CN102695723A - 改进的神经营养因子分子 - Google Patents

Abstract

本发明公开了拥有降低的肝素和硫酸乙酰肝素结合亲和力、但是仍保持神经营养活性的神经营养因子多肽，编码所述神经营养因子变体的核酸，以及表达增强的神经营养因子多肽的载体和宿主细胞。也公开了所述增强的神经营养因子多肽、核酸和宿主细胞在治疗或预防疾病中的用途。

Description

改进的神经营养因子分子

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年10月30日提交的美国临时专利申请号61/256352的权益，所述专利的完整内容通过引用的方式并入。

背景技术

本发明涉及开发和使用增强的神经营养因子多肽，其拥有降低的肝素和硫酸乙酰肝素结合亲和力，但是仍保持神经营养活性；编码所述神经营养因子变体和载体的核酸以及表达增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。另外，本发明也包括所述增强的神经营养因子多肽、核酸和宿主细胞在治疗疾病中的用途。

神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族配体(GFLs)是TGF-β超家族的远亲成员，它们是体外强有力的神经营养因子并且对于体内不同神经元群体的发育是重要的(Airaksinen，M.S.等人，(1999)“GDNF familyneurotrophic factor signaling：four masters，one servant？(神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)家族神经营养因子信号传导：四个主导，一个从属？)”Mol.Cell.Neurosci.13，313-325)。该家族存在具有高度序列相似性的四个已知成员：GDNF、neurturin(NRTN)、artemin(ARTN)和persephin(PSPN)。这些因子均通过转染期间重排(RET)的跨膜受体酪氨酸激酶的活化发挥功能，所述活化激活多条信号传导途径。(Knowles，PP.(2006)“Structureand chemical inhibition of the RET tyrosine kinase domain(RET酪氨酸激酶结构域的结构和化学抑制)”，J.Biol.Chem.28133577-33587)。受体复合物中包括高亲和力糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的细胞表面蛋白，名为GFRα(GDNF家族受体α)，虽然每种GFL存在一种GFRα，但是交叉信号传导在受体复合物之间出现(Airaksinen等人，ibid)。多种GFLs还共有针对肝素的亲和力，PSPN例外，它似乎具有低亲和力或无亲和力(Maxim M.Bespalov博士论文，18.12.2009，赫尔辛基大学)。肝素是一种主要限于肥大细胞的硫酸化多糖。然而，高度相关的硫酸乙酰肝素(HS)更为普遍存在，其位于在细胞表面和胞外基质上。已经表明，GDNF和肝素/HS之间的相互作用显示对2-O-硫酸盐存在的高依赖性(Rickard等人，(2003)“The binding of human glialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF)to heparin and heparansulfate：importance of 2-O-sulfate groups and effects on itsinteraction with its receptor GFRα1(人神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)与肝素和硫酸乙酰肝素的结合：2-O-硫酸盐基团的重要性及对与其受体GFRα1相互作用的影响).”Glycobiology 13，419-426)。

由于它们的神经营养性质，GFLs是用于治疗中枢和外周神经系统疾病和损伤的新出现候选物。GFLs如神经营养因子的治疗性用途的核心在于这些分子能够刺激广泛类型的神经元的存活和生长，包括例如多巴胺能神经元、交感神经元、副交感神经元、感觉神经元和脊髓运动神经元。(Bespalov，MM和Saarma，M.(2007)“GDNF family receptor complexes are emerging drugtargets(GDNF家族受体复合物是新出现的药物靶).”Trends in Pharm.Sci.28(2)68-74)。例如GDNF蛋白和基因治疗载体中的NRTN均已经在治疗帕金森病的临床试验中施用至患者，并且已经显示刺激动物模型中的多巴胺反转。(Hadaczek等人，(2010)“Pharmacokinetics and bioactivity of glial cellline-derived factor(GDNF)and neurturin(NTN)infused into ratbrain(输注至大鼠脑中的神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)和神经营养因子(NTN)的药物代谢动力学和生物活性).”Neuropharm.581114-1121)。另外，疾病如阿尔茨海默、ALS、癫痫、成瘾性、慢性疼痛和中风也可以得益于基于神经营养因子能够促进神经元存活和生长的神经营养因子疗法。

另外，对于下述概念存在增加的支持：神经营养因子疗法可以用于治疗糖尿病(Rossi等人，(2005)Diabetes 54(5)1324-30；Mwangi等人，(2008)Gastroenterology 134(3)727-37；Mwangi等人，(2010)Am J Physiol.Gastrointest Liver Physiol.299(1)G283-92)；勃起障碍(Laurikainen等人，(2000)Cell.Tissue.Res.302(3)321-9，Laurikainen等人，(2000)J.Neurobiol.43(2)198-205，May等人，(2008)Eur.Urol.54(5)1179-87；Kato等人，(2009)Gene Therapy 16(1)26-33)；脱发(Botchkareva等人，(2000)Am.J.Pathol.156(3)1041-53，Adly等人，(2008)J.Am.Acad.Dermatol.58(2)238-50)；听力下降(Ylikoski等人，(1998)Hear Res.124(1-2)17-26，Stover等人，(2001)Hear Res.155(1-2)143-51，Stover等人，(2000)Brain Res Mol Brain Res.76(1)25-35；先天性巨结肠(Hirschsprung’s disease)(Taraviras等人，(1999)Development 126(12)2785-97，Roberts等人，(2008)Am J Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.294(4)G996-G1008)；神经病理性疼痛(Adler等人，(2009)Pain.Med.10(7)1229-36)和视网膜病变(Igarahi等人，(2000)Cell.Struct.Funct.25(4)237-41，Nishikiori等人，(2007)56(5)1333-40)。

在一项最近的II期临床试验中，使用病毒载体(CERE-120)，将NRTN施用至帕金森病患者。通过立体定位注射法递送CERE-120至脑的硬膜区，从而以高度定向的方式提供稳定的、长时间持续的NRTN表达。然而，双盲对照的试验的结果表明，用CERE-120治疗的患者与对照组中的那些患者之间不存在可觉察的差异。相对于在基线的大约39点的平均值，两个组均在方案定义的主要端点方面显示大约7点的改善(在12个月后进行统一帕金森病评定量表(UPDRS)运动评分(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale-motor offscore)。两个组有相当数目的患者显示出基于基线具有临床意义的改善。CERE-120似乎是安全和良好耐受的。在CERE-120试验法的18个月随访中，相对于安慰剂，观察到适中的临床益处。

试验失败的原因尚不完全明了。一种假设是，尽管直接注射至脑的受影响区域，但是神经营养因子对硫酸乙酰肝素的高亲和力阻止该分子充分扩散至宽广到足以产生效力的区域。在这种假设的支持下，对神经营养因子在两位治疗过的患者的脑中分布的分析以及动物研究表明，在输注至脑内后，神经营养因子未能均匀分布((Hadaczek等人，(2010)“Pharmacokinetics andbioactivity of glial cell line-derived factor(GDNF)and neurturin(NTN)infused into rat brain(输注至大鼠脑中的神经胶质细胞系源神经营养因子(GDNF)和神经营养因子(NTN)的药物代谢动力学和生物活性)”Neuropharm.58 1114-1121；2009年5月27日Ceregene Press Release)，从而再次表明更宽的生物分布可能是有利的。

另外，新近的动物研究包括将肝素连同神经营养因子共输注至帕金森病的猕猴模型的脑中(Grodin等人，“Intraputamenal infusion of exogenousneurturin protein restores motor and dopaminergic function in theglobus pallidus of MPTP-lesioned rhesus monkeys(外源神经营养因子蛋白质的壳核内输注恢复了MPTP受损猕猴的苍白球中的运动和多巴胺能功能).”Cell Transplantation 17：373-381，2008)。理论上，共输注的肝素将阻止神经营养因子与胞外基质结合，同时仍允许与靶细胞上的RET/GFRα受体复合物结合。因此，共注射的神经营养因子可能扩散至更广泛的面积。

另一种改善神经营养因子的功效和生物分布的方法将是改变该分子的肝素结合亲和力，而不影响影响其神经营养性能。然而，在本申请人的发现之前，神经营养因子中参与介导肝素结合作用的实际氨基酸的位置和身份是未知的。另外，不知道肝素结合结构域的突变是否会破坏该蛋白质的折叠和/或三维结构，并且导致突变分子丧失生物学功能丧失，并且更具体地丧失神经营养活性。因此，对改进的神经营养因子多肽仍存在需要，所述多肽显示出改进的生物分布，同时保留高的生物学活性。

尽管这种方法富有吸引力，但是已经调研过神经营养因子和GDNF家族其他成员的肝素结合特征其功能性影响的先前研究，提供了杂乱和矛盾的结果。(Rider，CC，(2006)Biochem.Soc.Trans.34(3)458-460；Rickard SM等人，(2003)Glycobiology 13(6)419-26，Davies JA等人，(2003)GrowthFactors 21(3-4)109-19，Rider CC，(2003)Biochem.Soc.Trans.31(2)337-9，Tanaka M等人，(2002)Neuroreport 13(15)1913-1916，Hamilton JF等人(2001)Exp.Neurol.168(1)155-61，Ai X等人，(2007)Development134(18)3327-38)。

例如，虽然先前研究已经显示，基序“BBXB”或“BBBXXB”，其中“B”是一个碱性氨基酸并且“X”是任何氨基酸，对于肝素结合是重要的，然而其他研究显示，不含有这种基序的蛋白质也可以结合肝素和HS(Delacoux等人“Unraveling the amino acid sequence crucial for heparin binding tocollagen V(揭示对于肝素与胶原蛋白V结合至关重要的氨基酸序列).”J.Biol.Chem.2000275(38)：29377-82)。另外，缺少神经营养因子的详细三维结构阻碍了以下详细分析：神经营养因子中任何带正电荷的相应残基是否实际上在成熟蛋白中表面暴露和取向，从而它们的侧链是正确对齐以与肝素相互作用。

另外，采用其他GFL成员的研究已经显示，肝素结合作用可能主要源自这个蛋白质家族的N末端区域之内或跨越几个区域分布。(Alfano等人(“Themajor determinant of the heparin binding of glial cell-line derivedneurotrophic factor is near the N-terminus and is dispensable forreceptor binding(神经胶质细胞系源神经营养因子的肝素结合作用的主要决定因素位于N-端附近并且对于受体结合作用是可替代的)”Biochem.J.404：131-140，2007)；Silvian等人，(“Artemin crystal structure revealsinsights into heparan sulfate binding(Artemin晶体结构揭示硫酸乙酰肝素结合的内情).”Biochemistry 45：6801-6812，2006))。

Silvian等人探索了ARTN的肝素结合特征并且表明，前-α-螺旋区内的一系列精氨酸残基接触晶体结构中的硫酸盐原子。他们发现在该晶体中无序的ARTN氨基端区域(第1-9位氨基酸)负责一些HS结合活性。此外，他们通过用谷氨酸残基取代方式，将ARTN的前-α-螺旋区中的三个精氨酸(Arg48，Arg49和Arg51)进行了诱变。谷氨酸的掺入导致对肝素分子的亲和力降低，这表明这个前螺旋区域可能在硫酸乙酰肝素相互作用中发挥作用。然而，ARTN的这个前螺旋区域在神经营养因子中不是充分保守的，表明神经营养因子中这个区域的功能可以得不到保留。

在Alfano等人报道的研究中，缺失GDNF的N端区域导致肝素结合作用的明显降低。另外，Alfano等人对GDNF中含有多个碱性氨基酸的区域中的成对带正电荷的氨基酸(K81A/K84A和R88A/R90A)，实施了丙氨酸扫描诱变，所述碱性氨基酸位于成熟GDNF蛋白的α螺旋区的一个面上。Alfano等人发现无论单个或组合地，双氨基酸变化均未能显著地降低GDNF对肝素的结合亲和力。

虽然GDNF、ARTN和NRTN是同源的并且包含总体上相似的结构，但是成熟蛋白的N端区域和理论性肝素结合序列周围的区域均不是充分保守的。因此，就这些蛋白质结构域在NRTN中作用的精确预测，不能从源于GDNF或ARTN的研究中精确推断。

本发明部分地基于发现神经营养因子中这样的氨基酸，其包括第51至63位氨基酸(以成熟的人神经营养因子进行编号)，它们在介导神经营养因子与肝素相互作用方面发挥重要作用。另外，本申请人已经意外地发现，这个区域内氨基酸的突变导致增强的神经营养因子多肽，其显示出降低的肝素亲和力并且仍保留有神经营养活性，特别地，其保留有与GFRα1或GFRα2相互作用以诱导RET磷酸化和诱导细胞效应的能力。因而，本发明提供了具有改进生物学活性的新的神经营养因子多肽，编码此类多肽的多核苷酸，和表达此类多肽的细胞以及它们用于治疗和预防疾病的方法。

发明内容

本发明部分地基于发现这样的神经营养因子分子，其具有降低的肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合能力，但仍保留一旦与受体复合物结合就诱导RET蛋白磷酸化的能力。因此，在一个实施方案中，本发明包括纯化的神经营养因子多肽，其包括拥有诱导RET磷酸化并且拥有降低的肝素结合活性能力的神经营养因子变体。在另一个实施方案中，纯化的神经营养因子多肽变体包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸处的一个或多个置换。在另一个实施方案中，含神经营养因子变体的纯化多肽包含SEQ ID NO：1、2、3和4。

在另一个实施方式中，本发明包括一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO：5)的差异是，在所述成熟野生型神经营养因子第51至第63氨基酸的包含区域内具有至少一个带正电荷氨基酸的突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。

在一个方面，以100ng/ml的浓度在37℃添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRα1或GFRα2。

在一个方面，所述神经营养因子多肽可以在小于1M NaCl的NaCl浓度在pH 7.2下从肝素亲和柱洗脱。

在一个方面，所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置处的至少一个突变。

在一个方面，所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置处的至少一个突变。在一个方面，该突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。在另一个方面，该突变导入至少一个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G、和E62S。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列对第51至第62位氨基酸的替换。

在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述多肽是增强的神经营养因子多肽。在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述多肽是增强的人神经营养因子多肽。

在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述神经营养因子多肽与(SEQ ID NO：5)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。

在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQ ID NO：1。在权利要求7多肽的一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQ ID NO：2。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQ ID NO：3。在一个方面，所述神经营养因子多肽包含SEQ ID NO：4。

在这些神经营养因子多肽中任一者的另一个方面，所述神经营养因子多肽是与另一种蛋白质融合的融合蛋白。

在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述神经营养因子多肽中任一者至需要这种治疗的患者。

在一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠(Hirschsprung’sdisease)、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

在一个方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自由嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

在这些方法中任一者的一个方面，所述神经营养因子多肽通过全身性施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过鞘内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过鼻内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过脑实质内施用法施用。在另一个方面，所述神经营养因子多肽通过持续释放组合物或装置施用。

在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含前述神经营养因子肽的任一者和药学上可接受载体。

在另一个实施方案中，本发明包括分离的编码神经营养因子多肽的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO：5)，区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少一个带正电荷的氨基酸突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。

在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中以100ng/ml的浓度在37℃添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFR α1或GFR α2。

在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽可以在小于1M NaCl的NaCl浓度在pH 7.2下从肝素亲和柱洗脱。

在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63的位置处的至少一个突变。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62的位置处的至少一个突变。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中突变导入至少一个氨基酸，其独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺。

在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述多肽包含突变R52A、R56A和R58A。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。在一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述多肽包含由ARLQGQGALVGS序列对第51至第62位氨基酸的替换。

在要求保护的多核苷酸中任一者的另一个方面，该多核苷酸编码一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与(SEQ ID NO：5)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。

在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：6。在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：7。在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：8。在一个方面，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：9。

在另一个实施方案中，本发明包括一种重组载体，其包含前述多核苷酸。在一个方面，该重组载体还包含与所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。在一个方面，该重组载体是病毒载体。

在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述重组载体中任一者至需要这种治疗的患者。

在这种方法的一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

在这种方法的另一方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

在一个方面，该重组载体通过全身性施用法施用。在一个方面，该重组载体通过鞘内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过鼻内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过脑实质内施用法施用。在一个方面，该重组载体通过持续释放组合物或装置施用。

在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含任一的前述重组载体和药学上可接受载体。

在另一个实施方案中，本发明包括一种宿主细胞，其包含根据权利要求26至43中任一项所述的多核苷酸。在一个方面，该宿主已经用前述重组载体的任一者转化或转染。在一个方面，该宿主细胞分泌前述神经营养因子多肽的任一者。

在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的前述宿主细胞的任一者至需要这种治疗的患者。

在一个方面，该患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

在一个方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

在一个方面，该宿主细胞通过全身性施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过鞘内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过鼻内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过脑实质内施用法施用。在一个方面，该宿主细胞通过持续释放组合物或装置施用。

在另一个实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含前述宿主细胞的任一者和药学上可接受载体。在另一个实施方案中，本发明包括一种药物递送系统，其包含鞘内泵和前述任一多肽。

附图说明

图1.纯化的增强的神经营养因子变体的样品以及市售批次的神经营养因子利用15％SDS-PAGE在非还原条件下进行分析，并且经考马斯染色法显现。

图2.将纯化的神经营养因子变体1、2、3、4制备物(N1至N4)、成熟野生型神经营养因子和神经营养因子商业制备物(2ug)施加至HiTrap肝素柱并用连续NaCl梯度洗脱(用10mM Hepes开始，逐步增加NaCl至2M)。通过214nm处的蛋白质吸收(在左侧轴上显示)监测蛋白质的洗脱。基于导电性(由虚线和所述图的右侧轴指示)测定含有洗脱蛋白质组分的确切盐浓度。图2A显示商业神经营养因子制备物的洗脱图，图2B显示使用与神经营养因子变体相同的方法所产生的野生型神经营养因子制备物的洗脱图，图2C显示N1的洗脱图，图2D显示N2的洗脱图，图2E显示N3的洗脱图，并且图2F显示N4的洗脱图。

图3显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。稳定表达RET的细胞用GFRα2瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过通过免疫沉淀法分离RET。样品通过用抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体(B)再探测。

图4显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。稳定表达RET的细胞用GFRα1瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过免疫沉淀法分离RET。样品通过用抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体(B)再探测。

具体实施方式

定义

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。额外的定义遍及发明详述各处描述。如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数称谓，除非上下文另外清楚地指出。因而，例如，对“一个分子”的指称包括一个或多个此类分子，对“一种试剂”的指称包括一种或多种此类不同的试剂，对“一种抗体”的指称包括一种或多种此类不同的抗体，并且对“该方法”的指称包括指称本领域普通技术人员已知的同等步骤和方法，所述同等步骤和方法可以被修改或替换本文所述的方法。

在提供一个值范围的情况下，应当理解，其也具体地披露了该范围上限与下限之间的每一个中间值，直至该下限值的十分之一个单位，除非上下文有明确的其他说明。所述范围内任一所述值或中间值与这个范围内任一其他所述值或中间值之间的每一较小范围，其包括在本发明的范围内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该范围内或排除在外，并且在所述较小范围包括上下限值二者之一、上下限值二者均排除、或者上下限值二者均包括——这些情形下的每一范围也包括在本发明中，其受所述范围中任何具体排除的界限约束。在所述的范围包括所述界限之一者或两者的情况下，本发明中也包括排除所包括的这些界限的任一者或两者的范围。

术语“约”或“大约”意指本领域普通技术人员所测定特定值的可接受的误差范围，这将部分地取决于怎样度量或测定该值，即，测量系统的界限值。例如，“约”可以意指处于距均值的1或2个标准偏差范围内。或者，“约”可以意指加上或减去至多到20％、优选地至多到10％、更优选地至多到5％的范围。

如本文所用，术语“细胞”、“多个细胞”、“细胞系”、“宿主细胞”、和“多个宿主细胞”互换地使用，并且包括动物细胞，并且包括无脊椎动物细胞、非哺乳脊椎动物细胞和哺乳动物细胞。全部此类名称均包括细胞群体和子代。因而，术语“转化体”和“转染子”包括原代个体细胞和源自其中的细胞系，无论传代次数是多少。示例性非哺乳脊椎动物细胞包括例如鸟类细胞、爬行类细胞和两栖类细胞。示例性无脊椎动物细胞包括，但不限于昆虫细胞，例如毛虫(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))细胞、蚊(埃及伊蚊(Aedesaegypti))细胞、果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))细胞、Schneider细胞和家蚕(Bombyx mori)细胞。参见，例如，Luckow等人，Bio/Technology6：47-55(1988)。细胞可以是分化的、部分分化的或未分化的，例如，干细胞，包括胚胎干细胞和多能干细胞。另外，可以根据本发明使用源自器官或器官系统的组织样品。示例性哺乳动物细胞包括，例如源自人、非人灵长类、猫、犬、羊、山羊、牛、马、猪、兔、包括小鼠、仓鼠、大鼠和豚鼠的啮齿类动物及其任何衍生物和子代的细胞。

术语“细胞培养物”或“组织培养物”指在如转瓶、组织培养瓶、皿、多孔平板等的容器中悬浮或贴附于多种表面或基材所培育的细胞。

术语“细胞疗法”指包括将细胞注射、移植或其他方式置入哺乳动物身体中用于治疗的疗法。在不同的方面，细胞可以是自体的，细胞可以产生蛋白质，细胞可以是再生性的，细胞可以是修饰的，细胞可以是基因修饰的，细胞可以是体细胞、前体细胞或干细胞。

短语“保守性氨基酸置换”或“保守性突变”指一个氨基酸由具有共同特性的另一个氨基酸置换。限定各个氨基酸之间共同特性的功能性方式是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的归一化频率(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。根据此类分析，可以定义氨基酸的组，其中组内的氨基酸优先交换彼此，并且因此在它们影响总体蛋白质结构方面彼此最相似(Schulz，G.E.和R.H.Schirmer，Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。

以这种方式定义的氨基酸组的实例包括：“由Glu、Asp、Asn、Gln、Lys、Arg和His组成的带电荷/极性组；由Pro、Phe、Tyr和Trp组成的“芳香族或环状组”；和由Gly、Ala、Val、Leu；Ile、Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族组”。

在每个组内部，也可以鉴定出亚组，例如，带电荷/极性氨基酸组可以进一步划分成由Lys、Arg和His组成的“带正电荷亚组”；由Glu和Asp组成的“带负电荷亚组”和由Asn和Gln组成的“极性亚组”。芳香族或环状组可以进一步划成由以下亚组组成的亚组：由Pro、His和Trp组成的“氮环亚组”和由Phe和Tyr组成的“苯基亚组”。脂族组可以进一步划成由以下亚组组成的亚组：由Val、Leu和Ile组成的“大脂族非极性亚组”、由Met、Ser、Thr和Cys组成的“脂族轻微极性亚组”和由Gly和Ala组成的“小残基亚组”。

保守性突变的实例包括置换以上亚组内部的氨基酸，例如，Lys替换Arg并且反之亦然，从而可以维持正电荷；Glu替换Asp并且反之亦然，从而可以维持负电荷；Ser替换Thr，从而可以维持游离-OH；Gln替换Asn，从而可以维持游离-NH₂。

如本文所用，术语“减少”或相关的术语“减少的”、“降低”或“降低的”指统计显著的减少。为避免怀疑，所述术语通常指所给出参数的至少10％减少，并且可以包括至少20％减少、30％减少、40％减少、50％减少、60％减少、70％减少、80％减少、90％减少、95％减少、97％减少、99％或甚至100％减少(即，测量的参数是处于零)。

术语“表位标签”指与目的蛋白编码区融合以使检测或纯化目的蛋白成为可能的任何抗原决定簇或任何生物学结构或序列。此类融合蛋白可以鉴定和纯化，例如通过使用表位标签特异性抗体。表位标签的代表性实例包括而不限于His标签(6-组氨酸)、HA标签(血凝素)、V5-标签、c-Myc标签、GST标签和FLAG标签(DYKDDDDK)。

术语“被囊的”在表述“被囊细胞”的语境下指已经用人工膜包被各个细胞或细胞群外部的细胞。

如本文所用的术语“表达”指核苷酸序列在宿主细胞内部的转录和/或翻译。宿主细胞中所需产物的表达水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量或由选择的序列编码的所需多肽的量确定。例如，从选择的序列中转录的mRNA可以通过RNA印迹杂交、核糖核酸酶RNA保护法、与细胞RNA原位杂交或通过PCR定量。由选择的序列编码的蛋白质可以由多种方法定量，所述方法包括，但不限于例如ELISA、蛋白质印迹法、放射免疫测定、免疫沉淀测定、蛋白质生物学活性分析、或者FACS分析后再蛋白免疫染色。

“表达控制序列”是引起编码序列在宿主细胞中表达的DNA调节序列，如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。示例性表达控制序列在Goeddel，Gene Express ion Technology：Methodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。

术语“异源DNA”指已经导入细胞中的DNA，或源自另一来源或来自相同来源但处于不同(即非固有)环境下的核酸序列。

术语“同源性”描述基于数学的序列相似比较结果，其用来鉴定具有相似功能或基序的基因或蛋白质。本发明的核酸和蛋白质序列可以用作“查询序列”以针对公共数据库执行进行检索，以例如鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。此类检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)(Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)进行。BLAST核苷酸搜索可以在采用NBLAST程序，评分＝100、字长度＝12的情况下执行，以获得与本发明核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、评分＝50、字长度＝3进行BLAST蛋白质搜索，以获得同源于本发明蛋白质分子的氨基酸序列。为了出于比较目的获得空位比对结果，可以使用空位BLAST，如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数。

术语“同源的”指拥有“共同进化起源”的两个蛋白质之间的关系，所述蛋白质包括相同动物物种中来自超家族的蛋白质(例如，免疫球蛋白超家族)，以及来自不同动物物种的同源蛋白(例如，肌球蛋白轻链多肽等；见Reeck等人，Cell，50：667，1987)。无论根据同一性百分数还是根据存在特定的残基或基序和保守位置，如其序列相似性所反映的，此类蛋白质(和它们的编码核酸)具有序列同源性。

如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”、“增强”或“增强的”指统计显著的增加。为避免怀疑，所述术语通常指所给出参数的至少10％增加，并且可以包括超过对照值的至少20％增加、30％增加、40％增加、50％增加、60％增加、70％增加、80％增加、90％增加、95％增加、97％增加、99％或甚至100％增加。

术语“分离的”，当用来描述神经营养因子多肽时，意指已经鉴定过并且从其自然环境的组分中分离和/或回收的一种蛋白。其自然环境的杂质组分是一般将干扰该蛋白质的研究、诊断性或治疗性用途的物质，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，蛋白质将被纯化到至少95％均匀性，这可通过在非还原性或还原性条件下使用考马斯蓝或优选地银染色法进行SDS-PAGE来评估。分离的蛋白质包括在重组细胞内部在原位的蛋白质，因为目的蛋白的自然环境的至少一种组分将不再存在。然而，一般将通过至少一个纯化步骤制备分离的蛋白质。

如本文所用，“同一性”意指当比对两个或更多个序列以使序列匹配最大化、即计入空位和插入时，在所述序列中相应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分数。可以通过已知的方法容易计算同一性，所述方法包括但不限于在(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编著，Oxford UniversityPress，New York，1988；Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编著，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis ofSequence Data，第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，HumanaPress，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；及Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编著，M Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)中描述的那些方法。设计确定同一性的方法，以获得所检验序列之间的最大匹配。另外，确定同一性的方法编纂于可公共获得的计算机程序中。确定两个序列之间同一性的计算机程序方法包括，但不限于GCG程序组(Devereux，J.等人，NucleicAcids Res 12(1)：387(1984))、BLASTp、BLASTn和FASTA(Altschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990)和Altschul等人Nuc.Acids Res.，25：3389-3402(1997))。BLAST X程序是从NCBI和其他来源而可公共获得(BLAST手册，Altschul，S.等人，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。公知的Smith Waterman算法也可以用来确定同一性。

如本文中可互换使用的术语“有效连接”和“有效连接的”指将两个或更多个核苷酸序列或序列元件，以允许它们按照意图方式发挥作用的方式安置。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包括与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接的、能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的一个或多个DNA元件。在其他实施方案中，核酸分子可以额外地包括一个或多个核苷酸序列，其选自：(a)能够增加翻译的核苷酸序列；(b)能够增加重组蛋白分泌于细胞外部的核苷酸序列；和(c)能够增加mRNA稳定性的核苷酸序列，其中此类核苷酸序列与编码重组蛋白的核苷酸序列有效连接。通常但不必然地，有效连接的核苷酸序列是连续的，并且根据需要，是符合可读框的。然而，虽然能够使染色质开放和/或维持染色质处于开放状态的有效连接的DNA元件，通常位于编码重组蛋白的核苷酸序列的上游；但是它不必然与该核苷酸序列连续。通过本领域公知的重组方法，例如使用PCR方法，通过在适宜的限制性位点处连接或通过复性，完成多种核苷酸序列的有效连接。如果合适的限制性位点不存在，可以根据常规惯例使用合成性寡核苷酸接头或衔接子。

如本文所用，术语“患者”在本发明语境中优选地是一种哺乳动物。该哺乳动物可以是人、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人之外的哺乳动物可以有利地用作代表特定疾病和病症动物模型的患者。患者可以是雄性或雌性。患者可以是先前已经被诊断或鉴定为存在细胞变性或减少的个体，和任选地已经经历或正在经历干预性治疗的个体。优选地，该患者是人。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸”在本文中可互换地使用，指任何长度的核苷酸聚合物形式，无论是核糖核苷酸或是脱氧核糖核苷酸。这些术语包括单链、双链或三链的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体、或者包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学修饰的、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可以包含糖和磷酸酯基团(如一般可以在RNA或DNA中找到)，或修饰或取代的糖或磷酸酯基团。此外，可以通过合成互补链并且在适宜的条件下复性双链，或者通过使用DNA聚合酶以适宜的引物从头合成互补链，而从化学合成的单链多核苷酸产物获得双链多核苷酸。核酸分子可以表现为许多不同的形式，例如基因或基因片段、一个或多个外显子、一个或多个内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支化多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离DNA、任意序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，尿嘧啶(uracyl)，其他的糖类和连接基团，如氟代核糖(fluororibose)与硫代酯(thioate)，以及分支性核苷酸(nucleotide branches)。如本文所用，“DNA”或“核苷酸序列”不仅包括碱基A、T、C和G，还包括以下情况的任一者：这些碱基的类似物或修饰形式、如甲基化核苷酸，核苷酸间的修饰体，如不带电荷的连接和硫酯键连接、糖类似物的使用、以及使用修饰的和/或替代的骨架结构如聚酰胺。

如本文所用，术语“多肽”指包含彼此通过肽键或修饰肽键连接的两个或多个氨基酸残基的任何分子(即肽电子等排体)。“多肽”指短链，常称作肽、寡肽或低聚物，同时也指较长链，通常称作蛋白质。多肽可以含有除20种基因编码氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过天然过程如翻译后加工、或通过本领域公知的化学修饰技术，所修饰得到的氨基酸序列。此类修饰在基本教材中和更详细的专著中以及本领域技术人员熟悉的海量研究文献中都有充分描述。修饰可以在多肽中的任何地方出现，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。可以理解，相同类型的修饰可以在给定多肽中的几个位点处以相同或不同的程度存在。另外，给定的多肽可以含有许多类型的修饰。多肽可以因遍在蛋白化而支化，并且它们可以是存在或不存在支化的环状。环状、分枝和分枝环状多肽可以因翻译后天然过程产生或可以通过合成方法产生。修饰包括例如，乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、生物素酰化、黄素的共价结合、血红素部分的共价结合、核苷酸或核苷酸衍生物的共价结合、脂类或脂类衍生物的共价结合、磷脂酰肌醇的共价结合、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPl锚形体形成、羟化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA介导的添加氨基酸至蛋白质如精氨酰化、和遍在蛋白化(见，例如，Proteins--Structure and Molecular Properties，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translationalProtein Modifications：Perspectives and Prospects(翻译后蛋白质修饰：展望和前景)，1-12，引自Post-translational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson编著，Academic Press，New York，1983；Seifter等人，“Analysis for protein modifications and nonprotein cofactor(蛋白质修饰和非蛋白质辅因子的分析)”，Meth Enzymol，182，626-646，1990，和Rattan等人，“Protein Synthesis：Post-translational Modificationsand Aging(蛋白质合成：翻译后修饰和衰老)”，Ann NY Acad Sci，663，48-62，1992)。

“启动子”是能够在细胞中结合RNA聚合酶并且启动下游(3’方向)编码序列转录的DNA调节区。如本文所用，启动子序列在其3’末端与转录起始位点相结合并且向上游(5’方向)延伸，以包括可检测水平的高于背景的启动转录所需要的最少数目的碱基或元件。转录起点(用核酸酶S1可以容易定位确定)可以存在于启动子序列，也可以存在于负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)内部。真核启动子可以经常，但是不总是含有“TATA”框和“CAT”框。除-10和-35共有序列之外，原核启动子还含有Shine-Dalgarno序列。本领域公知来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型、诱导型和阻遏型启动子。代表性来源包括例如，病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌细胞类型，并且源自这些来源的合适启动子是容易地可获得的，或者可以基于在线公众可获得的序列、或者例如从诸如ATCC以及其他商业或个人来源的保藏物来合成产生。启动子可以是单向的(即，以一个方向启动转录)或双向的(即，以3’或5’方向启动转录)。启动子的非限制性实例包括例如T7细菌表达系统、pBAD(araA)细菌表达系统、细胞巨化病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子。诱导型启动子包括Tet系统(美国专利5,464,758和5,814,618)、蜕皮激素诱导性系统(No等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1996)93(8)：3346-3351；T-RE_x ^TM系统(Invitrogen Carlsbad，CA)，

(Stratagene，(San Diego，CA))和Cre-ER^T他莫西芬诱导性重组酶系统((Indra等人Nuc.Acid.Res.(1999)27(22)：4324-4327；Nuc.Acid.Res.(2000)28(23)：e99；美国专利7,112,715号；和Kramer和Fussenegger，Methods Mol.Biol.(2005)308：123-144)或本领域已知适于在合乎需要的细胞中表达的任何启动子。

如本文所用的术语“纯化”指已经在减少或消除无关物质即杂质存在的条件下所分离的材料，所述杂质包括天然物质、其中所述材料从该天然物质获得。例如，纯化的蛋白质优选地基本上不含在细胞中与该蛋白质结合的其他蛋白质或核酸。用于纯化的方法是本领域公知的。如本文所用，术语“基本上不含”在实践中其在材料的分析测定的语境下被使用。优选地，基本上不含杂质的纯化材料是至少50％纯的；更优选地是至少75％纯的，并且仍更优选地是至少95％纯的。可以通过色谱法、凝胶电泳、免疫测定法、组成分析法、生物学测定法和本领域已知的其他方法来评估纯度。术语“基本上纯的”表示可以使用本领域已知的常规纯化技术可实现的最高程度的纯度。

术语“重组蛋白”或“重组多肽”指i)异源DNA部分地或全部编码的蛋白质，或ii)自表达控制序列(如启动子或增强子)表达的蛋白质，其中所述的表达控制序列由异源DNA完整或部分地产生，所述异源DNA激活内源基因的表达。

术语“序列相似性”指在可或可不共有共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性的程度(见Reeck等人，上文)。然而，在常见用途中和在本申请中，术语“同源的”当用副词如“高度地”修饰时，可以指序列相似性并且可以或可以不涉及共同进化起源。

在具体实施方案中，如已知的序列比较算法如BLAST、FASTA、DNA Strider、CLUSTAL等所确定的，当至少约85％和更优选地至少约90％或至少约95％的核苷酸在核酸序列的限定长度范围内匹配时，则两个核酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。这种序列的实例是本发明特定基因的等位基因或物种变体。也可以通过杂交，例如在诸如相对于这个特定系统所定义的严格条件下在DNA印迹杂交实验中鉴定出基本上同源的序列。

类似地，在本发明的特定实施方案中，当多于90％的氨基酸残基相同时，则两个氨基酸序列是“基本上同源的”或“基本上相似的”。当多于约95％的氨基酸残基相似时，两个序列是功能上相同的。优选地，通过使用例如GCG(Genetics Computer Group，第7版，Madison，Wis.)程序包或使用上述任何程序和算法进行比对，以鉴定出相似或同源的多肽序列。所述程序可以使用Smith和Waterman局部同源性算法，采用默认值：空位产生罚分＝-(1+1/k)，k是空位延伸数目，平均匹配＝1，平均错配＝-0.333。

如本文定义，术语“持续释放”、“延长的释放”或“贮库制剂”指药物如增强的神经营养因子多肽从持续释放组合物或持续释放装置中被释放，所述释放与直接静脉内或皮下施用单次剂量增强的神经营养因子多肽后本来可获得神经营养因子多肽的时间相比，它在更长的时间范围内发生。在一个方面，持续释放将是在至少约1周至2周的时间范围内发生的释放。在另一个方面，持续释放将是在至少约4个月的时间范围内发生的释放。释放的持续性和释放的水平可以受持续释放装置的类型(例如，可编程泵或渗透驱动泵)或所用的持续释放组合物(例如，单体比率、分子量、嵌段组成、和聚合物组成是否多样性)、多肽载量和/或产生所需作用的赋形剂的选择所影响，如本文中充分描述。

术语“转化”或“转染”指将一个或多个核酸分子转移至宿主细胞或生物中。将核酸分子导入宿主细胞中的方法包括例如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖介导转染法、微量注射法、阳离子脂类介导转染法、电穿孔法、划痕负载法(scrape loading)、射弹导入法或病毒或其他感染介质感染法。“转化的”、“转导的”或“转基因的”在细胞的语境下，是指已经导入有重组或异源核酸分子(例如，一个或多个DNA构建体或RNA或siRNA对应物)的宿主细胞或生物。核酸分子可以稳定地表达(即，以有功能的形式在细胞中维持超过约三个月)或以有功能的形式在细胞中非稳定地维持不足三个月，即，瞬时表达。例如，“转化的”、“转化体”、和“转基因”细胞已经经历转化过程并且含有外来核酸分子。术语“未转化的”指未曾经历转化过程的细胞。

术语“治疗性”或“治疗”意指至减轻、减缓、延迟、减弱、逆转、改善、控制或防止患者中某病状的至少一个症状。术语“治疗性”也可以意指停滞、延迟发作(即，在疾病临床表现之前的时间段)和/或降低某病状发展或加重的风险。

如本文所用，术语“治疗有效量”、“预防有效量”或“诊断有效量”是为了在施用后产生所需生物学反应所需要的该活性试剂的量，所述活性试剂例如是增强的神经营养因子多肽、包含有编码此类增强的神经营养因子其核苷酸序列的多核苷酸、或表达重组增强的神经营养因子的宿主细胞。

术语“变体”指与参比多核苷酸或多肽不相同，但是仍保持一些其基本性能的多核苷酸或多肽。常见的多肽变体在氨基酸序列上与参比多肽不同。通常，改变是有限的，从而参比多肽和变体的序列是总体相似的，并且在许多区域内是相同的。变体和参比多肽可以因一个或多个置换、插入或缺失，以其任意组合在氨基酸序列上不同。置换或插入的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码的氨基酸残基。

术语“野生型神经营养因子”或“前神经营养因子原”指编码氨基酸序列(表D3中的SEQ ID NO：26)的基因。术语“成熟野生型神经营养因子”或“成熟的人神经营养因子”指编码已经通过移除分泌信号和前蛋白该加工过的氨基酸序列(表D2中的SEQ ID NO：5)的基因。术语“NRTN”指编码野生型神经营养因子的基因。

除非另外说明，本发明的实施将采用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术属于本领域普通技术人员的能力范围。文献中解释了此类技术。见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等人(1995年和定期增补内容；Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和6章，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak和amesO’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；OxfordUniversity Press；M.J.Gait(编者)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I，编者Edward Harlow，DavidLane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual，Ed Harlow(编者)，David Lane(编者)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-3，4-2)，1855.Handbook of Drug Screening，Ramakri shna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes编著(2001，New York，N.Y.，Marcel Dekker，ISBN0-8247-0562-9)；和Lab Ref：A Handbook of Rec ipes，Reagents，and OtherReference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编著，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。这些通用教材的每一部通过引用的方式并入本文。

除非另外定义，本文中所用的全部技术术语及科学术语，具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述相似或等效的任何方法、组合物、试剂、细胞，都可以用于实施或检验本发明，然而优选的方法和材料是在本文中所描述的。

上文所讨论的出版物仅提供在本申请的提交日期之前的相关公开内容。不应解释为本发明因为利用在先发明，而不能被给予对于此类公开具有占先权的权利。

将本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份单独的出版物或参考文献通过引用方式，如充分所述的那样并入本文。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式，以上述针对出版物和参考文献的方式完整并入本文。

概述

本发明部分地基于发现这样的增强的神经营养因子分子，其具有降低的肝素和硫酸乙酰肝素结合能力，但意外地仍保留一旦与受体复合物结合就诱导RET蛋白磷酸化的能力。因此，在不同的实施方案中，本发明包括纯化的多肽、编码增强的神经营养因子多肽的多核苷酸、含有所述多核苷酸的重组载体、和表达增强的神经营养因子多肽的宿主，其中所述增强的神经营养因子多肽拥有诱导RET磷酸化的能力和拥有降低的肝素结合亲和力。另外，本发明中包括这些多种实施方案在治疗人类疾病和病症中的用途。

I.神经营养因子多肽

如本文所用的术语“增强的神经营养因子多肽”或“增强的神经营养因子”或“增强的NRTN”包括全部天然存在形式的和合成形式的神经营养因子，它们与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5相比区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63位氨基酸的区域内，具有至少一个带正电荷氨基酸的突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在另一个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少两个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在另一个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少三个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在另一个方面，增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少五个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在一个实施方案中，术语“增强的神经营养因子多肽”指一种多肽，该多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO：5)在所述成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少90％相同，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。在另一个方面，用于任一种本发明方法中的“增强的人神经营养因子多肽”与(成熟野生型神经营养因子)SEQ ID NO：5在所述成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少95％相同，但将成熟的人神经营养因子的第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。

在一个实施方案中，使用102个氨基酸长的成熟野生型神经营养因子(SEQID NO：5)的编号，与成熟野生型神经营养因子相比，所述增强的神经营养因子多肽包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸处的一个或多个突变。在本发明的一个方面，增强的神经营养因子在成熟人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内部，含有1个至13个氨基酸突变。在一个方面，增强的神经营养因子将包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸突变，所述突变在成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内部。在又一个方面，增强的神经营养因子将包含3、5、7、9或11个氨基酸突变，所述突变在成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的区域内部。

在增强的神经营养因子多肽中任一种的一个方面，所述一个或多个突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸至增强的神经营养因子中。在增强的神经营养因子多肽中任一种的另一方面，所述一个或多个突变导入至少一个独立地选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸至增强的神经营养因子中。

在另一个方面，增强的神经营养因子多肽包含由ARLQGQGALVGS序列(SEQID NO：25)对第51至第62位氨基酸的替换。在另一个方面，增强的神经营养因子多肽包含选自SEQ ID NO：22至25(表D1)的序列，其中与成熟的野生型人神经营养因子相比，所述增强的神经营养因子多肽显示出降低的肝素亲和力。

在本发明的又一个方面，增强的神经营养因子多肽将包含SEQ ID NO：1、2、3或4(表D2)。

与野生型序列相比，变体中置换的氨基酸以粗体字显。

增强的神经营养因子多肽可以拥有在第51至63残基区域外部的额外氨基酸置换，所述置换也不实质性影响与肝素结合或RET的磷酸化诱导。另外，已经将成熟的人神经营养因子的天然存在变体测序，并且本领域已知所述变体至少部分地是功能上可互换的。因而基于人以及其他物种的神经营养因子的同源物、直向同源物和天然存在异构体中任一者的序列，选择如表D3中所显示的神经营养因子的天然存在变体(见SEQ ID NOs：26至30)，来产生含有一个或多个保守氨基酸变化的增强的神经营养因子，将是例行事务。

本领域已知，可合成地修饰蛋白质或肽的序列，同时保留它们的有用活性，并且这可以使用本领域内标准的和文献中广泛描述的技术实现，例如，随机诱变或位点定向诱变、切割和连接核酸，或者通过化学合成或修饰氨基酸或多肽链。例如，可以将保守性氨基酸突变修饰导入增强的神经营养因子中并且视为属于本发明的范围。

增强的神经营养因子因而可以基于神经营养因子的任何天然存在的异构体，在包含第51至63位氨基酸的肝素结合区的外部，进行包含一个或多个氨基酸缺失、添加、插入和/或置换。这些突变可以是连续或非连续的。代表性的变体可以包括与表D2中所列的任何序列相比，具有1至8个、或更优选地1至4个、1至3个或者1或2个氨基酸置换、插入和/或缺失的那些变体。

类似地，如果在使用增强的人神经营养因子时，出现免疫原性顾虑，则解决和/或减弱这些顾虑属于本领域技术的能力范围，例如，通过使用自动化的计算机识别程序来鉴定潜在的T细胞表位，和使用定向进化方法来鉴定免疫原性更小的形式。可以产生任何的此类修饰或其组合并且用于本发明的任何方法中，只要其活性仍保持。

可以在本发明的任何方法中使用的增强的神经营养因子多肽可以具有这样的氨基酸序列，其与成熟的人神经营养因子氨基酸序列(SEQ ID NO：5)在成熟野生型神经营养因子的长度范围内基本上同源或基本上相似，所述长度不包括由成熟人神经营养因子的第51至第63位残基包括的13个氨基酸(即，与SEQ ID NO：5的第1至第50位氨基酸、第64至第102位氨基酸基本上同源或基本上相似)。

另外在一些实施方案中，增强的神经营养因子多肽可以包含源自其他充分表征的分泌蛋白(如免疫球蛋白)中的合成或天然存在的分泌信号序列，包括例如IgG分泌信号序列。特别地，将野生型神经营养因子最初合成为前蛋白原，其包含分泌信号(第1-19位氨基酸)和包含第20至95位氨基酸的前肽，所述前肽在生物合成和从细胞分泌期间受到加工。因此，在一个方面，本发明的增强的神经营养因子多肽可以包括与野生型神经营养因子(SEQ ID NO：26)中的那些前序列和原序列相同或基本上相似的前序列和原序列(pro sequence)。

在一些实施方案中，此类蛋白质可以受蛋白酶剪切作用加工以原位形成增强的成熟神经营养因子。此类融合蛋白包括例如将增强的神经营养因子与遍在蛋白融合以提供新的N端氨基酸，或使用分泌信号以介导将增强的神经营养因子高水平分泌至细胞外介质中，或使用N或C端表位标签以改善纯化或检测。

在其他实施方案中，也包括增强的人神经营养因子与其他蛋白质的融合蛋白，并且这些融合蛋白可以增加增强的神经营养因子多肽的生物学活性、靶向性、生物学寿命、渗透血脑屏障的能力或药物代谢动力学特性。改善药物代谢动力学特性的融合蛋白的实例包括而不限于与人白蛋白(Osborn等人：Eur.J.Pharmacol.456(1-3)：149-158，(2002))、抗体Fc结构域、多聚Glu或多聚Asp序列和转铁蛋白的融合物。另外，与由氨基酸Pro、Ala和Ser(’PAS化’)组成的构象上无序的多肽序列或羟乙基淀粉(以商标

出售)的融合，提供了增加增强的神经营养因子的水动力学体积的简单方式。这种额外的延伸采取大体积的随机结构，这可显著地增加所得到的融合蛋白的尺寸。通过这种手段，一般迟滞肾过滤对增强的神经营养因子的快速清除作用达几个数量级。另外，也已经显示，Ig G融合蛋白的使用使得蛋白质与蛋白质(如GDNF)的融合蛋白渗透血脑屏障成为可能(Fu等人，(2010)Brain Res.1352：208-13)。构思用于本发明内的一种额外融合蛋白方法包括将增强的神经营养因子与多聚化结构域融合。代表性多聚化结构域包括而不限于卷曲螺旋二聚化结构域如存在于某些DNA结合多肽中的亮氨酸拉链结构域、免疫球蛋白Fab恒定区二聚化结构域如免疫球蛋白重链CH1恒定区或免疫球蛋白轻链恒定区。在优选的实施方案中，多聚化结构域源自四连蛋白并且更特别地包含四连蛋白三聚化结构元件，这详述于WO 98/56906中。

可以理解柔性分子接头(或间隔区)可以任选地介于增强的神经营养因子和本文中公开的任何融合蛋白之间并且共价地连接这两者。可以在本发明方法、蛋白质、多核苷酸和宿主细胞的任一者中使用任何的此类融合蛋白。

增强的神经营养因子可以处于其天然形式，即，例如它们在自然界中出现那些不同变体，所述变体可以视为人神经营养因子的功能上等同的变体，或它们可以是其功能上等同的天然衍生物，这些衍生物可以在它们的氨基酸序列方面不同，例如，因蛋白酶水解性截短作用(例如，从N端或C端或两端)或其他翻译后修饰所致。在本发明的任何方法中也特别地包括增强的人神经营养因子的天然存在的化学衍生物，包括其翻译后修饰和降解产物，如，增强的人神经营养因子的焦谷氨酰基变体、异天冬胺酰基变体、蛋白酶水解的变体、磷酸化变体、糖基化变体、氧化变体、异构化变体和脱胺变体。

增强的神经营养因子的化学修饰，其保留或稳定增强的神经营养因子活性或生物学半寿期，也可以随本文所述的任何方法一起使用。此类化学修饰策略包括，而不限于PEG化、糖基化和酰化(Clark等人：J.Biol.Chem.271(36)：21969-21977，(1996)；Roberts等人：Adv.Drug.Deliv.Rev.54(4)：459-476，(2002)；Felix等人：Int.J.Pept.Protein.Res.46(3-4)：253-264，(1995)；Garber AJ：Diabetes Obes.Metab.7(6)：666-74(2005))。也可以包括C-和N端保护基、稳定化氨基酸和拟肽单位。

多种PEG衍生物是可用的，并且适合用于PEG-缀合物的制备。例如，以商标名

Series出售的NOF公司PEG试剂提供了众多的PEG衍生物，包括甲氧基聚乙二醇和活化的PEG衍生物，例如甲氧基-PEG胺、马来酰亚胺和羧酸的衍生物，它们可用于通过多种方法偶联至药物、酶、磷脂和其他生物材料，并且Nektar Therapeutics高级PEG化技术还提供多样的PEG-偶联技术以改善治疗药的安全性和功效。

检索专利、公布的专利申请和相关出版物也将为阅读本公开的本领域技术人员提供明显可能的PEG偶联技术和PEG-衍生物。例如，美国专利6,436,386；5,932,462；5,900,461；5,824,784；和4,904,584号；所述文献的内容通过引用的方式完整并入，它们描述了此类技术和衍生物和用于制造它们的方法。因而，在考虑到本发明公开内容和其他这些专利的公开内容时，本领域技术人员可能将PEG、PEG-衍生物或一些其他聚合物与增强的神经营养因子偶联以延长其释放。

PEG是一种公知的聚合物，具有以下特性：溶解于水中和许多有机溶剂中、无毒性、无免疫原性并且还清亮、无色、无嗅和稳定。PEG的一种用途是将此聚合物共价接合至不溶性分子以使所得到的PEG-分子缀合物可溶。出于这些原因和其他原因，已经选择PEG作为用于接合的优选聚合物，但是它仅用于说明目的，而不起限制作用。可以用其他水溶性聚合物获得相似的产物，所述水溶性聚合物包括而不限于；聚乙烯醇、其他聚(烯化氧)如聚(丙二醇)等、聚(氧乙烯化多元醇)如聚(氧乙烯化甘油)等、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二噁烷、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐和聚氨基酸。本领域技术人员将能够基于想要的剂量、循环时间、蛋白酶解抗性和其他考虑事项选择想要的聚合物。

可以将天然L-氨基酸的异构体例如D-氨基酸，掺入以上形式的增强的神经营养因子的任一者中，并且用于在本发明的任何方法中。额外的变体可以包括单个或多个氨基酸的氨基端和/或羧基端融合物以及序列内的插入。更长的肽可以包含增强的神经营养因子序列的一者或多者的多重副本。插入型氨基酸序列变体是在蛋白质中的某位点处导入一个或多个氨基酸残基的那些变体。缺失型变体以从序列中移除一个或多个氨基酸为特征。变体可以例如包括，如在其他物种中或归因于地理变异而在自然界中出现的不同等位变体。

增强的神经营养因子的变体、衍生物和融合蛋白是功能上等同的，在于它们具有可检测的神经营养因子活性。更具体地，它们显示出至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、优选地至少60％、更优选地至少80％的人神经营养因子活性。因而它们能够替代神经营养因子本身。这种活性意指天然人神经营养因子显示的任何活性，无论是在体内或体外试验系统中显示的生理学反应，还是由天然人神经营养因子介导的任何生物学活性或反应，例如，在基于酶或细胞的测定方面或在与试验组织、膜或金属离子的结合方面。增强的神经营养因子的全部此类变体、衍生物、融合蛋白或片段均包含于并且可以用于，本文所公开和/或要求保护的多核苷酸、载体、宿主细胞和方法的任一者中，并且它们均隶属于术语“增强的神经营养因子”。

用于确定有功能的神经营养因子的活性的合适测定法包括RET磷酸化测定法(Virtanen等人，(2005)“The first cysteine-rich domain of thereceptor GFRalphal stabilizes the binding of GDNF(受体GFRα1第一半胱氨酸丰富结构域稳定GDNF的结合作用).”Biochem J.387：817-824)，和神经突生长晕测定法(Virtanen等人，(2005)“The first cysteine-richdomain of the receptor GFRalphal stabilizes the binding of GDNF(受体GFRα1第一半胱氨酸丰富结构域稳定GDNF的结合作用).”Biochem J.387：817-824)；可溶性GFRα蛋白结合测定法(Virtanen等人，(2005)“Thefirst cysteine-rich domain of the receptor GFRalpha1 stabilizes thebinding of GDNF(受体GFRα1第一半胱氨酸丰富结构域稳定GDNF的结合作用).”Biochem J.387：817-824)，或N-共结合蛋白聚糖结合测定法(MaximM.Bespalov博士学位论文，2009年12月18日，赫尔辛基大学)，或在GFRα蛋白存在下的NCAM结合测定法(Paratcha等人，(2003)“The neural celladhesion molecule NCAM is an alternative signaling receptor for GDNFfamily ligands(神经细胞黏附分子NCAM是GDNF家族配体的替代性信号传导受体).”113：867-879)，或细胞表面上GPI锚定的GFRα蛋白结合测定法(Virtanen等人，(2005)“The first cysteine-rich domain of the receptorGFRalphal stabilizes the binding of GDNF(受体GFRα1第一半胱氨酸丰富结构域稳定GDNF的结合作用).”Biochem J.387：817-824)；在胚多巴胺能神经元上的体外存活测定法(Lindholm等人，(2007)“Novel neurotrophicfactor CDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo(新神经营养因子CDNF在体内保护和拯救中脑多巴胺神经元).”Nature 448：73-77)，胚颈上神经节交感神经元的体外存活测定法(Yu等人，(2003)“GDNF衍生的交感神经元因新的非线粒体途径死亡.”J Cell Biol 163：987-997)，背根神经节或运动神经元的体外存活测定法(Paveliev等人(2004)“GDNF家族配体在成熟的感觉神经元中激活轴突生长期间的多个事件”Mol CellNeurosci 25：453-459)；和神经毒性6-OHDA存在下保护成年啮齿类多巴胺能神经元的能力测定法(Lindholm等人，(2007)“Novel neurotrophic factorCDNF protects and rescues midbrain dopamine neurons in vivo(新神经营养因子CDNF在体内保护和拯救中脑多巴胺神经元).”Nature 448：73-77)或体内MPTP损害测定法(Schober等人，(2007)“GDNF applied to theMPTP-lesioned nigrostriatal system requires TGF-beta for itsneuroprotective action(应用于MPTP损害的黑质纹状体系统的GDNF要求TGF-β用于其神经保护作用).”Neurobiol Dis.25：378-391)。

例如，可以使用已经用人RET长同工型稳定转染(

等人，1999，EMBO J.，18：5901)和已经用大鼠GFRα1或人GFRα2瞬时转染的成纤维细胞，容易地实施RET磷酸化测定法。在转染后1日，将细胞在无血清的DMEM(Sigma)中饥饿4小时，并随后施加试验性神经营养因子10分钟。此后，裂解成纤维细胞，并且将裂解物用于RET的免疫沉淀(使用针对RET的抗体，例如SantaCruz Biotechnology Inc可商业获得的抗体)。免疫复合物可以使用蛋白G-Sepharose(GE Healthcare)收集并且依靠8％SDS-PAGE和蛋白质印迹法来分析。可以通过针对磷酸酪氨酸的抗体(从Upstate Biotechnology可商业获得)来检测RET的磷酸化。RET的成功磷酸化表明，所述神经营养因子是功能上神经营养因子活性的。

在另一个方面，与野生型的成熟人神经营养因子相比，本发明的增强的神经营养因子多肽具有减少的结合至肝素或硫酸乙酰肝素的亲和力。在不同的实施方案中，与野生型的成熟人神经营养因子相比，增强的神经营养因子多肽的亲和力可以具有约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍或约1000倍较低的对肝素或硫酸乙酰肝素的亲和力。

因此，在不同方面，本发明的增强的神经营养因子多肽可以具有高于约5×10^-6M、高于约1×10^-6M、高于约5×10^-7M、高于约1×10^-7M、高于5×10^-8M或高于1×10^-8M的表观肝素亲和力(即具有K_d)。测量在野生型成熟神经营养因子具有约2-4×10^-9M表观肝素亲和力(K_d)的条件下进行。

可以使用多种本领域认可的方法，包括基于表面等离子体共振的方法，例如使用由GE Healthcare以商标名

出售的仪器，或基于溶液的亲和力测定法，例如使用从Sapidyne可商业获得的KinExA技术，可容易地测定增强的神经营养因子多肽对肝素的亲和力。这些系统包含能够容易和精确测定增强的神经营养因子对肝素亲和力的、种类繁多的市售试剂和偶联试剂。

另外，可以将从肝素亲和柱(如由GE Healthcare Life Sciences以商标名HITRAP^TM肝素HP出售的那些肝素亲和柱)洗脱蛋白质所需要的离子强度作为表征，来测定增强的神经营养因子多肽对肝素的相对亲和力。

因此在本发明的一个方面，所增强的神经营养因子多肽可以在小于约1摩尔NaCl的NaCl浓度下从HITRAP^TM肝素HP洗脱。在本发明的其他方面，当使用由10mM Hepes pH 7.2和增加NaCl至2M组成的连续NaCl梯度洗脱时，本发明的增强的神经营养因子多肽可以在小于1.0M；小于0.9M NaCl；小于0.8M NaCl；小于0.7M NaCl；小于0.6M NaCl；小于0.5M NaCl；小于0.4M NaCl；或更小于0.3摩尔NaCl的NaCl浓度时从HITRAP^TM肝素HP洗脱。尽管可以理解，蛋白质将从柱中经过多个级分洗脱，但是目的多肽的大部分(即大于约75％)质量将在小于给定NaCl浓度时洗脱，如通过常规手段例如但不限于蛋白质印迹法或ELISA所测量。在一个交互类型的实验中，包含增强的神经营养因子多肽的本发明多肽将或在固定化支持物上或在大于1M NaCl的溶液中，而不与肝素或硫酸乙酰肝素良好结合。例如，在大于1M NaCl的浓度下，少于95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的本发明多肽将结合。

在另一个方面，本发明的增强的神经营养因子多肽可以与递送至治疗部位的药物偶联，或与促进包含目的细胞的部位成像的可检测标记物偶联。用于将蛋白质与此类可检测标记物偶联的方法是本领域公知的，而使用可检测标记物成像的方法也是本领域公知的。使用多种标记物，标记的蛋白质可以用于多种测定法中。合适的检测手段包括使用可检测标记物，如放射性核素、酶、辅酶、荧光剂、化学发光剂、生色原、酶底物或辅因子、酶抑制剂、辅基复合体、自由基、粒子、染料等。

因此，在一个方面，本发明包括在其N端或C端以可检测标记物标记的增强的神经营养因子或药物。

荧光性可检测标记物的实例包括稀土元素螯合物(铕螯合物)、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、丽丝胺、藻红蛋白、得克萨斯红、以及红外染料如Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、IR800CW、ICG和以商标名

FLUORS如FLUORS 680和750出售的染料，所述全部标记物均从Molecularprobes和其他供货商可商业获得。

合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合体的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯、藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适放射性物质的实例包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。此类标记的试剂可以用于多种公知的测定法如放射免疫测定、酶免疫测定例如ELISA、荧光免疫测定等。

本发明的增强的神经营养因子多肽可以与治疗性部分如细胞毒素、治疗剂或放射性金属离子或放射性同位素缀合。放射性同位素的实例包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。此类缀合物可以用于调节给定的生物学反应；药物部分不得解释为限于经典的化学治疗药。例如，药物部分可以是拥有所需生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可以包括例如毒素，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。

II.编码增强的神经营养因子的多核苷酸

在另一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码本发明的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列。

在一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO：5)区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少一个带正电荷的氨基酸突变；并且其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述增强的神经营养因子具有降低的肝素亲和力。

在另一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少两个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在另一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5的区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少三个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在另一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子与相应的成熟野生型神经营养因子SEQ ID NO：5区别在于，所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少五个带正电荷的氨基酸突变，并且与成熟的人神经营养因子相比，显示出降低的肝素亲和力。

在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子与(SEQ ID NO：5)在成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少90％相同，但将成熟人神经营养因子的第51至第63位残基包括的13个氨基酸除外。在另一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子与(SEQ ID NO：5)在成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内至少95％相同，但将成熟人神经营养因子的第51至第63位残基包括的13个氨基酸除外。

在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中使用102个氨基酸的成熟野生型神经营养因子的编号，与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO：5)相比，所述增强的神经营养因子包含在第51、52、54、55、56、57、58、60、61、62或63位氨基酸处的一个或多个突变。在本发明的一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子包含在由成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内的1个至13个氨基酸突变。在一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中与成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列相比，所述增强的神经营养因子包含在由成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸突变。在又一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子的核苷酸序列，其中增强的神经营养因子包含在由成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内的3、5、7或9个氨基酸突变。

在本发明的一个方面，本发明的分离的多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子多肽包含在由成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基包括的区域内的至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。在本发明分离的多核苷酸中任一者的另一个方面，所述多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子多肽包含在由成熟的人神经营养因子(SEQ ID NO：5)第51至第63位残基所包括的区域内的至少一个独立选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

在本发明分离的多核苷酸中任一者的另一个方面，所述多核苷酸包含了编码增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列，其中所述增强的神经营养因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS对第51至62位氨基酸的替换。在本发明分离的多核苷酸中任一者的另一个方面，所述多核苷酸包含了编码下述序列的核苷酸序列，其中所述序列选自SEQ ID NO：6至9(表D4)。

在一个方面，本发明的多核苷酸包含这样的核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：6、7、8或9。

本领域技术人员理解，遗传密码子是简并的，并且一些氨基酸具有多个密码子。因此，多个多核苷酸可以编码本发明的多肽。另外，可以出于多种原因操作多核苷酸序列。实例包括但不限于掺入优选的密码子以增强所述多核苷酸在多种生物中的表达(通常见Nakamura等人，Nuc.Acid.Res.(2000)28(1)：292)。此外，可以并入沉默突变以导入或消除限制性位点、降低CpG双核苷酸基序的密度(见例如，Kameda等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(2006)349(4)：1269-1277)或减弱单链序列形成茎-环结构的能力(见，例如，Zuker M.，Nucl.Acid.Res.(2003)；31(13)：3406-3415)。此外，表达可以通过在起始密码子处包含Kozak共有序列[即(a/g)cc(a/g)ccATGg]而进一步优化。用于此目的的Kozak共有序列是本领域已知的(Mantyh等人PNAS 92：2662-2666(1995)；Mantyh等人Prot.Exp.&Purif.6，124(1995))。

Ic重组载体

本发明的另一个实施方案提供了包含多核苷酸的重组载体和重组病毒载体，其中所述多核苷酸的序列包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本文中公开的任一增强的神经营养因子多肽。

选择适于表达本发明的增强的神经营养因子多肽的重组载体、用于插入表达所述增强的神经营养因子的核酸序列至该载体中的方法、和递送该重组载体至目的细胞的方法，处于本领域的技术范围内。见例如Tuschl，T.(2002)，Nat.Biotechnol，20：446-448；Brummelkamp T R等人(2002)，Science 296：550-553；Miyagishi M等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：497-500；PaddisonP J等人(2002)，Genes Dev.16：948-958；Lee N S等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：500-505；Paul C P等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：505-508，Conese等人，Gene Therapy 11：1735-1742(2004)，和Fjord-Larsen等人，(2005)Exp Neurol 195：49-60，所述文献的全部公开内容通过引用方式并入本文。

代表性的市售重组表达载体包括，例如来自Invitrogen的pREP4、pCEP4、pREP7和pcDNA3.1和pcDNA^TM5/FRT和来自Stratagene的pBK-CMV和pExchange-6核心载体。

重组载体可以直接地或与合适的递送试剂联合施用至患者，所述递送试剂包括Minis Transit LT1亲脂性试剂；lipofectin；脂质胺(lipofectamine)；cellfectin；聚阳离子(例如，聚赖氨酸)或脂质体。

选择适用于本发明中的重组病毒载体、用于插入表达所述增强的神经营养因子多肽的核酸序列至该载体中的方法、和递送该病毒载体至目的细胞的方法，处于本领域的技术范围内。见例如，Dornburg R(1995)，Gene Therap.2：301-310；Eglitis M A(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller A D(1990)，Hum Gene Therap.1：5-14；和Anderson W F(1998)，Nature 392：25-30，所述文献的完整内容通过引用方式并入本文。

代表性的市售病毒表达载体包括，但不限于基于腺病毒的系统，如从Crucell，Inc.可获得的Per.C6系统，基于慢病毒的系统如来自Invitrogen的pLP1，和逆转录病毒载体如来自Stratagene(US)的逆转录病毒载体pFB-ERV和pCFB-EGSH。

通常，能够接受待表达的增强的神经营养因子多肽编码序列的、任何病毒载体可以使用，例如，源自腺病毒(AV)；腺联病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒、乳头瘤病毒(美国专利6,399,383和7,205,126号)等的载体。病毒载体的嗜性也可以将载体用来自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假病毒化来进行修饰。例如，本发明的AAV载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白假病毒化。也可以使用例如乳头瘤病毒的非感染性假病毒粒子，以使得高效递送基因至粘膜成为可能(美国专利7,205,126号，Peng等人，Gene Ther.2010年7月29日，电子出版物)。

在一个方面，可以在本发明中使用源自AV和AAV的病毒载体。用于表达本发明的增强的神经营养因子的合适AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法、和用于将该载体递送至靶细胞内的方法，在Samulski R等人(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher K J等人(1996)，J.Virol.，70：520-532；SamulskiR等人(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利5,252,479号；美国专利5,139,941号；国际专利申请号WO 94/13788；和国际专利申请号WO 93/24641中描述，所述文献的完整内容通过引用方式并入本文。

一般地，所述重组载体和重组病毒载体包含了指导本发明的多核苷酸在多种系统中、在体外和体内表达的表达控制序列。例如，一套调节元件将指导在某些哺乳动物细胞或组织中表达，并且另一套调节元件将指导在细菌细胞的表达，并且还有第三套调节元件将指导在杆状病毒系统中表达。一些载体是杂合载体，其含有为在多于一个系统中表达所需要的调节元件。含有这些多种调节系统的载体是市售的，并且本领域技术人员将容易地能够将本发明的多核苷酸克隆至此类载体中。

在一些情况下，该载体将拥有用于在多种细胞中表达的启动子。在其他情况下，该载体将拥有具有组织特异性的启动子。例如，该启动子仅仅在神经元中指导表达。在一个方面，本发明的载体包含其核苷酸序列编码SEQ ID NO：1、2、3或4的多核苷酸。

IV.宿主细胞

在另一个实施方案中，本发明提供了用本发明载体转化的宿主细胞。在一个方面，本发明的增强的神经营养因子多肽由所述宿主细胞表达，以产生或制造增强的神经营养因子多肽。此类宿主细胞包括细菌、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞。有用的微生物宿主包括，但不限于来自芽孢杆菌属(Bacillus)、埃西氏菌(Escherichia)(如大肠杆菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、沙门氏菌属(Salmonella)、欧文氏菌属(Erwinia)的细菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、多个大肠杆菌菌株(例如HB101(ATCC NO.33694)、DH5α、DH10和MC1061(ATCCNO.53338))。本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株也可用作表达多肽的宿主细胞，包括来自汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、Rhino-sporidium、酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的那些菌株和其他真菌。优选的酵母细胞包括例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerivisae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。额外地，根据需要，可以使用昆虫细胞系统以产生本发明的增强的神经营养因子。此类系统例如由Kitts等人，Biotechniques，14：810-817(1993)；Lucklow，Curr.Opin.Biotechnol.，4：564-572(1993)；和Lucklow等人(J.Virol.，67：4566-4579(1993)中描述。优选的昆虫细胞包括Sf-9和HI5(Invitrogen，Carlsbad，Calif.)。

众多合适的哺乳动物宿主细胞也是本领域已知的，并且许多是从美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)可获得的。实例包括，但不限于哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC No.CCL61)、CHO DHFR-细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：4216-4220(1980))、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCCNo.CRL1573)、PER.C6细胞、NSO、ARPE-19或3T3细胞(ATCC No.CCL92)。选择合适的哺乳动物宿主细胞和用于转化、培养、扩增、筛选和产物产生及纯化的方法是本领域已知的。其他合适的哺乳动物细胞系是猴COS-1(ATCC No.CRL1650)和COS-7细胞系(ATCC No.CRL1651)及CV-1细胞系(ATCC No.CCL70)。其他示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化的细胞系。正常的二倍体细胞、源自原代组织以及原代外植体体外培养的细胞株也是合适的。候选细胞可以是在所选基因方面存在基因缺陷，或者可以含有优势效应的选择基因。其他合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于小鼠成神经细胞瘤N2A细胞、HeLa、小鼠L-929细胞、源自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系，它们是从ATCC可获得的。这些细胞系的每一种是已知的并且可用于蛋白质表达。

在另一个方面，所述宿主细胞可以通过细胞疗法用来表达和递送增强的神经营养因子。因此，在另一个方面，本发明包括用于治疗疾病或病症的细胞疗法，其包括施用表达或能够表达增强的神经营养因子的宿主细胞。在一个方面，所述疾病或病症选自肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、和视网膜病变。

细胞疗法包括施用已经在身体外部经选择、增殖和药理学处理或改变(即基因修饰)的细胞(Bordignon，C.等人，Cell Therapy：Achievements andPerspectives(细胞疗法：成就与展望)(1999)，Haematologica，84，第1110-1149页)。此类宿主细胞包括例如，已经受到基因修饰以表达增强的神经营养因子多肽的原代细胞(包括巨噬细胞)和干细胞。细胞疗法的目的是替换、修复或增强受损组织或器官的生物学功能(Bordignon，C.等人，(1999)，Haematologica，84，第1110-1149页)。

已经研究使用移植的细胞治疗众多内分泌病，如贫血和侏儒症、血液病、肾和肝功能衰竭、垂体及CNS缺损和糖尿病(Uludag等人，Technology ofMammalian Cell Encapsulation(2000)，Advanced Drug Delivery Reviews，42，第29-64页)。移植的细胞可以发挥作用以释放生物活性化合物如本发明的增强的神经营养因子多肽，进而替换在受影响的系统中不存在或产生不够足量的内源性神经营养因子。使用其他激素和神经递质的此类方法的实例，包括移植分泌GDNF的被囊细胞以治疗帕金森病(Lindvall O和Wahlberg LU(2008)Exp Neurol.209(1)：82-88)、使用巨噬细胞介导的GDNF递送(Biju K等人，(2010)Mol Ther.18(8)：1536-44)、植入胰岛细胞用于治疗胰岛素依赖性糖尿病(Miyamoto，M，Current Progress and Perspectives in Cell Therapy forDiabetes Mellitus(用于糖尿病的细胞疗法的当前进展和前景)(2001)，HumanCell，14，第293-300页)、和植入产生多巴胺的神经元用于治疗帕金森病(Lindvall，O.和Hagell，P.，Cell Therapy and Transplantation inParkinson’s Disease(帕金森病中的细胞疗法和细胞移植)(2001)，ClinicalChemistry and Laboratory Medicine，39，第356-361页)。

与完整器官移植物相比，细胞疗法更容易获得。然而，受体免疫系统对移植细胞的排异仍是问题，尤其在需要长期使用的情况下，如糖尿病患者胰岛植入物的情况(Morris，P.J.，Immunoprotection of Therapeutic CellTransplants by Encapsulation(通过包囊作用对治疗性细胞移植物进行免疫保护)，(1996)，Trends in Biotechnology，14，第163-167页)。作为免疫抑制的替代，已经开发了其中通过膜阻隔物物理地保护移植细胞避免受体免疫系统影响的包囊法(Morris，P.J.，Immunoprotection of Therapeutic CellTransplants by Encapsulation(通过包囊作用对治疗性细胞移植物进行免疫保护)，(1996)，Trends in Biotechnology，14，第163-167页)。使用被囊细胞是优选的，因为免疫抑制药物的全身性施用与有害副作用和并发症相关，这归因于免疫系统的非特异性抑制。

因此，在另一个方面，本发明包括用于治疗疾病或病症的细胞疗法，其包括施用表达或能够表达增强的神经营养因子的宿主细胞，其中宿主细胞已经是包入胶囊内的。

包囊法通常划分为两类：(1)微囊化，其一般涉及直径0.3至1.5mm大小的球状小囊泡，所述囊泡含有单个细胞或小细胞团块和(2)巨囊化，其涉及在管或盘形状的中空装置中的较大细胞团(Uludag等人，(2000)，Advanced DrugDelivery Reviews，42，第29-64页)。

认为膜将理想地保护被囊细胞免遭免疫应答影响，与此同时是充分可渗透的，以允许流入细胞存活需要的分子并分泌期望的生物活性化合物和废物。众多材料已经用于细胞包囊，其中多糖藻酸盐最常见(Rowely，J.A.等人，Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials(藻酸盐水凝胶作为合成性胞外基质材料)(1999)，Biomaterials，20，第45-53页)。膜一般由形成胶化复合物的、带相反电荷的天然或合成聚合物所组成；其中多聚阴离子藻酸盐和多聚阳离子聚(L-赖氨酸)的组合广泛地使用(Uludag等人，(2000)，Advanced Drug Delivery Reviews，42，第29-64页)。通过变动相应聚合物的浓度和它们的接触时间，可以调节所产生的水凝胶膜的孔隙度。其他通常使用的材料包括通常有较大毒性的(甲基)丙烯酸酯，和作为中性聚合物的琼脂糖(Uludag等人，(2000)，Advanced Drug Delivery Reviews，42，第29-64页)。

细胞或细胞团块可以通过保形包覆技术包入胶囊，因而膜与细胞直接接触(Uludag等人，(2000)，Advanced Drug Delivery Reviews，42，第29-64页)。或者，膜可以围绕含有细胞团块的芯部形成。可以将所述芯部工程化，以包括促进细胞存活或细胞功能的组分，如包含养分和营养因子。

可以将膜或芯部工程化以作为合成性胞外基质(ECM)发挥作用。ECM组分的添加可以辅助细胞表现分化的功能并且可使胶囊内的细胞团块组织化(Uludag等人，(2000)，Advanced Drug Delivery Reviews，42，第29-64页)。已经相对于贴壁细胞研究了合成性ECM的用途，因为大部分藻酸盐膜的亲水性本质通常排斥细胞接合和展开(Rowely，J.A.等人，Alginate Hydrogels asSynthetic Extracellular Matrix Materials(藻酸盐水凝胶作为合成性胞外基质材料)(1999)，Biomaterials，20，第45-53页).用含有RGD配体共价修饰的藻酸盐水凝胶片，已经显示可支持成肌细胞的生长(Rowely，J.A.等人，Alginate Hydrogels as Synthetic Extracellular Matrix Materials(藻酸盐水凝胶作为合成性胞外基质材料)(1999)，Biomaterials，20，第45-53页)。相对于封闭的胶囊、仅当细胞生长于平坦片材的情形下，所述细胞与所述修饰藻酸盐水凝胶的相互作用才可实现(Rowley等人，1999)。

Lim，美国专利4,409,331和4,352,883号公开了通过细胞体外产生生物材料的微囊化方法的用途，其中胶囊具有取决于正在产生的目的生物材料的可变通透性。Wu等人，Int.J.Pancreatology，3：91-100(1988)公开了将产生胰岛素的微囊化胰岛移植至患糖尿病的大鼠中。Aebischer等人，Biomaterials，12：50-55(1991)公开了分泌多巴胺的细胞的巨囊化。

另外，多种包囊介质可以在本发明的方法和疗法中使用。实例包括：含有纤维蛋白的琼脂糖，含有纤连蛋白的琼脂糖，或纤连蛋白和纤维蛋白原的组合。合适的天然衍生介质包括植物衍生的树胶，如碱金属藻酸盐和琼脂糖，和其他植物衍生的物质，如纤维素及其衍生物(例如，甲基纤维素)。动物组织衍生的介质如明胶和壳聚糖也是有用的。备选地，芯部基质可以由胞外基质(ECM)组分制成，如Kleinman等人，美国专利4,829,000号所描述。合适的合成性水凝胶包括聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇嵌段共聚物、聚苯乙烯磺酸钠、乙烯基-甲基-三苄基氯化铵和聚磷腈(Cohen，S.等人J.Anal.Chem.Soc.，112，第7832-7833页(1990))。

细胞可以包裹于中空纤维中或在几百微米大小的微胶囊内。前者具有较高机械稳定性和可恢复性的优点。另一方面，微胶囊具有利于贴壁依赖性细胞生长的较高的比表面积和利于养分供应和产物分泌的较低的传质阻力。为组合这两种方法的优势，微胶囊化的细胞可以进一步巨囊化，例如，在中空纤维中巨囊化；选择高度通透性的中空纤维将很少增加总的传质阻力。

微胶囊形成法是一项由制药工业用来制造持续释放产品的已知技术。在细胞胶囊化的领域内，藻酸盐的凝胶化是研究充分的系统。藻酸盐是从褐藻类抽取的葡糖醛酸内酯(glycuranan)。钙或其他多价反离子螯合了多糖中存在的毗连嵌段的α-1，4-L-葡糖醛酸内酯残基。将含有悬浮的活细胞的藻酸盐溶液滴入或挤入含有钙离子的溶液时，实现了细胞胶囊化。形成的微胶囊可以通过吸附多聚离子如聚赖氨酸进一步包覆，所述微胶囊可以由藻酸盐再次包覆。已经通过这种方法包囊了许多的细胞类型，包括胰岛、肝细胞、PC I12细胞、软骨细胞和成纤维细胞。

V.使用方法

在另一个实施方案中，本发明包括一种预防或治疗细胞变性或减少的方法，包括施用治疗有效量的以下物质至需要这种治疗的患者：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括以下物质用于治疗细胞变性或减少的用途：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在一个方面，所述细胞变性或减少包括神经元变性，所述神经元变性因周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经系统肿瘤、多发性硬化和感染的病状而产生。

在另一个方面，所述细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

因此在一个方面，本发明包括一种治疗神经变性脑病的方法，包括施用治疗有效量的以下物质至需要这种治疗的患者：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一方面，本发明包括以下物质用于治疗神经变性脑病的用途：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在这些方法中任一者的一个方面，所述神经变性病选自肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和痴呆。

在一个方面，本发明包括了停滞、延迟发作(即在临床表现神经变性脑病之前的时间段)或降低发展成神经变性脑病的风险的方法。在另一个方面，本发明包括了减缓、减轻、减弱、逆转、改善或阻止神经变性脑病的至少一个症状或体征的方法。

在一个方面，所述神经变性病是肌萎缩侧索硬化，并且该疾病的此类体征和症状包括：足和脚趾前部提起困难(垂足)，腿无力，手无力或笨拙，言语不清或吞咽困难，手臂、肩部和舌头的肌肉痉挛和颤搐，咀嚼、吞咽、交谈和呼吸困难。

在一个方面，所述神经变性病是帕金森病，并且该疾病的此类体征和症状包括：震颤、运动迟缓(运动徐缓)、肌肉僵硬、体姿和平衡受损、自主运动丧失、交谈困难和痴呆。

在一个方面，所述神经变性病是阿尔茨海默病，并且该疾病的此类体征和症状包括：记忆丧失、抽象思维困难、正确识字困难、定向障碍、判断力丧失、执行熟悉任务困难、和个性发生改变。

在一个方面，所述神经变性病是亨廷顿病，并且该疾病的此类体征和症状包括：个性发生改变、认知能力下降、轻度的平衡困难、笨拙、自主性面部运动、快速眼动、吞咽困难和痴呆。

在一个方面，所述神经变性病是痴呆，并且该疾病的此类体征和症状包括：健忘、语言困难、时间和地点错乱、判断力下降、和个性发生改变。

在另一个方面，本发明包括一种治疗神经元损伤的方法，包括施用治疗有效量的以下物质至需要这种治疗的患者：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括以下物质用于治疗神经元损伤的用途：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在一个方面，此类神经元损伤选自缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤和神经病理性疼痛。

在另一个方面，本发明包括一种治疗与衰老相关的疾病或病症的方法，包括施用治疗有效量的以下物质至需要这种治疗的患者：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括以下物质用于治疗与衰老相关的疾病或病症的用途：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在一个方面，此类疾病或病症选自听力下降、勃起障碍、外周或自主神经病变、视网膜病变和老年性痴呆。

在另一个方面，本发明包括一种治疗与糖尿病相关的疾病或病症的方法，包括施用治疗有效量的以下物质至需要这种治疗的患者：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一个实施方案中，本发明包括以下物质用于治疗与糖尿病相关的疾病或病症的用途：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在一个方面，此类疾病或病症选自高血糖症、I型糖尿病、II型糖尿病和1.5型糖尿病。

在另一个实施方案中，本发明提供了用于促进细胞(如干细胞)在培养基中生长和/或分化的方法，所述方法包括施用本发明的多肽、载体、病毒载体或宿主细胞至所述细胞。本发明的多肽，载体，病毒载体或宿主细胞可以施用于培养下的细胞，以改变靶细胞的表型特征和/或基因型特征。例如，可以使某些靶细胞暴露于本发明的多肽，从而所述多肽与细胞受体结合并且诱导该细胞内的信号转导。这种信号转导可以在靶细胞中诱导出任何期望目的的某些特性。仅作为举例并且不认为构成限制，施用本发明的多肽可以在靶细胞中诱导分化。这些分化的细胞可以具有多种用途，包括，但不限于在预防或治疗方案中植入受试者中。

以相似的方式，本发明的载体或病毒载体可以应用于培养下的靶细胞。通过任何手段转导本发明的核酸，可以导致具有所需品质的瞬时或稳定的基因型变化。最后，本发明的宿主细胞可以与培养下的靶细胞共培养，此时本发明的多肽或病毒载体由所述宿主细胞产生。产生的多肽或载体随后可以与培养下的细胞结合，以产生所需要的瞬时或稳定的基因型变化或表型变化。通常将以这种方式使用的宿主细胞视为“饲养细胞”，其原因在于所述宿主细胞的特性可以影响与之共培养的靶细胞。在与靶细胞共培养之前，本发明的宿主细胞可以或可以不经过照射。

VI.药物组合物

在一个实施方案中，本发明提供了包含治疗有效量的以下物质的药物组合物：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

用于本发明中的药物组合物可以根据本领域公知和文献中广泛讨论的技术和方法配制，并且可以包含分别用于蛋白质、多核苷酸和宿主细胞的任何已知载体、稀释剂或赋形剂。见例如，Gennaro(2000)Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy，第20版，ISBN：0683306472。

在一个方面，所述组合物可以为药学活性成分的无菌水溶液剂和/或混悬剂、气雾剂、油膏剂等形式。作为水溶液剂的制剂是最优选的。此类制剂一般含有增强的神经营养因子本身、水和充当稳定剂的一种或多种缓冲剂(例如，含有磷酸盐的缓冲液)和任选地一种或多种防腐剂。

此类制剂构成本发明的又一个方面，所述制剂含有例如约5.0至250微克、约5.0至200微克、约5.0至150微克、约5.0至120微克、约5.0至100微克、约5.0至80微克或上文所提及范围值中的任一者，例如约200微克、约180微克、约160微克、约140微克、约120微克、约100微克、约80微克、约60微克或约40微克的任一本发明的增强的神经营养因子多肽或本发明的多核苷酸或本发明的重组载体。在一个方面，此类制剂可以通过直接输注，或通过壳核内注射至脑中施用，每日1次或每周1次(Gill等人，(2003)Nat Med.9(5)：589-95；Lang等人，(2006)Ann Neurol.59(3)：459-66)。

所述增强的神经营养因子多肽的药物组合物可以包含增强的神经营养因子多肽的可药用盐。对于合适盐的综述，见Stahl和Wermuth的Handbook ofPharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use(Wiley-VCH，2002)。合适的碱性盐由可形成无毒盐的碱所生成。代表性实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐(Hemisalt)，例如，半硫酸盐和半钙盐。

适于肠胃外施用的本发明待用的增强的神经营养因子多肽的药物组合物，可以包含药学活性成分的无菌水溶液和/或混悬液，优选地制成与接受者的血液相等渗，通常使用氯化钠、丙三醇、葡萄糖、甘露醇、山梨醇等来制备。

适于口服施用的本发明的增强的神经营养因子多肽的药物组合物，可以例如包含无菌纯化的原粉形式的肽，所述原粉优选地由一层包膜或多层包膜(肠衣膜)覆盖，以保护所述肽免受在胃中降解并且从而使得这些物质能够从牙龈或在小肠中被吸收。活性成分在组合物中的总量可以从99.99至0.01重量百分数变动。

在本发明方法中，本发明的多核苷酸可以与递送试剂独立地组合，或者作为表达该多核苷酸的重组载体或病毒载体，施用至受试者。用于与本发明重组载体联合施用的合适递送试剂包括，Mirus Transit TKO亲脂性试剂；lipofectin；脂质胺(lipofectamine)；cellfectin；或者聚阳离子(例如，聚赖氨酸)或脂质体。

优选的递送试剂是脂质体。脂质体可以有助于递送重组载体至特定组织，并且也可以增加载体的血液半寿期。适用于本发明中的脂质体由标准的形成囊泡的脂类组成，所述脂类通常包括中性或带负电荷的磷脂和固醇，如胆固醇。一般通过考虑诸多因素，如所需要的脂质体大小和脂质体在血流中的半寿期，来指导脂类的选择。检索专利、公布的专利申请和相关出版物，也将为阅读本公开的本领域技术人员提供明显可能的脂质体技术。美国专利6,759,057；6,406,713；6,352,716；6,316,024；6,294,191；6,126,966；6,056,973；6,043,094；5,965,156；5,916,588；5,874,104；5,215,680和4,684,479号描述了脂质体和脂质包覆的微泡，和用于制造它们的方法，其内容通过引用方式并入本文。

脂质体可以包括本领域已知的任何脂质或脂质组合。例如，形成囊泡的脂类可以是天然存在或合成的脂类，包括磷脂如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和鞘磷脂，如美国专利6,056,973和5,874,104号所公开。形成囊泡的脂类也可以是糖脂、脑苷脂或阳离子脂类，如1，2-双油酰氧基-3-(三甲基氨基)丙烷(DOTAP)；N-1-(2，3-双十四烷氧)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)；N-1-(2，3-双油酰氧基)丙基]-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)；N-1-(2，3-双油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)；3-β-N-(N’，N’-二甲氨基乙烷)氨基甲酰胆固醇(DC-Chol)；或双十八烷二甲基溴化铵(DDAB)，如美国专利6,056,973号所公开。胆固醇也可以以适当的范围存在以赋予囊泡稳定性，如美国专利5,916,588和5,874,104号所公开。

可以通过本领域技术人员已知的标准技术制造用于本发明任何方法中的脂质体。例如，在一个实施方案中，如美国专利5,916,588号中所公开，制备了有效药物的缓冲溶液。随后，将合适的脂类如氢化大豆磷脂酰胆碱和胆固醇(二者均为粉末形式)溶解于氯仿等中并且由旋转蒸发法干燥。将因此形成的脂质薄膜重悬于二乙醚等中并且置于烧瓶中，并且在水浴中超声波处理，期间添加有效药物的缓冲溶液。一旦醚已经蒸发，则中断超声波处理并且施加氮气流直至移除残余醚。美国专利6,352,716；6,294,191；6,126,966；6,056,973；5,965,156和5,874,104号中描述了其他的标准制造方法。本发明的脂质体可以由本领域通常可接受的制造脂质体的任何方法所产生，所述方法包括而不限于上文所引用文献的方法(所述文献的内容通过引用方式并入本文)。

在一个方面，包裹本发明重组载体的脂质体，包含了可以将脂质体靶向特定细胞或组织的配体分子。在一个方面，修饰包裹本发明载体或多核苷酸的脂质体，从而以避免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如将具有抑制调理作用的组分结合于所述结构的表面来进行修饰。在一个实施方案中，本发明的脂质体可以包含抑制调理作用的组分和配体。

用于制备本发明脂质体中的抑制调理作用的组分，一般地是巨大的亲水聚合物，其与脂质体膜结合。如本文所用，当抑制调理作用的组分以化学或物理方式与脂质体膜连接，例如通过脂溶性锚形体插入膜自身中或通过与膜脂的活性基团直接结合时，所述抑制调理作用的组分与脂质体膜是“结合”的。这些抑制调理作用的亲水聚合物可形成保护性表层，其可显著降低脂质体被巨噬细胞-单核细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)所摄入；例如，如美国专利4,920,016号中所描述，其完整公开内容通过引用方式并入本文。用抑制调理作用的组分修饰的脂质体，处于循环的时间因而比未修饰的脂质体长得多。

包围脂质体的合适的亲水聚合物包括，而不限于聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙酯、聚丙烯酸羟乙酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚乙二醇、聚天冬酰胺和亲水肽序列，如美国专利6,316,024；6,126,966；6,056,973；6,043,094号中所述；所述文献的内容通过引用的方式完整并入。

VII.联合疗法

本发明还包括联合疗法，其包含施用治疗性剂量的增强的神经营养因子多肽至患者，其中所述增强的神经营养因子多肽与第二有效药物组合。

在一个方面，所述第二有效药物选自L-DOPA、BDNF、GFRα2和CDNF。

在这种语境下，“组合施用”意指：(1)作为相同单一剂量形式的一部分；(2)分别施用，但是作为相同治疗性治疗计划或方案的一部分，一般但是不一定在同一日施用。当增强的神经营养因子作为辅助疗法随第二有效药物如L-DOPA施用时，优选地，所述增强的神经营养因子可以按每日或每周以固定的剂量施用，并且以所需的基础剂量服用L-DOPA。

第二有效药物的施用途径可以是本领域任意已知的。第二有效药物可以按照本领域已知的方法配制，通常与药学上可接受载体或稀释剂一起配制为，例如片剂、胶囊剂、锭剂、药锭剂(troche)、酏剂、溶液或混悬剂以口服施用，配制于合适的可注射用溶媒中以肠胃外施用，或配制为洗剂、油膏剂或乳膏剂以局部施用。

当然，每一施用组分的确切剂量，将根据开具的具体组分、正在治疗的受试者状况、疾病或病症的严重程度、所施用的方式以及处方医师的具体评判，其不同而不同。

VIII.施用的方法

可以将包含治疗有效量的以下物质的药物组合物直接施用至血流、肌肉或内部器官中：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

用于肠胃外施用的合适手段包括静脉内、动脉内、腹内、鞘内、脑实质内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内、滑膜腔内和皮下。肠胃外施用的合适装置包括针头(包括微针头)注射器、无针头注射器和输注技术。

增强的神经营养因子多肽的肠胃外制剂一般是水溶液剂，其可以含有赋形剂如盐、糖和缓冲剂，(一般地，pH是3至9，并且在一个方面，pH是约5，并且NaCl浓度是约150mM)。

对于一些应用，肠胃外制剂可以是更适当地配制为无菌非水溶液，或配制为与合适溶媒如无菌、无热原水联合待用的干燥形式。肠胃外制剂在无菌条件下例如通过冻干法的制备，可以使用本领域技术人员公知的标准药学技术容易地完成。

可以将肠胃外施用的制剂配制成速效和/或持续释放。持续释放组合物包括延迟释放、调控释放、脉冲释放、控释释放、定向释放和编程释放。因而，增强的神经营养因子多肽可以配制为混悬剂或配制为固体剂、半固体剂或触变液体剂以用于植入贮库施用，其中所述的植入贮库提供增强的神经营养因子多肽的持续释放。此类制剂的实例包括，而不限于涂药支架和半固体剂和混悬剂，其包含载药的聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)或聚(丙交酯)(PLA)层状囊泡或微粒子、水凝胶(Hoffman AS：Ann.N.Y.Acad.Sci.944：62-73(2001))、由Flamel Technologies Inc.开发以商标名

出售的聚氨基酸纳米粒子系统、由Atrix，Inc.开发以商标名

出售的非水质凝胶系统、由Durect Corporation开发以商标名

出售的蔗糖乙酸酯异丁酸酯延长释放制剂、和由SkyePharma开发并以商标名

出售的基于脂质的系统。

能够在延长的时间范围内、递送所需剂量的增强的神经营养因子多肽的持续释放装置，是本领域已知的。例如，美国专利5,034,229；5,557,318；5,110,596；5,728,396；5,985,305；6,113,938；6,156,331；6,375,978和6,395,292号；教导了渗透驱动的装置，所述装置能够以所需速率在延长的时间范围(即，范围从多于1周直至1年或更长的时间)内递送有效药物制剂，如溶液剂或混悬剂。其他示例性持续释放装置包括可提供恒定流量、可调流量或可编程流量的有益药物制剂的调节型泵，所述泵可从Medtronic公司获得，包括以商标名SYNCHROMED INFUSION

出售的鞘内泵；可从Johnson&Johnson系统公司获得，包括以商标名

出售的分度泵和以商标名

出售的技术泵。其他的装置实例在美国专利6,283,949；5,976,109；5,836,935和5,511,355号中描述。

可以将包含治疗有效量的以下物质的药物组合物直接施用至中枢神经系统或脑：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。这种方法比须经口服或通过其他注射途径递送，一般地有允许小得多的剂量。因此药物的副作用经常被降低或消除。另外，该组合物可以跨血脑屏障递送。

因此在本发明的一个方面，将包含治疗有效量的以下物质的药物组合物通过鞘内注射施用至椎管(环绕脊髓的鞘内空间)中：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在另一个方面，使用脑实质内注射法、经嗅上皮鼻内递送法(Illum等人，(2003)J.Contol.Release 87，187-98；Sakane等人，(1991)Chem.Pharm.Bull.39 1458-2456；Hanson等人，(2008)BMC Neurosci.10(9Suppl 3)S5)或对流增强的递送法(Pasha和Gupta(2010)Expert Opin.Drug.Deliv.7(1)113-135；Allaed等人，(2009)Biomaterials 30(12)2302-18)，将包含治疗有效量的以下物质的药物组合物直接施用至脑：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

在一些使用方法中，优选任一所公开药物制剂的特定类型的施用法。例如，在用于治疗ALS、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和急性脑损伤所要求保护方法的一个方面，优选脑实质内递送法。另外，此类脑实质内递送可以对准脑的特定区域。例如，对于治疗帕金森病，优选直接立体定位注射至脑的特定区域内。这里，优选壳核内输注包含治疗有效量的以下物质的任一药物组合物：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。

壳核的主要功能是调节运动和影响多类型学习。它使用多巴胺来履行其功能。在帕金森病中，壳核发挥关键作用，因为它的输入和输出与黑质和苍白相互联系。在帕金森病中，通向内部苍白球的直接通道的活性下降，并且通向外部苍白球的间接通道的活性增加。这些作用一起造成丘脑的过度抑制。

另外，已经显示，神经胶质细胞衍生神经营养因子的壳核内输注(Hutchinson，M.等人，Journal of Neuroscience Methods 163(2007)190-192；Love，S.等人，Nature Medicine 11(7)(2005)703-704；Gill，S.等人，Nature Medicine 9(5)(2003)589-595)可以用来治疗帕金森病。输注GDNF至后壳核中引起酪氨酸羟化酶-免疫阳性神经纤维的明显局部增加，并且也可能在黑质内存在纤维出芽。虽然仍不清楚酪氨酸羟化酶-免疫阳性神经纤维的增加，其多大程度因轴突出芽所致以及其多大程度因备用但功能失调的纤维中酪氨酸羟化酶的上调所致，然而在这两种情况下，研究发现支持以下结果：在接受壳核输注密切相关GDNF的人中，所述疾病具有持久的临床改善。

也可以将用于本发明中的增强的神经营养因子多肽局部地、经表皮(皮内)或经皮施用皮肤或粘膜。在这种情况下，可以优选局部施用法来治疗听力下降或勃起障碍。用于此目的的常见制剂包括凝胶剂、水凝胶、洗剂、溶液剂、乳膏剂、油膏剂、撒粉散剂、敷剂(dressing)、泡沫剂、膜剂、皮肤贴剂、糯米纸囊剂(wafer)、植入剂、海绵剂、纤维剂、绷带剂和微乳剂。也可以使用脂质体。常见的载体包括醇、水、矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙三醇、聚乙二醇和丙二醇。可以掺入渗透促进剂一见，例如，Finnin和Morgan：J.Pharm.Sci.88(10)：955-958，(1999)。局部施用法的其他手段包括借助电穿孔法、离子导入法、超声导入法(phonophoresis)、超声导入法(sonophoresis)、和微针头或无针头注射法递送，例如使用以商标名POWDERJECT^TM和BIOJECT^TM出售的系统。

可以将局部施用的制剂配制成速效和/或调控释放。调控释放制剂包括延迟释放、持久释放、脉冲释放、控释释放、定向释放和编程释放。

在本发明的另一个实施方案中，将增强的神经营养因子多肽持续释放至血液中，其包括一种持续释放的组合物，所述组合物包含包装在微球体中的增强的神经营养因子多肽。微球体已经显示可用于，在延长的时间范围内以受控方式递送有益有效药物至靶区域。微球体通常是生物可降解的，并且可以用于皮下、肌内和静脉内施用。

通常，每个微球体由有效药物和如美国专利6,268,053号中公开的聚合物分子组成，所述有效药物可以居中位于聚合物分子所形成的膜内，或备选地分散遍及微球体，因其内部结构包含有所述有效药物和聚合物赋形剂该基质。一般，微球体的外表面对水是可通透的，这允许水性流体进入微球体，以及允许增溶的有效药物和聚合物离开微球体。

在一个实施方案中，聚合物膜包含如美国专利6,395,302号中公开的交联聚合物。当交联聚合物的孔径等于或小于有效药物的水动力直径时，则有效药物在聚合物降解时将会基本释放。另一方面，当交联聚合物的孔径大于有效药物的尺寸时，则有效药物通过扩散至少部分地释放。

用于制造微球体膜的其他方法是已知的并且在本领域中已经使用，其可以用于实施本文所公开的发明。用于外膜的常见材料包括以下类别的聚合物：(1)基于碳水化合物的聚合物，如甲基纤维素、基于羧甲基纤维素的聚合物、葡聚糖、聚右旋糖、壳多糖、壳聚糖和淀粉(包括羟乙基淀粉)，及其衍生物；(2)聚脂族醇，如聚氧化乙烯及其衍生物，包括PEG、PEG-丙烯酸酯、聚乙烯亚胺、聚乙酸乙烯酯，及其衍生物；(3)聚乙烯基聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯基)磷酸酯、聚(乙烯基)膦酸及其衍生物；(4)聚丙烯酸及其衍生物；(5)聚有机酸，如聚马来酸，及其衍生物；(6)聚氨基酸如聚赖氨酸，和聚亚氨基酸，如聚亚胺基酪氨酸，及其衍生物；(7)共聚物和嵌段共聚物，如泊洛沙姆407或Pluronic L-101；聚合物及其衍生物；(8)四聚物及其衍生物；(9)聚醚，如聚(聚四亚甲基醚二醇)，及其衍生物；(10)天然存在的聚合物，如玉米醇溶蛋白、壳聚糖和茁霉多糖，及其衍生物；(11)聚酰亚胺，如聚n-三(羟甲基)甲基丙烯酸甲酯及其衍生物；(12)表面活性剂，如聚氧乙烯失水山梨糖醇，及其衍生物；(13)聚酯，如聚乙二醇)(n)单甲基醚单(琥珀酸琥珀酰亚胺酯)酯，及其衍生物；(14)分枝和环状聚合物，如分枝的PEG和环糊精，及其衍生物；和(15)聚醛，如聚(全氟氧化丙烯-共-全氟甲醛)，及其衍生物，如美国专利6,268,053号中所公开，所述文献的内容通过引用方式并入本文。本领域普通技术人员已知的其他常见聚合物包括聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚乳酸均聚物；聚乙交酯均聚物；聚己酸内酯；聚羟基丁酸酯-聚羟基戊酸酯共聚物；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚酯酰胺；聚原酸酯；聚13-羟基丁酸；和聚酸酐，如美国专利6,517,859号中所公开，所述文献的内容通过引用方式并入本文。

在一个实施方案中，本发明的微球体与其他分子连接或包被。此类分子可以促进定向、增强受体介导作用和免遭细胞内吞作用或破坏。常见的分子包括磷脂、受体、抗体、激素和多糖。额外地，一个或多个可裂解的分子可以是与微球体的外表面连接以使微球体靶向预定位点。随后，在适宜的生物学条件下，所述分子被切割，从而引起微球体从靶释放。

通过标准技术制造用于持续释放组合物中的微球体。例如，在一个实施方案，通过将溶液中的有效药物与溶液中的聚合物或聚合物的混合物在能量源存在下混合足够量的时间，进行体积排阻以形成如美国专利6,268,053号中公开的粒子。调整溶液的pH至所述大分子的等电点(pI)附近的pH。接下来，使溶液暴露于单独或与超声波处理、涡旋混合、混合或搅拌组合的能量源、如热、辐射或电离，以形成微粒子。随后，通过本领域技术人员公知的物理分离方法，将所产生的微粒子与溶液中存在的任何未掺入的组分分离，并且随后洗涤。美国专利6,669,961；6,517,859；6,458,387；6,395,302；6,303,148；6,268,053；6,090,925；6,024,983；5,942,252；5,981,719；5,578,709；5,554,730；5,407,609；4,897,268和4,542,025号中描述了其他标准制造方法；所述文献的内容通过引用的方式完整并入。微球体是本领域普通技术人员公知的并且可容易地获自各公司，所述公司具有提供此类技术用于延长释放药物递送的经验。例如，Baxter Healthcare Corp.的子公司Epic Therapeutics开发了在完全基于水的过程中产生生可蚀解蛋白质微球体的蛋白质药物递送系统，其以商标名

出售；OctoPlus开发了以商标名

出售的交联聚糖微球体系统，其基于基质的本体降解而不是表面侵蚀而释放有效成分。

检索专利、公布的专利申请和相关出版物也将为阅读本公开的本领域技术人员提供明显可能的用于配制持续释放组合物的微球体技术。例如，美国专利6,669,961；6,517,859；6,458,387；6,395,302；6,303,148；6,268,053；6,090,925；6,024,983；5,942,252；5,981,719；5,578,709；5,554,730；5,407,609；4,897,268；和4,542,025号，其内容通过引用的方式完整并入，所述文献描述了微球体和用于制造它们的方法。在考虑到本发明公开内容和其他这些专利的公开内容时，本领域技术人员可能产生并且使用用于持续释放增强的神经营养因子多肽的微球体，所述微球体用于本文要求保护的任一方法或试剂盒中。

增强的神经营养因子多肽可以鼻内或吸入施用，典型地以干粉吸入器的干粉剂形式(其可单独作为混合物成分例如存在于乳糖的干混物中，或者作为已混合好的组分粒子，例如与磷脂如磷脂酰胆碱相混合)，以加压容器、泵、喷雾器、雾化器(优选地，利用电-水动力学以产生细雾的雾化器)或气雾器(nebulizer)(使用或不使用合适的推进剂，如1，1，1，2-四氟乙烷或1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷)中的气溶胶喷雾剂形式，或者以滴鼻剂形式。对于鼻内使用，粉剂可以包含生物胶粘剂，例如，壳聚糖或环糊精。

加压的容器、泵、喷雾器、雾化器或气雾器含有本发明化合物的溶液或混悬剂，其包含例如，乙醇、含水乙醇、或用于分散、增溶或延长活性物质释放的合适可选剂，作为溶剂的推进剂，和任选的表面活性剂，如失水山梨糖醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸。

在干粉剂或混悬剂制剂使用之前，将药物产物微粉化至适于通过吸入法递送的尺寸(一般小于5μm)。这可以通过任何适宜的方法如螺旋喷射磨机、流化床喷射磨机、形成纳米粒子的超临界流体加工、高压均化或喷雾干燥来实现。

可以配制胶囊剂(例如从明胶或羟丙基甲基纤维素中制得)、泡罩剂(blister)和用于吸入器或吹入器中的套筒剂(cartridge)，以包含本发明化合物的粉末混合物、合适的散剂基底(powder base)如乳糖或淀粉，和性能调节剂如L-亮氨酸、甘露醇或硬脂酸镁。乳糖可以是非晶态的或是一水合物形式，优选地是后者。其他合适的赋形剂包括葡聚糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。

在利用电-水动力学产生细雾的雾化器中所使用的合适溶液制剂，可以含有每次致动1μg至20mg的增强的神经营养因子，并且致动体积可以从1μL至100μL变动。常见配方可以包含增强的神经营养因子多肽、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可以代替丙二醇使用的备选溶剂包括甘油和聚乙二醇。可以添加合适的香料、如薄荷醇和左薄荷脑，或甜味剂、如糖精或糖精钠，至本发明期望用于吸入/鼻内施用的那些制剂。可以使用例如PGLA，将用于吸入/鼻内施用的制剂，配制成速效的和/或调控释放的。调控释放的制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控释释放、定向释放和编程释放。

在干粉吸入剂和气雾剂的情况下，通过可进行递送计量的阀门来确定剂量单位。一般将本发明的装置设置成施用某计量或“吹喷量”，其含有0.1mg至10mg的增强的神经营养因子多肽。每日总剂量一般将处于可以单一剂量或更常见作为一整天内分割剂量施用的0.1mg至20mg范围中。

鼻内递送是无针头的患者友好的施用途径，其能够绕过血液屏障。另外，似乎从蛛网膜腔出发的CSF液再循环返同至蛛网膜下腔，其可以将施加至嗅粘膜的药物携带返回CNS的蛛网膜下腔(Begley等人，(2004)Pharmacol.Ther.10429-45)。额外地，鼻递送的简便性允许在居家环境自我施用。这种途径明显优于肠胃外施用法，后者通常必须在医学监督下给药。鼻内递送的其他优点包括鼻上皮的高通透性，和因鼻腔表面积相当大和血流量相对高所致的快速吸收。与其他的非注射施用相比，如与口服制剂相比，经鼻递送因其以下特征而是一种有吸引力的途径：避免肝脏首过效应、快速起效和较高的生物利用率(Hussain，Adv.Drug Deliv.Rev.(1998)29(1-2)：39-49；Ilium，J.Control Release(2003)87(1-3)：187-98)。

历史上，治疗性肽和蛋白质在经鼻施用后的生物利用率总是相对低的，这主要归咎于它们的较大分子尺寸造成不容易通过和归咎于酶的快速降解。随着氨基酸的数目增加超过约20个，生物利用率一般变得十分低(Wearly，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.1991；8：331-394)。

即便存在这些限制，一些肽产物已经成功地作为鼻内制剂实现销售(Ilium，The nasal route for delivery of polypeptides(用于递送多肽的经鼻途径).引自：Peptide and Protein Drug Delivery.编者Frokjaer，S.，Christrup，L.，Krogsgaard-Larsen，P.，Munksgaard，Copenhagen 1990，第157-170页)。FDA批准的实例包括

MIACALCIN^TM(降钙素)和SYNAREL^TM(那法瑞林)。临床试验已经展示，流感病毒(三价)和白喉毒素(CRM-197)可以经鼻递送，效果良好(Davis，Adv.Drug Del.Rev.(2001)51：21-42)。Larsen等人(Eur.J.Clin.Pharmacol.1987；33：155-159)得出结论：鼻内施加低分子量多肽布舍瑞林(buserelin)其显示为可靠的施用模式。肽如胰岛素、人生长激素、胰高血糖素、水蛭素、人干扰素-β和人副甲状腺激素的鼻内制剂的其他实例，在Costantino等人(www.ondrugdelivery.com，2005；Sakr，Int.J.Pharmaceutics 1996，132：189-194；O’Hagan等人，Pharm.Res.1990，7：772-776；Cefalu，Diabetes Care 2004，27：239-245；Zhang等人，Biol.Pharm.Bull 2005，28：2263-2267)中有讨论。

另外，几种药物已经在鼻内施用后成功地递送至脑(Yu等人，(2005)Neurosci.Lett.387(1)5-10，Reger等人，(2008).Alzheimer’s Dis.13(3)323-31，Thorne等人，(2004)Neuroscience 127，481-96)。在US20100129354，US20030077300，美国专利7,244,709号和美国专利7,812,120号中另外教授了用于鼻内递送的方法和药物组合物。

因此在本发明的一个方面，将包含治疗有效量的以下物质的药物组合物通过鼻内施用法施用：任一所述的增强的神经营养因子多肽，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组载体，包含编码任一所述的增强的神经营养因子多肽的核苷酸序列的重组病毒载体，或者表达任一所述的重组的增强的神经营养因子多肽的宿主细胞。在本发明的另一个方面，将药物组合物配制成鼻内施用，并且任选地包含一种或多种试剂以增强鼻内递送。

以下实施例意图说明，但不以任何方式、类型或形式限制本发明，无论是以明确方式还是以暗示方式。当它们是可能使用的典型实施例时，可以可选地使用本领域技术人员已知的其他方法、方法学或技术。

实施例

实施例1：分子建模

初步分析神经营养因子的一级序列揭示了神经营养因子的跟区内的一段残基(RRLRQRRRLRRER)(SEQ.ID.NO 31)，其与肝素结合的共有序列尤其与序列“BBXB”或“BBBXXB”一致，其中B是碱性氨基酸并且X是任何残基(Hileman等人，(1998)Bioessays.20(2)：156-67)。虽然这个序列的鉴定与肝素结合作用一致，但是应当指出，对蛋白质一级结构中该共有序列的研究结果，不意味着该序列必然地参与肝素结合。具体而言，已经确立，i)缺少这些共有序列的蛋白质仍可以与肝素结合(Delacoux等人(2000)J.Biol.Chem.275(38)：29377-82)，和ii)含有该基序的蛋白质可能不结合肝素。

实际上，对于全部蛋白质，连续排列的成段带正电荷的氨基酸与肝素或硫酸乙酰肝素结合的能力，依赖于碱性残基在完全折叠的成熟蛋白质的完整三维结构背景下的3维取向。另外，由于肝素和硫酸乙酰肝素是线性聚合物，神经营养因子中带正电荷的残基必须不仅存在于一级序列中，还必须在空间上正确地对齐。换而言之，至少三个带正电荷的侧链必须被表面暴露，应当以正确方向取向，并且以正确的相对空间关系排列，以高效地与肝素和硫酸乙酰肝素中带负电荷的残基对接。

因此，对于本发明的研究而言，我们使用一级序列分析和同源性模型的组合来研究突变体。具体而言，为了检验神经营养因子中所选择的带正电荷残基是否也遵循这些空间规则，基于已知的GDNF晶体结构对神经营养因子的3D结构进行建模(Eigenbrot和Gerber，(1997)Nat.Struct.Biol.19974(6)：435-8)。将该结构可视化，并且用PyMol软件(DeLano Scientific)进行计算机方式诱变。

该分析的结果表明，神经营养因子和肝素的相互作用结构域大约覆盖由成熟神经营养因子第51至63位氨基酸所界定的区域。更具体地，该分析表明，该区域中每个带正电荷的氨基酸可能对肝素和硫酸乙酰肝素与神经营养因子的相互作用作出贡献。更具体地，基于该分析，我们得出结论；带正电荷的氨基酸R51、R52、R54、R56、R57、R58、R60、R61和R63至少某种程度对神经营养因子的肝素亲和力作出贡献。

为直接检验这个假设，构建一系列突变体，其中将数目不等的带正电荷的精氨酸残基替换为丙氨酸残基。构建体N1、N2各自包含三个氨基酸改变，这些改变散布于神经营养因子和肝素的相互作用推定结构域的表面上，所述的结构域覆盖成熟的人神经营养因子第51至63位残基。

在构建体N3中，将构建N1和N2突变体所作的突变相组合，从而导入5个点突变。在该构建体中，不突变R63以检验这样的假设：保留相关基因ARTN，PSPN和GDNF中的碱性氨基酸残基是功能上有意义的。另外，在最终构建体中(N4)，覆盖第51至62位残基的神经营养因子的推定肝素结合区，由来自PSPN相应区域和相关序列中的7个残基和5个不相关的残基替换(ARLQGQGALVGS)(SEQ ID NO：25)。与野生型人神经营养因子的相应序列相比，这种改变导致9个氨基酸产生变化。

如下文更详细地描述，全部这些构建体均成功地表达，显示正确的折叠，并且既在功能测定法中有活性，又显示降低的肝素亲和力。可以得到结论，这个覆盖第51至63位氨基酸的神经营养因子区域是这样的蛋白质区域，该区域可容易地进行蛋白质优化，以产生显示出肝素亲和力降低而功能上活性的神经营养因子突变体。

实施例2：神经营养因子变体的产生

从OpenBiosystems购买对应于登录号BC137399的编码人神经营养因子的DNA。将神经营养因子的成熟序列(不包括其内源信号序列和原序列(pro-sequence))亚克隆至载体pSJP-2中，该载体的载体骨架基于生产质粒(E778)的pAAV-MCS(Stratagene)，所述质粒编码IgG信号序列(Fjord-Larsen等人，(2005)“Efficient in vivo protection of nigral dopaminergicneurons by lentiviral gene transfer of a modified Neurturinconstruct(通过慢病毒基因转移修饰的神经营养因子构建体对黑质多巴胺能神经元的高效体内保护).”Exp Neurol 195：49-60)，随后产生无原序列的成熟神经营养因子序列。使用E778作为反向PCR诱变的模板。用于未加标签的神经营养因子变体N1的引物是：F/5’-ag gcg cgg gcc ctg cgg cgg gag cgggtg cgc-3’(SEQ ID NO：11)和R/5’-g gcg cag tgc tcg cag ccc gag gtc gtagac g-3’(SEQ ID NO：12)；用于N2的引物是：F/5’-ctg cgg gcg gag gcg gtgcgc gcg cag ccc tgc tgc-3’(SEQ ID NO：13)和R/5’-gcg ccg ccg ctg ggccag tcg tcg cag ccc gag gtc g-3’(SEQ ID NO：14)；用于N3的引物是：F/5’-cgggcc ctg cgg gcg gag cgg gtg cgc gcg cag ccc-3’(SEQ ID NO：15)和R/5’-cgcctg ggc cag tgc tcg cag ccc gag gtc gta gac g-3’(SEQ ID NO：16)；用于N4的引物是：F/5’-ggc gcc ctg gtg ggg tcc cgg gtg cgc gcg cag ccctgc-3’(SEQ ID NO：17)，R/5’-ctg acc ctg cag tcg tgc cag ccc gag gtc gtagac gcg c-3’(SEQ ID NO：18)。PCR反应用Phusion^TM高保真DNA聚合酶(Finnzymes)进行。将PCR混合物用DpnI消化(Fermentas)，并且将突变的质粒用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化，用T4多核苷酸激酶(Fermentas)磷酸化，用T4DNA连接酶(Fermentas)连接并转化至感受态DH5α大肠杆菌细胞中。从单菌落分离质粒DNA并且通过对插入物测序验证诱变结果。

将V5-标签(GKPIPNPLLGLDST，SEQ ID NO：19)添加至全部构建体的N末端。为了增强信号序列后的裂解作用，在该信号序列和V5标签之间导入两个额外氨基酸残基(丙氨酸和精氨酸)。为了增强标签-表位的暴露，在V5-标签和成熟神经营养因子序列之间导入两个额外氨基酸残基(丝氨酸和甘氨酸)。使用E778，N1，N2，N3和N4作为用于诱变的模板，并且引物是：F/5’-ctc ctcggt ctc gat tct acg tcg ggg gcg cgg ttg ggg gcg cgg cct tg-3’(SEQ IDNO：20)；R/5’-agg gtt agg gat agg ctt acc ccg cgc cga att cac ccc tgtaga aag aaa ggc-3’(SEQ ID NO：21)。反向PCR诱变和后续克隆步骤如上文那样进行。加V5-标签的克隆称作E779(来自E778)、NV1(来自N1)、NV2(来自N2)、NV3(来自N3)和NV4(来自N4)。

实施例3：神经营养因子变体的产生和纯化

将CHO细胞用E436(GFP)、加V5-标签的野生型神经营养因子、或加V5-标签的神经营养因子变体NV1-NV4瞬时转染。使用Turbofect(Fermentas)根据制造商的说明书进行转染。在四小时后，将含有转染试剂的培养基替换为由DMEM(Sigma)、10％FBS(HyClone)、100U/ml青霉素(Gibco)和100μg/ml链霉素(Gibco)组成的正常培养基。两日后，从每块平板收集培养基。为了沉淀漂浮的细胞，将培养基在使用前离心(5分钟，16,200×g)。将收获的样品加载于15％SDS-PAGE上并且通过蛋白质印迹法用V5-抗体分析(Invitrogen)。全部变体均成功地表达并且分泌至培养基中，并且在SDS-PAGE上显示为正确预测分子量(数据未显示)。

实施例4：神经营养因子变体的肝素结合性能

来自瞬时转染的CHO细胞的培养基(5ml)用20ml的10mM Hepes，pH 7.2稀释。HiTrap肝素HP柱(GE Healthcare)用10ml的10mM Hepes，pH 7.2平衡，用进样器根据制造商的说明书施加稀释的样品。该柱用5ml在10mMHepes，pH 7.2中的0.1M NaCl洗涤，随后用10mM Hepes，pH 7.2中的步进(每个步骤0.5ml)NaCl-梯度0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M、1.0M、1.1M、1.2M和1.5M NaCl洗脱。该柱随后用5ml的2.0M NaCl根据制造商的说明书再生，用10ml的10mM Hepes缓冲液pH7.2再平衡，并且用于以下样品。所分析样品的顺序是第一：NV1，第二：NV2，第三：NV3，第四：NV4和第五：野生型神经营养因子。使用野生型作为最末样品以遍及整个测定法期控制柱的功能。

来自每个洗脱级分的样品(20μl)随Laemml i缓冲液煮沸，加载于15％SDS-PAGE上并且通过蛋白质印迹法用V5-抗体分析(Invitrogen)。作为对照，20μl的原始培养基加载到凝胶的第一泳道上。测定法进行两次，得到相同结果。表E1中显示结果。应当指出在该表中，NaCl的容积摩尔数表示施加至该柱的溶液浓度，并且在该测定法中洗脱级分的NaCl浓度未进行测定。(++)表示通过WB用抗V5抗体检测到的分子量约15kDa的神经营养因子的较强条带，并且(+)表示较弱条带。结果显示，与野生型神经营养因子相比，全部四个加V5-标签的神经营养因子变体具有显著地下降的肝素结合作用。

具体而言，神经营养因子野生型蛋白在约1.0至1.2M NaCl的NaCl浓度范围内从该柱洗脱。相比之下，神经营养因子突变体NV1在约0.9至1.0M NaCl的NaCl浓度范围内从该柱洗脱；神经营养因子突变体NV2在约0.6至0.8MNaGl的NaCl浓度范围内从该柱洗脱；神经营养因子突变体NV3在约0.6至0.7M NaCl的NaCl浓度范围内从该柱洗脱；并且神经营养因子突变体NV4在约0.4至0.7M NaCl的NaCl浓度范围内从该柱洗脱。

因而得出结论，与野生型神经营养因子相比，全部神经营养因子突变体具有降低的亲和力。另外，得出结论，神经营养因子突变体NV4和NV3显示最低的表观肝素亲和力。

实施例5：神经营养因子变体的受体磷酸化性能

用人RET长同工型稳定转染(

等人，1999，EMBO J.，18：5901)的成纤维细胞(MG87-RET)用大鼠GFRα1或人GFRα2瞬时转染。使用Turbofect(Fermentas)根据制造商的说明书进行转染。在四小时后，将含有转染试剂的培养基替换为由DMEM(Sigma)、10％FBS(HyClone)、2μg/ml嘌呤霉素(Sigma)、100U/ml青霉素(Gibco)和100μg/ml链霉素(Gibco)组成的正常培养基。1日后，将细胞在DMEM(Sigma)中饥饿四小时。在禁绝后，将瞬时转染CHO细胞(表达GFP、加V5-标签的野生型神经营养因子或加V5-标签的神经营养因子变体NV1-NV4)的培养基用DMEM(Sigma)1∶2稀释，并且施加至GFRα1或GFRα2转染的MG87-RET成纤维细胞10分钟。此后，裂解成纤维细胞，并且将裂解物用于RET的免疫沉淀(针对RET的抗体来自Santa CruzBiotechnology Inc)。免疫复合物以蛋白G-Sepharose(GE Healthcare)收集并且依靠8％SDS-PAGE和蛋白质印迹法来分析。可以通过针对磷酸酪氨酸的抗体(Upstate Biotechnology)检测RET的磷酸化。通过剥离滤膜并用针对RET的抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)再探测，验证等载量。测定法进行两次，得到相同结果。

表E2中汇总的结果显示，全部构建体均能够促进由共同受体GFRα1和GFRα2介导的RET磷酸化。因此，得出结论，全部的这些变体均产生了可溶、正确表达且从哺乳动物表达系统分泌、并且拥有功能活性的三维结构的蛋白质。

实施例6：用GFRα2-Fc融合蛋白沉淀神经营养因子

为确定是否可以基于神经营养因子变体对GFRα2的亲和力，从培养基粗制备物中纯化这些变体，收集来自加V5-标签的NRTN变体瞬时转染的CHO细胞的培养基，贮存在+4℃并且用于预备沉淀测定法。将每种培养基(400μl)的等分试样与重组人GFRα2-Fc嵌合体(0.4μg，R&D Systems)、针对V5-表位的抗体(0.4μg，Invitrogen)、或针对NRTN的抗体(0.4μg，R&D Systems)在+4℃孵育1小时，伴以混合。蛋白G对来自小鼠和山羊的抗体及对重组GFRα2-Fc嵌合体中人IgG₁的Fc部分具有强亲和力。因此添加蛋白G-Sepharose至样品并且在+4℃孵育继续进行1小时，伴以混合。在沉淀后，将样品用还原性Laemmli缓冲液从蛋白G-Sepharose洗脱并且加载于SDS-PAGE上。对于加V5-标签的NRTN变体的蛋白质印迹分析，使用抗V5抗体(Invitrogen)，同时样品在还原条件下加载在SDS-PAGE上。对于未加标签的NRTN变体的蛋白质印迹分析，使用抗NRTN抗体(R&D Systems)，同时样品在非还原条件下加载在SDS-PAGE上。在还原条件下加载样品的情况下，抗NRTN抗体的灵敏度明显较低。

结果(未显示)表明，全部神经营养因子变体均可以借助与抗体恒定区(Fc)融合的市售GFRα2进行沉淀，并且可以随后通过蛋白G-sepharose柱纯化。另外，这种纯化方法似乎至少与使用V-5表位标签的免疫沉淀法同样高效。

实施例7：神经突生长晕测定法

为了确证RET-磷酸化测定法的结果，收集来自用加GFP标签或V5标签的NRTN变体瞬时转染2日的CHO细胞的培养基，贮存在+4℃并且用于预备神经突生长晕测定法。来自培养基(DMEM，10％胎牛血清，青霉素和链霉素)的样品用DMEM进行1∶2稀释，并且添加马血清至终浓度5％。用GFRα2瞬时转染最初从亲本PC12细胞系亚克隆而来的PC6-3细胞。转染后1日，将培养基替换为来自CHO细胞的稀释培养基。来自GFP转染的CHO细胞的培养基如上文稀释并且作为阴性对照用于PC6-3细胞。将NRTN(50ng/ml，PeproTech)添加至条件的CHO培养基(如上文稀释)并且作为阳性对照用于PC6-3细胞。未计数神经突，但是在诱导5日后，对细胞的代表性视野拍照。结果(未显示)表明，全部神经营养因子变体在这个测定法中也是有生物学活性的。

实施例8：稳定性测定法

CHO细胞用加V5-标签的NRTN变体瞬时转染。2日后，将培养基收集并且(A)在10mM EDTA存在或不存在情况下不加稀释使用，或(B)用50mM缓冲液(柠檬酸钠缓冲液pH 6.0，Tris缓冲液pH 6.8，或Tris缓冲液pH 8.0，Tris缓冲液pH 8.8，Tris缓冲液pH 9.5)以1∶10加以稀释使用。在不存在细胞的情况下，将未稀释或稀释的培养基(400μl)转移至空平板，并且在37℃孵育5小时。在孵育结束时，取出20μl样品并且加载在还原性条件下的SDS-PAGE上。如前所述实施蛋白质印迹分析，并且使用抗V5抗体检测蛋白质。表E3中显示的结果表明，在EDTA存在和不存在时，神经营养因子的野生型和NV1变体在细胞不存在的情况下从培养基中消失，相比之下，突变体NV2、NV3和NV4似乎在这些条件下具有增强的稳定性。

因此，该数据表明，与野生型神经营养因子相比，增强的神经营养因子多肽并且尤其变体NV2、NV3和NV4额外地具有出意料的增强的稳定性特征。

实施例9：正常CHO细胞和硫酸乙酰肝素缺陷型CHO细胞的免疫细胞化学 染色

CHO细胞用未加标签的野生型NRTN、加V5-标签的野生型NRTN或加V5-标签的NV4 NRTN变体瞬时转染。在2日后，收集培养基的样品并且贮存在+4℃。将第二组CHO细胞接种于盖片上。2日后，这些细胞的一部分用GFRα2转染。转染后1日，将培养基替换为从表达NRTN变体的第一组CHO细胞收集的贮存培养基。将细胞与培养基孵育10分钟并且随后用PBS淋洗3次持续5分钟，之后，用3％PFA固定15分钟，在0.2％Triton X-100中透化5分钟并且在1％BSA中封闭30分钟。将抗V5抗体(Invitrogen)1∶500稀释并且将CY3-缀合的驴抗小鼠抗体(Jackson)以1∶400稀释。该测定法如上重复，但是使用硫酸乙酰肝素缺陷的CHO细胞(psgA 745)。在这种情况下，细胞不透化，并且胞核在封片前用Hoechst(Invitrogen)染色。

结果(未显示)表明，野生型神经营养因子与野生型CHO细胞的表面结合，但是不与硫酸乙酰肝素缺陷型CHO细胞相结合。相比之下，神经营养因子变体NV4不能与野生型或硫酸乙酰肝素缺陷型CHO细胞相结合。因而得出结论，至少相对于变体NV4，由第51至62位氨基酸所包括的高亲和力相互作用结构域的缺失，足以阻止增强的神经营养因子与细胞表面结合。

实施例10：增强的神经营养因子多肽的规模化生产和表征

成熟的充分折叠的神经营养因子以具有7个二硫键的半胱氨酸节结构为特征。二聚体蛋白质的每个单体携带三个分子内二硫键，并且所述单体由一个额外的分子间二硫键连接在一起。先前研究已经确定，在哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞中(CHO细胞)的NRTN表达，与大肠杆菌所产生的NRTN相比，一般允许产生更高(体外)生物学活性的蛋白质(Hoane等人，(2000)Exp Neurol.162(1)：189-93)。这是因为哺乳动物细胞对于带二硫键的分泌蛋白的折叠具有严格的胞内质量控制，而大肠杆菌表达一般地要求二硫键结合的蛋白质从包涵体中再折叠。

因此，使用CHO细胞并利用在Icosagen Ltd.开发的专利QMCF技术(见欧洲专利EP1851319号)，实现增强的神经营养因子蛋白质的规模化生产。简而言之，用于增强的神经营养因子编码序列的QMCF表达载体携带有，由多瘤病毒无增强子最小复制起点和Epstein-Barr病毒科重复序列提供的维持元件组成的杂合复制起点。已经开发QMCF技术以使用能够支持复制和稳定维持QMCF多拷贝胞核染色体外表达载体的该细胞表达治疗性蛋白。用于生产的细胞系是修饰的悬浮CHO细胞(CHOEBNALT85)，所述细胞表达两种额外的蛋白质以提供在多瘤病毒无增强子起点处的复制起始，并且提供表达载体的有效维持。表达了无任何N端标签或额外N端氨基酸残基的神经营养因子变体。序列如表D2所示。

纯化方法

在室温融化来自表达NRTN的CHO细胞(以Icosagen Ltd的QMCFTechnology)的培养基。将HITRAP^TM肝素HP柱(Iml，GE Healthcare)用10ml的10mM Hepes，pH 7.2平衡，之后用进样器根据制造商的说明书施加1-10ml未稀释的培养基。收集培养基，并且使其经过该柱两次。该柱用10ml在10mMHepes，pH 7.2中的0.2M NaCl洗涤。将NRTN富集样品用5×600μl的10mM Hepes pH 7.2，1.2M NaCl洗脱。收集第二号和第三号级分并且在AmiconUltra 0.5ml 10K浓缩器(Millipore)中根据制造商的说明书，将其浓缩至终体积50-65μl。样品随后以10mM Hepes pH 7.2按1∶10稀释至NaCl终浓度约120mM。根据制造商的说明书，将可溶性重组GFRα2-Fc嵌合体(10-200μg，R&D Systems)与PBS中的蛋白G HP SpinTrap柱(GE Healthcare)结合。将1∶10稀释的样品添加至GFRα2柱并且在+4℃孵育至少1小时，伴以混合。该柱首先用4×400μl的冷10mM Hepes pH 7.2，1.0M NaCl洗涤并且随后用4×400μl的冷10mM Hepes pH 7.2，0.1M NaCl洗涤。NRTN样品用5×200μl预温(25℃)的10mM Hepes pH 7.2，2.0M MgCl₂洗脱。将洗脱的级分立即用10mM Hepes pH 7.2，0.150M NaCl稀释(1∶2)并且用AMICONULTRA^TM0.5ml 10K浓缩器浓缩。将样品进一步在相同的缓冲液中稀释(1∶2)并且随后浓缩3次以产生10mM Hepes pH 7.2中约125mM MgCl₂和150mM NaCl的终浓度。纯化的蛋白质的样品以及市售批次的神经营养因子，利用15％SDS-PAGE在非还原条件下分析，并且经考马斯染色法显现。图1中所示的结果表明，纯化步骤可使各种增强的神经营养因子高效分离。

N端测序和质谱分析

通过Edman降解法用Applied Biosystems Procise 494A HT测序仪(PerkinElmer，Waltham，MA)测定纯化的NRTN变体的N端序列(其中在不事先修饰的情况下，不能检测到半胱氨酸)。二聚体蛋白的分子量用MALDI-TOF仪器测定(Ultraflex TOF/TOF，Bruker)，此仪器在5700Da和16900Da之间精确校准。表E4中的结果显示，所述蛋白质具有正确的质量并且显示很少或没有N端剪切。

实施例11：神经营养因子变体对肝素亲和力的Biacore分析

使用Biacore T100仪器和链霉亲和素包覆的传感器芯片SA(S系列，GEHealthcare)，通过表面等离子体共振法分析NRTN变体对肝素的亲和力。将生物素酰化的肝素(Sigma)与芯片结合。为消除生物素-肝素制备物中的游离生物素，将50μl生物素-肝素(20μg/μl)在10mM Hepes pH 7.2中以1∶10稀释，并且随后用Amicon Ultra浓缩管(10K，Millipore)浓缩返同至50μl。通过反复的稀释/浓缩循环，实现1,000,000倍脱盐效果。我们假定脱盐的生物素-肝素的同收率是100％，并且将其在HBS-EP+缓冲液(GE Healthcare：100mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20)中稀释至终浓度200μg/ml，之后将其加载于链霉亲和素包覆的芯片上，流速5μl/分钟，持续10分钟。生物素-肝素与芯片的结合导致芯片上361RU的增加。无配体添加至参比芯片。

通过考马斯染色法确定NRTN变体的实际浓度。NRTN变体以五个不同的浓度(25、50、100、200和500nM)经过肝素包覆的芯片。当NRTN变体在标准缓冲液(HBS-EP+)中稀释时，缔合的起始显著延迟。因此，我们增加缓冲液的NaCl浓度至235mM。使用调整的缓冲液，我们在流速30μl/分钟、上样时间240秒和解离时间600秒的情况下，分析NRTN变体和肝素之间的相互作用。在循环之间，芯片用1M NaCl再生30秒。稳定时间是20秒。

结果表明，野生型神经营养因子在这些条件下显示2.5×10^-9M和3.8×10^-9M之间的表观肝素亲和力。相比之下，全部神经营养因子变体均显示显著较低的表观肝素亲和力。(数据未显示)。

实施例12：肝素亲和层析

为表征NRTN变体对肝素的亲和力，我们使用一根小肝素亲和层析柱。在10mM Hepes pH 7.2中加载约2μg每种纯化的NRTN变体至肝素亲和层析柱之后，将样品用连续NaCl梯度(10mM Hepes，NaCl递增至2M)洗脱。通过214nm处的蛋白质吸收监测蛋白质的洗脱。基于导电性测定含有洗脱蛋白质级分的确切盐浓度。A214nm检测器位于电导率检测器之前(约20-25μl)。由于流速是50μl/分钟，故延迟约半分钟记录与A214吸光度对应的电导率。

图2中所示的结果与我们对来自肝素亲和柱的这些蛋白质的洗脱特征的较早分析结果(表E1中所示)充分对应。这里，基于导电性测定含有洗脱蛋白质级分的确切盐浓度。A214nm检测器位于电导率检测器之前(约20-25μl)。由于流速是50μl/分钟，故延迟约半分钟记录与A214吸光度对应的电导率。具体而言，神经营养因子野生型蛋白在约1.08M NaCl浓度相对应的电导率峰下，从该柱洗脱。相比之下，尽管以较低产率同收，神经营养因子突变体N1在约0.97M NaCl浓度相对应的电导率峰下，从该柱洗脱；神经营养因子突变体N2在约0.56M NaCl浓度相对应的电导率峰下，从该柱洗脱；神经营养因子突变体N3在约0.56M NaCl浓度相对应的电导率峰下，从该柱洗脱；并且神经营养因子突变体N4在约0.48M NaCl浓度相对应的电导率峰下，从该柱洗脱。

实施例13：纯化的神经营养因子变体的受体磷酸化特征

稳定表达人RET长同工型(

等人，1999，EMBO J.，18：5901)的成纤维细胞(MG87-RET)，如前所述用大鼠GFRα1或人GFRα2瞬时转染。将含有100ng/ml商业神经营养因子或纯化的NRTN变体的样品，添加至细胞在37℃持续10分钟。此后，裂解成纤维细胞，并且将裂解物用于RET免疫沉淀(针对RET的抗体来自Santa Cruz Biotechnology Inc)。将免疫复合物以蛋白G-Sepharose(GE Healthcare)收集，并且以8％SDS-PAGE和蛋白质印迹法来分析。通过针对磷酸酪氨酸的抗体(Upstate Biotechnology)来检测RET的磷酸化。通过剥离滤膜并用针对RET的抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc)再探测，来验证相等的载量。测定法进行两次，得到相同结果。

图3显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。将稳定表达RET的细胞用GFRα2瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过免疫沉淀法分离RET。样品通过抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体(B)再探测。图4显示RET-磷酸化测定的蛋白质印迹分析结果。将稳定表达RET的细胞用GFRα1瞬时转染，并且在用所示神经营养因子变体刺激后，将细胞裂解并且通过免疫沉淀法分离RET。样品通过抗磷酸酪氨酸抗体(A)探测来分析。为证实相等的载量，所述样品随后用抗RET抗体(B)再探测。如用神经营养因子变体的粗制备物先前所测定的，结果证实，全部增强的神经营养因子多肽显示功能性活性。

Claims (69)

1.一种神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO.5)区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少一个带正电荷的氨基酸突变；并且

其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。

2.根据权利要求2所述的神经营养因子多肽，其中以100ng/ml的浓度在37℃添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRα1与GFRα2两者之一。

3.根据权利要求1或2所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽在小于1M NaCl的NaCl浓度和pH 7.2下从肝素亲和柱洗脱。

4.根据权利要求3所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置处的至少一个突变。

5.根据权利要求3所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置处的至少一个突变。

6.根据权利要求4或5所述的神经营养因子多肽，其中所述突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。

7.根据权利要求6所述的神经营养因子多肽，其中所述突变导入至少一个独立选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

8.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。

9.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。

10.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。

11.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。

12.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS对第51至第62位氨基酸的替换。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与(SEQ ID NO.5)在成熟野生型神经营养因子的氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。

14.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO：1。

15.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO：2。

16.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO：3。

17.根据权利要求7所述的神经营养因子多肽，其中所述多肽包含SEQ IDNO：4。

18.一种治疗细胞变性或减少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求1至17中任一项所述的神经营养因子多肽。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述的细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过全身性施用法施用。

22.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过鞘内施用法施用。

23.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过鼻内施用法施用。

24.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过脑实质内施用法施用。

25.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述神经营养因子多肽通过持续释放组合物或装置施用。

26.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至17中任一项所述的神经营养因子多肽和药学上可接受载体。

27.编码神经营养因子多肽的分离的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与成熟野生型神经营养因子(SEQ ID NO.5)区别在于所述成熟野生型神经营养因子在包含第51至第63氨基酸的区域内至少一个带正电荷的氨基酸突变；并且

其中与成熟野生型神经营养因子相比，所述神经营养因子多肽具有降低的肝素亲和力。

28.据权利要求27所述的多核苷酸，其中以100ng/ml的浓度在37℃添加至成纤维细胞持续10分钟时，所述神经营养因子多肽具有诱导RET磷酸化的能力，其中所述成纤维细胞表达RET和GFRα1与GFRα2二者之一。

29.根据权利要求27或28所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽可以在小于1M NaCl的NaCl浓度和pH 7.2下从肝素亲和柱洗脱。

30.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R52、R54、R56、R58、R61和R63位置处的至少一个突变。

31.根据权利要求29所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽具有在选自R51、R54、Q55、R56、R57、R58、R60、R61和E62位置处的至少一个突变。

32.根据权利要求30或31所述的多核苷酸，其中所述突变导入至少一个中性、两性或带负电荷的脂族氨基酸。

33.根据权利要求32所述的多核苷酸，其中所述突变导入至少一个独立选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R56A和R58A。

35.根据权利要求34所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R54A、R61A和R63A。

36.根据权利要求35所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R52A、R54A、R56A、R58A和R61A。

37.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含突变R51A、R54Q、Q55G、R56Q、R57G、R58A、R60V、R61G和E62S。

38.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽包含由序列ARLQGQGALVGS对第51至第62位氨基酸的替换。

39.根据权利要求27至38中任一项所述的多核苷酸，其中所述神经营养因子多肽与(SEQ ID NO.5)在成熟野生型神经营养因子的所述氨基酸序列范围内基本上同源或基本上相似，但成熟的人神经营养因子第51至第63位残基所包括的13个氨基酸除外。

40.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQ IDNO：6。

41.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQ IDNO：7。

42.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQ IDNO：8。

43.根据权利要求所述33的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含SEQ IDNO：9。

44.一种重组载体，其包含根据权利要求27至43中任一项所述的多核苷酸。

45.根据权利要求44所述的重组载体，还包含与所述多核苷酸有效连接的表达控制序列。

46.根据权利要求44或45所述的重组载体，其中所述载体是病毒载体。

47.一种治疗细胞变性或减少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的根据权利要求44至46中任一项所述的重组载体。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述的细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过全身性施用法施用。

51.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过鞘内施用法施用。

52.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过鼻内施用法施用。

53.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过脑实质内施用法施用。

54.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述重组载体通过持续释放组合物或装置施用。

55.一种药物组合物，其包含根据权利要求44至46中任一项所述的重组载体和药学上可接受载体。

56.一种宿主细胞，其包含根据权利要求26至43中任一项所述的多核苷酸。

57.根据权利要求56所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞已经用根据权利要求44至46所述的重组载体转化或转染。

58.根据权利要求56或57所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌根据权利要求1至17中任一项所述的多肽。

59.一种治疗细胞变性或减少的方法，包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的权利要求56-58的宿主细胞。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述患者患有选自周围神经病、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、缺血性卒中、急性脑损伤、急性脊髓损伤、神经病理性疼痛、糖尿病、勃起障碍、脱发、先天性巨结肠、神经系统肿瘤、多发性硬化、听力下降、视网膜病变和感染中的疾病或病症。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述的细胞变性或减少包括造血细胞变性或减少，其选自嗜酸粒细胞减少、嗜碱粒细胞减少、淋巴细胞减少、单核细胞减少、嗜中性粒细胞减少、贫血、血小板减少和干细胞减少。

62.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过全身性施用法施用。

63.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过鞘内施用法施用。

64.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过鼻内施用法施用。

65.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过脑实质内施用法施用。

66.根据权利要求58至61中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞通过持续释放组合物或装置施用。

67.一种药物组合物，其包含根据权利要求58至61中任一项所述的宿主细胞和药学上可接受载体。

68.一种药物递送系统，其包含鞘内泵和权利要求1-17中任一项所述的多肽。

69.根据权利要求1至17中任一项所述的神经营养因子多肽，其中所述神经营养因子多肽与另一个蛋白质或多肽序列融合。