载体靶向于具有与SEQ IDNO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的LPSS多肽。优选地，所述神经激活剂或其载体靶向于具有与SEQ ID NO：1、5、12、13、14、15、16、17、18、19、21-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列的上调的LPSS多肽。更优选地，所述氨基酸序列选自上调的分泌因子(SEQ ID NO：1、13、14和22)、上调的信号转导途径(SEQ ID NO：5、12、15、16、17和19)、上调的受体和粘着分子(SEQ ID NO：21和22)及上调的代谢酶(SEQ ID NO：23-25)。更优选上调的LPSS多肽具有与SEQ ID NO：21或22所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列。
靶向剂可以是LPSS多肽的抗体、蛋白质、肽、LPSS多肽激动剂、LPSS多肽拮抗剂、肽模拟物、小分子、或者与LPSS多肽特异性结合的另一种化合物。如本文所用术语“特异性结合”是指与非特异性相互作用有可测定的不同的结合。特异性结合可以例如通过确定与对照分子的结合相比的分子的结合而测定，对照分子通常是不具有结合活性的相似结构的分子，例如相似大小但没有特异性结合序列的肽。如果分子与对照分子相比与LPSS多肽具有可测定的较高的亲和性，则存在特异性结合。结合的特异性可以通过例如与已知结合靶位的对照分子竞争而测定。本文所用术语“特异性结合”包括低和高亲和性特异性结合。特异性结合可以例如通过Kd为至少大约10-4M的低亲和性靶向剂而表现。例如如果LPSS多肽具有一个以上的靶向剂结合位点，则低亲和性的靶向剂可用于靶向微血管内皮。特异性结合可以通过Kd为至少大约10-7M、至少大约10-8M、至少大约10-9M、至少大约10-10M或者Kd为至少大约10-11M或10-12M或更高的高亲和性靶向剂表现。低和高亲和性靶向剂均用于靶向微血管内皮。
靶向剂优选与治疗剂或其药物可接受的载体缀合。“缀合”在本文是指由共价偶联在一起的两个实体组成。在本发明中，第一个实体通常是如上述的靶向剂，而第二个实体可以是治疗或诊断部分，如用于治疗或诊断CNS或微血管失调的分子或结构。这种治疗或诊断部分可以例如是抗肿瘤化合物，如抗肿瘤剂或胞毒性药物，如烷化剂，例如盐酸氮芥(Mechlorethamine hydrochloride)(Nitrogen Mustard，Mustargen，HN2)、环磷酰胺(Cytovan，Endoxana)、异环磷酰胺(Ifosfamide)(IFEX)、苯丁酸氮芥(Leukeran)、苯丙氨酸氮芥(Phenylalanine Mustard，L-sarcolysin，Alkeran，L-PAM)、白消安(Myleran)、硫化三磷(Triethylenethiophosphoramide)、亚硝基脲氮芥(B iCNU，BCNU)、Lomustine(CeeNU，CCNU)、Streptozocin(Zanosar)等；植物生物碱，例如长春新碱(Oncovin)、长春花碱(Velban，Velbe)、紫杉醇(Taxol)等；抗代谢物，例如氨甲蝶呤(MTX)、6-巯基嘌呤(Purinethol，6-MP)、6-硫代鸟嘌呤(6-TG)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Cytosar-U，Ara-C)、Azacitidine(Mylosar，5-AZA)等；抗生素，例如放线菌素D(Actinomycin D，Cosmegen)、阿霉素(adriamycin)、道诺红菌素(daunomycin，Cerubidine)、Idarubicin(Idamycin)、博来霉素(Blenoxane)、光神霉素(Mithramycin，Mithracin)、丝裂霉素(Mutamycin)等；及其它抗细胞增殖剂，例如羟基脲(Hydrea)、普鲁苄肼(Mutalane)、Dacarbazine(DTIC-Dome)、顺铂(Platinol)、Carboplatin(Paraplatin)、天冬酰胺酶(Elspar)、鬼臼亚乙苷(VePesid，VP-16-213)、Amsarcrine(AMSA，m-AMSA)、Mitotane(Lysodren)、Mitoxantrone(Novatrone)等；gefitinib(ZD 1839或IressaTM)及imatinib mesylate(或)；抗癌生物药品包括抗体(或rituximab；或trastuzumab；
或ibritumomab tiuxetan(放射标记的)；
或cetuximab；AvastinTM或bevacizumab或rhuMAb-VEGF)及细胞因子(
或α-干扰素；IL-2或aldesleukin)以治疗原发脑瘤或机体肿瘤的脑转移；抗炎症药物包括抗体(
或etanercept；或infliximab；或basiliximab；或daclizumab；或anakinra；
或omalizumab；或adalimumab；
或natalizumab；RhuFabTM或ranibizumab；RaptivaTM或efalizumab)及细胞因子如干扰素-α、干扰素-β(
或干扰素-β-1a；或干扰素-β-1b；
或干扰素-β-1a)、干扰素-γ、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、TNF、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF：
或sargramostim)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF：
或filgrastim)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、血小板衍生生长因子(PDGF)，以治疗例如神经退行性疾病相关的神经炎症；神经营养因子(例如NGF或神经生长因子；BDNF或脑衍生神经营养因子；NT3或神经营养蛋白-3；NT4或神经营养蛋白-4；NT5或神经营养蛋白-5；RDGF或视网膜衍生生长因子；CNTF或睫状神经营养因子；活化素；bFGF或碱性成纤维细胞生长因子；aFGF或酸性成纤维细胞生长因子；GDNF或神经胶质细胞系衍生神经营养因子或neublastin或artemin或enovin，presephin，neurturin；CTGF或结缔组织生长因子；EGF或上皮生长因子)；红细胞生成素(EPO)(
或红细胞生成素α；或红细胞生成素；或红细胞生成素β；或darbepoietin alfa)；生长激素或促生长素(
)；抗-NogoA Mab(IN-1)；Nogo66抑制剂的NogoA拮抗剂(NEP1-40)，以治疗例如神经退行性疾病；酶(例如
或葡糖脑苷脂酶；AldurazymeTM或laronidase；AryplaseTM或芳基硫酸酯酶B；I2S或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶；α-L-iduronidase；N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶；phenylase；天冬氨酰氨基葡糖苷酶(aspartylglucosaminidase)；酸脂肪酶；半胱氨酸转运蛋白；Lamp-2；α半乳糖苷酶A；酸神经酰胺酶(acid ceramidase)；α-L-岩藻糖苷酶；ss-氨基己糖苷酶A；GM2-激活剂缺乏；α-D-甘露糖苷酶；ss-D-甘露糖苷酶；芳基硫酸酯酶A；saposin B；神经氨酸酶；α-N-乙酰氨基葡糖苷酶磷酸转移酶；磷酸转移酶7-亚基；类肝素-N-硫酸酯酶；α-N-乙酰氨基葡糖苷酶；乙酰CoA：N-乙酰转移酶；N-乙酰葡萄胺6-硫酸酯酶；半乳糖6-硫酸酯酶；0-半乳糖苷酶；透明质酸氨基葡糖苷酶(hyaluronoglucosaminidase)；多硫酸酯酶(multiplesulphatases)；棕榈酰蛋白硫酯酶；三肽基肽酶I；酸性鞘磷脂酶；胆固醇运输(cholesterol trafficking)；组织蛋白酶K；α-半乳糖苷酶B；唾液酸转运蛋白；SOD或Cu/Zn超氧化物岐化酶)以治疗例如溶酶体贮积病(相关的神经学症状)或其它神经退行性疾病；脑作用激素及神经递质如促生长素抑制素、催产素、血管升压素、咖啡因、VIP、促肾上腺皮质激素(ACTH)、缩胆囊素(CCK)、P物质、铃蟾肽、促胃动素、胰高血糖素样肽、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1)；及神经肽及其衍生物如肽YY(PYY)、神经肽Y(NPY)、胰多肽(PP)、神经激肽A、神经激肽B、内啡肽、脑啡肽、神经降压肽、神经调节肽K、神经调节肽L、降钙素相关肽(CGRP)、内皮缩血管肽、ANP(″心房利尿钠肽″)、BNP(″脑尿钠肽″)、CNP(C-型尿钠肽″)及PACAP(″垂体腺苷酸环化酶激活肽″)；显影剂，尤其是基于抗体的那些；不透过血脑屏障的神经递质拮抗剂或激动剂(如某些NMDA受体阻断剂)；抗生素，如：氨基糖苷类，例如氨羟丁卡那霉素A、阿泊拉霉素、阿贝卡星(arbekacin)、黄霉素(bambermycins)、丁苷菌毒、地贝卡星(dibekacin)、二氢链霉素、健霉素、庆大霉素、异帕米星(isepamicin)、卡那霉素、小诺霉素(micronomcin)、新霉素、奈替米星(netilmicin)、paromycin、核糖霉素、紫苏霉素、壮观霉素、链霉素、妥布拉霉素、托奇霉素；氯霉素(amphenicols)，例如叠氮氯霉素(azidamfenicol)、氯霉素、氟苯尼考(florfenicol)及theimaphenicol；安莎霉素类(ansamycins)，例如rifamide、利福平、利福霉素、rifapentine、利福昔明(rifaximin)；β-内酰胺，例如carbacephems、碳青霉烯、头孢菌素、头孢霉素(cehpamycins)、单环内酰胺、oxaphems、青霉素；lincosamides，例如clinamycin、洁霉素；大环内酯类，例如克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirthromycin)、红霉素等等；多肽，例如双霉素、杆菌肽、卷曲霉素等等；四环素类，例如阿哌环素(apicycline)、氯四环素、羟甲金霉素等等；合成的抗菌制剂，如2，4-二氨基嘧啶、硝基呋喃、喹诺酮类(quinolones)及其类似物、磺胺、砜；抗真菌制剂，如：多烯，例如两性霉素B、杀念珠菌素、制皮菌素、菲律宾菌素、制霉菌色素、曲古霉素、哈霉素、明霉素、甲三菌素、游霉素、制霉菌素、培西洛星(pecilocin)、表霉素；合成的抗真菌剂，如丙烯胺(allylamines)，例如布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、terbinafine；咪唑，例如联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、氯登妥因(chlordantoin)、氯米达唑(chlormidazole)等等，硫代氨基甲酸，例如托西拉酯(tolciclate)，三唑，例如氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、特康唑(terconazole)；驱肠虫药，如：槟榔碱、绵马毒素、绵马酚、二氯苯(dichlorophene)、酸藤子素、苦辛(kosin)、萘(napthalene)、niclosamide、石榴碱、奎纳克林、土木香内脂、amocarzine、amoscanate、驱蛔素、bephenium、bitoscanate、四氯化碳、香芹酚、cyclobendazole、diethylcarbamazine等等；抗疟剂，如：acedapsone、氨酚喹(amodiaquin)、arteether、artemether、青蒿素、artesunate、atovaquone、比比林(bebeerine)、黄连素、chirata、氯胍(chlorguanide)、氯奎、chlorprogaunil、金鸡纳树皮、金鸡尼丁、金鸡宁、cycloguanil、龙胆苦苷、halofantrine、羟氯奎、mefloquine hydrochloride、3-methylarsacetin、扑疟喹(pamaquine)、plasmocid、伯氨喹、乙嘧啶(pyrimethamine)、奎纳克林、奎宁、quinocide、奎宁、二元砷酸钠(dibasic sodium arsenate)；抗原生动物制剂，如：acranil、tinidazole、ipronidazole、ethylstibamine、pentamidine、乙酰胺胂(acetarsone)、aminitrozole、茴香霉素、nifuratel、磺甲硝咪唑、benzidazole、苏拉明等等；编码多肽(优选编码Neprilysin及上述蛋白质、肽、酶、细胞因子、白细胞介素、激素及生长因子)或多肽的反义DNA的基因(包括表达载体和/或启动子，优选GFAP-和/或γ-GTP启动子)；及反义探针(核酸或肽核酸)。除了治疗或诊断部分与靶向剂之间的直接缀合之外，这种治疗或诊断部分可以被包囊化在微容器(nanocontainer)内，如微颗粒(nanoparticle)、脂质体或微凝胶(nanogel)，所述靶向剂优选与这种微容器共价偶联。与微容器的这种缀合可以直接缀合或者通过任何熟知的聚合物缀合剂缀合，如鞘磷脂、聚乙二醇(PEG)或其它有机聚合物，及与单一的靶向剂或者与抗血脑屏障和脑细胞膜上的胰岛素、运铁蛋白、IGF、leptin、LRP(1B)或LDL受体的任何熟知的血脑屏障靶向部分组合。生产包含靶向的(PEG)脂质体的这种药物组合物的详细描述见美国专利No.6,372,250。
本领域已知靶向剂与治疗或诊断部分缀合的多种方法。这种方法是例如Hermanson于U.S.6,180,084和U.S.6,264,914中所述方法(1996，Bioconjugate Techniques，Academic Press)，包括例如应用免疫学中常规应用的将半抗原与载体蛋白连接的方法(见Harlow和Lane，1988，″Antibodies：A laboratory manual″，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)。技术人员意识到在一些情况中，靶向剂或治疗部分或诊断部分根据例如缀合程序或所用的化学基团而可能丧失效力或功能性。然而，在给定的多种缀合方法中，技术人员能发现不影响或最小影响缀合的实体的效力或功能性的缀合方法。
靶向剂与治疗或诊断部分缀合的合适方法包括例如碳二亚胺缀合方法(Bauminger and Wilchek，1980，Meth.Enzymol.70：151-159)。或者，一个部分可以与靶向剂偶联，如Nagy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7269-7273(1996)及Nagy et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：1794-1799(1998)所述，所述文献在此均并入参考。另一种合适的缀合方法是例如高碘酸钠氧化，随后经适当反应物的还原烷化及戊二醛交联。
当靶向剂与治疗部分是(多)肽时，可以应用特别有用的缀合方法。在这种情况中，这两种实体可以合成为包含靶向剂和治疗肽的氨基酸序列的单(多)肽链。当靶向剂和治疗肽的氨基酸序列总和不超过50、80或100个氨基酸时，缀合物可以通过上述固相肽合成方法合成。或者，当氨基酸序列总和较大时，包含靶向剂和治疗肽的单(多)肽链可以通过下述重组表达技术产生。在这种情况中，例如编码靶向剂的核酸序列和编码治疗肽的核酸序列可以以符合读框地可操纵地连接以形成一个单一的开放读框。含有单一开放读框的核酸序列然后可以插入合适的表达载体中以在合适的宿主中表达，然后如下述从中回收缀合物并任选进一步纯化。在这些方法中，靶向肽可以置于治疗肽的一端或两端，或者可以插入治疗肽的氨基酸序列内的一或多个位置，而不破坏各自肽的功能或效力。使用常规的方法，本领域技术人员可以确定靶向肽相对于治疗肽的最佳位置。
微血管通透性的诊断
本发明另一方面涉及诊断患者微血管通透性的方法。这种方法优选包括如下步骤：(a)确定患者微血管内皮中编码LPSS多肽的核酸序列的表达水平，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(b)将该核酸序列的表达水平与核酸序列表达水平的参考值进行对比，参考值优选是在健康个体的微血管内皮中表达水平的平均值。核酸序列的表达水平可以间接通过确定该核酸序列编码的LPSS多肽的量而确定。在一个优选的方法中，对比一种以上核酸序列的表达水平。当分析一种以上的核酸序列时，这可以使用如下述及实施例中所述的包含互补核酸的微阵列而常规进行。表达水平可以在得自患者的样品中回体(ex vivo)确定。所述方法优选是诊断微血管通透性失调或诊断对微血管通透性失调的易感性的方法，所述微血管通透性可以是如上所述。所述方法也可以用于评估恢复微血管通透性的治疗效力。
筛选能调节内皮通透性的物质
本发明的另一方面涉及鉴别能调节微血管内皮细胞通透性的物质的方法。所述方法优选包括如下步骤：(a)提供能表达编码LPSS多肽的一或多个核酸序列的测试细胞群，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(b)将测试细胞群与包含测试物质的组合物接触；(c)确定与所述物质接触的测试细胞群中编码LPSS多肽的核酸序列的表达水平，LPSS多肽具有与SEQ ID NO：1-25所示氨基酸序列有至少90％相同性的氨基酸序列；(d)将该核酸序列的表达水平与未与所述物质接触的测试细胞群中核酸序列的表达水平进行对比；及(e)鉴别在与所述物质接触的测试细胞群与未与所述物质接触的测试细胞群之间产生所述核酸序列表达水平不同的物质。在这个方法中，核酸序列的表达水平可以通过间接确定由该核酸序列编码的LPSS多肽的量而确定。可以对比一种以上的核酸序列的表达水平。在一个优选的方法中，测试细胞群包含内皮细胞，优选血管内皮细胞，更优选微血管内皮细胞，最优选脑微血管内皮细胞。测试细胞群中的细胞优选是哺乳动物细胞，优选人细胞。优选在所述方法中，与所述物质接触的测试细胞群和未与所述物质接触的测试细胞群衍生自一种细胞群，优选衍生自一种细胞系，更优选衍生自一个细胞。在进一步优选的方法中，测试细胞群与辅助细胞群共培养，测试细胞群在滤膜的一侧培养，辅助细胞群在滤膜的另一侧培养，且所述辅助细胞群优选包含星形胶质细胞。
用于本发明方法中的优选的LPSS多肽
我们在此揭示了特异性差异表达的多肽，其参与血管通透性的降低。我们因此称这些多肽为“脂多糖敏感性”多肽或LPSS多肽。LPSS多肽参与一些不同类型的参与控制血脑屏障功能性的机制。这些包括分泌因子、信号转导途径、受体和粘着分子及代谢酶。LPSS多肽及这些机制在下文更详细地描述。如果已知或可利用，给出了每个LPSS多肽的如下信息：
■LPSS多肽的编码氨基酸序列(序列表)；
■受体、受体激动剂、受体拮抗剂；
■激动剂LPSS多肽或片段；
■全部或部分LPSS多肽受体激动剂；
■激动性肽模拟物；
■激动性抗体或抗体片段；
■激动性小分子或其它药物；
■拮抗性LPSS多肽片段；
■拮抗性肽模拟物；
■拮抗性小分子或其它药物；
■拮抗性或中和抗体或抗体片段；
■部分或反向LPSS多肽受体激动剂；
■全部或部分LPSS多肽受体拮抗剂。
技术人员将意识到这些实体的每一种均可用于在此所述的本发明方法中。
分泌的多肽
胞外分泌的或操作的LPSS多肽(如激素、酶、生长因子、细胞因子、趋化因子、结合蛋白等等)在本发明的实施方案中优选用于特异性调节或监测血脑屏障通透性。我们已经鉴别一些这种新的特异性差异表达的多肽，包括前B细胞集落增强因子、骨形态发生蛋白4、潜伏转化生长因子β结合蛋白2、肿瘤坏死因子α诱导蛋白6、肝素结合表皮生长因子样生长因子(白喉毒素受体)及磷脂酶A2，VII组。除了白喉毒素受体(SEQ ID NO：22)和磷脂酶A2，VII组(SEQ ID NO：23)在不同的部分论述之外(分别在受体和粘着分子及代谢酶部分论述)，这些物质在下文更详尽地论述。
编码前B细胞集落增强因子(pre-B-cell colony-enhancing factor)的PBEF基因(SEQ ID NO：1；LPSS01)在BCEC单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。前B细胞集落增强因子是作用于早期B细胞系前体细胞的一种细胞因子。其增加干细胞因子(MGF)和白细胞介素7(IL7)的前B细胞集落形成活性。令人惊奇地发现PBEF基因或前B细胞集落增强因子在组成血脑屏障的细胞中被LPS修饰，先前对此未加报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变PBEF基因产物(前B细胞集落增强因子)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。前B细胞集落增强因子活性可以通过PBEF基因的反义抑制而便利地降低，而前B细胞集落增强因子活性可以通过将PBEF基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源前B细胞集落增强因子而便利地增加。另外，Ognjanovic等(2001，J Mol Endocrinol.26(2)：107-117)揭示了前B细胞集落增强因子的抗体，其可用于诊断或治疗目的。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，与PBEF基因互补的核酸以及PBEF蛋白的抗体均可以应用。
编码骨形态发生蛋白4(bone morphogenic protein 4)的BMP4基因(SEQ ID NO：2、3和4；LPSS02)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后是下调的(表1和表2)。下调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。骨形态发生蛋白4(或者骨形态发生蛋白2B(BMP2B或BMP2B1)或ZYME)是骨形态发生蛋白家族的一个成员，是转化生长因子β超家族的一部分。所述超家族包括生长因子和分化因子的大家族。骨形态发生蛋白最初通过去矿质的骨提取物在体内在骨外(extraskeletal)部位诱导软骨骨发生的能力而鉴别。这个特殊家族成员在人的软骨内骨形成的发生中起重要作用，其表达的降低与许多骨病相关，包括可遗传的失调进行性骨化性纤维发育不良(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva)。对这个基因的5’非翻译区中的可变剪接已经加以了描述，并描述了三个均编码同一蛋白质的变体。令人惊奇地发现BMP4基因或骨形态发生蛋白4的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现在先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变BMP4基因产物(骨形态发生蛋白4)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。骨形态发生蛋白4的活性可以通过反义抑制BMP4基因或者通过将内皮细胞暴露于骨形态发生蛋白4抑制剂noggin或chordin而便利地降低，而骨形态发生蛋白4活性可以通过将BMP4基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源骨形态发生蛋白4而便利地增加。另外，R&D Systems Europe Ltd.，UK提供了骨形态发生蛋白4的有用的抗体，其可用于诊断或治疗目的。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，与BMP4基因互补的核酸以及BMP4蛋白的抗体均可以有用。
编码潜伏转化生长因子β结合蛋白2(latent transforming growthfactor beta binding protein 2)的LTBP2基因(SEQ ID NO：13；LPSS06)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与增加血管通透性。潜伏转化生长因子β结合蛋白2(先前称为LTBP3)参与胞外基质中tgf-β的结合。其作为调节tgf-β功能的一个重要机制。LTBP2中的突变已经在两个非典型的马方综合征(Marfan syndrome)情况中鉴别。令人惊奇地发现LTBP2基因或者潜伏转化生长因子β结合蛋白2在组成血脑屏障的细胞中被LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的一个新机会。因此，改变LTBP2基因产物(潜伏转化生长因子β结合蛋白2)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。潜伏转化生长因子β结合蛋白2的活性可以通过反义抑制LTBP2基因而便利地降低，同时潜伏转化生长因子β结合蛋白2的活性可以通过将LTBP2基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源潜伏转化生长因子β结合蛋白2而便利地增加。另外，ElastinProducts Company，Inc.(Missouri，USA)提供了潜伏转化生长因子β结合蛋白2的抗体，其用于诊断或治疗目的。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透状态的诊断目的。为此，可应用与LTBP2基因互补的核酸以及LTBP2蛋白的抗体。
编码肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(tumor necrosis factoralpha-induced protein 6)的TNFAIP6基因(SEQ ID NO：14；LPSS07)在BCEC单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(或者肿瘤坏死因子刺激基因6蛋白或TSG6，或者透明质酸结合蛋白，或者肿瘤坏死因子诱导蛋白6，或者肿瘤坏死因子α可诱导蛋白6)是一种分泌蛋白，其含有一个透明质酸结合结构域，并因此是透明质酸结合蛋白家族的一个成员。已知透明质酸结合结构域参与胞外基质稳定性和细胞迁移。这个蛋白质已经示出与间-α-抑制剂(inter-alpha-inhibitor，IαI)形成一种稳定的复合物，并因此增强IαI的丝氨酸蛋白酶抑制活性，其在与炎症相关的蛋白酶网络中是重要的。这个基因在正常成纤维细胞、外周血单核的细胞、滑膜细胞和软骨细胞中的表达可以通过肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1和LPS诱导。表达也可以通过血管平滑肌细胞中的机械刺激而诱导，并发现与蛋白聚糖合成及聚集相关。TNFAIP6与粘附受体CD44相似。令人惊奇地发现TNFAIP6基因或者肿瘤坏死因子α诱导蛋白6在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变TNFAIP6基因产物(肿瘤坏死因子α-诱导蛋白6)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。肿瘤坏死因子α诱导蛋白6活性可以通过反义抑制TNFAIP6基因或者通过使用TNFAIP6蛋白的抗体而便利地降低，同时肿瘤坏死因子α诱导蛋白6的活性可以通过将TNFAIP6基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源肿瘤坏死因子α诱导蛋白6而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可应用与TNFAIP6基因互补的核酸以及TNFAIP6蛋白的抗体。
信号转导途径
参与胞内信号转导途径的多肽在本发明的实施方案中优选用于特异性调节血脑屏障的通透性。我们已经鉴别了一些新的这种特异性差异表达多肽，包括成视网膜细胞瘤结合蛋白6、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ、巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物、GTP结合蛋白RH06、phosducin同种型phosducin样蛋白质/orphanl、钙网蛋白前体及G蛋白偶联受体诱导蛋白。这些蛋白质在下文更详细地描述。
编码成视网膜细胞瘤结合蛋白6的RBBP6基因(SEQ ID NO：5；LPSS03)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。成视网膜细胞瘤结合蛋白6(或RBQ-1或DKFZp761B2423)是一种遍在表达的核蛋白。发现一些蛋白质直接结合调节细胞增殖的成视网膜细胞瘤蛋白。其与低磷酸化的成视网膜细胞瘤蛋白优先相互作用。令人惊奇地发现RBBP6基因或成视网膜细胞瘤结合蛋白6的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变RBBP6基因产物(成视网膜细胞瘤结合蛋白6)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中用于特异性调节血脑屏障的通透性。成视网膜细胞瘤结合蛋白6的活性可以通过反义抑制RBBP6基因或者通过使用RBBP6蛋白的抗体而便利地降低，同时成视网膜细胞瘤结合蛋白6的活性可以通过将RBBP6基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源成视网膜细胞瘤结合蛋白6而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可应用与RBBP6基因互补的核酸以及RBBP6蛋白的抗体。
编码钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的CAMK2G基因(SEQ ID NO：6、7、8、9、10和11；LPSS04)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是下调的(表1和表2)。下调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ(或CAMK、CAMKG、CAMK-II、MGC26678)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，及属于Ca(2+)/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族(subfamily)。钙信号在谷氨酸能(glutamatergic)突触对可塑性的一些方面是至关紧要的。在哺乳动物细胞中，这个酶由四个不同的链组成：α、β、γ及δ。这个基因的产物是γ链。迄今为止已经鉴定了编码6个不同的同种型的6个可变剪接变体。已经描述了编码不同同种型的另外的可变剪接变体，但其全长性质还未确定。令人惊奇地发现CAMK2G基因或钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变CAMK2G基因产物(钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的活性可以通过反义抑制CAMK2G基因或者通过使用CAMK2G蛋白的抗体而便利地降低，同时钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ的活性可以通过将CAMK2G基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)IIγ而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与CAMK2G基因互补的核酸以及CAMK2G蛋白的抗体。另外，Bui等(2000，Cell 100(4)：457-67)产生了表达CaMKIIγB*(T287D)的转基因小鼠，CaMKIIγB*是CaMKIIγB的部分钙非依赖性突变体，其在本发明的实施方案中可用于特异性研究血脑屏障。
编码巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物(macrophagemyristoylated alanine-rich C kinase substrate)的MACMARCKS基因(SEQ ID NO：12；LPSS05)在BCEC单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物中在暴露于LPS 2小时后在BCEC中均是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物(也称为F52或MARCKS样蛋白或MLP或MLP1或者MARCKS相关蛋白MRP)在钙调蛋白信号转导和蛋白激酶C系统的偶联中起作用。其参与中枢神经系统发育。令人惊奇地发现MACMARCKS基因或者巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物在组成血脑屏障的细胞中被LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变MACMARCKS基因产物(巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物的活性可以通过反义抑制MACMARCKS基因或者通过MACMARCKS蛋白的抗体而便利地降低，同时巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物的活性可以通过将MACMARCKS基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与MACMARCKS基因互补的核酸以及MACMARCKS蛋白的抗体。另外，Wu等(1996，Proc Natl Acad Sci USA，93(5)：2110-2115)产生了F52缺陷小鼠，其在本发明的实施方案中可用于特异性研究血脑屏障。
编码GTP结合蛋白RHO6的RHO6基因(SEQ ID NO：15；LPSS08)在BCEC单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中均是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。GTP结合蛋白RHO6(或roundl、RND1)参与肌动蛋白细胞骨架和细胞附着的调节。RHO6与ARHE(或RND3或Rho8或RhoE)高度相似。令人惊奇地发现RHO6基因或者GTP结合蛋白RHO6在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变RHO6基因产物(GTP结合蛋白RHO6)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。GTP结合蛋白RHO6的活性可以通过反义抑制RHO6基因或者通过RHO6蛋白的抗体而便利地降低，同时GTP结合蛋白RHO6的活性可以通过将RHO6基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源GTP结合蛋白RHO6而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与RHO6基因互补的核酸以及RHO6蛋白的抗体。
编码phosducin同种型phosducin样蛋白/orphan 1的PDC基因(SEQID NO：16和17；LPSS09)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。Phosducin(也称为phosducin样蛋白或PhLP1或者phosducin、松果体或者Gβγ结合蛋白或者33kDA光转导蛋白(phototransducing protein)或者PHD或者MEKA)位于视网膜视杆细胞的外部和内部节段(segment)中。Phosducin可参与视觉光转导的调节或者参与光受体代谢的整合。Phosducin通过与视网膜G-蛋白转导素的β和γ亚基相互作用而调节光转导级联。已经描述了两个可变剪接的转录变体。该变体编码的同种型之一，phosducin样orphan蛋白不结合G蛋白。Phosducin蛋白及其同种型也存在于其它组织中，在此其参与信号转导途径。编码这个蛋白质的基因是色素性视网膜炎和乌斯赫尔综合征(Usher syndrome)II型的一种潜在的候选基因。令人惊奇地发现PDC基因或者phosducin同种型phosducin-样蛋白/orphan 1的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变PDC基因产物(phosducin同种型phosducin样蛋白/orphan 1)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。Phosducin同种型phosducin样蛋白/orphan 1的活性可以通过反义抑制PDC基因或者通过使用PDC蛋白的抗体而便利地降低，同时phosducin同种型phosducin样蛋白/orphan 1的活性可以通过将PDC基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源phosducin同种型phosducin-样蛋白/orphan 1而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以应用与PDC基因互补的核酸以及PDC蛋白的抗体。
编码钙网蛋白前体的CALR基因(SEQ ID NO：18；LPSS10)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是差异下调的(表1和表2)。BCEC单层与BCEC-星形胶质细胞共培养物之间差异下调的LPSS多肽参与从LPS刺激中恢复的能力(图2)。钙网蛋白(或者自身抗原Ro或干燥综合征抗原A或SSA或cClqR)是一种多功能蛋白质，其在内质网腔中作为主要的Ca2+结合(贮存)蛋白。其在核中也已经发现，提示其在转录调节中也许有作用。钙网蛋白结合合成的肽KLGFFKR，其与核受体超家族的DNA结合结构域中的氨基酸序列几乎相同。钙网蛋白结合系统性狼疮和斯耶格伦(sjogren)患者的某些血清中的抗体，其含有抗Ro/SSA抗体，其在物种中是高度保守的，且其位于内质网和肌质网中，在此其可以与钙结合。钙网蛋白的氨基末端与糖皮质激素受体的DNA结合结构域相互作用并防止该受体与其特异性糖皮质激素应答元件结合。钙网蛋白可抑制雄激素受体与其激素应答性DNA元件结合，并可以抑制雄激素受体和视黄酸受体的体内转录活性以及视黄酸诱导的神经元分化。因此，钙网蛋白通过核激素受体而可作为基因转录调节重要调节子。系统性红斑狼疮与钙网蛋白的自身抗体效价增加相关，但钙网蛋白不是Ro/SS-A抗原。先前的论文称钙网蛋白是Ro/SS-A抗原，但这点随后未被证实。人钙网蛋白自身抗体效价的增加在IgG和IgM类别的完全先天性心传导阻滞的婴儿中发现。令人惊奇地发现CALR基因或钙网蛋白前体的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变CALR基因产物(钙网蛋白前体)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。钙网蛋白前体的活性可以通过反义抑制CALR基因或通过使用CALR蛋白的抗体而便利地降低，同时钙网蛋白前体的活性可以通过将CALR基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源钙网蛋白前体而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与CALR基因互补的核酸以及CALR蛋白的抗体。
编码G-蛋白偶联受体诱导蛋白(G-protein-coupled receptorinduced protein)的C8FW基因(SEQ ID NO：19；LPSS11)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是差异上调的(表1和表2)。BCEC单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物之间差异上调的LPSS多肽参与从LPS刺激中恢复的能力(图2)。C8FW(或GIG2)是一种中间基因符号(interim gene symbol)，并以这种磷蛋白质而命名，其由促有丝分裂途径调节。这种G-蛋白偶联受体诱导蛋白与蛋白激酶相似。令人惊奇地发现C8FW基因或者G-蛋白偶联受体诱导蛋白的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变C8FW基因产物(G-蛋白偶联受体诱导蛋白)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。G-蛋白偶联受体诱导蛋白的活性可通过反义抑制C8FW基因或者通过使用C8FW蛋白的抗体而便利地降低，同时G-蛋白偶联受体诱导蛋白的活性可以通过将C8FW基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于G-蛋白偶联受体诱导蛋白而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与C8FW基因互补的核酸以及C8FW蛋白的抗体。
受体和粘着分子
作为膜(信号化或内在化)受体或(信号化)粘着分子的多肽在本发明的实施方案中优选用于特异性调节血脑屏障的通透性。我们已经鉴别了一些新的这种特异性差异表达的多肽，包括趋化因子(C-X-C基序)受体4、生长激素受体和白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子)。这些在下文更详细地论述。
编码趋化因子(C-X-C基序)受体4的CXCR4基因(SEQ ID NO：20；LPSS12)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是下调的(表1和表2)。下调的LPSS多肽参与增加血管通透性。趋化因子受体4是一种G蛋白偶联受体，其结合CXC细胞因子。其介导细胞内钙的流出。趋化因子受体4参与激活MAPK、编程性细胞死亡、趋化性、组织发生和器官发生、免疫应答、炎症应答、侵润生长、神经发生、对病毒和毒力的应答(其是HIV-1进入细胞的一种共同受体)。根据所研究的性质，这种蛋白质称为神经肽Y受体Y3(NPY3R)；融合素(fusin)；白细胞衍生的7-跨膜结构域受体(LESTR)；7-跨膜-节段受体(seven-transmembrane-segment receptor)、脾；脂多糖(LPS)相关蛋白3(LAP3)，具有多种名称(如HM89、NPYR、HSY3RR、NPYY3R、D2S201E)。令人惊奇地发现CXCR4基因或者趋化因子受体4的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变CXCR4基因产物(趋化因子受体4)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。趋化因子受体4活性可以通过反义抑制CXCR4基因或者通过趋化因子受体4拮抗剂包括CXCR4蛋白的抗体而便利地降低，同时趋化因子受体4的活性可以通过将CXCR4基因导入细胞中或者将内皮细胞暴露于外源趋化因子受体4激动剂而便利地增加。迄今为止，已经描述了如下CXCR4拮抗剂：肽化合物(T22、T134、T140、ALX40-4C、CGP64222)、bicyclam衍生物(AMD3100)、中和抗体(12G5、44717-111)及天然拮抗剂(HIV-1tat蛋白)(Sachpatzidis et al.，2003，J Biol Chem 278(2)：896-907；DeClercq et al.，2001，Antivir Chem Chemother 12 Suppl 1：19-31；Tamamura et al.，1998，Biochem Biophys Res Commun 253(3)：877-882)。迄今为止，已经描述了如下CXCR4激动剂：肽化合物(RSVM、ASLW)及天然激动剂(基质细胞衍生因子1α和β(CXCL12)(Sachpatzidis et al.，2003，supra)。另外，R & D Systems Europe Ltd.，UK提供了重组人和小鼠CXCL12及趋化因子受体4的有用的抗体及其配体CXCL12，其可用于诊断或治疗目的。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以使用与CXCR4基因互补的核酸以及CXCR4蛋白的抗体。
编码生长激素受体的GHR基因(SEQ ID NO.21；LPSS13)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。生物学活性的生长激素结合其跨膜受体(GHR)，使其二聚体化以激活胞内信号转导途径，引起胰岛素样生长因子I(IGF1)的合成与分泌。在血浆中，IGF1结合可溶的IGF1受体(IGF1R)。对于靶细胞，这个复合物激活信号转导途径，导致引起生长的促有丝分裂及合成代谢应答。GHR也已知是生长激素结合蛋白(GHBP)，其衍生自GHR的胞外激素结合区域，GHBP保持结合循环中的生长激素，并稳定循环中的生长激素。令人惊奇地发现GHR基因或生长激素受体的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现先前未加以报道，提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。因此，改变GHR基因产物(生长激素受体)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中用于特异性调节血脑屏障的通透性。生长激素受体活性可以通过反义抑制GHR基因、通过生长激素受体拮抗剂(包括高浓度的生长激素，其然后成为拮抗性的)或者通过GHR蛋白的抗体而便利地降低，同时生长激素受体活性可以通过将GHR基因导入细胞中或通过将内皮细胞暴露于外源生长激素受体激动剂(如生长激素)而便利地增加。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以应用与GHR基因互补的核酸以及GHR蛋白的抗体。
编码白喉毒素受体(或者肝素结合表皮生长因子样生长因子)的DTR(或HEGFL)基因(SEQ ID NO：22；LPSS 14)在BCEC-星形胶质细胞共培养物中暴露于LPS 2小时后在BCEC中是上调的(表1和表2)。上调的LPSS多肽参与血管通透性的增加。
白喉毒素受体(或称为HB-EGF或肝素结合EGF样生长因子前体或者白喉毒素敏感性DTS)是白喉毒素(DT)的受体，是白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的溶原化菌株产生的强力外毒素。DT，是一种58kDa的多功能蛋白质，其杀死易感的哺乳动物细胞。其由两个二硫键连接的蛋白质片段组成，这两个片段均是中毒过程所需的。A片段催化真核延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2)的ADP核糖基化，从而抑制蛋白质合成。B片段负责毒素与细胞结合并且是促进A片段进入细胞溶胶所必需的。特异性细胞表面DT受体的存在于1973年首次论证，现在已知DT通过受体介导的胞吞进入易感哺乳动物细胞。最初的步骤包括DT与DTR的结合，随后是毒素：受体复合物的内在化进入包被的窝(pit)中及A片段易位至细胞溶胶中。事实上，在DT毒素结合其细胞受体之后，其被胞吞，同时在这个胞吞泡中其暴露于酸性pH环境。酸性pH诱导毒素分子中的结构变化，提供了膜插入和易位至细胞溶胶的驱动力。不是所有的哺乳动物细胞均对DT等同地敏感。例如，猴肾细胞如Vero细胞是高度敏感的，而例如人、兔、豚鼠和仓鼠细胞是中等程度敏感的，小鼠和大鼠细胞是抗性的。鸡细胞对DT也是敏感的。如在实施例2中所示出，在顶端和基底外侧暴露之后，DT在(亚)纳摩尔范围以浓度和时间依赖性方式对牛BCEC是毒性的。
HB-EGF最初在1990年鉴别为巨噬细胞分泌的肝素结合生长因子。如同EGF家族的其它成员，HB-EGF通过结合EGF受体(EGF-R)分子的erb类别而发挥其生物学作用。HB-EGF激活两种EGF受体亚型，HER1和HER4并结合细胞表面HSPG。然而，与EGF家族的大多数成员包括EGF不同，HB-EGF与肝素高亲和性结合。肝素表现为加强HB-EGF与信号转导EGF-R的结合，并还可以调节生长因子对靶细胞的生物学作用，包括细胞迁移和增殖。HB-EGF对成纤维细胞、平滑肌细胞和上皮细胞是促有丝分裂的，但对内皮细胞不是。另外，HB-EGF是由上皮细胞产生的并作为这些细胞的自分泌生长因子。其是热抗性的阳离子蛋白，分子量为大约22kDa，用1.0M NaCl从肝素亲和层析柱洗脱。HB-EGF基因表达在应答例如氧化、缺血、渗透压(高葡萄糖或高渗)、电子和机械(剪切)刺激时及暴露于细胞因子(TNF-α、IL-1β、TGF-α)、LPS、生长因子(EGF、HB-EGF、双调蛋白、bFGF、PDGF)、溶血磷脂酰胆碱、氯化汞、佛波酯、Ca-离子载体、血清、凝血酶、内皮缩血管肽-1、血管紧张素II、脂蛋白、血小板活化因子(PAF)、α-肾上腺素能激动剂及转录因子如MyoD、Raf、v-Ha-ras之后是高度上调的。可溶的成熟HB-EGF是从较大的膜锚定前体中由基质金属蛋白酶(MMP′s，特别是MMP-3)和ADAM′s(一个解离素(disintegrin)和金属蛋白酶家族，包括ADAM9、ADAM10/Kuzbanian、ADAM12/meltrin-α及ADAM17/TACE(TNF-α转换酶))而蛋白酶解的。这个过程称为胞外域脱落(ectodomain shedding)，通过如下方式诱导或上调：UV光、IL-1β、茴香霉素、山梨糖醇、LPS、过氧化氢、脱羟肾上腺素、内皮缩血管肽-1、血管紧张素II、胰岛素样生长因子-1、12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)，通过蛋白激酶Cδ的激活及随后与ADAM9/MDC9/meltrin-γ的胞质结构域结合，或者通过溶血磷脂酸(LPA)，经Ras-Raf-MEK和小GTPase Rac信号化途径，或者通过应激和炎症细胞因子诱导的p38MAPK介导的途径(Takenobu et al.，2003，J.Biol.Chem.，278：17255-17262；Umata et al.，2001，J.Biol.Chem.，276：30475-30482；Asakura et al.，2002，Nature Medicine，8：35-40)。Pro-HB-EGF脱落由MMP抑制剂如基于氧肟酸的KB-R8301、一般的MMP抑制剂(包括TIMP′s)及BB-94(batimastat)和ADAM12抑制剂KB-R7785及ADAM10抑制剂XL784和XL081或者其类似物而抑制。TPA诱导的脱落是由PKC抑制剂Ro-31-8220抑制的，LPA诱导的脱落是由MEK拮抗剂PD98059抑制的，p38MAPK-介导的脱落是由SB203580抑制的(Takenobu et al.，2003，如前)。在从膜的蛋白酶解过程之后，相当数量的HB-EGF前体在细胞表面保持未切割(Nakamura etal.，1995，J.Cell Biol.129：1691-1705)。
HB-EGF参与许多正常的生理学过程，如胚泡植入和伤口愈合，并参与病理学过程如肿瘤生长、SMC增生和动脉粥样硬化。HB-EGF基因表达已经在许多组织中论证，包括血管内皮和平滑肌细胞、炎症细胞(主要是NK细胞)、骨骼肌和心肌、肾系膜细胞(kidney mesangialcells)、角质细胞、小肠、脑(神经元和神经胶质细胞)、整个关节、滋养层、胚泡、卵巢和子宫、胎盘、皮肤、淋巴结、膀胱和肿瘤细胞(包括神经胶质瘤)。
近来已经发现HB-EGF前体发挥白喉毒素受体的功能(Naglich etal.，1992，Cell，69：1051-1061)。尽管HB-EGF前体在包括具有相似组织分布的人、猴、大鼠和小鼠等物种中表达，但由于在人和猴中由DT特异性识别的序列中的氨基酸取代(HB-EGF上DT的受体结合结构域)导致大鼠和小鼠对DT有抗性，这降低了DT与啮齿动物HB-EGF的结合(Mitamura et al.，1995，J.Biol.Chem.，270：1015-1019)。近来已经示出AA141(Glu141)是DT结合及毒素敏感性的关键残基(Hooper andEidels，1996，Biochem.Biophys.Res.Commun.，220：675-680)。稍后Mitamura等(1997，J.Biol.Chem.，272：27084-27090)揭示了DT结合及毒素敏感性的两个另外的关键残基(AA115(Phe115)和AA127(Leu127))。表3示出不同的DT-不敏感的(小鼠、大鼠)及DT敏感的(中国仓鼠、兔、猪、猴、人和鸡)物种的HB-EGF的DT受体结合结构域(AA106-147)的序列。
表3：DT不敏感的(小鼠(Ms)、大鼠(Rt))和DT敏感的(中国仓鼠(CH)、兔(Rb)、猪(P)、猴(Mk)、人(H)和鸡(C))物种中HB-EGF的DT受体结合结构域(AA106-147)的序列。与人不同的残基用斜体字表示，粗体表示的残基是DT结合和毒素敏感性关键的残基(AA115(Phe115)、AA127(Leu127)和AA141(Glu141))。
肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)及其它相关蛋白质如CD9/DRAP27和α3-β1-整联蛋白通过增加DTR与其配体的亲和性(以及HB-EGF与其受体的结合(Shishido et al.，1995，J.Biol.Chem.49：29578-29585))而调节DTR功能。抗CD9/DRAP27单克隆抗体(IgG1：ALB-6和TP82，和IgG2a：BU16和007，及MAB1206)抑制DT与人细胞的结合和毒性(Nakamura et al.，1995，如前；Mitamuraet al.，1992，J.Cell Biol.118：1389-1399；Iwamoto et al.，1991，J.Biol.Chem.266：20463-20469)。
发现DTR基因(或者白喉毒素受体(或者肝素结合表皮生长因子样生长因子)在组成血脑屏障的细胞上表达(如实施例1和2所示出)，并且DTR的生物学活性由如下因素修饰：疾病刺激(如实施例1和3中针对LPS所示出)、肝素结合(如实施例3中暴露于外源肝素所示出)、拮抗剂(如实施例2中针对CRM197(DT的竞争性拮抗剂)及实施例2和4中针对可溶的HB-EGF(DT的非竞争性拮抗剂)所示出、胞外域脱落的抑制剂(如实施例3中暴露于基质金属蛋白酶BB-94(或batimastat)所示出)或其组合(如实施例3所示出)，这个发现提供了将药物特异性靶向并穿过血脑屏障和/或胞内区室，特别是溶酶体的新机会。改变DTR基因产物(即肝素结合表皮生长因子样生长因子)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节靶向血脑屏障的能力。特异性结合DTR的(受体结合结构域)(如(部分)DT、(部分)DT的B片段、(部分)CRM197(如实施例4所示出)或者任何其它配体)的任何配体在本发明的实施方案中均用于将药物靶向于血脑屏障。
蛋白质毒素(或者其非毒性衍生物)作为例如肽和蛋白质的载体穿过膜并进入细胞溶胶中的应用的一般概念未加以更新(参见关于此论题的最新综述Sandvig and van Deurs(2002，Annu.Rev.CellDev.Biol.，18：1-24)。DT在与其受体HB-EG结合后，通过称为受体介导的胞吞的过程而内在化。受体介导的胞吞/胞吞转运是一种熟知的安全而有效的将药物选择性靶向于脑的货物运载转运机制(Pardridge，2002，Nat.Rev.Drug Discov.，1：131-139)。然而，先前从未意识到通过涉及受体介导的胞吞/胞吞转运机制(针对例如运铁蛋白受体所描述的)，DTR的特异性配体携带药物直接穿过血脑屏障进入CNS的应用。事实上，只开发了破伤风毒素蛋白的非毒性C片段(TTC或Tet451)及破伤风毒素蛋白的非毒性衍生物(Glu234由Ala取代)携带药物进入CNS，然而通过明显不同的作用机制(与在血脑屏障处受体介导的胞吞/胞吞转运相比)，包括吸收进外周神经末梢随后通过逆行轴突运输至其细胞体并跨突触转移至中枢神经元(见U.S.5,780,024描述，在此并入参考，及Li et al.，2001J.Biol.Chem.276：31394-31401所述)。即使先前已经描述了HB-EGF在大鼠脑的神经元、神经胶质细胞和血管中组成型及疾病诱导型表达(Mishima等(1996，Neurosci.Lett.，213：153-156)，Nakagawa等(1998，Dev.BrainRes.，108：263-272)，Hayase等(1998，Brain Res.，784：163-178)及Tanaka等(1999，Brain Res.，827：130-138))，但这些作者无一意识到将与DTR的配体偶联的药物靶向输送于脑中这些细胞(胞内区室)的机会。这种疏忽通过这样的事实得以最佳地解释：啮齿动物HB-EGF不是DT的受体。事实上，在啮齿动物中，DT穿过脑肿瘤的微血管的通透性与其它大蛋白质的通透性相等或略低(Wrobel et al.，1990，J.Neurosurg.72(6)：946-950)，即使其在被动扩散后可以有效地杀死脑内的肿瘤细胞(Arguello et al.，1996.Blood.87(10)：4325-4332)。因此这些研究仅针对HB-EGF的自分泌和邻分泌(auto-and juxtacrine)生长和粘着因子性质而进行。更令人惊奇地，即使在受体介导的胞吞/胞吞转运方面著名的CNS药物输送专家(包括关于此论题出版了许多学术和综述类文章/书籍、专利和专利申请的Pardridge和Rapoport)及Yatvin等的最近公布的、其中提供了将药物输送至脑的可用技术的全面综述的题目为“Covalent conjugates of biologically-active compounds with aminoacids and amino acid derivatives for targeting tophysiologically-protected sites”的美国专利申请(US20030087803，在此并入参考)的作者均未意识到将与DTR的配体偶联的药物靶向输送于脑内细胞(胞内区室)的机会。
DT对易感的哺乳动物细胞是非常毒性的事实使得药物靶向于具有其天然配体DT的DTR不是优选的。然而，非毒性DT部分包括(部分)DT的B片段或者(部分)CRM197(DT的非毒性突变蛋白)的鉴别开启了通过DTR安全而有效地将药物靶向于脑的大门。CRM197是最优选的，因为与CRM197缀合的多糖在接种疫苗程序中已经安全地用于数百万人(婴儿、学步儿童、青少年和成人)(例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)b型寡糖CRM197缀合疫苗(HibTiterTM)；肺炎球菌7价缀合疫苗(PrevnarTM)；脑膜炎球菌C寡糖缀合疫苗(MenjugateTM和MeningtecTM))。从这些研究中已知CRM197蛋白是一种安全而有效的糖类T细胞依赖性载体。同样，CRM66(交叉反应性66kDa蛋白质)是铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A的一种失活突变形式，其特异性结合低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白(LRP)和LRP 1B，并可以与Demeule等针对p97(黑素运铁蛋白(melanotransferrin))所述相似的方式用于输送药物穿过血脑屏障(2002，J.Neurochem.83(4)：924-933)，其结合相同的受体(WO03009815)。
CRM197是由产生毒素的棒状杆菌噬菌体(corynephage)(β)的亚硝基胍诱变而产生的非产生毒素的噬菌体(β197tox-)感染的白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)产生的(Uchida，et al.1971，NatureNew Biology，233：8-11)。CRM197蛋白与白喉毒素具有相同的分子量，但在结构基因中有一个碱基改变而不同(鸟嘌呤改变为腺嘌呤)。这个单一的碱基改变导致成熟蛋白质中氨基酸取代(AA52：谷氨酸取代为甘氨酸)并消除了白喉毒素的毒性。
疫苗中的载体蛋白基于如下观点而揭示。用完整的(但失活的)病毒或细菌接种是有效的，但具有许多缺点和副作用。为此，揭示了仅具有病毒和细菌的免疫原性部分(或模拟物)的接种方案(例如(多)糖或荚膜蛋白)。然而，这种疫苗在处于感染危险的群体中至少是有效的：无B细胞免疫应答的个体，依赖于T细胞应答以起到免疫保护的老年人和2岁以下的婴幼儿。由于这种疫苗几乎不是T细胞免疫应答的诱导剂，因此病毒和细菌的免疫原性部分转变为能诱导T细胞应答的免疫原是在靶向群体中产生足够的保护作用的关键因素。已经揭示了将病毒和细菌的免疫原性部分与合适的蛋白质载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(形式化DT)、牛血清白蛋白(BSA)或者人血清白蛋白(HSA)连接，通过非特异性作用机制产生这种免疫原。事实上，白喉类毒素缀合物的作用机制在此与DTR结合介导的对淋巴细胞的作用不相关。为避免白喉类毒素缀合物的任何残余毒性，随后将白喉类毒素用非毒性的DT突变体CRM197代替。载体蛋白基于非特异性作用机制而应用的观点由这样的事实而认可，即CRM197缀合疫苗的效力在DT非敏感性小鼠中常规测试。Gupta等(1997，Vaccine 15：1341-1343)示出CRM197缀合疫苗的免疫原性中的巨大不同可以在DT不敏感的小鼠和DT敏感的豚鼠之间论证，表明CRM197-缀合疫苗在DT敏感的物种中确实利用特异性DTR介导的细胞吸收。
DT(的受体结合结构域)的中和抗体可以存在于接纳体的血清中(因为先前暴露于或接种了白喉棒杆菌、(部分)DT(B-片段)或(部分)CRM197(或任何其它(部分)非毒性DT)，这可以预防DTR上与CRM197(或与DT结合结构域特异性结合的任何其它化合物)缀合的药物的特异性结合，从而降低药物输送系统的整体效力。这种中和抗体优选在应用药物输送系统之前通过将接纳体暴露于有效的最小量游离CRM197或者与中和抗体上DT结合结构域特异性结合的任何其它化合物(如(部分)DT(B-片段)或者(部分)CRM197的CRM197片段、小分子、肽、模拟物、抗独特型抗体等等)而失活的。
另外，令人惊奇地发现DTR基因或白喉毒素受体(或者肝素结合表皮生长因子样生长因子)的表达在组成血脑屏障的细胞中由LPS修饰，这个发现提供了修饰或监测血脑屏障功能性的新机会。另外，改变DTR基因产物(即肝素结合表皮生长因子样生长因子)的生物学活性的任何制剂在本发明的实施方案中均用于特异性调节血脑屏障的通透性。白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子)活性可以通过反义抑制DTR基因或者通过肝素结合表皮生长因子样生长因子拮抗剂或者通过DTR蛋白的抗体而便利地降低，同时白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子)活性可以通过将DTR基因导入细胞中或者通过将内皮细胞暴露于外源肝素结合表皮生长因子样生长因子而便利地增加。另外，R & D Systems Europe Ltd.，UK提供了重组人HB-EGF及HB-EGF的有效抗体，其可用于诊断或治疗目的。这个基因表达的改变在本发明的实施方案中可用于血管通透性状态的诊断目的。为此，可以应用与HB-EGF基因互补的核酸以及HB-EGF蛋白的抗体。
为了显著增强相关的动物疾病模型的实验和有效性以在本发明的实施方案中特异性研究血脑屏障的通透性，优选产生人样HB-EGF转基因或敲入(knock-in，KI)小鼠。人样HB-EGF转基因小鼠可以通过导入在组成型激活的(例如肿瘤)启动子或组织特异性启动子优选GFAP和/或γ-GTP启动子控制下的人DTR基因(编码HB-EGF)而遗传工程化，以获得该基因在脑和/或脑血管中表达。然而，最优选在ES细胞中通过同源重组导入遗传工程化的Hegfl基因(编码在其内源启动子控制下的小鼠HB-EGF基因)，由此外显子2和3将含有人白喉毒素受体结合结构域的序列，优选含有阳性和阴性选择标记序列。白喉毒素受体结合结构域的编码序列定位于外显子2的末端和外显子3的起始处。最后，小鼠基因组DNA克隆衍生自PAC文库，优选pPAC4文库(129/SvevTACfBr菌株)。在靶向载体中，最初的第二个和第三个外显子通过遗传工程由人白喉毒素受体结合结构域的特异性序列置换，产生白喉毒素敏感性受体结合结构域。在内含子2内或外显子3的下游，存在PGK驱动的LoxP位点位于两侧的neo盒。将胚胎干细胞(E14)电穿孔并使用外部探针通过Southern印迹分析选择进行同源重组的克隆。人白喉毒素受体结合结构域的序列通过PCR使用人特异性引物测试，另外优选随后用限制酶消化以及对外显子2和3进行测序分析。将靶向的ES细胞注入胚泡以产生嵌合动物。确定F1刺豚鼠(agouti)子代基因型，探查突变的等位基因的传递(transmission)，产生转基因品系的人样HB-EGF+NEO。将杂合的人样HB-EGF+NEO小鼠与EIIA-Cre品系的小鼠繁殖(Lakso et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.93(12)：5860-5865)以除去neo盒。通过这些方式，获得种系传递并建立转基因品系人样HB-EGF KI。将小鼠与C57B1/6J进一步繁殖5代。使用纯合的人样HB-EGF KI和wt同窝出生仔鼠进行进一步分析(～97％C57B16J背景)。然后，为在人样HB-EGF KI小鼠中使异种肿瘤植入物生长，在本发明中可利用许多免疫缺陷小鼠。这些小鼠包括但非限于裸鼠、scid鼠和rag-1和rag-2基因缺陷小鼠。具有由于某些遗传基因座突变而导致的不同类型的免疫缺陷的其它动物可见于网址immunology.tch.harvard.edu。将这些小鼠与前述人样HB-EGF KI小鼠杂交以产生免疫功能缺陷但表达人样HB-EGF的子代。另外，在这些小鼠中期望无针对外源载体蛋白如CRM197的免疫遗传学应答(产生例如中和抗体)。另外，将前述人样HB-EGF KI(原始的和/或免疫缺陷的)小鼠与现有技术领域作为疾病模型所述的任何剔除的转基因/KI小鼠杂交以产生既具有疾病表型又对外源载体蛋白如CRM197敏感的子代。同样，转基因大鼠和猪也可以由此产生。
序列相同性
“序列相同性”在本文是指通过序列对比确定的两或多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两或多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本技术领域中，“相同性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关程度，这可以通过这种序列链之间的匹配而确定。两个氨基酸序列之间的“相似性”通过对比一种多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代与另一种多肽的序列而确定。“相同性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算，所述方法包括但非限于如下所述：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and GenomeProjects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；ComputerAnalysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heine，G.，Academic Press，1987；及Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，NewYork，1991；及Carillo，H.，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。
确定相同性的优选方法设计为给出测试序列之间的最大匹配。确定相同性和相似性的方法可在公众可利用的计算机程序中程序化。确定两个序列之间的相同性和相似性的优选计算机程序方法包括例如GCG程序包(Devereux，J.，et al.，Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))，BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。BLAST X程序可公开得自NCBI及其它来源(BLAST Manual，Altschul，S.，et al.，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。也可以使用熟知的Smith Waterman算法确定相同性。
多肽序列对比的优选参数包括如下：算法：Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；对比矩阵(comparisonmatrix)：BLOSSUM62，来自Hentikoff and Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)；缺口罚值(Gap Penalty)：12；缺口长度罚值：4。具有这些参数的程序可公开得自位于Madison，WI的Genetics Computer Group的Ogap程序。前述参数(连同末端缺口的nopenalty一起)是氨基酸对比的默认参数。
核酸对比的优选参数包括如下：算法：Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)；对比矩阵：匹配＝+10，错配＝0；缺口罚值：50；缺口长度罚值：3。得自位于Madison，Wis.的GeneticsComputer Group的Gap程序。上述给出了核酸对比的默认参数。
任选地，在确定氨基酸相似性程度中，技术人员也可考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这为技术人员所已知。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的可交换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含有酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，及天冬酰胺-谷氨酰胺。本文揭示的氨基酸序列的取代变体是其中所揭示的序列中已经除去了至少一个残基并在此位置插入一个不同的残基。优选地。氨基酸变化是保守的。对于每个天然发生的氨基酸的优选的保守取代如下：Ala取代为ser；Arg取代为lys；Asn取代为gln或his；Asp取代为glu；Cys取代为ser或ala；Gln取代为asn；Glu取代为asp；Gly取代为pro；His取代为asn或gln；Ile取代为leu或val；Leu取代为ile或val；Lys取代为arg、gln或glu；Met取代为leu或ile；Phe取代为met，leu取代为tyr；Ser取代为thr；Thr取代为ser；Trp取代为tyr；Tyr取代为trp或phe；Val取代为ile或leu。
重组产生多肽的重组技术和方法
本发明中使用的多肽可以使用重组技术制备，其中编码感兴趣的多肽的核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达。本发明因此还涉及包含上述核酸分子或核苷酸序列的载体的应用。优选地，所述载体是一种复制载体，其包含一个复制起点(或者自主复制序列)，这保证了所述载体在适于载体的宿主中增殖。或者该载体能整合入宿主细胞的基因组中，例如通过同源重组或别的方式进行。特别优选的载体是一种表达载体，其中编码上述多肽的核苷酸序列任选地与能指导编码序列在载体的宿主细胞中表达的启动子可操纵地连接。
如本文所用，术语“启动子”是指一个核酸片段，其位于基因转录起始位点的转录方向的上游，发挥控制一或多个基因转录的作用，并且在结构上以存在DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其它DNA序列而鉴别，所述序列包括但非限于转录因子结合位点、阻抑物和激活物蛋白结合位点及本领域技术人员已知的任何其它核苷酸序列以发挥直接或间接调节启动子转录的量的作用。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下是活性的启动子。“诱导型”启动子是依赖于生理或发育条件而被调节的启动子。“组织特异性”启动子仅在特殊类型的分化的细胞/组织中有活性。
表达载体使得上述LPSS多肽可以使用重组技术制备，其中编码感兴趣的LPSS多肽的核苷酸序列在合适的细胞中表达，例如在培养的细胞或多细胞生物体的细胞中表达，所述方法如Ausubel et al.，″Current Protocols in Molecular Biology″，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(1987)及Sambrook and Russell(2001，如前)所述；这两篇文献在此均以其全文并入参考。也见于Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：488(描述定点诱变)和Roberts et al.(1987)Nature 328：731-734或Wells，J.A.，et al.(1985)Gene 34：315(描述盒式诱变)所述。
典型地，在表达载体中使用编码希望的多肽的核酸。术语“表达载体”一般是指能影响基因在与这种序列相容的宿主中表达的核苷酸序列。这些表达载体典型地包括至少合适的启动子序列及任选转录终止信号。如本文所述也可以使用影响表达必需的或有益的额外因素。将编码多肽的DNA掺入能导入并在体外细胞培养物中表达的DNA构建体中。特别地，DNA构建体适于在原核宿主如细菌，例如大肠杆菌(E.coli)中复制，或者可以导入培养的哺乳动物、植物、昆虫，例如Sf9、酵母、真菌或其它真核细胞系中。
制备用于导入特殊宿主的DNA构建体典型地包括由宿主识别的一个复制系统、编码希望的多肽的指定的DNA节段及与多肽编码节段可操纵地连接的转录和翻译起始和终止调节序列。当DNA节段与另一个DNA节段以功能关系放置时，则是“可操纵地连接的”。例如，如果一个启动子或增强子刺激编码序列转录时则与该序列是可操纵地连接。信号序列的DNA如果表达为参与多肽分泌的前蛋白(preprotein)，则其与编码该多肽的DNA是可操纵地连接。一般地，可操纵地连接的DNA序列是邻近的，并且在信号序列的情况中是邻近及解读相(reading phase)的。然而，增强子不需要与其控制转录的编码序列邻近。连接通过在便利的限制位点或在插入的连接物(adapter)或接头(linker)处连接而完成。
适当的启动子序列的选择通常依赖于针对DNA节段表达所选择的宿主细胞。合适的启动子序列的例子包括本领域熟知的原核及真核启动子(见例如Sambrook and Russell，2001，如前)。转录调节序列典型地包括由宿主识别的异源增强子或启动子。合适的启动子的选择根据宿主而定，但启动子如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子是已知及可利用的(见例如Sambrook and Russell，2001，supra)。表达载体包括复制系统和转录和翻译调节序列，并且可以应用多肽编码节段的插入位点。细胞系和表达载体的可使用组合的例子如Sambrook和Russell(2001，如前)及Metzger et al.(1988)Nature334：31-36所述。例如，合适的表达载体可以在酵母，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、昆虫细胞，例如Sf9细胞，哺乳动物细胞，例如CHO细胞及细菌细胞例如大肠杆菌中表达。宿主细胞因此可以是原核或真核宿主细胞。宿主细胞可以是适于在液体培养基中或固体培养基上培养的宿主细胞。宿主细胞在生产上述LPSS多肽的方法中使用。所述方法包括在有益于多肽表达的条件下培养宿主细胞的步骤。任选地，所述方法可包含回收该多肽。所述多肽可例如通过标准蛋白质纯化技术从培养基中回收，所述蛋白质纯化技术包括本领域已知的多种层析方法。
或者，宿主细胞是多细胞生物体的一部分，如转基因植物或动物、优选非人动物的一部分。转基因植物在其至少一部分细胞中包含上述载体。产生转基因植物的方法例如U.S.6,359,196及在本文引用的参考文献所述。这种转基因植物可用于生产上述LPSS多肽的方法中，所述方法包括回收在其细胞中包含所述载体的一部分转基因植物或者回收一部分这种转基因植物的子代，由此所述植物含有所述多肽，及任选地从该植物部分中回收该多肽。这种方法也见于U.S.6,359,196及在本文引用的参考文献所述。相似地，转基因动物在其体细胞和生殖细胞中包含上述载体。转基因动物优选是一种非人动物。产生转基因动物的方法例如WO01/57079及在本文引用的参考文献中所述。这种转基因动物可以用于生产上述LPSS多肽的方法中，所述方法包括从包含该载体的转基因动物或其雌性子代中回收体液的步骤，其中所述体液含有该多肽，并任选地从该体液中回收该多肽。这种方法也见于WO01/57079及在本文引用的参考文献中所述。含有所述多肽的体液优选是血液，更优选是乳汁。
制备多肽的另一种方法是应用体外转录/翻译系统。将编码多肽的DNA克隆进如前述的表达载体中。然后将该表达载体在体外转录和翻译。翻译产物可直接使用或首先纯化。得自体外翻译的多肽典型地不含有在体内合成的多肽上翻译后修饰，尽管由于固有存在微粒体而可能发生一些翻译后修饰。通过体外翻译而合成多肽的方法见例如Berger & Kimmel，Methods in Enzymology，Volume 152，Guide toMolecular Cloning Techniques，Academic Press，Inc.，San Diego，CA，1987所述。
基因治疗
本发明的一些方面涉及包含上述核苷酸序列的表达载体的应用，其中所述载体是适于基因治疗的载体。适于基因治疗的载体见于Anderson 1998，Nature 392：25-30；Walther and Stein，2000，Drugs 60：249-71；Kay et al.，2001，Nat.Med.7：33-40；Russell，2000，J.Gen.Virol.81：2573-604；Amado and Chen，1999，Science 285：674-6；Federico，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10：448-53；Vigna and Naldini，2000，J.Gene Med.2：308-16；Marin et al.，1997，Mol.Med.Today 3：396-403；Peng and Russell，1999，Curr.Opin.Biotechnol.10：454-7；Sommerfelt，1999，J.Gen.Virol.80：3049-64；Reiser，2000，Gene Ther.7：910-3；及本文应用的参考文献所述。
特别合适的基因治疗载体包括腺病毒和腺伴随病毒(AAV)载体。这些载体感染众多类型的分裂和非分裂细胞。另外，腺病毒载体能高水平表达转基因。然而，由于腺病毒和AAV载体在进入细胞后的附加型性质，因此这些病毒载体最适于仅需要转基因瞬时表达的治疗应用(Russell，2000，J.Gen.Virol.81：2573-2604)。优选的腺病毒载体被修饰以降低宿主应答，如Russell(2000，如前)所述。
通常地，基因治疗载体是如上述的有义表达载体，其包含编码被表达的LPSS多肽的核苷酸序列，由此该核苷酸序列可操纵地与如上述合适的调节序列连接。这种调节序列至少包含一个启动子序列。表达基因治疗载体编码的多肽的核苷酸序列的合适启动子包括例如巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、病毒长末端重复启动子(LTRs)，如来自鼠莫洛尼氏白血病病毒(MMLV)劳氏肉瘤病毒或HTLV-1的那些启动子，猿猴病毒40(SV40)早期启动子及单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子。
已经描述了一些诱导型启动子系统，其可以通过给予小的有机或无机化合物而诱导。这种诱导型启动子包括由以下物质控制的那些启动子，重金属如金属硫蛋白(metallothionine)启动子(Brinster et al.1982 Nature 296：39-42；Mayo et al.1982 Cell 29：99-108)、RU-486(一种孕酮拮抗剂)(Wang et al.1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：8180-8184)、类固醇(Mader and White，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5603-5607)、四环素(Gossen and Bujard 1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；U.S.Pat.No.5,464,758；Furth et al.1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9302-9306；Howe et al.1995 J.Biol.Chem.270：14168-14174；Resnitzky et al.1994 Mol.Cell.Biol.14：1669-1679；Shockett et al.1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6522-6526)及tTAER系统，其基于多嵌合(multi-chimeric)反式激活蛋白，其由作为VP16的激活结构域的tetR多肽及雌激素受体的配体结合结构域组成(Yeeet al.，2002，US 6,432,705)。
基因治疗载体可任选地包含编码第二个或另外的蛋白质的第二个或者一或多个另外的核苷酸序列。所述第二个或另外的蛋白质可以是(可选择的)标记蛋白，其使得可以鉴别、选择和/或筛选含有表达构建体的细胞。为此目的，合适的标记蛋白是例如荧光蛋白GFP及可选择的标记基因HSV胸苷激酶(在HAT培养基上选择)、细菌潮霉素B磷酸转移酶(在潮霉素B上选择)、Tn5氨基糖苷磷酸转移酶(在G418上选择)及二氢叶酸还原酶(DHFR)(在氨甲蝶呤上选择)、CD20、低亲和性神经生长因子基因。获得这些标记基因的来源及其使用方法由Sambrook和Russel(2001)“Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd edition)”，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York提供。
或者，所述第二个或另外的核苷酸序列可编码一种蛋白质(如果确实需要)，该蛋白质提供了可以治疗转基因细胞患者的故障安全机制。这种核苷酸序列通常称为自杀基因，其编码能将前体药物转变为能杀死其中表达所述蛋白质的转基因细胞的毒性物质的蛋白质。这种自杀基因的合适实例包括例如大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因或者单纯疱疹病毒、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒的胸苷激酶基因之一，在这种情况中可以使用9-[1，3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤作为前体药物以杀死患者体内的IL-10转基因细胞(见例如Clair et al.，1987，Antimicrob.Agents Chemother.31：844-849)。
基因治疗载体优选在包含下述合适的药物载体的药物组合物中配制。
抗体
本发明的一些方面涉及特异性结合上述本发明的LPSS多肽的抗体或抗体片段。产生特异性结合给定多肽的抗体或抗体片段的方法见例如Harlow and Lane(1988，Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和WO91/19818；WO 91/18989；WO 92/01047；WO 92/06204；WO 92/18619；及US 6,420,113和本文引用的参考文献所述。本文所用术语“特异性结合”包括低和高亲和性特异性结合。特异性结合可以例如通过Kd为至少大约10-4M的低亲和性抗体或抗体片段展示。特异性结合也可以通过高亲和性抗体或抗体片段而展示，例如Kd为至少大约10-7M、至少大约10-8M、至少大约10-9M、至少大约10-10M或者Kd为至少大约10-11M或10-12M或更高的抗体或抗体片段。
肽模拟物
特异性结合LPSS多肽或LPSS多肽受体的并可用于本发明的任何方法的肽样分子(称作肽模拟物)或非肽分子可以使用本领域已知的方法鉴别，例如在本文并入参考的US 6,180,084所详述。这种方法包括例如筛选肽模拟物、肽的文库、DNA或cDNA表达文库、组合化学及特别有用的噬菌体展示文库。这些文库可以筛选LPSS多肽或其受体的激动剂和拮抗剂，通过将该文库与基本纯化的LPSS多肽、LPSS多肽受体、其片段或结构类似物相接触而进行。
药物组合物
本发明进一步涉及包含上述活性成分LPSS多肽、抗体或基因治疗载体的药物制品。所述组合物优选除了活性成分之外至少包含一种药物可接受的载体。
在一些方法中，从哺乳动物、昆虫或微生物细胞培养物中、从转基因哺乳动物的乳汁中或者其它来源中纯化的本发明的多肽或抗体以纯化形式与药物学载体一起作为药物组合物而给予。生产包含多肽的药物组合物的方法见美国专利No：5,789,543和6,207,718所述。优选的形式根据指定的给予模式和治疗应用而定。
药物载体可以是适于将多肽、抗体或基因治疗载体输送给患者的任何相容的非毒性物质。无菌水、醇、脂肪、蜡及惰性固体都可用作载体。药物可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等也可掺入药物组合物中。
药物组合物中本发明的LPSS多肽或抗体的浓度可以广泛变化，即从低于大约0.1％重量、通常为至少大约1％重量至多如20％重量或更多。
对于口服给予，所述活性成分可以固体剂型给予，如胶囊、片剂和粉末，或者以液体剂型给予，如酏剂、糖浆和悬浮液。活性成分可以连同非活性成分和粉末状载体如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、淀粉、纤维素或纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石、碳酸镁等一起装入胶囊内。可以加入的以提供希望的颜色、味道、稳定性、缓冲能力、分散或其它已知希望的特征的额外的非活性成分的实例是红色氧化铁、硅胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛、可食用的白色墨水等。可以使用相似的稀释剂以产生压制片剂。片剂和胶囊均可以制备为持续释放产物而在几个小时的时期内提供持续释放药物。压制片剂可以是糖衣的或者用薄膜包被的以掩盖任何讨厌的味道并保护该片剂免于被空气破坏，或者是肠衣片以在胃肠道内选择性分解。口服给予的液体剂型可以含有色素和香味剂以增加患者的接受度。
LPSS多肽、抗体或基因治疗载体优选胃肠外给予。胃肠外给予的多肽、抗体或载体必须是无菌的。无菌状态可以通过灭菌滤膜过滤而达到，之后冻干和重建(reconstitution)。LPSS多肽、抗体或载体的胃肠外给予途径是根据已知方法而定，例如静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内、颅内、鞘内、经皮、鼻、口腔、直肠或阴道途径注射或灌注。所述肽、抗体或载体通过灌注或大丸药注射而持续给予。静脉内灌注的典型组合物可以制成为含有10-50ml无菌的0.9％NaCl或5％葡萄糖溶液，任选补加20％白蛋白溶液和1-50μg LPSS多肽、抗体或载体。肌内注射的典型药物组合物制成为含有例如1-10ml无菌缓冲水和1-100μg本发明的LPSS多肽、抗体或载体。制备胃肠外给予的组合物的方法是本领域熟知的并在不同资料中详加描述，包括例如Remington′s Pharmaceutical Science(15th ed.，Mack Publishing，Easton，PA，1980)(在本文以其全文并入参考)。
对于治疗应用，药物组合物以足以降低症状的严重程度和/或预防或阻滞症状进一步发展的量给予患有微血管通透性失调的患者。足够达到这个目的的量为“治疗”或“预防有效剂量”。这种有效剂量根据病症的严重程度及根据患者的一般健康状况而定。通常地，治疗或预防有效剂量优选是这样的剂量，其使得微血管通透性恢复至正常未受影响的健康个体的平均水平。
在本发明的方法中，LPSS多肽或抗体通常以大约1μg/kg患者体重/周或更高的剂量给予患者。通常的剂量高于10μg/kg/周。剂量方案可以在从10μg/kg/周至至少1mg/kg/周的范围内。典型的剂量方案是10μg/kg/周、20μg/kg/周、30μg/kg/周、40μg/kg/周、60μg/kg/周、80μg/kg/周和120μg/kg/周。在优选的方案中，每周给予一次、两次或三次10μg/kg、20μg/kg或40μg/kg。治疗优选通过胃肠外途径给予。
微阵列
本发明另一方面涉及包含上述核酸、多肽或抗体的微阵列(或者其它高通量筛选设备)。一种微阵列是含有一或多种固定的核酸或多肽片段的固体支持物或载体，以分析核酸或氨基酸序列或其混合物(见例如WO 97/27317、WO97/22720、WO 97/43450、EP 0 799 897、EP 0 785 280、WO 97/31256、WO97/27317、WO 98/08083及Zhu andSnyder，2001，Curr.Opin.Chem.Biol.5：40-45所述)。包含所述核酸的微阵列可用于例如上述分析基因型或表达模式的方法中。包含多肽的微阵列可用于检测与所述多肽相互作用的底物、配体或其它分子的合适候选物。包含抗体的微阵列可用于分析上述多肽表达模式的方法中。
附图描述
图1是具有BCEC-ACM单层(a组)和BCEC-星形胶质细胞共培养物(b组)的滤膜插入物的详细示意图。
图2是在体外暴露于脂多糖(LPS)之后在BBB发生的事件的详细示意图。将BCEC在50％ACM中培养为单层或者与星形胶质细胞共培养。星形胶质细胞增加体外BBB性能(1相)。由LPS诱导的疾病破坏BCEC单层(2相)，而BCEC+星形胶质细胞共培养物能恢复(3相)。这个恢复过程涉及蛋白质重新合成，因为环己酰亚胺(CHX)能完全抑制恢复相。
图3示出暴露于LPS中2小时后对TEER穿过BCEC-ACM单层的作用，以Ohm.cm2(平均值+/-标准差，a组)及与对照的％表示(对照即未处理的BCEC-ACM单层，平均值+/-标准差，b组)。
图4示出在暴露于LPS 2小时后对TEER穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用，以Ohm.cm2(平均值+/-标准差，a组)及与对照的％表示(对照即未处理的BCEC-星形胶质细胞共培养物，平均值+/-标准差，b组)。
图5示出在滤膜顶面(血液)侧暴露于不同浓度(1ng/ml直至10μg/ml)的DT后对TEER穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)。
图6示出在滤膜基底外侧(脑)侧暴露于不同浓度(25ng/ml直至1μg/ml)的DT后对TEER穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)。
图7示出在暴露于100ng/ml DT后对TEER穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)，DT预先与不同浓度的可溶的HB-EGF(0.1-10μg/ml)温育(在室温温育1小时)，通过结合DT的受体结合结构域而作为DTR的非竞争性拮抗剂，之后暴露于滤膜的顶面。
图8示出TEER穿过用5μg/ml的CRM197预处理1小时的BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)，通过结合DT的受体结合结构域而作为DTR的竞争性拮抗剂，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
图9示出TEER穿过用肝素(125μg/ml)预处理1小时的BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)，通过在DT的受体结合结构域中导入构象变化而在DTR作为DT结合的增强剂，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
图10示出TEER穿过用顶面暴露于1μg/ml LPS(血清型055:B5)2小时的BCEC-星形胶质细胞共培养物的作用(以与对照的平均％表示)，从而增加DTR的表达水平，或者暴露于10μmol BB94(batimastat)1小时，作为参与胞外域脱落过程的MMP’s的抑制剂，从而增加细胞膜上DTR利用度，或者暴露于LPS和BB94的组合，从而增加表达水平和细胞膜上DTR的利用度，之后BCEC暴露于100ng/ml DT。
图11示出在暴露于相应于5μg/ml未缀合的HRP的HRP缀合蛋白(CRM197、BSA和全运铁蛋白)后，BCEC裂解物中HRP活性。
图12示出在暴露于相应于5μg/ml未缀合的HRP、HRP缀合的CRM197、HRP缀合的BSA后，BCEC裂解物中HRP活性，HRP缀合的CRM197与10μg/ml可溶的HB-EGF预温育，通过结合CRM197的受体结合结构域而作为DTR介导的吸收的非竞争性拮抗剂。
图13示出HRP缀合的CRM197在体外穿过血脑屏障的活性及选择性胞吞转运作用(即在37℃(实心线)和4℃(虚线)以相应于5μg/ml未缀合的HRP的浓度，顶面暴露于HRP缀合的CRM197(环形线)和HRP缀合的BSA(方形线)之后HRP在基底外侧区室中的活性。
图14示出在37℃和4℃暴露于相应于5μg/ml游离HRP浓度的HRP-荷载CRM197包被的PEG脂质体之后，HRP在BCEC裂解物中的活性(以抑制主动吸收)，表明HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体由BCEC主动吸收。
图15示出暴露于相应于5μg/ml游离HRP浓度的HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体或HRP荷载BSA包被的PEG脂质体之后，HRP在BCEC裂解物中的活性(以确定载体特异性)，表明HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体由BCEC特异性吸收。
图16示出暴露于相应于5μg/ml游离HRP浓度的HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体之后，HRP在BCEC裂解物中的活性，并与在用50μg/ml的游离CRM197预处理1小时的BCEC中的吸收相对比(以确定DTR的特异性关联)，表明HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体确实通过DTP由BCEC特异性吸收。
图17示出HRP通过CRM197包被的脂质体穿过体外血脑屏障的选择性胞吞转运作用(即以相应于5μg/ml游离HRP的浓度，在顶面暴露于HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体(环形线)及HRP荷载BSA包被的PEG脂质体(方形线，以确定载体特异性)之后，HRP在基底外侧区室中的活性)。
图18示出HRP在CRM197-HRP缀合物注射的动物的三个大脑皮质匀浆样品(即全部匀浆(称为匀浆)、脑实质(称为实质)及脑血管(称为毛细管))中的活性。在来自TrF-HRP缀合物注射的动物以及游离HRP注射的动物的所有样品中，HRP活性水平均低于HRP分析的检测极限，表明只有与40kDa物质(即HRP)缀合的CRM197在大脑皮质中特异性吸收，其中游离HRP及与TrF缀合的HRP则否。
图19示出了代表性照片：
(A组)通过TMB针对内源过氧化物酶活性而直接染色的非灌注对照脑(注意遍布于整个切片的血管的独特及强染色模式特征)；
(B组)通过TMB针对内源过氧化物酶活性而直接染色的充分灌注的对照脑(注意用盐水通过心脏动脉的灌注程序能完全除去在A组中见到的内源过氧化物酶活性)；
(C和D组)两个游离HRP注射的动物的充分灌注的脑的TMB染色的冷冻切片(cryo-section)(注意与在充分灌注的对照脑中一样，无可明显的染色可观测到)；
(E和F组)CRM197-HRP缀合物注射的动物的充分灌注的脑的两个TMB染色的冷冻切片(注意小血管相关的染色模式特征，以及穿过血管外渗(即转运)HRP的独特染色区域特征)；
(G和H组)CRM197-HRP缀合物注射的动物的两个更好灌注的脑的TMB染色的冷冻切片(再一次注意穿过血管外渗(即转运)HRP的独特染色区域特征)；
(I和J组)TrF-HRP缀合物注射的动物的充分灌注的脑的两个TMB染色的冷冻切片(注意与小血管相关的少量(如果有的话)非常微弱的染色模式)；
(K和L组)TrF-HRP缀合物注射的动物的另外充分灌注的脑的两个TMB染色的冷冻切片(再一次注意与小血管相关的少量(如果有的话)非常微弱的染色模式)。
总之，这些结果表明与40kDa物质(即HRP)缀合的CRM197在大脑皮质被特异性吸收，而在此游离的HRP及与TrF缀合的HRP则否。大脑皮质冷冻切片的所有放大倍率均为40倍。
图20示出代表性照片：
(A和D组)用小鼠抗白喉毒素通过对白喉毒素的免疫组织化学针对CRM197染色的CRM197-HRP缀合物注射的动物的冷冻切片(注意遍布整个切片的微弱的均匀分布的染色模式，A组：放大倍率20倍及D组：放大倍率100倍)；
(B和E组)用小鼠抗白喉毒素通过对白喉毒素的免疫组织化学针对CRM197染色的游离HRP注射的动物的冷冻切片(注意没有染色模式存在，B组：放大倍率20倍及E组：放大倍率100倍)；
(C和F组)用小鼠抗白喉毒素通过对白喉毒素的免疫组织化学针对CRM197染色的TrF-HRP缀合物注射的动物的冷冻切片(再一次注意无染色模式存在，C组：放大倍率20倍及F组：放大倍率100倍)。
总之，这些结果表明CRM197(裂解的或仍与HRP缀合的)在脑中被吸收。
实施例
方法和材料
1.1细胞培养
1.1.1牛脑毛细血管的分离
脑毛细血管分离自牛(小牛)脑，在屠宰场从刚杀死的动物中获得。将脑在冰冻的磷酸盐缓冲盐水(LPSS，1.1mM KH2PO4，5.6mMNa2HPO4及150mM NaCl，pH 7.4)中运至实验室。除去脑膜和白质并将灰质收集在补加了10％(v/v)热失活的(56℃，30分钟)胎牛血清的Dulbecco′s Modified Eagle′s培养基(DMEM)中(DMEM+S)。DMEM是用高D-葡萄糖(4.5g/l)、NaHCO3(3.7g/l)和HEPES(25mM)配制的，含有额外的MEM非必需氨基酸，L-谷氨酰胺(2mM)，硫酸链霉素(0.1g/l)和青霉素G钠(100000U/l)。血管片段通过使用Wheaton匀浆仪人工匀浆，随后在150μm尼龙网上过滤而制备。将血管在37℃在于DMEM+S中在胶原酶CLS3(210U/ml)、胰蛋白酶TRL(91U/ml)和DNAse I(170U/ml，终浓度)中消化1小时，随后通过200μm尼龙网过滤。将脑毛细血管级分重悬于冷冻混合物(胎牛血清(FCS)与10％(v/v)DMSO)中并在-80℃贮存
1.1.2星形胶质细胞的分离
星形胶质细胞分离自新生的Wistar大鼠仔(Harlan B.V.，Zeist，TheNetherlands)。将分离的皮质片段化并在37℃与于DMEM(HEPES充分缓冲的(50mM)，无NaHCO3)中用0.016％(w/v)胰蛋白酶-EDTA(终浓度)在摇动的水浴中温育(80rpm，30分钟)。将悬浮液分别通过120和45μm尼龙网过滤。将细胞悬浮液在增湿孵箱(Napco ScientificCompany，Tualatin，OR，USA)中的250ml塑料组织培养瓶(GreinerB.V.，Alphen a/d Rijn，The Netherlands)中在37℃在空气与10％CO2的混和气体中在DMEM+S中培养3天。之后，将培养基每隔一天更换一次。在培养7天后，在摇动水浴(80rpm)中在室温摇动培养物过夜以除去除了星形胶质细胞之外的其它细胞。2天后，将培养物与0.05％(w/v)胰蛋白酶-EDTA以1∶3的分离比率在聚-D-赖氨酸包被的培养瓶中传代(10μg/ml聚-D-赖氨酸溶液搅动过夜，在空气中干燥并用LPSS洗涤(3次))。当铺满时，每隔一天收集一次星形胶质细胞条件培养基(astrocyte conditioned medium)，共2-4周，灭菌过滤并在-20℃贮存。为了共培养，将2周的培养物传代并在液氮中以冷冻混合物贮存。
1.1.3脑毛细血管和BCEC培养物的差异接种(seeding)
将脑毛细血管接种在胶原(人胎盘IV型，于0.1％(v/v)乙酸中10μg/ml溶液中2小时并用LPSS洗涤3次)和人血浆纤连蛋白(于LPSS中10μg/ml溶液，30分钟)包被的250ml塑料组织培养瓶中并在孵箱中粘附4小时。之后，将培养基更换为生长培养基(具有50％(v/v)星形胶质细胞条件培养基的DMEM+S，补加了125μg/ml肝素)并将过度生长的细胞、占优势的BCEC和一些周细胞在37℃在10％CO2中培养。
1.1.4BBB在滤膜上的体外制备
体外BBB模型在胶原包被的(如上述)Transwell聚碳酸酯滤膜上制备(表面积：0.33cm2，孔大小：0.4μm，Coming Costar，Cambridge，MA，USA)。在大约70％铺满时(脑毛细血管接种后第4或5天)，将BCEC对内皮细胞用胰蛋白酶-EDTA传代(500BAEE单位猪胰蛋白酶和180μg EDTA/ml)大约1分钟，剩下仍与基质粘附的大部分周细胞。BCEC和星形胶质细胞共培养物是用接种在滤膜底部的星形胶质细胞制备的，密度为45000个星形胶质细胞/滤膜。使星形胶质细胞粘附于滤膜底部8分钟、2或3天，之后传代BCEC。BCEC以30000BCEC/滤膜的密度接种。将BCEC+星形胶质细胞共培养物在前两天在补加了125μg/ml肝素的DMEM+S中及在最后两天在DMEM+S中共培养成为紧密的单层。由此培养BCEC单层，但向培养基中加入50％(v/v)星形胶质细胞条件培养基。
1.2Affymetrix基因表达分析
1.2.1总RNA的分离
在BCEC+星形胶质细胞共培养物的情况中，先除去星形胶质细胞，然后通过刮Transwell滤膜的基底外侧而分离BCEC RNA。总RNA分离自BCEC(含有＜5％周细胞(Gaillard et al.，2001，如前))，使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行。为此，除去细胞-培养基并更换为40μl/Transwell滤膜的裂解缓冲液。随后，将裂解物重悬并从多个(12-18)Transwell滤膜中收集，随后根据厂商推荐的程序从动物细胞中分离总RNA。使用QIA粉碎机匀浆细胞裂解物。当需要时，将总RNA用乙酸钠和乙醇浓缩。
1.2.2标记RNA的制备
随后根据厂商推荐方案进行从总RNA中制备生物素酰化的cRNA以进行Affymetrix基因表达分析，如AffymetrixExpression Analysis Manual(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)所述。简而言之，将6-16μg/样品的总RNA用于双链cDNA合成，使用Gibco BRL Superscript Choice System(Life Technologies，Rockville，MD，USA)进行。使用T7-dT24引物和Superscript II逆转录酶(Life Technologies，Rockville，MD，USA)进行第一条链合成。第二条链合成涉及大肠杆菌DNA聚合酶I(Life Technologies，Rockville，MD，USA)。然后将双链cDNA使用酚/氯仿提取(利用锁相凝胶(phaselock gel)(Eppendorf AG，Hamburg，Germany))随后通过乙酸铵和乙醇沉淀而纯化。生物素酰化的cRNA通过从cDNA体外转录而合成，使用BioArray HighYield RNA转录标记试剂盒(Enzo Diagnostics，Farmingdale，NY，USA)在37℃温育5小时而进行。然后将标记的cRNA使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)的RNA cleanup方案进行纯化。随后，将15-20μg标记的cRNA通过在94℃在片段化缓冲液(40mM Tris-乙酸(pH8.1)、125mM KOAc、30mM MgOAc)中加热35分钟而片段化。
1.2.3杂交
将标记的和片段化的cRNA与HG-U95Av2和HG-U133A阵列(Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)在厂商推荐的条件下杂交。将cRNA首先与Test2Chip(Affymetrix)杂交，以保证制品的质量。简而言之，将cRNA在杂交混合物(1×MES杂交缓冲液，100μg/ml鲱精(herringsperm)、50μg/ml乙酰化的BSA、对照寡核苷酸B2和真核杂交对照物)中稀释，变性，然后在45℃以60rpm杂交16小时。杂交后，洗涤阵列并用链霉抗生物素-藻红蛋白染色，使用AffymetrixFluidicsStation 400进行。阵列上的荧光信号使用Hewlett-Packard Affymetrix扫描仪测定。
实施例1：
“脂多糖敏感基因”的鉴别、在BCEC-ACM单层和BCEC-星形胶质细胞共培养物中及之间的差异表达
在早期的实验中(如Gaillard(2000a，如前)所详述，在此并入参考)，我们发现星形胶质细胞和炎症过程(通过脂多糖LPS模拟)在BBB的动态共培养模型中显示相反的作用。简而言之，星形胶质细胞增加屏障的功能性，而LPS降低屏障的功能性。另外，星形胶质细胞致使从LPS中发生恢复过程，这在无星形胶质细胞物理存在时(即在BCEC-ACM单层中)观测不到。最后，这个恢复过程依赖于蛋白质合成，这表明涉及特异性基因转录。在图2中，这个实验方法以图示详细描述。
为进行涉及的LPSS基因及其参与恢复过程的鉴别，针对从牛脑种原代分离的脑毛细血管中培养的BCEC，使用四种不同的细胞培养条件(如Gaillard et al.，2001，如前所详述，在此并入参考并在“1.1细胞培养”中简要加以了描述)：1)将滤膜上BCEC单层插入50％ACM中(图1a：BCEC-ACM)；2)将滤膜上BCEC单层插入50％ACM中，顶面暴露于1μg/ml LPS(血清型055：B5)2小时；3)将滤膜上BCEC单层与在滤膜插入物底部培养的原代分离的新生大鼠脑星形胶质细胞一起插入(图1b：BCEC-星形胶质细胞)；4)将滤膜上BCEC单层与在滤膜插入物的底部培养的原代分离的新生大鼠脑星形胶质细胞一起插入，顶面暴露于1μg/ml LPS(血清型055：B5)2小时。将LPS处理的BCEC(条件2和4)与在未处理的BCEC(条件1和3)中发现的结果相对比。
在暴露于LPS中2小时后，BBB功能性通过TEER穿过滤膜而确定，使用具有电流经过的和电压测定电极的电阻系统(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)进行。TEER(Ohm.cm2)从输出装置屏幕上显示的电阻中减去无细胞的胶原包被的滤膜的电阻而计算，并根据滤膜的表面积校准。穿过在底部仅有星形胶质细胞的胶原包被的滤膜的TEER接近为0(Gaillard et al.，2001，如前)。
穿过BCEC-ACM单层的平均TEER为29.3+/-2.1 Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝12)，之后暴露于LPS并在暴露于LPS中2小时后降低为21.2+/-4.2 Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝18)。见图3a的结果图示。根据不成对的t-试验(p＞0.05)，不能认为TEER中的这种降低是显著的。相应地，当与未处理的BCEC-ACM单层对比时，TEER降低为72.4+/-14.3％(平均值+/-标准差，n＝18)(见图3b的示意图)。
穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的平均TEER为149.8+/-5.4Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝18)，之后暴露于LPS并在暴露于LPS中2小时后降低为65.5+/-2.1 Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝18)。见图4a的结果图示。TEER中的这种降低根据未成对的t-试验(p＜0.0001)可以可认为是非常显著的。相应地，当与未处理的BCEC-星形胶质细胞共培养物对比时，TEER降低为43.7+/-1.4％(平均值+/-标准差，n＝18)(见图4b的图示)。
对于所有试验条件(BCEC-ACM单层+/-LPS及BCEC-星形胶质细胞共培养物+/-LPS)，RNA分离、cRNA的标记及杂交方案均以一式三份进行，所有样品均在HG-U95Av2和HG-U133A阵列上分析。使用Affymetrix Microarray Suite 5.0和Affymetrix Data Mining Tool 2.0初步分析已获得的强度数据。使用Microsoft Excel(Microsoft，USA)进一步分析。进行其中每个芯片的数据被比例化(scaled)为使用者限定的靶强度的整体比例(global scaling)，以使得试验可对比。在所有样品中通过Affymetrix Microarray Suite 5.0认为“不存在(absent)”的基因在进一步的分析中被排除。当可应用时，只对在所有三个“一式三份”样品中“存在(present)”或“边缘性存在(marginally present)”的基因进行进一步分析。进行Mann-Whitney试验以鉴别统计学显著性地差异表达的基因(在对照BCEC-ACM单层与LPS-处理的BCEC-ACM单层之间；在对照BCEC-星形胶质细胞共培养物与LPS处理的BCEC-星形胶质细胞共培养物之间；在LPS处理的BCEC-ACM单层与LPS处理的BCEC-星形胶质细胞共培养物之间)。当p值＜0.05时认为差异是统计学显著的。另外，对于BCEC-ACM单层与BCEC-星形胶质细胞共培养物之间LPS的作用，基于平均强度值计算倍数改变(只有2倍或更高倍数的改变认为是生物学相关的)。
鉴别的基因在此称为“脂多糖敏感性(LPSS)”基因，因此加以编码(LPSS01-LPSS25)并示于表1。本发明还包括LPSS基因的SEQ IDNO号、LPS作用(上调、下调、差异表达(dif+或dif-))、在公众易获得的数据库的参考登记号(RefSeq)、基因符号及描述(名称或基因名称)。对于每个鉴别的LPSS基因，特异的结果示于表2。
实施例2
BCEC-星形胶质细胞共培养物中LPSS14(DTR)的定性
对于血脑屏障上LPSS14(DTR)的定性，将从小牛脑部原代分离的脑毛细血管培养的BCEC在滤膜插入物上用作单层，该滤膜插入物的底部上具有培养的原代分离的新生大鼠脑星形胶质细胞(图1b：BCEC-星形胶质细胞，如Gaillard et al.，2001，如前所详述，在此并入参考并在“1.1细胞培养”中简要描述)。我们使用：1)在滤膜的顶面(血管侧)上暴露于不同浓度(1ng/ml直至10μg/ml)DT的BCEC(结果示于图5)；2)与1相同，但随后DT暴露于滤膜的基底外侧部(脑侧)(结果示于图6)；3)暴露于100ng/ml DT的与不同浓度可溶HB-EGF(0.1-10μg/ml)预温育的BCEC，通过结合DT的受体结合结构域而发挥DTR非竞争性拮抗剂的作用，之后暴露于滤膜的顶面(结果示于图7)；4)BCEC与5μg/ml用CRM197预处理1小时，通过结合DT的受体结合结构域而发挥DTR的竞争性拮抗剂作用，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(结果示于图8)。
在暴露于DT后，每个小时使用具有电流通过和电压测定电极的电阻系统(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通过穿过滤膜的TEER而评定BBB的功能性。TEER(Ohm.cm2)是从输出装置屏幕上展示的电阻中减去无细胞的胶原包被滤膜的电阻而计算并根据滤膜的表面积而校准。穿过在底部仅有星形胶质细胞的胶原包被滤膜的TEER接近为0(Gaillard et al.，2001，如前)。对TEER的作用针对对照处理的滤膜而标准化并如此表示。
在顶面暴露于1ng/ml直至10μg/ml的DT之后，穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的TEER以浓度和时间依赖性方式降低，而低如1ng/ml的浓度在过夜温育之后是毒性的(图5)。这些结果表明DT在顶面由BCEC有效地吸收，其中其可以发挥其毒性作用。
在基底外侧暴露于25ng/ml直至1000ng/ml的DT之后，穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的TEER以浓度和时间依赖性方式降低，而当与等摩尔的顶面浓度或数量的DT对比时，这些作用大约提前1小时发生(图6)。这些结果表明当与顶面暴露对比时，DT更有效地由BCEC从基底外侧部位吸收。
在顶面暴露于与可溶HB-EGF预温育的100ng/ml DT之后，DT对BCEC-星形胶质细胞共培养物的毒性作用以浓度依赖性方式降低(图7)。事实上，100ng/ml DT与10μg/ml可溶HB-EGF的预温育完全阻止了DT诱导的对BCEC的毒性作用，甚至在过夜后评价也如此。这些结果表明BCEC中DT吸收通过先前DT与其可溶受体的特异性结合而被有效地阻断，使其在BCEC内不能发挥其毒性作用。
在BCEC与CRM197预温育之后，对BCEC-星形胶质细胞共培养物的毒性作用在顶面暴露于100ng/ml DT后降低(图8)。这些结果表明BCEC中DT吸收通过先前CRM197与DTR的特异性结合而被有效地拮抗，使DT在BCEC内部不太可能发挥其毒性作用。
实施例3
BCEC-星形胶质细胞共培养物中LPSS14(DTR)生物学活性的调节
为调节血脑屏障上LPSS14(DTR)的生物学活性，从牛脑中原代分离的脑毛细管培养的BCEC用作滤膜插入物上的单层，该滤膜插入物的底部具有原代分离的新生大鼠脑星形胶质细胞(图1b：BCEC-星形胶质细胞，如Gaillard et al.，2001，如前所详述，在此并入参考并在“1.1细胞培养”中简要描述)。我们使用：1)用肝素(125μg/ml)预处理1小时的BCEC，通过在DT的受体结合结构域中导入一个构象改变而在DTR发挥DT结合增强子的作用，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(结果示于图9)；2)BCEC顶面暴露于1μg/ml LPS(血清型055：B5)2小时，从而增加DTR的表达水平，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(结果示于图10)；3)BCEC顶面暴露于10μmol的BB94(batimastat)1小时，发挥参与胞外域脱落过程的MMP’s的抑制剂的作用，从而增加细胞膜上DTR有效性，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(结果示于图10)；4)LPS(2)与BB94(3)组合，从而增加细胞膜上DTR的表达水平和有效性，之后BCEC暴露于100ng/ml DT(结果示于图10)。
在暴露于DT后，使用具有电流经过和电压测定电极的电阻系统(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通过穿过滤膜的TEER每小时评定一次BBB功能性。TEER(Ohm.cm2)从输出装置屏幕上显示的电阻减去无细胞的胶原包被滤膜的电阻而计算并针对滤膜表面积而校准。穿过在底部仅有星形胶质细胞的胶原包被滤膜的TEER接近为0(Gaillard et al.，2001，如前)。对TEER的作用针对对照处理的滤膜而标准化并如此表示。
在BCEC与肝素预温育后，在顶部暴露于100ng/ml DT后对BCEC-星形胶质细胞共培养物的毒性作用以所述作用比未处理的对照组提前大约1小时发生的方式增加(图9)，这与在使用10倍高的DT浓度后测定的毒性水平一致。这些结果表明BCEC中DT吸收通过肝素而有效地增加。
在BCEC与LPS或BB94预温育后，在顶面暴露于100ng/ml DT之后对BCEC-星形胶质细胞共培养物的毒性作用以所述作用比未处理对照组更快速发生的方式中等程度地增加(图10)。另外，当BCEC与LPS和BB94一起预温育时，在顶面暴露于100ng/ml DT之后对BCEC-星形胶质细胞共培养物的毒性作用以所述作用比未处理对照组及单独处理的BCEC中更快速发生的方式增加(图10)。这些结果表明BCEC中DT吸收通过LPS(可能由于增加的DTR表达所致)和BB94(可能由于通过抑制的胞外域脱落而增加的DTR有效性所致)而有效地增加，并且这些是加性效应。
实施例4
通过LPSS14(DTR)靶向于血脑屏障的药物：体外吸收研究
为评定通过LPSS14(DTR)血脑屏障药物靶向能力，从牛脑中原代分离的脑毛细血管培养的BCEC在96孔平板中用作单层(如Gaillard etal.，2001，如前所详述，在此并入参考并在“1.1细胞培养”中简要描述)。我们使用：1)与辣根过氧化物酶(HRP，40kDa的酶)以10∶1重量/重量比率缀合的蛋白质(CRM197、BSA和全运铁蛋白(TrF))(图11)；及2)与HRP以10∶1重量/重量比率缀合的CRM197及与10μg/ml可溶HB-EGF预温育(室温1小时)的HRP以10∶1重量/重量比率缀合的CRM197，通过与CRM197的受体结合结构域结合而发挥DTR介导的吸收的非竞争性拮抗剂作用(图12)；及3)在37℃和4℃HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体以确定主动吸收(图14)。为进行4℃的实验，将BCEC在冰箱中冷却1小时，之后开始吸收实验。在这个特异性实验中，BCEC在完全hepes缓冲的DMEM+S中生长最后2天；及4)HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体及HRP荷载BSA包被的PEG脂质体，以确定特异性吸收(图15)；5)HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体及BCEC上HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体，用50μg/ml游离的CRM197预处理1小时，通过与CRM197包被的PEG脂质体的受体结合结构域结合而发挥DTR的竞争性拮抗剂作用(图16)。
根据厂商指导利用HRP缀合试剂盒将蛋白质与HRP缀合(AlphaDiagnostic International，San Antonio，TX，USA)。另外，缀合的蛋白质在充满Sephacryl S-200HR基质的HiPrep 16/60柱上进一步纯化(Amersham Biosciences，UK)。
脂质体(100nm)基本如Mastrobattista et al.(1999，Biochim.Biophys.Acta.1419：353-363)所述制备并由2∶1比率的EPC-35和胆固醇组成，具有2.5％PEG2000-DSPE和2.5％PEG2000-马来酰亚胺-PE，与大约3-60CRM197蛋白质/脂质体缀合。简而言之，在有机溶剂蒸发后，将脂质膜重悬于含有0.3mg HRP/μmol PL的HBS pH6.5中，脂质体通过一系列滤膜(200-50nm)而挤压(extrude)3-5次。使用SATA用硫醇基修饰CRM197，根据Bloemen等所述进行(1995，FEBS Lett.357：140-144)。将CRM197与SATA(1∶8摩尔比率)在持续摇动下室温温育1小时。游离的SATA通过30kDa截断(cutoff)滤膜(Vivaspin)离心而除去。就在与PEG2000-马来酰亚胺-PE偶联之前，将硫醇基通过与0.1M羟胺(pH 7.4)在室温温育45分钟而激活(去保护)。硫醇基的量和稳定性用Ellman′s试剂确定(Ellman，1959，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77)。HRP预荷载脂质体用CRM197缀合的PEG2000包被，根据插入后方法进行(Iden et al.，2001，Biochim Biophys Acta.1513(2)：207-216)。简而言之，将2.5％CRM197缀合的PEG2000-马来酰亚胺-PE与2.5％PEG2000-DSPE的微团(micelle)在40℃的2小时温育期间移至预形成的HRP荷载脂质体中，之后在Sephadex CL4B柱上分离，随后使用超速离心法浓缩(60.000g，30分钟，10℃)。为进行特异性实验(如每个实施例所示)，在上述方案中将CRM197用BSA代替作为对照脂质体。在制备之后，磷脂含量根据Fiske和Subarrow所述确定，蛋白质含量使用Biorad蛋白质分析(对Bradford的修改方法)确定。CRM197包被的PEG脂质体含有3.3蛋白质/脂质体，而BSA包被的PEG脂质体含有26.9蛋白质/脂质体。另外，大小(对CRM197包被的PEG脂质体而言是112nm，对BSA包被的PEG脂质体而言是104nm)和多分散性(对CRM197包被的PEG脂质体而言是0.21，对BSA包被的PEG脂质体而言是0.08)使用Malvern 4700系统(Malvern Ltd.Malvern，UK)通过动态光散射确定。Zeta电势(对CRM197包被的PEG脂质体而言是-18.6+/-0.7，对BSA包被的PEG脂质体而言是-25.2+/-11.2)使用Malvern3000 HSa zetasizer(Malvern Ltd.Malvern，UK)确定。
缀合的蛋白质的HRP活性、脂质体及细胞裂解物样品中的HRP含量使用具有适当的校准曲线的标准比色测定而检测。细胞和脂质体(在用冷却的PBS彻底洗涤后)通过40μl的0.1％脱氧胆酸钠水溶液裂解。
在BCEC与相应于5μg/ml未缀合的HRP的HRP缀合蛋白质温育之后，CRM197-HRP缀合物当与BSA-和运铁蛋白-HRP缀合物对比时优选由BCEC吸收(图11)。这些结果表明与40kDa物质缀合的CRM197由BCEC特异性吸收。
在BCEC与用10μg/ml可溶HB-EGF预温育的CRM197-HRP-缀合物(相应于5μg/ml未缀合HRP)温育后，CRM197-HRP缀合物的特异性吸收与BSA-HRP-缀合物的特异性吸收相对比被完全抑制(图12)。这些结果表明与40kDa物质缀合的CRM197通过DTR介导的吸收过程而由BCEC特异性吸收。
在BCEC与相应于5μg/ml游离HRP浓度的HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体温育后，当与在4℃的吸收相对比时，在37℃HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体由BCEC主动吸收(图14)，当与HRP荷载BSA包被的PEG脂质体的吸收对比时是特异性的(图15)，及当与用50μg/ml游离CRM197预处理1小时的BCEC吸收的HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体的吸收量对比时是由DTR特异性介导的(图16)。总之，这些结果表明CRM197包被的PEG脂质体在BCEC是由DTR主动及特异性吸收的。
实施例5
通过LPSS14(DTR)靶向穿过血脑屏障的药物：体外胞吞转运研究
为评定经LPSS14(DTR)通过胞吞转运靶向血脑屏障的药物的能力，从牛脑中原代分离的脑毛细血管培养的BCEC在滤膜插入物上用作单层，该滤膜底部有培养的原代分离的新生大鼠脑星形胶质细胞(图1b：BCEC-星形胶质细胞，如Gaillard et al.，2001，如前所详述，在此并入参考并在“1.1细胞培养”中简要描述)。为进行这个实施例中描述的胞吞转运实验，在前2或3天，将细胞用312.5μM8-(4-chlorophenylthio(CPT))-cAMP，和17.5μM RO-20-1724在完全hepes缓冲的DMEM+S中处理以显著增加BCEC-星形胶质细胞共培养物的紧密度(即降低细胞旁泄漏(paracellular leakiness))。我们使用：1)作为靶向部分的CRM197及作为对照蛋白的BSA与辣根过氧化物酶(HRP，一种40kDa的酶)以2∶1重量/重量比率缀合，在37℃和4℃进行，以确定主动和特异性胞吞转运作用(图13)。为进行4℃实验，将滤膜在冰箱中冷却1小时之后开始转运实验；2)HRP荷载CRM197包被的PEG脂质体和HRP荷载BSA包被的PEG脂质体以确定特异性胞吞转运作用(图17)。
BBB功能性使用具有电流经过和电压测定电极的电阻系统(ERS)(Millicell-ERS，Millipore Corporation，Bedford，MA，USA)通过穿过滤膜的TEER评定。TEER(Ohm.cm2)是从输出装置屏幕上显示的电阻减去无细胞的胶原包被滤膜的电阻而计算，并根据滤膜表面积而校准。穿过仅在底部具有星形胶质细胞的胶原包被滤膜的TEER接近为0(Gaillard et al.，2001，如前)。
利用HRP缀合试剂盒(Alpha Diagnostic International，San Antonio，TX，USA)根据厂商指导将蛋白质与HRP缀合。另外，将缀合的蛋白质在充满Sephacryl S-200HR基质(Amersham Biosciences，UK)的HiPrep 16/60柱上进一步纯化。
脂质体(100nm)基本根据Mastrobattista等(1999，Biochim.Biophys.Acta.1419：353-363)所述制备，由2∶1比率的EPC-35和胆固醇组成，具有2.5％PEG2000-DSPE和2.5％PEG2000-马来酰亚胺-PE，与大约3-60CRM197蛋白质/脂质体缀合。简而言之，在有机溶剂蒸发后，将脂质膜重悬于含有0.3mg HRP/μmol PL的HBS pH 6.5中，并将脂质体通过一系列滤膜(200-50nm)挤压3-5次。根据Bloemen等(1995，FEBS Lett.357：140-144)所述将CRM197使用SATA用硫醇基修饰。将CRM197和SATA(1∶8摩尔比率)在持续摇动下在室温温育1小时。游离的SATA在30kDa截断滤膜(Vivaspin)上通过离心除去。就在与PEG2000-马来酰亚胺-PE偶联之前，将硫醇基通过与0.1M羟胺(pH 7.4)在室温温育45分钟而激活(去保护)。硫醇基的量和稳定性用Ellman′s试剂(Ellman，1959，Arch.Biochem.Biophys.82：70-77)确定。将HRP预荷载的脂质体用CRM197缀合的PEG2000包被，根据插入后方法进行(Iden et al.，2001，Biochim Biophys Acta.1513(2)：207-216)。简而言之，将2.5％CRM197-缀合的PEG2000-马来酰亚胺-PE和2.5％PEG2000-DSPE微团在40℃的2小时温育期间移至预制的HRP荷载脂质体中，之后在Sephadex CL4B柱上分离，随后使用超速离心(60.000g，30分钟，10℃)浓缩。对于特异性实验(如每个实施例所示)，在进行上述方案时将CRM197以BSA代替作为对照脂质体。在制备后，磷脂含量根据Fiske和Subarrow所述确定，蛋白质含量用Biorad蛋白质分析(Bradford的修改方法)测定。CRM197包被的PEG脂质体含有3.3蛋白质/脂质体，BSA包被的PEG脂质体含有26.9蛋白质/脂质体。另外，大小(对于CRM197包被的PEG脂质体而言是112nm，对于BSA包被的PEG脂质体而言是104nm)和多分散性(对于CRM197包被的PEG脂质体而言是0.21，对于BSA包被的PEG脂质体而言是0.08)使用Malvern 4700系统(Malvern Ltd.Malvern，UK)通过动态光散射而确定。Zeta电势(对于CRM197包被的PEG脂质体而言是-18.6+/-0.7，对于BSA包被的PEG脂质体而言是-25.2+/-11.2)使用Malvern 3000 HSazetasizer(Malvern Ltd.Malvern，UK)确定。
将与CRM197或BSA缀合的HRP或者与CRM197或BSA缀合的HRP荷载PEG脂质体加入滤膜插入物的顶面，并将滤膜直接移至含有温的(对于HRP缀合的蛋白质而言是冷却的)250μl hepes缓冲的DMEM+S的新鲜孔中。每小时(共4小时)将这个步骤重复一次以防止HRP缀合的蛋白质或与CRM197或BSA缀合的HRP荷载PEG脂质体在BCEC的近腔室侧可能发生的再次胞吞。胞吞转运的HRP进入基底外侧区室的累积HRP活性使用具有适当的校准曲线的标准比色测定检测。
穿过BCEC-星形胶质细胞共培养物的平均TEER在用8-4-CPT-cAMP和RO-20-1724处理后从149.8+/-5.4 Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝18)增加至834+/-77 Ohm.cm2(平均值+/-标准差，n＝24)。DT敏感性在未处理的细胞和处理的单细胞之间观测到无差异(数据未示出)。
在BCEC与相应于5μg/ml未缀合HRP浓度的HRP缀合蛋白质温育后，CRM197-HRP缀合物当与BSA-HRP缀合物相对比时优先穿过BCEC而胞吞转运(图13)。在4℃，CRM197-HRP缀合物的转运水平与在37℃和4℃的BSA-HRP缀合物相同(图13)。这些结果表明CRM197即使当与40kDa蛋白质物质缀合时也特异性及主动胞吞转运穿过血脑屏障。
在BCEC与相应于5μg/ml游离HRP浓度的与CRM197或BSA缀合的HRP荷载PEG脂质体温育时，CRM197包被的PEG脂质体当与BSA包被的PEG脂质体相对比时优先胞吞转运穿过BCEC(图17)。这些结果表明CRM197即使当与大约100nm的脂质体缀合时也能特异性输送其40kDa蛋白质物质穿过血脑屏障。
实施例6
经LPSS14(DTR)靶向穿过血脑屏障的药物：
在豚鼠中进行的体内脑分布研究
在幼雄性豚鼠(Dunkin-Hartley HsdPoc：HD，250-300g)中与HRP缀合(2∶1重量/重量比率)的CRM197或全运铁蛋白(TrF)的脑部吸收在颈动脉内大丸剂注射所述缀合物(相应于0.5ml未缀合HRP的盐水中500μg/ml浓度)之后1.5小时进行确定，并与等浓度的游离HRP进行对比。利用HRP缀合试剂盒(Alpha Diagnostic International，San Antonio，TX，USA)根据厂商指导将蛋白质与HRP缀合。另外，缀合的蛋白质在充满Sephacryl S-200HR基质(Amersham Biosciences，UK)的HiPrep16/60柱上进一步纯化。简而言之，将动物在空气/氧混合物(2∶1)中用异氟烷吸入麻醉(4％诱导，1-1.5％保持)。将一个插管置于颈动脉中以收集血样和给药。在注射蛋白质之后1.5小时，将动物用4％异氟烷(1-2分钟)深度麻醉，随后通过颈动脉用盐水灌注(＜5分钟)整个动物(包括脑)，以清除血管中血液。之后将动物断头并从颅骨中取出脑以进一步分析。只使用清除全部血液的脑(基于对脑进行目测)进行进一步分析。
切下灌注的脑皮质(及一个未灌注的对照脑)并称重。之后，将皮质片段匀浆并将一半体积的匀浆通过120μm尼龙网过滤。另外，除了全部的匀浆之外，过滤物(含有血管结构)和洗脱物(含有脑实质细胞)均用于分析胞吞转运的HRP进入三个脑皮质样品(即全部的匀浆(图18中称为“匀浆”)、脑实质(图18中称为“实质”)及脑血管(图18中称为“毛细血管”))的HRP活性。组织/细胞用0.1％脱氧胆酸钠水溶液(终浓度)裂解，之后使用标准比色测定方法通过适当的校准曲线检测旋转后的匀浆的清澈上清中HRP活性，并根据上清的稀释度和蛋白质含量校准。
切下灌注的脑(及一个未灌注的对照脑(即未注射HRP或HRP缀合物))的大约0.5cm中央横切面(central cross-section)(耳至耳)，直接在异戊烷中速冻并在-80℃贮存直至使用。将组织切片在恒冷切片机上切成14μm的冷冻切片。将一些切片通风固定，HRP(或者在未灌注的对照脑的情况中的内源过氧化物酶)活性通过TMB(过氧化物酶底物试剂盒TMB，Vector Laboratories)直接染色30分钟，在去离子水(demi water)中洗涤5分钟，及在一系列乙醇和二甲苯中脱水(90％乙醇2×1分钟；100％乙醇2×1分钟；二甲苯2×1分钟)最后包埋于Entellan(Merck)中。其它切片在4％多聚甲醛中固定(15分钟)，脑中CRM197分布用小鼠抗白喉毒素1∶10(OBT0746，ImmunologicalsDirect.com)及二级HRP-山羊抗小鼠抗体1∶250(Jackson Immunoresearch)通过对白喉毒素的免疫组织化学染色。这个初级抗体在斑点印迹实验中在纯蛋白质样品及在CRM197-HRP缀合的匀浆样品中均能选择性染色CRM197以及CRM197-HRP缀合物(数据未示出)。内源过氧化物酶被阻断(在PBS中用0.3％H2O2及0.1％NaN320分钟)，非特异性染色通过5％正常山羊血清而阻止。二级抗体的HRP活性通过TMB(过氧化物酶底物试剂盒TMB，Vector Laboratories)染色10分钟，在demi水中洗涤5分钟，并在系列乙醇和二甲苯脱水(90％乙醇2×1分钟；100％乙醇2×1分钟；二甲苯2×1分钟)，最后包埋于Entellan(Merck)中。不进行复染。
在豚鼠注射HRP缀合的CRM197和TrF(均相应于500μg/ml未缀合的HRP浓度)以及等浓度的游离HRP之后1.5小时，仅在CRM197-HRP缀合物注射的动物的所有三个脑皮质匀浆样品(即全部的匀浆(图18中称为“匀浆”)、脑实质(图18中称为“实质”)及脑血管(图18中称为“毛细血管”))中观测到HRP活性(图18)。这个分析包括来自三个动物的数据，基于脑中血液的完全不存在(这在如下述冷冻切片中也被证实)。TrF-HRP缀合物注射的动物以及游离HRP注射的动物的所有样品中HRP活性水平低于检测限度(这两组n＝2，基于脑中血液完全不存在(这在如下述冷冻切片中也被证实)而选择)。这些结果表明与40kDa物质(即HRP)缀合的CRM197在脑皮质中被特异性吸收，游离的HRP及与TrF缀合的HRP则否。不幸地，注射的HRP缀合物和游离HRP的血浆动力学基于HRP的标准比色测定方法不能确定，这是由于血液中存在高水平的内源性过氧化物酶所致，在对照组(即0.5μl盐水)注射的动物中也随着时间而改变(可能由于注射的盐水体积所致轻度和短暂溶血所致，在所有动物中均观测到)。因此，未能计算CRM197-HRP缀合物的脑皮质分布体积。
在未灌注的对照脑的冷冻切片直接针对内源过氧化物酶活性由TMB直接染色之后，在遍布整个切片观测到血管特有的独特和强染色模式。这个模式的典型实例示于图19中A组。从图19中B组可以意识到，通过颈动脉灌注盐水的程序能完全除去这种内源过氧化物酶活性。这些结果表明血液中确实存在妨碍内源性过氧化物酶，这在血浆样品中已经用针对HRP的标准比色测定方法观测到。游离HRP注射的动物的充分灌注的脑的TMB染色的冷冻切片示出与充分灌注的对照脑一样，无可见的染色(图19，C和D组示出两个不同动物的代表性照片)。然而，CRM197-HRP缀合物注射的动物的充分灌注的脑的TMB染色的冷冻切片示出与小血管相关的特征性染色模式(图19，E和F组示出代表性照片(E和F来自相同的动物))。另外，在这些动物中观测到遍布整个切片的一些穿过血管渗出的(即转运的)HRP特有的独特的染色区域(图19，F、G和H组示出三个不同动物的代表性照片)。相反，TrF-HRP缀合物注射的动物的充分灌注的脑的TMB染色的冷冻切片示出少许(如果存在的话)非常微弱的与小血管相关的染色模式(图19，I和J及K和L组示出两个不同动物的两张代表性照片)。总之，这些结果与得自脑皮质匀浆的数据一致，再一次表明与40kDa物质(即HRP)缀合的CRM197在脑皮质中被特异性吸收，游离HRP及与TrF缀合的HRP则否。
其中脑中CRM197分布用小鼠抗白喉毒素通过对白喉毒素的免疫组织化学染色的冷冻切片示出遍布整个切片的微弱的均匀分布的模式(图20，A和D组示出来自相同动物的两张代表性照片的放大图)。这个染色模式在游离的HRP和TrF-HRP缀合物注射的动物中未观测到(图20，B和E组及C和F组分别示出来自相同动物的两张代表性照片的放大图)。总而言之，这些结果表明CRM197(裂解或仍与HRP缀合)在脑部被吸收。
当考虑到所有示出的方法及与关于DTR的现有技术领域可利用的方法组合时，提议如下将药物输送至并穿过血脑屏障的作用机制：在药物或脂质体缀合的载体蛋白(例如CRM197)的B结构域与白喉毒素受体特异性结合之后，该载体蛋白/药物复合物被胞吞。由于pH改变诱导的载体蛋白构象改变，因此载体蛋白/药物复合物的T结构域插入内体膜中，随后A结构域(包括药物复合物)易位至细胞溶胶中。此后，药物和载体蛋白(切割的或仍缀合的)被转运穿过血脑屏障。由于一部分内体可能在溶酶体中死亡，因此这个作用机制也用作将治疗剂输送至溶酶体的方式。在这种情况中，特别优选与酶(例如在患有溶酶体贮积病的患者中缺乏的酶)的缀合物。
表1：“脂多糖敏感性(LPSS)”基因、其SEQ ID NO号、LPS作用(表示为上调(up)、下调(down)、差异(dif+或dif-))、其登记号(RefSeq)、基因符号和描述(或基因名称)。
| LPSSNO. | SEQ IDNO. | LPS作用 | 登记号 | 基因符号 | 描述 |
| 01 | 1 | 上调 | NM 005746 | PBEF | 前B细胞集落增强因子 |
| 02 | 234 | 下调 | NM 001202 NM 130850 NM 130851 | BMP4 | 骨形态发生蛋白4 |
| 03 | 5 | 上调 | NM 006910 | RBBP6 | 成视网膜细胞瘤结合蛋白6 |
| 04 | 67891011 | 下调 | NM 172171 NM 172169 NM 172170 NM 001222 NM 172172 NM 172173 | CAMK2G | 钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaM激酶)II γ，同种型1-6 |
| 05 | 12 | 上调 | NM 023009 | MACMARCKS | 巨噬细胞豆蔻酰化富丙氨酸C激酶底物 |
| 06 | 13 | 上调 | NM 000428 | LTBP2 | 潜伏转化生长因子β结合蛋白2 |
| 07 | 14 | 上调 | NM 007115 | TNFAIP6 | 肿瘤坏死因子α诱导蛋白6 |
| 08 | 15 | 上调 | NM 014470 | RHO6 | GTP-结合蛋白RHO6 |
| 09 | 1617 | 上调 | NM 002597 NM 022576 | PDC | Phosducin同种型phosducin样蛋白Phosducin同种型phosducin-样orphan 1 |
| 10 | 18 | Dif- | NM 004343 | CALR | 钙网蛋白前体 |
| 11 | 19 | Dif+ | NM 025195 | C8FW | G-蛋白偶联受体诱导蛋白 |
| 12 | 20 | 下调 | NM 003467 | CXCR4 | 趋化因子(C-X-C基序)受体4 |
| 13 | 21 | 上调 | NM 00063 | GHR | 生长激素受体 |
| 14 | 22 | 上调 | NM 001945 | DTR | 白喉毒素受体(肝素结合表皮生长因子样生长因子) |
| 15 | 23 | Dif+ | NM 005084 | PLA2G7 | 磷脂酶A2，VII组(血小板活化因子乙酰水解酶，血浆) |
| 16 | 24 | Dif+ | NM 002970 | SAT | 亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶 |
| 17 | 25 | Dif+ | NM 003358 | UGCG | 神经酰胺葡糖基转移酶 |
表2：LPSS基因的LPS应答(全局规模强度平均值+/-标准偏差)
序列表
<110>to-BBB控股股份有限公司
<120>炎症状态下在血脑屏障中差异表达的核酸
<130>P206561EP
<140>P206561EP
<141>2001-02-11
<160>25
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>491
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Met Asn Pro Ala Ala Glu Ala Glu Phe Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp
1 5 10 15
Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys
20 25 30
Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys
35 40 45
Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr
50 55 60
Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys Val Val Thr Lys Glu Lys Ile
65 70 75 80
Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu His Phe Gln Asp Asp Val Phe
85 90 95
Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu
100 105 110
Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly
115 120 125
Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu
130 135 140
Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr
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Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu
165 170 175
Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp
180 185 190
Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala
195 200 205
Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu
210 215 220
Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr
225 230 235 240
Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp
245 250 255
His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile Val Thr Gln Phe Ser Ser Val
260 265 270
Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu
275 280 285
Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr
290 295 300
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340 345 350
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Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp
405 410 415
Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu
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Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala
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Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala His His
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<211>408
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<213>Homo sapiens
<400>2
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
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<213>Homo sapiens
<400>7
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275 280 285
Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile
290 295 300
Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu
305 310 315 320
Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Pro Gln Ser Asn Asn Lys
325 330 335
Asn Ser Leu Val Ser Pro Ala Gln Glu Pro Ala Pro Leu Gln Thr Ala
340 345 350
Met Glu Pro Gln Thr Thr Val Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys
355 360 365
Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys
370 375 380
Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala
385 390 395 400
Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp Pro Gly
405 410 415
Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu Gly Met
420 425 430
Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn Ser Lys
435 440 445
Pro Ile His Thr Thr Ile Leu Asn Pro His Val His Val Ile Gly Glu
450 455 460
Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp Gly
465 470 475 480
Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser Gln Ser Glu Glu Thr Arg Val Trp His
485 490 495
Arg Arg Asp Gly Lys Trp Leu Asn Val His Tyr His Cys Ser Gly Ala
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Pro Ala Ala Pro Leu Gln
515
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<213>Homo sapiens
<400>9
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1 5 10 15
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Lys Lys Thr Ser Thr Gln Glu Tyr Ala Ala Lys Ile Ile Asn Thr Lys
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Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile
50 55 60
Cys Arg Leu Leu Lys His Pro Asn Ile Val Arg Leu His Asp Ser Ile
65 70 75 80
Ser Glu Glu Gly Phe His Tyr Leu Val Phe Asp Leu Val Thr Gly Gly
85 90 95
Glu Leu Phe Glu Asp Ile Val Ala Arg Glu Tyr Tyr Ser Glu Ala Asp
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Ala Ser Lys Cys Lys Gly Ala Ala Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu
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Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly
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Lys Pro Val Asp Ile Trp Ala Cys Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu
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225 230 235 240
Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn
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Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val
275 280 285
Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile
290 295 300
Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu
305 310 315 320
Leu Asn Lys Lys Ser Asp Gly Gly Val Lys Glu Pro Gln Thr Thr Val
325 330 335
Val His Asn Ala Thr Asp Gly Ile Lys Gly Ser Thr Glu Ser Cys Asn
340 345 350
Thr Thr Thr Glu Asp Glu Asp Leu Lys Val Arg Lys Gln Glu Ile Ile
355 360 365
Lys Ile Thr Glu Gln Leu Ile Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu
370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Asn Pro His Val His Val Ile Gly Glu Asp Ala Ala Cys Ile Ala Tyr
435 440 445
Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Ile Asp Gly Gln Gly Arg Pro Arg Thr Ser
450 455 460
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Asn Val His Tyr His Cys Ser Gly Ala Pro Ala Ala Pro Leu Gln
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<213>Homo sapiens
<400>10
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1 5 10 15
Phe Glu Glu Leu Gly Lys Gly Ala Phe Ser Val Val Arg Arg Cys Val
20 25 30
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35 40 45
Lys Leu Ser Ala Arg Asp His Gln Lys Leu Glu Arg Glu Ala Arg Ile
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65 70 75 80
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100 105 110
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Thr Pro Gly Tyr Leu Ser Pro Glu Val Leu Arg Lys Asp Pro Tyr Gly
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Val Thr Pro Glu Ala Lys Asn Leu Ile Asn Gln Met Leu Thr Ile Asn
245 250 255
Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val
260 265 270
Cys Gln Arg Ser Thr Val Ala Ser Met Met His Arg Gln Glu Thr Val
275 280 285
Glu Cys Leu Arg Lys Phe Asn Ala Arg Arg Lys Leu Lys Gly Ala Ile
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Leu Thr Thr Met Leu Val Ser Arg Asn Phe Ser Ala Ala Lys Ser Leu
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340 345 350
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Pro Ala Lys Arg Ile Thr Ala Asp Gln Ala Leu Lys His Pro Trp Val
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275 280 285
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Glu Ala Ile Asn Asn Gly Asp Phe Glu Ala Tyr Thr Lys Ile Cys Asp
385 390 395 400
Pro Gly Leu Thr Ser Phe Glu Pro Glu Ala Leu Gly Asn Leu Val Glu
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Gly Met Asp Phe His Lys Phe Tyr Phe Glu Asn Leu Leu Ser Lys Asn
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115 120 125
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
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Met Arg Pro Arg Thr Lys Ala Arg Ser Pro Gly Arg Ala Leu Arg Asn
1 5 10 15
Pro Trp Arg Gly Phe Leu Pro Leu Thr Leu Ala Leu Phe Val Gly Ala
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35 40 45
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165 170 175
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Pro Pro Cys Gln Asn Arg Gly Ser Cys Ser Arg Pro Gln Leu Cys Val
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Cys Arg Ser Gly Phe Arg Gly Ala Arg Cys Glu Glu Val Ile Pro Asp
210 215 220
Glu Glu Phe Asp Pro Gln Asn Ser Arg Leu Ala Pro Arg Arg Trp Ala
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Glu Arg Ser Pro Asn Leu Arg Arg Ser Ser Ala Ala Gly Glu Gly Thr
245 250 255
Leu Ala Arg Ala Gln Pro Pro Ala Pro Gln Ser Pro Pro Ala Pro Gln
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Ser Pro Pro Ala Gly Thr Leu Ser Gly Leu Ser Gln Thr His Pro Ser
275 280 285
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
Gln Pro Asp Arg Glu Pro Pro Gly Arg Gly Ser Arg Pro Arg Ala Leu
435 440 445
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450 455 460
Gln Leu Ala Ser Val Asn Pro Ser Leu Val Lys Val His Ile His His
465 470 475 480
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485 490 495
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Ser Arg Ser Arg Cys Val Ser Asp Lys Ala Ile Ser Met Leu Gln Gly
660 665 670
Leu Cys Tyr Arg Ser Leu Gly Pro Gly Thr Cys Thr Leu Pro Leu Ala
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Asp Leu Ala Cys Glu Asn Gly Glu Cys Val Asn Thr Glu Gly Ser
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Ala Arg Ile Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gly Val His Phe Arg Pro
1640 1645 1650
Gly Tyr Glu Tyr Gly Pro Gly Pro Asp Asp Leu His Tyr Ser Ile
1655 1660 1665
Tyr Gly Pro Asp Gly Ala Pro Phe Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Glu
1670 1675 1680
Asp Thr Val Pro Glu Pro Ala Phe Pro Asn Thr Ala Gly His Ser
1685 1690 1695
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1820
<210>14
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Met Ile Ile Leu Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Leu Trp Glu Asp Thr Gln
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Gly Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu
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Leu Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His
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130 135 140
Ile Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile
145 150 155 160
Cys Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gun Arg Ile His Leu Ser
165 170 175
Phe Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr
180 185 190
Val Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg
195 200 205
Tyr Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val
210 215 220
Met Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe
225 230 235 240
Gln Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Val Ser Lys Ser Ser Gln Gly
245 250 255
Lys Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Lys Asn Phe Leu Ala Gly
260 265 270
Arg Phe Ser His Leu
275
<210>15
<211>232
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
Met Lys Glu Arg Arg Ala Pro Gln Pro Val Val Ala Arg Cys Lys Leu
1 5 10 15
Val Leu Val Gly Asp Val Gln Cys Gly Lys Thr Ala Met Leu Gln Val
20 25 30
Leu Ala Lys Asp Cys Tyr Pro Glu Thr Tyr Val Pro Thr Val Phe Glu
35 40 45
Asn Tyr Thr Ala Cys Leu Glu Thr Glu Glu Gln Arg Val Glu Leu Ser
50 55 60
Leu Trp Asp Thr Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Asp Asn Val Arg Pro Leu
65 70 75 80
Cys Tyr Ser Asp Ser Asp Ala Val Leu Leu Cys Phe Asp Ile Ser Arg
85 90 95
Pro Glu Thr Val Asp Ser Ala Leu Lys Lys Trp Arg Thr Glu Ile Leu
100 105 110
Asp Tyr Cys Pro Ser Thr Arg Val Leu Leu Ile Gly Cys Lys Thr Asp
115 120 125
Leu Arg Thr Asp Leu Ser Thr Leu Met Glu Leu Ser His Gln Lys Gln
130 135 140
Ala Pro Ile Ser Tyr Glu Gln Gly Cys Ala Ile Ala Lys Gln Leu Gly
145 150 155 160
Ala Glu Ile Tyr Leu Glu Gly Ser Ala Phe Thr Ser Glu Lys Ser Ile
165 170 175
His Ser Ile Phe Arg Thr Ala Ser Met Leu Cys Leu Asn Lys Pro Ser
180 185 190
Pro Leu Pro Gln Lys Ser Pro Val Arg Ser Leu Ser Lys Arg Leu Leu
195 200 205
His Leu Pro Ser Arg Ser Glu Leu Ile Ser Ser Thr Phe Lys Lys Glu
210 215 220
Lys Ala Lys Ser Cys Ser Ile Met
225 230
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Met Pro Glu Ser Leu Asp Ser Pro Thr Ser Gly Arg Pro Gly Val Thr
1 5 10 15
Thr His Ser Thr Arg Thr Pro Gly Thr Glu Ile Gln Thr Ile Ile Ser
20 25 30
Asn Pro Val Pro Lys Met Glu Glu Ala Lys Ser Gln Ser Leu Glu Glu
35 40 45
Asp Phe Glu Gly Gln Ala Thr His Thr Gly Pro Lys Gly Val Ile Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ser Lys Lys Glu Ile Leu Arg Gln Met Ser Ser Pro Gln Ser Arg
85 90 95
Asn Gly Lys Asp Ser Lys Glu Arg Val Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln
100 105 110
Glu Tyr Glu Leu Ile His Lys Glu Lys Glu Asp Glu Asn Cys Leu Arg
115 120 125
Lys Tyr Arg Arg Gln Cys Met Gln Asp Met His Gln Lys Leu Ser Phe
130 135 140
Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu Leu Glu Thr Gly Lys Gln Phe
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Leu Glu Thr Ile Glu Lys Glu Leu Lys Ile Thr Thr Ile Val Val His
165 170 175
Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu
180 185 190
Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys
195 200 205
Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro
210 215 220
Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser
225 230 235 240
Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser
245 250 255
Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro Glu Arg Glu Val His Val Leu
260 265 270
Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp Val Glu
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
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1 5 10 15
Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln Glu Tyr Glu Leu Ile His Lys Glu Lys
20 25 30
Glu Asp Glu Asn Cys Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Gln Cys Met Gln Asp
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Met His Gln Lys Leu Ser Phe Gly Pro Arg Tyr Gly Phe Val Tyr Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Thr Thr Ile Val Val His Ile Tyr Glu Asp Gly Ile Lys Gly Cys
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Asp Ala Leu Asn Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ile
100 105 110
Val Lys Phe Cys Lys Ile Lys Ala Ser Asn Thr Gly Ala Gly Asp Arg
115 120 125
Phe Ser Leu Asp Val Leu Pro Thr Leu Leu Ile Tyr Lys Gly Gly Glu
130 135 140
Leu Ile Ser Asn Phe Ile Ser Val Ala Glu Gln Phe Ala Glu Glu Phe
145 150 155 160
Phe Ala Gly Asp Val Glu Ser Phe Leu Asn Glu Tyr Gly Leu Leu Pro
165 170 175
Glu Arg Glu Val His Val Leu Glu His Thr Lys Ile Glu Glu Glu Asp
180 185 190
Val Glu
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Met Leu Leu Ser Val Pro Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Leu Ala Val
1 5 10 15
Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly
20 25 30
Trp Thr Ser Arg Trp Ile Glu Ser Lys His Lys Ser Asp Phe Gly Lys
35 40 45
Phe Val Leu Ser Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Asp Glu Glu Lys Asp Lys
50 55 60
Gly Leu Gln Thr Ser Gln Asp Ala Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Ala Ser
65 70 75 80
Phe Glu Pro Phe Ser Asn Lys Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr
85 90 95
Val Lys His Glu Gln ASn Ile Asp Cys Gly Gly Gly Tyr Val Lys Leu
100 105 110
Phe Pro Asn Ser Leu Asp Gln Thr Asp Met His Gly Asp Ser Glu Tyr
115 120 125
Asn Ile Met Phe Gly Pro Asp Ile Cys Gly Pro Gly Thr Lys Lys Val
130 135 140
His Val Ile Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Asn Val Leu Ile Asn Lys Asp
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Ile Arg Cys Lys Asp Asp Glu Phe Thr His Leu Tyr Thr Leu Ile Val
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Arg Pro Asp Asn Thr Tyr Glu Val Lys Ile Asp Asn Ser Gln Val Glu
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Ser Gly Ser Leu Glu Asp Asp Trp Asp Phe Leu Pro Pro Lys Lys Ile
195 200 205
Lys Asp Pro Asp Ala Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Arg Ala Lys
210 215 220
Ile Asp Asp Pro Thr Asp Ser Lys Pro Glu Asp Trp Asp Lys Pro Glu
225 230 235 240
His Ile Pro Asp Pro Asp Ala Lys Lys Pro Glu Asp Trp Asp Glu Glu
245 250 255
Met Asp Gly Glu Trp Glu Pro Pro Val Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Lys
260 265 270
Gly Glu Trp Lys Pro Arg Gln Ile Asp Asn Pro Asp Tyr Lys Gly Thr
275 280 285
Trp Ile His Pro Glu Ile Asp Asn Pro Glu Tyr Ser Pro Asp Pro Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Val Lys Ser Gly Thr Ile Phe Asp Asn Phe Leu Ile Thr Asn Asp Glu
325 330 335
Ala Tyr Ala Glu Glu Phe Gly Asn Glu Thr Trp Gly Val Thr Lys Ala
340 345 350
Ala Glu Lys Gln Met Lys Asp Lys Gln Asp Glu Glu Gln Arg Leu Lys
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Asp Lys Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Ala Glu Asp
370 375 380
Lys Glu Asp Asp Glu Asp Lys Asp Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Asp
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Lys Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Val Pro Gly Gln Ala Lys Asp Glu
405 410 415
Leu
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Met Arg Val Gly Pro Val Arg Ser Ala Met Ser Gly Ala Ser Gln Pro
1 5 10 15
Arg Gly Pro Ala Leu Leu Phe Pro Ala Thr Arg Gly Val Pro Ala Lys
20 25 30
Arg Leu Leu Asp Ala Asp Asp Ala Ala Ala Val Ala Ala Lys Cys Pro
35 40 45
Arg Leu Ser Glu Cys Ser Ser Pro Pro Asp Tyr Leu Ser Pro Pro Gly
50 55 60
Ser Pro Cys Ser Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Gly Ser Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ile Ala Asp Tyr Leu Leu
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Leu Pro Leu Ala Glu Arg Glu His Val Ser Arg Ala Leu Cys Ile His
100 105 110
Thr Gly Arg Glu Leu Arg Cys Lys Val Phe Pro Ile Lys His Tyr Gln
115 120 125
Asp Lys Ile Arg Pro Tyr Ile Gln Leu Pro Ser His Ser Asn Ile Thr
130 135 140
Gly Ile Val Glu Val Ile Leu Gly Glu Thr Lys Ala Tyr Val Phe Phe
145 150 155 160
Glu Lys Asp Phe Gly Asp Met His Ser Tyr Val Arg Ser Arg Lys Arg
165 170 175
Leu Arg Glu Glu Glu Ala Ala Arg Leu Phe Lys Gln Ile Val Ser Ala
180 185 190
Val Ala His Cys His Gln Ser Ala Ile Val Leu Gly Asp Leu Lys Leu
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Arg Lys Phe Val Phe Ser Thr Glu Glu Arg Thr Gln Leu Arg Leu Glu
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Ser Leu Glu Asp Thr His Ile Met Lys Gly Glu Asp Asp Ala Leu Ser
225 230 235 240
Asp Lys His Gly Cys Pro Ala Tyr Val Ser Pro Glu Ile Leu Asn Thr
245 250 255
Thr Gly Thr Tyr Ser Gly Lys Ala Ala Asp Val Trp Ser Leu Gly Val
260 265 270
Met Leu Tyr Thr Leu Leu Val Gly Arg Tyr Pro Phe His Asp Ser Asp
275 280 285
Pro Ser Ala Leu Phe Ser Lys Ile Arg Arg Gly Gln Phe Cys Ile Pro
290 295 300
Glu His Ile Ser Pro Lys Ala Arg Cys Leu Ile Arg Ser Leu Leu Arg
305 310 315 320
Arg Glu Pro Ser Glu Arg Leu Thr Ala Pro Glu Ile Leu Leu His Pro
325 330 335
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340 345 350
Thr Ser Asp Gln Ile Val Pro Glu Tyr Gln Glu Asp Ser Asp Ile Ser
355 360 365
Ser Phe Phe Cys
370
<210>20
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Met Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met
1 5 10 15
Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu
20 25 30
Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile
35 40 45
Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly
50 55 60
Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu
65 70 75 80
Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val
85 90 95
Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val
100 105 110
His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala
115 120 125
Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser
130 135 140
Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val
145 150 155 160
Trp Ile Pro Ala Leu Leu Leu Thr Ile Pro Asp Phe Ile Phe Ala Asn
165 170 175
Val Ser Glu Ala Asp Asp Arg Tyr Ile Cys Asp Arg Phe Tyr Pro Asn
180 185 190
Asp Leu Trp Val Val Val Phe Gln Phe Gln His Ile Met Val Gly Leu
195 200 205
Ile Leu Pro Gly Ile Val Ile Leu Ser Cys Tyr Cys Ile Ile Ile Ser
210 215 220
Lys Leu Ser His Ser Lys Gly His Gln Lys Arg Lys Ala Leu Lys Thr
225 230 235 240
Thr Val Ile Leu Ile Leu Ala Phe Phe Ala Cys Trp Leu Pro Tyr Tyr
245 250 255
Ile Gly Ile Ser Ile Asp Ser Phe Ile Leu Leu Glu Ile Ile Lys Gln
260 265 270
Gly Cys Glu Phe Glu Asn Thr Val His Lys Trp Ile Ser Ile Thr Glu
275 280 285
Ala Leu Ala Phe Phe His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Leu Tyr Ala Phe
290 295 300
Leu Gly Ala Lys Phe Lys Thr Ser Ala Gln His Ala Leu Thr Ser Val
305 310 315 320
Ser Arg Gly Ser Ser Leu Lys Ile Leu Ser Lys Gly Lys Arg Gly Gly
325 330 335
His Ser Ser Val Ser Thr Glu Ser Glu Ser Ser Ser Phe His Ser Ser
340 345 350
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser
1 5 10 15
Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala
20 25 30
Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser
35 40 45
Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys
115 120 125
Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp
130 135 140
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Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu
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Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr
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Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp
195 200 205
Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys
210 215 220
Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln
245 250 255
Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile
260 265 270
Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser
275 280 285
Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro
290 295 300
Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu
305 310 315 320
Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe
325 330 335
His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu
340 345 350
Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser
355 360 365
Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser
370 375 380
Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn
385 390 395 400
Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg
405 410 415
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420 425 430
Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val
435 440 445
Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala
450 455 460
Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser
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Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala
485 490 495
Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser
500 505 5l0
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515 520 525
Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile
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Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu
545 550 555 560
Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala
565 570 575
Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val
580 585 590
Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile
595 600 605
Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser
610 615 620
Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro
625 630 635
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<211>208
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val
1 5 10 15
Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp
35 40 45
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
85 90 95
Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr
100 105 110
Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg
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Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
130 135 140
Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr
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Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu
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Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr
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Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His
195 200 205
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>23
Met Val Pro Pro Lys Leu His Val Leu Phe Cys Leu Cys Gly Cys Leu
1 5 10 15
Ala Val Val Tyr Pro Phe Asp Trp Gln Tyr Ile Asn Pro Val Ala His
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Met Lys Ser Ser Ala Trp Val Asn Lys Ile Gln Val Leu Met Ala Ala
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100 105 110
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Pro Leu Val Val Phe Ser His Gly Leu Gly Ala Phe Arg Thr Leu Tyr
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Ser Ala Ile Gly Ile Asp Leu Ala Ser His Gly Phe Ile Val Ala Ala
165 170 175
Val Glu His Arg Asp Arg Ser Ala Ser Ala Thr Tyr Tyr Phe Lys Asp
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Gln Ser Ala Ala Glu Ile Gly Asp Lys Ser Trp Leu Tyr Leu Arg Thr
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Leu Lys Gln Glu Glu Glu Thr His Ile Arg Asn Glu Gln Val Arg Gln
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Arg Ala Lys Glu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Leu Ile Leu Asp Ile Asp
225 230 235 240
His Gly Lys Pro Val Lys Asn Ala Leu Asp Leu Lys Phe Asp Met Glu
245 250 255
Gln Leu Lys Asp Ser Ile Asp Arg Glu Lys Ile Ala Val Ile Gly His
260 265 270
Ser Phe Gly Gly Ala Thr Val Ile Gln Thr Leu Ser Glu Asp Gln Arg
275 280 285
Phe Arg Cys Gly Ile Ala Leu Asp Ala Trp Met Phe Pro Leu Gly Asp
290 295 300
Glu Val Tyr Ser Arg Ile Pro Gln Pro Leu Phe Phe Ile Asn Ser Glu
305 310 315 320
Tyr Phe Gln Tyr Pro Ala Asn Ile Ile Lys Met Lys Lys Cys Tyr Ser
325 330 335
Pro Asp Lys Glu Arg Lys Met Ile Thr Ile Arg Gly Ser Val His Gln
340 345 350
Asn Phe Ala Asp Phe Thr Phe Ala Thr Gly Lys Ile Ile Gly His Met
355 360 365
Leu Lys Leu Lys Gly Asp Ile Asp Ser Asn Val Ala Ile Asp Leu Ser
370 375 380
Asn Lys Ala Ser Leu Ala Phe Leu Gln Lys His Leu Gly Leu His Lys
385 390 395 400
Asp Phe Asp Gln Trp Asp Cys Leu Ile Glu Gly Asp Asp Glu Asn Leu
405 410 415
Ile Pro Gly Thr Asn Ile Asn Thr Thr Asn Gln His Ile Met Leu Gln
420 425 430
Asn Ser Ser Gly Ile Glu Lys Tyr Asn
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<211>171
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
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1 5 10 15
Ile Leu Arg Leu Ile Lys Glu Leu Ala Lys Tyr Glu Tyr Met Glu Glu
20 25 30
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<213>Homo sapiens
<400>25
Met Ala Leu Leu Asp Leu Ala Leu Glu Gly Met Ala Val Phe Gly Phe
1 5 10 15
Val Leu Phe Leu Val Leu Trp Leu Met His Phe Met Ala Ile Ile Tyr
20 25 30
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35 40 45
Lys Leu Pro Gly Val Ser Leu Leu Lys Pro Leu Lys Gly Val Asp Pro
50 55 60
Asn Leu Ile Asn Asn Leu Glu Thr Phe Phe Glu Leu Asp Tyr Pro Lys
65 70 75 80
Tyr Glu Val Leu Leu Cys Val Gln Asp His Asp Asp Pro Ala Ile Asp
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Ser Gly Ile Arg Val Ile Pro Asp Thr Leu Thr Asp Met Val Asn Gln
145 150 155 160
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165 170 175
Arg Gln Gly Phe Ala Ala Thr Leu Glu Gln Val Tyr Phe Gly Thr Ser
180 185 190
His Pro Arg Tyr Tyr Ile Ser Ala Asn Val Thr Gly Phe Lys Cys Val
195 200 205
Thr Gly Met Ser Cys Leu Met Arg Lys Asp Val Leu Asp Gln Ala Gly
210 215 220
Gly Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Ile Ala Glu Asp Tyr Phe Met Ala
225 230 235 240
Lys Ala Ile Ala Asp Arg Gly Trp Arg Phe Ala Met Ser Thr Gln Val
245 250 255
Ala Met Gln Asn Ser Gly Ser Tyr Ser Ile Ser Gln Phe Gln Ser Arg
260 265 270
Met Ile Arg Trp Thr Lys Leu Arg Ile Asn Met Leu Pro Ala Thr Ile
275 280 285
Ile Cys Glu Pro Ile Ser Glu Cys Phe Val Ala Ser Leu Ile Ile Gly
290 295 300
Trp Ala Ala His His Val Phe Arg Trp Asp Ile Met Val Phe Phe Met
305 310 315 320
Cys His Cys Leu Ala Trp Phe Ile Phe Asp Tyr Ile Gln Leu Arg Gly
325 330 335
Val Gln Gly Gly Thr Leu Cys Phe Ser Lys Leu Asp Tyr Ala Val Ala
340 345 350
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370 375 380
Gly Gly Thr Ala Glu Glu Ile Leu Asp Val
385 390
Claims (15)
1.一种包含治疗剂或诊断剂和药物可接受载体的药物组合物，所述治疗剂或诊断剂或载体缀合于特异结合白喉毒素受体的靶向分子，其中所述靶向分子是白喉毒素非毒性突变体CRM197；
且所述药物组合物用于治疗或诊断选自如下一组中的失调：
(a)神经退行性疾病；
(b)神经精神失调；
(c)选自如下一组的中枢神经系统失调：脑肿瘤、癫痫、偏头痛、发作性睡病、失眠症、慢性疲劳综合征、高山病、脑炎、脑膜炎和AIDS相关性痴呆；及
(d)选自如下一组的血管发生相关失调：年龄相关性黄斑变性、骨质疏松、伤口愈合和组织修复和缺血性再灌注损伤；
(e)溶酶体贮积病。
2.权利要求1的药物组合物，其中所述白喉毒素受体包含SEQ IDNO：22的氨基酸序列。
3.权利要求1的药物组合物，其中所述靶向分子是所述白喉毒素受体的配体或激动剂。
4.权利要求1-3任一项的药物组合物，其中：
所述治疗剂选自：
(a)抗肿瘤化合物、抗细胞增殖药物；
(b)抗癌生物药品；
(c)神经营养因子；
(d)酶；
(e)脑作用激素和神经递质；
(f)不透过血脑屏障的神经递质激动剂或拮抗剂；
(g)抗生素、抗真菌制剂、抗原生动物药物；
(h)表达编码脂多糖敏感性多肽的核苷酸序列的治疗性核酸载体；
(i)功能性RNA分子；
或者
所述诊断剂是显像剂或抗体。
5.权利要求1的药物组合物，其中所述治疗剂或诊断剂被包囊化在纳米级容器内，并且所述靶向分子缀合于所述纳米级容器。
6.权利要求5的药物组合物，其中所述纳米级容器是纳米颗粒、脂质体或纳米级凝胶，所述治疗剂或诊断剂与该纳米级容器共价偶联。
7.治疗剂或诊断剂和药物可接受的载体在制备用于治疗或诊断失调的药物组合物中的应用，所述治疗剂或诊断剂或载体缀合于特异结合白喉毒素受体的靶向分子，其中所述靶向分子是白喉毒素非毒性突变体CRM197；
所述失调选自如下一组：
(a)神经退行性疾病；
(b)神经精神失调；
(c)选自如下一组的中枢神经系统失调：脑肿瘤、癫痫、偏头痛、发作性睡病、失眠症、慢性疲劳综合征、高山病、脑炎、脑膜炎和AIDS相关性痴呆；及
(d)选自如下一组的血管发生相关失调：年龄相关性黄斑变性、骨质疏松、伤口愈合和组织修复和缺血性再灌注损伤；
(e)溶酶体贮积病。
8.权利要求7的应用，其中所述白喉毒素受体包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。
9.权利要求7的应用，其中所述靶向分子靶向血脑屏障，且所述白喉毒素受体是脑毛细血管内皮细胞多肽。
10.权利要求9的应用，其中所述靶向分子是所述白喉毒素受体的配体或激动剂。
11.权利要求9的应用，其中所述白喉毒素受体在应答氧化刺激、缺血刺激、渗透压刺激、电子刺激、机械或剪切刺激、细胞因子、生长因子、溶血磷脂酰胆碱、氯化汞、佛波酯、Ca++离子载体、血清、凝血酶、内皮缩血管肽-1、血管紧张素II、脂蛋白、血小板活化因子、α-肾上腺素能激动剂、转录因子时被高度上调，或者所述白喉毒素受体通过肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、CD9/DRAP27和α3β1-整联蛋白增加所述白喉毒素受体对其配体的亲和性而调节。
12.权利要求9的应用，其中
所述治疗剂选自：
(a)抗肿瘤化合物、抗细胞增殖药物；
(b)抗癌生物药品；
(c)神经营养因子；
(d)酶；
(e)脑作用激素、神经递质；
(f)不透过血脑屏障的神经递质激动剂或拮抗剂；
(g)抗生素、抗真菌制剂、抗原生动物药物；
(h)表达编码脂多糖敏感性多肽的核苷酸序列的治疗性核酸载体；
(i)功能性RNA分子；
或者
所述诊断剂是显像剂或抗体。
13.权利要求9的应用，其中所述治疗剂或诊断剂被包囊化在纳米级容器内，并且所述靶向分子缀合于所述纳米级容器。
14.权利要求13的应用，其中所述纳米级容器是纳米颗粒、脂质体或纳米级凝胶，所述治疗剂或诊断剂与该纳米级容器共价偶联。
15.权利要求9的应用，其中所述药物通过选自静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、病灶内、颅内、鞘内、经皮、鼻、口腔、直肠或阴道途径的途径通过连续灌注或大丸药注射而给予。
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| HU Z.Y. ET AL.stimulation of IL-beta, TNF-alpha, IL-6 ions mRNAs expressionby LPS in the cultured rat glial and cerbral microvascularendothelial cells.SOCIETY FOR NEUROSCIENCE ABSTRACTS21 1-3.1995,1086. * |
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| SHUKALIAK J.A. ET AL.expression of beta chemokines RANTES and MIP-1beta byhuman brain microvessel endothelial cells in primary culture.JOURNAL OF NEUROPATHOLOGH AND EXPERIMENTAL NEUROLOGY59 5.2002,339-352. * |
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