CN113766920A - 用于治疗神经肌肉疾病的植物蜕皮素及其衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及20‑羟基蜕皮素及其衍生物,其旨在用于治疗神经肌肉疾病例如脊髓性肌萎缩或肌萎缩侧索硬化,或者更特别地用于治疗在这些神经肌肉疾病的背景下发生的引起肌肉功能改变的特定运动神经元病症。
Description
技术领域
本发明涉及植物蜕皮素和植物蜕皮素的半合成衍生物用于治疗神经肌肉疾病,特别是婴儿型脊髓性肌萎缩和肌萎缩侧索硬化的用途。
背景技术
神经肌肉疾病的特征在于由运动神经元、神经肌肉接头和骨骼肌构成的运动单元的功能改变。无论疾病的起源如何,神经(如在婴儿型脊髓性肌萎缩或肌萎缩侧索硬化中)或肌肉都会引起患者运动功能的改变,当重要的肌肉受到影响时,该运动功能的改变可从残障到过早死亡。对这些神经肌肉疾病的护理至今仍然是针对症状的,并且就患者的残障水平、这些病理状况的进展性以及他们所需的人力和物质需求而言,这代表了巨大的经济成本。研究和开发使得可以减轻患者的运动症状和依赖性的治疗具有一定的社会和经济利益。
在这些神经肌肉疾病中,有两种被描述为特别地影响运动神经元:婴儿型脊髓性肌萎缩(les amyotrophies spinales infantiles,或SMA),其症状出现在儿童期,以及肌萎缩侧索硬化(sclérose latérale amyotrophique,或SLA),其症状在成年期出现时发生。这两种具有不同原因和临床表现的神经退行性疾病具有共同的进行性肌去神经,导致肌萎缩(Al-Chalabi et Hardiman,2013;Crawford et Pardo,1996)。
婴儿型脊髓性肌萎缩代表遗传来源的儿童死亡的最常见原因,其中患病率为1/6,000至1/10,000出生者(Crawford et Pardo,1996)。根据症状出现的年龄和临床影响的进展,描述了从1型(最严重)到3型(其寿命可大于40年)的三种主要严重程度类型。患有SMA的患者由于分离的或聚集成束的肌纤维的萎缩而具有骨骼肌的对称性疼痛。几乎所有的SMA都具有近端优势,即影响躯干和靠近躯干的肌肉。逐步地,运动缺陷在第一步中扩展至下肢的肌肉,然后在第二步中通过优选地影响伸肌而扩展至上肢的肌肉。尽管具有很大的临床异质性,但遗传分析已经能够证明所有形式的SMA都是由位于染色体区域5q13处的针对运动神经元存活的基因SMN1的突变引起的。
在人基因组中,存在该基因的逆着丝粒拷贝,基因SMN2,其可存在于数个拷贝中(Lorson et al.,1998),但这使得可仅部分地抵消基因SMN1的功能的损失。事实上,SMN2与SMN1有5个核苷酸差异,其中一个在外显子7处,这有利于通过剪接由基因SMN2产生的90%的mRNA将其切除。这种选择性剪接导致产生截短的且不稳定的SMNΔ7蛋白。因此,由基因SMN2产生的蛋白质中仅10%是完整且具有功能的(Vitte et al.,1997;Lefebvre et al.,1997)。因此,已证明了基因SMN2的拷贝数、它们的表达水平与疾病严重程度之间的联系。SMN蛋白是小的普遍存在的蛋白,位于核的离散结构域中,称为螺旋体双子(Gemini ofCoiled Body)的Gem,并且在细胞的胞质中。尽管SMN蛋白具有特定的神经元作用,例如轴突生长(McWhorter et al.,2003)和轴突运输(Akten et al.,2011;Peter et al.,2011),但它也参与普遍存在的功能,例如核核糖核蛋白的生物发生(Buhler et al.,1999;Liu etal.,1997;Zhang et al.,2008)或mRNA翻译的调节(Sanchez et al.,2013)。因此,无论是SMN蛋白的表达,还是其细胞功能,都不能使得直接解释运动神经元的特定变性。
然而,不同动物模型的发展和基础研究的进展已经使得可以证明在神经元处仅Smn基因的条件性缺失不会再现SMA的完整症状也不会再现运动神经元变性(Frugier etal.,2000)。另一些研究描述了SMN蛋白在星形胶质细胞(Rindt et al.,2015)、施万细胞(Hunter et al.,2014)、心脏细胞(Bevan et al.,2010;Heier et al.,2010;Shabadi etal.,2010;Biondi et al.,2010)、肝细胞(Vitte et al.,2004)和血管(Somers et al.,2016)的正常运行中的作用,表明能量代谢在疾病的进展和严重程度中发挥的作用。其他进一步的研究集中于SMA中的运动单元并揭示了特定的神经肌肉接头改变(Kariya et al.,2008;Kong et al.,2009;Muray et al.,2008;Biondi et al.,2008),所述神经肌肉接头是运动神经元存活的重要组成部分。事实上,已证明SMN蛋白通过作用于神经递质囊泡池、突触活动(Torres-Benito et al.,2011)以及接头的成熟(使得其可获得功能并维持其功能的关键步骤)来参与神经肌肉接头的正常运行(Kariya et al.,2008;Biondi et al.,2008)。在另一方面,仅肌细胞中Smn基因的失效会产生严重的肌肉变化(Cifuentes-Diazet al.,2001;Rajendra et al.,2007;Lee et al.,2011),例如严重营养不良(Cifuentes-Diaz et al.,2001)、允许收缩的肌节结构的组织不良(Walker et al.,2008)、肌肉干细胞的正确融合降低(Nicole et al.,2003)以及因此其分化(Shafey et al.,2005)。另外,患有SMA的患者的肌源细胞的某些因子例如建立神经肌肉接触所必需的CANP(钙激活中性蛋白酶,Calcium-Activated Neutral Protease)较少(Fidzianska et al.,1984;Vrbova etal.,1989)。最后,已在体外观察到与SMA肌细胞共培养的运动神经元变性更快(Vrbova etal.,1989)。
迄今为止,为了开发针对SMA的治疗,已考虑了非常不同的方法。目前的研究策略大部分集中于通过提高SMN2基因的表达或修饰剪接SMN2转录来直接或不直接地修饰SMN的表达,或者旨在重新引入正确基因的基因治疗。一些研究专注于通过开发细胞治疗或者通过专注于激活神经保护(奥利索西(Olésoxime))或专注于改善肌肉功能(肌钙蛋白激活剂)而独立于SMN的方法。
尽管在SMA方面进行了数十项临床试验,但迄今为止,仅两种分子被当局批准。
第一种是肌钙蛋白激活剂(CK-2127107),其旨在提高肌节对钙的敏感性,以提高耐力和肌肉功能的表现(Hwee et al.,2015)。该分子最近被美国监管机构指定为SMA的孤儿药(2017年5月)。
第二种是反义寡核苷酸(ASO),其旨在有利于对由SMN2基因产生的转录物的外显子7的包含,从而使得可在鞘内注射之后通过脊髓细胞过表达完整的SMN蛋白(Hache etal.,2016;Chiriboga et al.,2016)。该分子由Biogen公司开发并且命名为诺西那生(Nusinersen),已得到美国和欧洲当局批准并且构成用于投放至市场以治疗1型和2型重度婴儿型脊髓性肌萎缩的治疗性应用的第一分子。无论是在动物模型上(Hua et al.,2010;Passini et al.,2011)还是在重度SMA患者的II期和III期临床试验期间(Finkel et al.,2016),用ASO靶向内含子7获得的第一结果对于这种致命疾病都是非常令人印象深刻并且具有前景的。然而,对于单独和/或长期注射到中枢神经系统的寡核苷酸在体内的使用,仍然存在数个灰色区域。首先,科学界对于患者对这种类型的靶向基因表达的外源性分子的长期耐受性缺乏后见之明。另外,另一些问题涉及在SMN蛋白的大量且不受控制的过表达中的固有风险,SMN蛋白的功能与细胞增殖有关(Grice et al.,2011)。另外,诺西那生的效力似乎更为重要,因为在治疗的开始对疾病的进展进行了提前干预,鉴于诊断时间和家庭的临床病程,难以获得临床情况。最后,在SMA中,重要的是要注意多组织改变在疾病进展中所发挥作用的重要性。然而,诺西那生是不穿过血脑屏障的分子,其通过鞘内途径进行治疗,使得其可仅靶向神经元和胶质细胞而不靶向其他器官,例如肌肉、肝、胰腺和血管系统。因此,它们的改变可限制诺西那生的治疗效果。最后,对于其SMN蛋白的表达水平高得多并且很少参与重要预后的患有3型SMA的患者,尚未批准治疗授权,使这种严重程度在治疗方面成为孤儿。
因此,显示出有必要开发与诺西那生互补的生理学和/或药理学方法以增强其保护作用并尽可能限制患者的临床病程、其依赖性和其临床护理。
植物蜕皮素代表了多羟基甾醇的大家族。这些分子由多种植物物种(蕨、裸子植物、被子植物)产生,并参与这些植物针对害虫的防御。植物界中的大多数植物蜕皮素是20-羟基蜕皮素。
专利FR 3 021 318公开了植物蜕皮素并且更特别是20-羟基蜕皮素(20E)已经成为许多药理学研究的对象。这些研究已经强调了这种分子的抗糖尿病和合成代谢特性。在大鼠体内(Syrov et al.,2000;Toth et al.,2008;Lawrence et al.,2012)和体外鼠肌管C2C12上(Gorelick-Feldman et al.,2008)均观察到其对肌肉中蛋白质合成的刺激作用。在临床研究中已发现上文在动物模型中描述的一些作用,但仍然罕见。因此,20-羟基蜕皮素有利于提高年轻运动员中的肌肉量(Simakin et al.,1988)。最后,法国专利FR 3021318还描述了20-羟基蜕皮素和20-羟基蜕皮素衍生物用于治疗和预防肌少症和肌少症性肥胖的用途(Lafont et al.,2017)。
发明内容
本发明的目的是限制与神经肌肉疾病相关的运动神经元损失以及这种变性的后果。
植物蜕皮素代表了植物多羟基甾醇的大家族,其结构对于昆虫蜕皮激素是显而易见的。这些分子由许多植物物种产生并参与其对害虫昆虫的防御。大多数植物蜕皮素是20-羟基蜕皮素。
本发明人出乎意料地发现,植物蜕皮素和植物蜕皮素半合成衍生物显著提高了患有脊髓性肌萎缩的哺乳动物的存活以及体重变化。另外,植物蜕皮素及其半合成衍生物限制了这种病理学中存在的肌萎缩和发育不全,并且显著限制了患有脊髓性肌萎缩的哺乳动物的运动神经元的损失。
出于该目的,本发明涉及包含20-羟基蜕皮素和/或至少一种20-羟基蜕皮素半合成衍生物的组合物,其用于在患有神经肌肉疾病的哺乳动物中治疗特定运动神经元病症,包括由于所述特定运动神经元病症而引起的肌肉功能改变。
在一些具体实施方案中,本发明还响应于以下单独实施或以其技术上有效的组合中的每一种实施的特征。
20-羟基蜕皮素及其衍生物有利地纯化至药用级。
所使用的20-羟基蜕皮素更优选地为富含20-羟基蜕皮素的植物提取物或包含20-羟基蜕皮素作为活性剂的组合物的形式。富含20-羟基蜕皮素的植物提取物是例如鹿草(Stemmacantha carthamoides)(也称为Leuzea carthamoides)、蛛丝毛蓝耳草(Cyanotisarachnoidea)和蓝耳草(Cyanotis vaga)的提取物。
获得的提取物更优选地纯化至药用级。
在一个实施方案中,20-羟基蜕皮素为植物提取物或植物的一部分的形式,所述植物选自包含按所述植物干重计至少0.5%的20-羟基蜕皮素的植物,所述提取物包含至少95%,并且优选地至少97%的20-羟基蜕皮素。所述提取物更优选地纯化至药用级。
在下文中将所述提取物称为BIO101。值得注意的是,其包含的杂质,如能影响所述提取物的药物应用的安全性、可用性或效力的微量化合物为按提取物干重计0%至0.05%。
根据本发明的一个实施方案,杂质是具有19或21个碳原子的化合物,例如红苋甾酮(Rubrostérone)、二氢红苋甾酮(Dihydrorubrostérone)或坡斯特甾酮(Poststérone)。
产生BIO101的植物更优选地选自鹿草(也称为Leuzea carthamoides)、蛛丝毛蓝耳草和蓝耳草。
20-羟基蜕皮素的衍生物通过半合成获得,并且特别地可以以欧洲专利申请no.EP15732785.9中描述的方式获得。
根据一个优选实施方案,肌肉功能改变是由于运动神经元功能的改变或其变性引起的。
在一个实施方案中,肌肉功能改变是横纹骨骼肌的肌肉功能改变或心肌的肌肉功能改变。
在一个实施方案中,肌肉功能改变与发育不全和/或萎缩相关。
在一个具体实施方案中,运动神经元病症由患有神经肌肉疾病的哺乳动物的遗传改变引起。
术语“遗传改变”意指突变,例如核苷酸的替换或插入或者核苷酸的缺失。
在一个具体实施方案中,本发明旨在用于在哺乳动物中治疗婴儿型脊髓性肌萎缩(SMA)或肌萎缩侧索硬化(SLA)的组合物。
在一个具体实施方案中,本发明旨在用于在哺乳动物中治疗散发性神经肌肉疾病(与因果基因或者一个或更多个易感基因的随机突变相关)或其中在选自以下的至少一种基因处存在突变的家族形式的组合物:干预SMA框架的SMN1、SOD1、编码TAR DNA结合蛋白43的TARDBP、VCP(含缬酪肽蛋白)FUS/TLS(融合于肉瘤/易位于脂肪肉瘤)和涉及SLA框架的C9ORF72(染色体9开放阅读框72)。
在一个具体实施方案中,对特定运动神经元病症的治疗包括提高运动神经元存活和/或加速神经肌肉接头的成熟。
在一个具体实施方案中,植物蜕皮素在人中以3至15毫克/千克/天的剂量施用。术语“植物蜕皮素”在此意指一般意义上的植物蜕皮素及其衍生物、20-羟基蜕皮素(特别是为提取物的形式)及其衍生物。
优选地,植物蜕皮素在成人中以200至1,000mg/天的剂量,分成一个或更多个剂量施用,并且在人儿童或婴儿中以5至350mg/天的剂量,分成一个或更多个剂量施用。术语“植物蜕皮素”在此意指一般意义上的植物蜕皮素及其衍生物、20-羟基蜕皮素(特别是为提取物的形式)及其衍生物。
在一些实施方案中,所述组合物包含被认为是植物蜕皮素衍生物的至少一种化合物,所述至少一种化合物具有通式(I):
[化1]
其中:
V-U是碳-碳单键并且Y是羟基或氢,或者V-U是C=C烯键;
X是氧,
Q是羰基;
R1选自:(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6)基团;(C1-C6)A基团,A表示任选地被OH、OMe、(C1-C6)、N(C1-C6)、CO2(C1-C6)类型的基团取代的杂环;CH2Br基团;
W是选自N、O和S,优选地为O并且更优选地为S的杂原子。
在本发明的框架中,“(C1-C6)”意指1至6个碳原子的直链或支链的任意烷基,特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基。有利地,其是甲基、乙基、异丙基或叔丁基,特别是甲基或乙基,更特别地是甲基。
在一个优选实施方案中,在式(I)中:
Y是羟基;
R1选自:(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6)基团;(C1-C6)A基团,A表示任选地被OH、OMe、(C1-C6)、N(C1-C6)、CO2(C1-C6)类型的基团取代的杂环;
W是选自N、O和S,优选地为O并且更优选地为S的杂原子。
在一些实施方案中,所述组合物包含选自以下化合物的至少一种化合物:
n° 1:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-17-(2-吗啉代乙酰基)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 2:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(3-羟基吡咯烷-1-基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 3:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(4-羟基-1-哌啶基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 4:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-[4-(2-羟乙基)-1-哌啶基]乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 5:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-二甲基氨基丙基(甲基)氨基)乙酰基]-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 6:2-[2-氧代-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-6-氧代-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-17-基]乙基]乙基硫烷基乙酸酯;
n° 7:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-乙基硫烷基乙酰基)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
n° 8:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(2-羟乙基硫烷基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮。
在一些实施方案中,所述组合物包含被认为是植物蜕皮素衍生物的至少一种化合物,所述至少一种化合物具有通式(II):
[化2]
在下文中将式(II)化合物称为BIO103。
在一些实施方案中,所述组合物被并入到可经口施用的可药用制剂中。
在本发明的框架中,术语“可药用”意指其可用于制备药物组合物,其通常是安全的、无毒的并且对于兽医以及人药物用途是可接受的。
附图说明
当阅读通过非限制性实例给出的以下描述并参照附图时,将更好地理解本发明,所述附图示出了:
图1A示出了从出生(P0)到出生后11天(P11),用载剂或用BIO101处理的SMA小鼠的体重变化的曲线。在此处和说明书的其余部分中,P对应于出生之后(出生后)的天数,n对应于样本量,并且p对应于用于量化结果的统计学显著性的“p值”;
图1B是从P0至P11用载剂或用BIO101处理的SMA小鼠的P11之前存活曲线的Kaplan-Meier表示;
图2是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的胫骨前肌(胫骨肌)的肌纤维总数的直方图;
图3A是表示健康对照小鼠(对照)的用苏木精和伊红染色的胫骨前肌截面的图像;
图3B是表示从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)的用苏木精和伊红染色的胫骨前肌截面的图像;
图3C是表示从P0至P11用BIO101处理的SMA小鼠(SMA BIO101)的用苏木精和伊红染色的胫骨前肌截面的图像;
图3D是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的胫骨前肌(胫骨肌)的肌纤维截面表面的直方图;
图3E是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌的肌纤维截面表面的直方图;
图3F是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的比目鱼肌的肌纤维截面表面的直方图;
图4A是示出在从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)中,胫骨前肌(胫骨肌)的肌纤维根据其截面表面的分布的直方图;
图4B是示出在从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)中,跖肌的肌纤维根据其截面表面的分布的直方图;
图4C是示出在从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)中,比目鱼肌的肌纤维根据其截面表面的分布的直方图;
图5A示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌AKT磷酸化的Western印迹;
图5B示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌AKT磷酸化进行量化的直方图;
图5C示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌ERK磷酸化的Western印迹;
图5D示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌ERK磷酸化进行量化的直方图;
图5C示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌的SMN蛋白的表达水平的Western印迹;
图5F示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌的SMN蛋白进行量化的直方图;
图6A示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓处的AKT磷酸化的Western印迹;
图6B示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓处的AKT磷酸化进行量化的直方图;
图6C示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓处的ERK磷酸化的Western印迹;
图6D示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓处的ERK磷酸化进行量化的直方图;
图6E示出了显示健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMAVH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓处的SMN蛋白的表达水平的Western印迹;
图6F示出了显示通过密度测量法对健康对照小鼠(CTL VH)、从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA VH)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的脊髓腰椎节段处的SMN蛋白进行量化的直方图;
图7A是表示健康对照小鼠(载剂对照)脊髓腰椎区域截面上运动神经元(抗胆碱乙酰转移酶)的免疫荧光标记的图像;
图7B是表示从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)脊髓腰椎区域截面上运动神经元(抗胆碱乙酰转移酶)的免疫荧光标记的图像;
图7C是表示从P0至P11用BIO101处理的SMA小鼠(SMA BIO101)脊髓腰椎区域截面上运动神经元(抗胆碱乙酰转移酶)的免疫荧光标记的图像;
图7D示出了健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)、从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的运动神经元的总数/切片/半腹侧脊髓的直方图;
图7E示出了健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)、从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的外侧和远端运动神经元的数目/切片/半腹侧脊髓的直方图;
图7F是示出通过对健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)、从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101)的半腹侧脊髓进行切片,根据其胞体表面的运动神经元分布的直方图;
图8是示出在健康对照小鼠(载剂对照n≥5)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=5)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101,n≥6)的组中不同类型的运动神经元(慢、中间和快)的数目分布的直方图;慢运动神经元的特征是ChAT+ERRβ+标记物的表达,快运动神经元的特征是ChAT+MMP9+标记物的表达,并且中间运动神经元的特征是ChAT+ERRβ-MMP9-标记物的表达。p<0.05时认为达到显著性。“*”指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异。“#”指示与SMA载剂小鼠组相比的显著性差异。
图9A示出了通过突触前面(face pre-synaptique)(神经丝和SNAP25)和突触后面(face post-synaptique)(α-银环蛇毒素)的不同标记物对神经肌肉接头进行免疫荧光标记的照片。用双苯酰亚胺染色使得可以识别核。比例尺表示10μm。
图9B是示出在健康对照小鼠(载剂对照,n=4)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=4)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101,n=4)的组中的跖肌中,不同类型的神经肌肉接头根据其成熟状态(呈所谓的“椒盐卷饼(bretzel)”形状:成熟的;有孔的:在成熟过程中;或均匀的:未成熟的)的百分比分布的直方图。“*”指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异(p<0.05)。
图9C是示出在健康对照小鼠(载剂对照,n=4)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=4)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101,n=4)的组中的比目鱼肌中,不同类型的神经肌肉接头根据其成熟状态(呈所谓的“椒盐卷饼”形状:成熟的;有孔的:在成熟过程中;或均匀的:未成熟的)的百分比分布的直方图。“*”指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异(p<0.05)。“#”指示与SMA载剂小鼠组相比的显著性差异。
图9D是示出在健康对照小鼠(载剂对照,n=4)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=4)或从P0至P11用BIO101处理的SMA(SMA BIO101,n=4)的组中的胫骨前肌中,不同类型的神经肌肉接头根据其成熟状态(呈所谓的“椒盐卷饼”形状:成熟的;有孔的:在成熟过程中;或均匀的:未成熟的)的百分比分布的直方图。“*”指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异(p<0.05)。“#”指示与SMA载剂小鼠组相比的显著性差异。
图10A示出了在第P5、P7和P9天通过旷场测试评价的健康对照小鼠(载剂对照,n=13)、从P0至P9用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=11)或从P0至P9用BIO101处理的SMA(SMABIO101,n=12)的运动表现。“*”的数目指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异(*=p<0.05、**=p<0.01、***=p<0.001和****=p<0.0001)。
图10B示出了在第P5、P7和P9天通过抓握测试评价的健康对照小鼠(载剂对照,n=17)、从P0至P9用载剂处理的SMA(SMA载剂,n=11)或从P0至P9用BIO101处理的SMA(SMABIO101,n=10)的肌肉疲劳。“*”的数目指示与载剂对照小鼠组相比的显著性差异(*=p<0.05、**=p<0.01和***=p<0.001)。
图11A示出了从P0至P11用载剂或用BIO103处理的SMA小鼠的体重曲线;
图11B是从P0至P11用载剂或用BIO101处理的SMA小鼠的P11之前存活曲线的Kaplan-Meier表示;
图12A是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO101)的胫骨前肌(胫骨肌)的肌纤维截面表面的直方图;
图12B是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO101)的跖肌的肌纤维截面表面的直方图;
图12C是示出健康对照小鼠(载剂对照)、从P0至P11用载剂处理的SMA(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO101)的比目鱼肌的肌纤维截面表面的直方图;
图13A是示出从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO103)的胫骨前肌(胫骨肌)的肌纤维根据截面表面分布的直方图;
图13B是示出从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO103)的跖肌的肌纤维根据截面表面分布的直方图;
图13C是示出从P0至P11用载剂处理的SMA小鼠(SMA载剂)或从P0至P11用BIO103处理的SMA(SMA BIO103)的比目鱼肌的肌纤维根据截面表面分布的直方图。
具体实施方案
下文将在本发明的一些优选且非限制性应用领域的特定背景下对本发明进行描述。
1.BIO101的纯化方法
根据以下步骤,从90%纯的20-羟基蜕皮素制备BIO101:
i)将90%纯的20-羟基蜕皮素在甲醇中热溶解,过滤并部分浓缩,
ii)添加3体积的丙酮,
iii)在搅拌下冷却至0℃至5℃的温度,
iv)过滤所获得的沉淀物,
v)用丙酮和水连续冲洗,以及
vi)干燥。
这种纯化涉及适合于该分子并且能够在工业规模上生产的重结晶方法。
步骤i)的过滤通过0.2μm颗粒过滤器进行。
步骤i)的部分浓缩有利地在存在MeOH的情况下在约50℃的温度下通过真空蒸馏进行。
步骤vi)的干燥在约50℃的温度下在真空中进行。
2.BIO103的合成方法
根据以下制备方法,通过从20-羟基蜕皮素半合成然后纯化至药用级来获得BIO103:
[化3]
BIO103的3步合成图:
I)氧化裂解20-羟基蜕皮素的碳C20与C22之间的侧链以获得坡斯特甾酮(poststérone)(本领域技术人员已知的方案),
II)在C21位引入溴原子,
III)使由此获得的溴化合物与乙硫醇反应。
3.BIO101和BIO103的生物活性
a.BIO101作用的表型分析
在FVB/NRj基因池上使用重度SMA小鼠模型,其特征是鼠基因Smn的外显子7失效并表达人转基因SMN2的2个拷贝(SmnΔ7/Δ7;huSMN2+/+)(Hsieh et al.,2000)。这些杂交产生的具有“FVB/NRj-SmnΔ7/Δ7huSMN2+/+2拷贝”基因型的小鼠被描述为“SMA”。这些小鼠的特征是从出生之后4天开始就观察到进行性生长衰竭,并且在生命结束时脊髓腹侧角约50%的运动神经元变性(进行性肌萎缩)并且平均寿命为约12天(Hsieh et al.,2000)。具有“FVB/NRj-Smn+/Δ7huSMN2+/+2拷贝”基因型的小鼠没有特定的表型并且被用作所谓的“对照”小鼠。通过用与载剂(在本案例中为环糊精)复合的分子BIO101,或用单独的载剂(VH)每天管饲50mg/kg的剂量对小鼠进行处理。每天分析体重和存活,直至P11。在说明书的其余部分中,n对应于样本量并且p对应于用于量化结果的统计学显著性的“p值”。
结果表明,与用载剂处理的动物(n=22)相比,在从出生起每天经口处理的小鼠中,单独的BIO101(n=18,其中n为样本量)使得可以显著限制(p<0.05)从出生后9天起可见的动物体重的损失(图1A),并显著降低(p<0.05)经处理动物的P11之前的死亡率(图1B)。
b.BIO101的肌肉营养作用的分析
在P11时,在小鼠最后一次管饲之后一小时,将经处理的小鼠用1%戊巴比妥以6μL/g小鼠麻醉,然后对伸肌比目鱼肌(具有混合类型学)、伸肌跖肌(具有快类型学)和屈肌胫骨肌(具有快类型学)进行取样,以进行组织学或分子学研究。
在取样之后,将比目鱼肌、跖肌和胫骨肌分别包含在保存基质中,然后在冷却的异戊烷中冷冻。对于每种肌肉,实现10μm厚的内侧截面。将这些切片用苏木精-伊红染色、脱水并在包含基质中封固。用显微镜(放大率为×200)拍摄这些切片的图像。为了获得具有浮雕印象的图像,使用微分干涉对比技术。从这些图像中,使用图像处理软件计算每种肌肉的肌纤维数目和这些纤维的20%的截面表面(图2)。
对用苏木精-伊红染色的取样肌肉截面的组织学分析显示了BIO101对肌肉发育不全(肌纤维数目)的有益作用。事实上,在胫骨肌中,用BIO101处理的SMA小鼠的肌纤维数目与用载剂处理的动物的纤维数目相比显著提高(分别为2358和2069个纤维(+14%),p<0.05)。
有趣的是,无论肌肉的性质和类型学如何,SMA小鼠中存在的肌萎缩都受到处理的限制。事实上,用BIO101处理使得可以显著限制所研究的三种肌肉屈肌或伸肌的萎缩。
相对于健康对照小鼠,在SMA背景下的肌纤维萎缩(图3A)在胫骨肌组织学切片上确实可见(图3B),并且对肌纤维截面表面的量化表明,相对于对照小鼠(n=4),SMA小鼠(n=4)的胫骨肌中的这种萎缩为56.1%(图3D)。由于用BIO101(n=4)处理,在P11时这种萎缩显著降低(p<0.05)至32.7%(图3C和图3D)。这同样适用于跖肌,其中与健康对照小鼠相比,在SMA小鼠中观察到46%的显著肌纤维萎缩(p<0.05)并且其中用BIO101处理将这种萎缩显著限制至17.9%(p<0.05)(图3E);并且同样适用于比目鱼肌(与对照相比,SMA小鼠的肌纤维萎缩为50.2%(p<0.01),相比之下,用BIO101处理为37.8%(p<0.05))(图3F)。
为了对BIO101对萎缩的作用进行更精细的分析,评价了肌纤维按截面表面类别的分布。根据它们的性质,肌纤维具有不同的截面表面。以缓慢收缩为特征的I型纤维的尺寸小于以快速收缩为特征的II型纤维的尺寸。在从P0至P11对SMA小鼠进行处理的情况下观察到的由分子BIO101引起的萎缩的显著降低,导致与用载剂处理的SMA小鼠相比,在用BIO101处理的SMA小鼠的所研究的三种肌肉中,这种处理对纤维根据其截面表面的分布产生显著作用(图4A、4B和4C)。与SMA载剂小鼠组相比,在从P0至P11用BIO101处理的SMA小鼠的胫骨肌中观察到截面表面为400至800μm2的纤维比例的显著提高,而截面表面为100至200μm2的纤维比例显著降低(p<0.05)(图4A)。在从P0至P11用BIO101处理的SMA的跖肌和比目鱼肌中,观察到跖肌截面表面为200至400μm2的纤维比例的提高,伴随着跖肌截面表面为0至100μm2的纤维比例的降低(图4B),以及比目鱼肌截面表面为100至200μm2的纤维比例的降低(图4C)。
c.分子分析
先前的研究已经使得可以证明AKT/CREB途径的激活不足和ERK/Elk-1途径的过度激活与“FVB/NRj-SmnΔ7/Δ7huSMN2+/+2拷贝”转基因小鼠脊髓腹侧角处SMN蛋白的低表达有关,该转基因小鼠用作重度II型脊髓性肌萎缩鼠模型,表明这些途径在疾病中的作用(Branchu et al.,2013)。
将冷冻的跖肌通过机械研磨在提取缓冲液中匀浆。对包含蛋白质提取物的上清液取样,然后根据Lowry蛋白质测定对蛋白质提取物进行定量。在SDS-PAGE凝胶上进行电泳,然后将分离的蛋白质转移到膜上。使用的一抗如下:小鼠单克隆抗SMN(1∶5000)、兔多克隆抗Ser473磷酸-AKT(1∶1000)、兔多克隆抗AKT(1/100)、兔单克隆抗磷酸-ERK 1/2(1∶500)、抗MAP激酶1/2(ERK 1/2)(1∶1000)。在冲洗之后,将膜用与过氧化物酶缀合的抗小鼠(1∶5000)或抗兔(1∶5000)二抗孵育。在使用一抗之后,通过在解离溶液中孵育破坏抗体-抗原复合物,然后将膜再次与兔抗AKT和抗MAP激酶1/2(ERK 1/2)抗体(1∶1000)一起孵育。抗体复合物通过化学发光显示,并通过凝胶、膜或薄膜样品的数字图像获取设备进行成像。通过减去背景并通过用β-肌动蛋白条带的光密度进行归一化用图像处理软件量化每个特异性条带的光密度。对于用载剂处理的对照,将获得的值确定为1,并将其他组的值相对于这些对照进行归一化,并表示为相对量。通过进行独立实验并通过使用不同的膜(在其上将每组与对照进行比较)获得来自每组的动物。跖肌处pAKT的定量值表示用载剂处理的3只小鼠/组(对照或SMA)和用BIO101处理的4只小鼠。跖肌处pERK的定量值表示至少4只小鼠/组。SMN的定量值表示n=2。关于脊髓处pAKT的定量值,对于pAKT和pERK,它们表示n=2只小鼠/组,而对于SMN的水平,它们表示n=4/组。
跖肌中的分子分析确定了与载剂对照小鼠(CTL VH)相比,在SMA小鼠中AKT途径确实激活不足(图5A和5B),有益于ERK途径(图5C和5D)(Branchu et al.,2013)。用BIO101处理11天使得可以通过非常显著地提高AKT磷酸化(pAKT)来逆转从P0至P11处理的小鼠肌肉中的这种关系(图5B),同时ERK磷酸化(pERK)水平显著降低(图5D)。这种有益且已被证明有益的情况与SMN蛋白的过表达有关(Branchu et al.,2013)。如所预期的,与健康对照动物相比,SMN蛋白在SMA动物中几乎不表达。然而,并且完全令人惊讶的是,在用BIO101处理之后,不能观察到SMN的表达水平的改变,这表明原始的分子调节(图5E和5F)。
还在SMA小鼠的脊髓处发现了ERK与AKT之间信号传导途径的这种平衡。事实上,与健康对照小鼠(CTL VH)相比,在SMA小鼠中观察到AKT磷酸化(pAKT)的明显降低(图6A和6B),而ERK磷酸化(pERK)提高(图6C和6D)。持续11天每天用BIO101处理SMA小鼠,通过提高pAKT水平和降低pERK水平,部分恢复动物脊髓中的这种平衡(图6B和6D)。预期在该模型中,SMN蛋白在SMA小鼠中不表达。如在跖肌中观察到的,用BIO101处理不能在经11天处理的SMA小鼠中恢复SMN水平(图6E和6F)。
d.运动神经元的分析
通过用胆碱乙酰转移酶(ChAT)进行免疫荧光标记,例如上文所述(Biondi etal.,2008;Boyer et al.,2013),对健康对照小鼠或者用载剂或BIO101处理11天的SMA的脊髓腰椎区域(L1至L5)厚截面上的运动神经元群进行定量和定性研究。然后通过对不同运动神经元亚群的研究,通过表征其在脊髓中的位置(外侧或内侧位置)以及其胞体尺寸的分布,对该分析进行细化。
用PBS对经麻醉的小鼠进行心内输注。取小鼠的脊髓,固定,然后冲洗。在4%琼脂糖溶液中包被脊髓腰椎区域(L1至L5)。在样品的整个长度上使用振动切片机制备50μm截面。然后将每5个脊髓切片中的一个切片用于免疫组织化学分析。在用0.1M甘氨酸饱和之后,组织然后被透化,封闭,然后用山羊多克隆一抗抗胆碱乙酰转移酶(ChAT)(1/400e)标记。然后洗涤切片,然后用与花青3偶联的抗山羊多克隆二抗(1∶400e)孵育。使用双苯酰亚胺(1/1000e)标记核,然后再次洗涤切片,然后用荧光染料的光漂白抑制剂封固。由于在不存在一抗的情况下进行了对照标记,因此验证了标记的特异性。
使用相机获得图像,所述相机安装在放大率为×200的显微镜上并且与特别是包含用于图像获取的合适软件的微计算机类型的中央处理单元联接。所有计数均使用图像处理软件进行。
在免疫荧光中,用抗ChAT抗体标记的运动神经元确实可在图中在脊髓腹侧角处以浅灰色标识(图7A、7B和7C)。确定三个小鼠组的每个组的半腹侧脊髓的每个切片的运动神经元数目。预期地,与在健康对照小鼠组(n=5)中发现的运动神经元数目相比(图7A),SMA小鼠(n=5)的运动神经元数目显著降低(图7B)。事实上,这两组之间的这种运动神经元变性为25%(p<0.05)(图7D)。以高度有趣的方式,观察到在用BIO101每天处理11天之后,这些SMA小鼠中的运动神经元数目(图7C)显著高于(p<0.05)用载剂处理的SMA小鼠(n=5)中的运动神经元数目。因此,观察到用BIO101处理显著限制了由于病理学引起的运动神经元的变性,并且该处理发挥了显著的神经保护作用,其中在用分子BIO101处理的组中,运动神经元的损失被限制至13%(图7D)。
然后,在一方面通过研究不同运动神经元亚群,通过分析其在脊髓中的位置(外侧或内侧位置),并且在另一方面通过研究其胞体表面的分布,对定量分析进行细化。
观察到与已接受载剂的SMA小鼠相比,用BIO101处理的SMA小鼠中的外侧运动神经元(支配远端肌肉)的数目更高,而对内侧运动神经元没有显著影响(图7E)。
如所预期的,对运动神经元胞体表面的分析表明,与健康对照小鼠相比,用载剂处理的SMA小鼠中的运动神经元的萎缩在运动神经元胞体表面小于600μm2的运动神经元的数目方面显著提高(p<0.05)。与此同时,在SMA小鼠中观察到具有表面大于900μm2的胞体的运动神经元的损失(p<0.05)(图7F)。用BIO101处理使得可以通过显著限制胞体表面小于300μm2的小运动神经元的数目来限制运动神经元的这种萎缩(p<0.05)(图7F)。重要的是要注意,在SLA的框架中,描述了运动单元同样不受病理过程的影响。事实上,该疾病的症状前鼠模型揭示了FF(快速疲劳)类型的运动单元的优选变性,调用运动神经元与具有大表面的胞体一起发挥作用(Pun et al.,2006)。在患者中也报道了类似的差异性变性(Dengleret al.,1990;Theys,Peeters et Robberecht,1999)。因此,在例如SLA的病理学框架中,降低具有小表面的运动神经元的比例以有利于具有较大胞体表面的那些可能是有趣的方法。
以对运动神经元的数目及其胞体尺寸的定量分析以及有关其位置(腹侧脊髓中的内侧或外侧)的定性研究进行补充的方式,我们研究了通过BIO101的处理对运动神经元亚群(慢运动神经元、中间运动神经元和快运动神经元)的保护的影响。这种运动神经元亚群定性分析是通过以下在对照或者用或未用BIO101处理的SMA小鼠的脊髓腰椎区域(L1至L5)的厚截面上进行的:例如上文所述(Biondi et al.,2008;Branchu et al.,2013)用胆碱乙酰转移酶进行免疫荧光标记,以及通过用雌激素相关受体-β(Estrogen-relatedreceptor-β,ERRβ)(慢运动神经元的特异性标记物)或基质金属肽酶9(Matrixmetallopeptidase 9,MMP9)(快运动神经元的特异性标记物)免疫荧光共标记对运动神经元的类型进行分析。
用PBS对经麻醉的小鼠进行心内输注。取小鼠的脊髓,固定,然后冲洗。在4%琼脂糖溶液中包被脊髓腰椎区域(L1至L5)。在样品的整个长度上使用振动切片机制备50μm截面。然后将每5个脊髓切片中的一个切片用于免疫组织化学分析。在用0.1M甘氨酸饱和之后,组织然后被透化,封闭,然后用以下一抗标记:山羊抗ChAT抗体(1/400e)、小鼠抗ERRβ抗体(1/400e)、兔抗MMP9抗体(1/600e)。在三次冲洗之后,将以下抗体与切片一起孵育:驴抗山羊Cy5抗体(1/400e)、驴抗小鼠Alexa 488抗体(1/400e)、驴抗兔Cy3抗体(1/400e)。使用双苯酰亚胺(1/1000e)标记核,然后再次洗涤切片,然后用荧光染料的光漂白抑制剂封固。由于在不存在一抗的情况下进行了对照标记,因此验证了标记的特异性。
使用相机获得图像,所述相机安装在放大率为×200的显微镜上并且与特别是包含用于图像获取的合适软件的微计算机类型的中央处理单元联接。所有计数均使用图像处理软件进行。
慢运动神经元(ChAT+ERRβ+)的数目在无论是用载剂处理的健康小鼠还是用载剂或用BIO101处理的SMA小鼠的组中均没有显著地变化(图8)。在用载剂处理的SMA动物组中观察到与健康对照小鼠相比的平均快运动神经元(ChAT+MMP9+)数目的显著损失(分别为11与16;p<0.05)。发生这种损失以有益于中间类型的运动神经元(ChAT+ERRβ-MMP9-),其数目在SMA载剂小鼠组中与在健康对照小鼠中存在的数目相比显著更高(7相对于4;p<0.05)。
有趣的是,用BIO101处理SMA小鼠优选地有利于快类型的运动神经元(ChAT+MMP9+)的存活。事实上,在用BIO101处理的SMA小鼠组中,快运动神经元的数目显著高于已接受载剂的SMA小鼠组中(14相对于11;p<0.05)。
因此,用BIO101处理限制了在该重度SMA模型中观察到的运动神经元损失,特别是通过保护小鼠免受快运动神经元的损失。
e.神经肌肉接头的分析
SMA的特征是由缺乏SMN蛋白所诱发的特定神经肌肉接头改变以及由特异性运动神经元死亡所诱发的去神经(Kariya et al.,2008;Biondi et al.,2008;Chali et al.,2016)。我们对神经肌肉接头进行了形态学研究,以确定所谓的“椒盐卷饼”成熟结构的成熟程度和片段化。为此,我们通过在用或未用分子BIO101处理的SMA小鼠的比目鱼肌、跖肌和胫骨肌的撕裂的肌纤维上进行免疫荧光(Leroy et al.,2014),对突触前面(突触素和神经丝)和突触后面(α-银环蛇毒素)进行了特异性标记。
用振动切片机实现75μm厚的纵切片。然后使切片在低搅拌的情况下在0.1M甘氨酸中饱和,然后用PBS洗涤。然后将其用PBS-BSA 4%-山羊血清5%-triton 0.5%的溶液封闭和透化。将抗神经丝(1/800e)和抗突触素(SNAP25;1/200e)一抗(为了确定神经肌肉接头的突触前面)孵育48小时,并用二抗(抗lapin647;1/400e)显示,然后洗涤。最后,然后将切片用与555(1/500e)直接偶联的抗α-银环蛇毒素孵育。洗涤切片,并用双苯酰亚胺(1/1,000e)标记核,然后封固在具有荧光染料的光漂白抑制剂的盖玻片与载玻片之间,用于在显微落射荧光成像中进行观察(图9A)。
神经肌肉接头根据三种类别(从最不成熟到最成熟:均匀板、有孔的或“椒盐卷饼”形状)进行定义和量化。
在所研究的所有肌肉(跖肌、比目鱼肌和胫骨肌)中,SMA动物中均匀神经肌肉接头的百分比相对于健康对照小鼠显著提高。神经肌肉接头的这种成熟延迟是预期的,并且已经在文献(Biondi et al.,2008)中进行了描述。事实上,在快伸肌跖肌中,P10时未成熟神经肌肉接头的百分比为89.7%,相对于健康对照小鼠中的49.7%(p<0.05)(图9B),在慢伸肌比目鱼肌中,未成熟神经肌肉接头的百分比为84.3%,相对于健康对照小鼠中的45.7%(p<0.05)(图9C),在快屈肌胫骨肌中,未成熟神经肌肉接头的百分比为69.3%,相对于健康对照小鼠中的28.7%(p<0.05)(图9D)。当SMA小鼠从它们出生到P10每天用BIO101处理时,在所有受试肌肉的神经肌肉接头中均观察到了更显著的成熟,未成熟板的百分比降低,从而有益于有孔板,这证明了成熟的加速。事实上,在跖肌中16.3%的接头为有孔类型,相比之下,在已接受载剂的SMA动物中为10.4%,(p=ns)(图9B)。这种差异在比目鱼肌(SMA组中的有孔接头为26.5%,相比之下,在用载剂处理的SMA小鼠组中为15.7%,p<0.05,图9C)和胫骨肌(经处理的SMA组中的有孔接头为45.7%,相比之下,在用载剂处理的SMA小鼠组中为30.7%,p<0.05,图9D)中是显著的。
因此,这些结果表明用BIO101处理加速了神经肌肉接头的成熟。
f.重度SMA小鼠模型中运动能力的分析
对从P0开始用或不用BIO101处理的2型重度SMA小鼠进行表型分析。从P5至P9纵向地每两天对小鼠的运动能力进行测试。本发明人通过旷场测试评价了自发位移能力,以及通过抓握测试评价了肌肉疲劳性,例如上文所述(Biondi et al.,2008;Branchu et al.,2013;Chali et al.,2016)。
根据小鼠的年龄,用于旷场测试的装置是不同的。对于P0至P6的动物,它由带有被划分成25个3cm×3cm正方形的场的网格图案的15×15×5cm的塑料盒构成。对于P7至P21的动物,它由带有被划分成16个7cm×7cm正方形的场的网格图案的28×28×5cm的塑料盒构成。对小鼠进行单独测试并且在每个环节之后洗涤评价装置。最初放置在场中心处的每只小鼠均能够自由移动5分钟。实验者在这5分钟期间记录行为测量值,并记录穿过的正方形的总数。
预期地,在所有测试时间(P5、P7和P9)时,用载剂处理的SMA小鼠与健康对照小鼠相比显示出运动表现的显著降低(图10A)。事实上,它们能够穿过的正方形数目在P5时为10,在P7时为6以及在P9时为8,相比之下,在健康对照小鼠组中在P5时为17,在P7时为12以及在P9时为24,(分别为p<0.01、p<0.0001和p<0.001)。在P5时,与用载剂处理的SMA小鼠(10个正方形)相比,用BIO101处理SMA小鼠没有改善其运动表现(11个正方形)。在P7时,与已接受载剂的SMA小鼠(穿过6个正方形)相比,用BIO101处理的小鼠的移动性显著提高(穿过10个正方形,p<0.05)。在P9时,这种差异不显著,但用BIO101处理倾向于具有有益作用,其中在SMA小鼠BIO101组中的小鼠能够穿过11个正方形,相比之下,在SMA载剂组中的小鼠穿过8个正方形(p=ns)。
为了评价肌肉疲劳性,从P5至P9测试小鼠后足的抓握力(抓握测试)。小鼠通过它们的后足悬挂在水平悬挂在空中的细金属杆上。记录悬空花费的时间。每只小鼠进行五次连续尝试,两次测试之间有一分钟的休息期。仅保留最佳测试以用于评价肌肉功能。
通过抓握测试测试的肌肉疲劳性显示,用载剂处理的SMA小鼠与健康对照小鼠相比预期地具有显著降低的肌肉功能(图10B)。事实上,它们能够在金属杆上保持悬挂的时间为在P5时为0.2秒、在P7时为6.2秒以及在P9时为5.6秒,相比之下,在健康对照小鼠组中在P5时为3.3秒、在P7时为11.4秒以及在P9时为16.1秒(分别为p<0.01、p<0.01和p<0.001)。在P5时,与用载剂处理的SMA小鼠(0.2秒)相比,用BIO101处理的SMA小鼠显著改善了其肌肉表现(2.3秒;p<0.05)。在P7时,用BIO101处理的SMA小鼠与已接受载剂的SMA小鼠相比悬空时间倾向于增加,但不显著(分别为12.2秒与6.2秒,p=ns)。最后,在P9时,与用载剂处理的SMA小鼠(5.6秒)相比,在用BIO101处理的小鼠中,BIO101非常显著地改善了该参数(20.9秒,p<0.01)。
总之,BIO101对SMA动物的自主运动性以及肌肉疲劳性具有有益作用。
g.BIO103作用的表型分析
在重度SMA模型中,使用相同的II型鼠模型来表征分子BIO103的表型作用。通过用与载剂(在本案例中为环糊精)复合的分子BIO103,或用单独的载剂(VH)每天管饲50mg/kg的剂量对小鼠进行处理。每天分析体重和存活,直至P11。
结果表明,与用载剂处理的动物(n=22)相比,在从出生起每天经口处理的小鼠中,BIO103(n=12)倾向于限制动物的体重损失,尽管差异未达到显著性阈值(图11A)。在另一方面,与已接受载剂的小鼠(P11时的存活为36.3%)相比,BIO103显著(p<0.05)提高了经处理动物的P11之前的存活(P11时的存活为66.6%)(图11B)。
f.BIO103的肌肉营养作用的分析
对已取样肌肉的苏木精伊红染色的截面的组织学分析表明了BIO103对肌萎缩(肌纤维的截面表面)的有益作用。
与分子BIO101相同,无论肌肉的性质和类型学如何,SMA小鼠中存在的肌萎缩均受到该处理的限制。事实上,用BIO103处理使得可以显著限制所研究的三种肌肉的萎缩。
预期地,对肌肉纤维表面的量化显示,与对照小鼠(n=4)相比,这种萎缩在SMA小鼠(n=4)的胫骨肌中非常显著并且为56.1%。由于用BIO103处理(n=4),在P11时这种萎缩显著降低(p<0.05)至22.1%(图12A)。这同样适用于跖肌,与健康对照小鼠相比,在SMA小鼠中观察到46%的显著肌纤维萎缩(p<0.05),并且用BIO103处理将这种萎缩显著限制至15.3%(p<0.05)(图12B);并且同样适用于比目鱼肌(与对照相比,SMA小鼠的肌纤维萎缩为50.2%(p<0.01),相比之下,用BIO103处理为37.1%(p<0.05))(图12C)。
为了对BIO103对萎缩的作用进行更精细的分析,评价了肌纤维按截面表面类别的分布。在从P0至P11对SMA小鼠进行处理的情况下观察到的由分子BIO103引起的萎缩的显著降低,导致与用载剂处理的SMA小鼠相比,在用BIO103处理的SMA小鼠的所研究的三种肌肉中,这种处理对纤维根据其截面表面的分布产生显著作用(图13A、13B和13C)。与SMA载剂小鼠组相比,在从P0至P11用BIO103处理的SMA小鼠的胫骨肌中观察到截面表面大于400μm2的纤维比例的显著提高,而截面表面小于200μm2的小纤维比例显著降低(p<0.05)(图13A)。在从P0至P11用BIO101处理的SMA的跖肌(图13B)和比目鱼肌(图13C)中,观察到截面表面大于300μm2的肌纤维比例提高,伴随着截面表面小于200μm2的肌纤维比例降低。
4.结论
鉴于BIO101和BIO103对患有婴儿型脊髓性肌萎缩的哺乳动物的运动神经元的发育不全、肌萎缩和变性的特性,因此可建议使用植物蜕皮素,并且特别是BIO101和BIO103(单独地或作为旨在纠正遗传改变作用的治疗的补充),以保护肌肉组织以及运动神经元,并且因此减缓具有肌肉功能恶化和/或运动神经元损失结果的神经肌肉疾病的变化。神经肌肉疾病特别地包括肌萎缩侧索硬化以及脊髓性肌萎缩。
更一般地,应注意的是,上文考虑的用于实施和进行本发明的模式是通过非限制性实例的方式描述的,并且因此可考虑其他替代方案。
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Claims (18)
1.组合物,其包含至少20-羟基蜕皮素和/或至少一种20-羟基蜕皮素半合成衍生物,所述组合物用于在患有神经肌肉疾病的哺乳动物中治疗特定运动神经元病症,包括由于所述特定运动神经元病症而引起的肌肉功能改变。
2.根据权利要求1所述应用的组合物,其中20-羟基蜕皮素作为植物提取物或植物部分的提取物的形式,所述植物选自包含按所述植物干重计至少0.5%的20-羟基蜕皮素的植物,所述提取物包含至少95%并且优选地至少97%的20-羟基蜕皮素。
3.根据权利要求2所述应用的组合物,值得注意的是,其包含的能影响所述提取物的药物应用的安全性、可用性或效力的杂质为按所述提取物干重计0%至0.05%。
4.根据权利要求2至3中任一项所述应用的组合物,其中所述植物选自鹿草(Stemmacantha carthamoides)、蛛丝毛蓝耳草(Cyanotis arachnoidea)和蓝耳草(Cyanotis vaga)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述应用的组合物,其中所述肌肉功能改变由运动神经元功能的改变或其变性产生。
6.根据权利要求1至5中任一项所述应用的组合物,其中所述运动神经元病症由患有神经肌肉疾病的哺乳动物的遗传改变引起。
7.根据权利要求1至6中任一项所述应用的组合物,其中肌肉功能改变是横纹骨骼肌的肌肉功能改变或心肌的肌肉功能改变。
8.根据权利要求1至7中任一项所述应用的组合物,其中所述肌肉功能改变与发育不全和/或萎缩相关。
9.根据权利要求1至8中任一项所述应用的组合物,其中所述神经肌肉疾病是婴儿型脊髓性肌萎缩(SMA)和/或肌萎缩侧索硬化(SLA)。
10.根据权利要求9所述应用的组合物,其中20-羟基蜕皮素和/或所述至少一种20-羟基蜕皮素半合成衍生物用于治疗导致SMA或SLA的至少一种遗传改变。
11.根据权利要求1至10中任一项所述应用的组合物,其中所述神经肌肉疾病由选自以下的至少一种基因的突变引起:SMN1、SOD1、TARDBP、VCP、FUS/TLS和C9ORF72。
12.根据权利要求1至11中任一项所述应用的组合物,其中对所述特定运动神经元病症的治疗包括提高运动神经元存活和/或加速神经肌肉接头的成熟。
13.根据权利要求1至12中任一项所述应用的组合物,其中20-羟基蜕皮素和/或所述至少一种20-羟基蜕皮素半合成衍生物在人中以3至15毫克/千克/天的剂量施用。
14.根据权利要求1至13中任一项所述应用的组合物,其中20-羟基蜕皮素和/或所述至少一种20-羟基蜕皮素半合成衍生物在成人中以200至1000mg/天的剂量分成一个或更多个剂量施用,在人儿童或婴儿中以5至350mg/天的剂量分成一个或更多个剂量施用。
16.根据权利要求15所述应用的组合物,其中在所述通式(I)中:
Y是羟基;
R1选自:(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)W(C1-C6)基团;(C1-C6)W(C1-C6)CO2(C1-C6)基团;(C1-C6)A基团,A表示任选地被OH、OMe、(C1-C6)、N(C1-C6)、CO2(C1-C6)类型的基团取代的杂环;
W是选自N、O和S,优选地为O并且更优选地为S的杂原子。
17.根据权利要求15至16中任一项所述应用的组合物,其中所述至少一种通式(I)化合物选自:
-n°1:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-17-(2-吗啉代乙酰基)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°2:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(3-羟基吡咯烷-1-基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°3:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(4-羟基-1-哌啶基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°4:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-[4-(2-羟乙基)-1-哌啶基]乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°5:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-二甲基氨基丙基(甲基)氨基)乙酰基]-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°6:2-[2-氧代-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-6-氧代-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-17-基]乙基]乙基硫烷基乙酸酯;
-n°7:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-乙基硫烷基乙酰基)-2,3,14-三羟基-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮;
-n°8:(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-三羟基-17-[2-(2-羟乙基硫烷基)乙酰基]-10,13-二甲基-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-十氢-1H-环戊[a]菲-6-酮。
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