ES2966716T3 - Fitoecdisonas y sus derivados para su uso en el tratamiento de enfermedades neuromusculares - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a la 20-hidroxiecdisona y sus derivados, destinados a ser utilizados en el tratamiento de una enfermedad neuromuscular como la atrofia muscular espinal o la esclerosis lateral amiotrófica, o más particularmente en el tratamiento de un trastorno específico de las neuronas motoras que causa alteraciones en el sistema muscular. función que ocurre en el contexto de estas enfermedades neuromusculares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Fitoecdisonas y sus derivados para su uso en el tratamiento de enfermedades neuromusculares

Campo técnico de la invención

La invención se refiere al uso de fitoecdisonas y derivados semisintéticos de fitoecdisonas para el tratamiento de enfermedades neuromusculares, en particular atrofia muscular espinal infantil.

Técnica anterior

Las enfermedades neuromusculares se caracterizan por una alteración en el funcionamiento de las unidades motoras, compuestas por neuronas motoras, uniones neuromusculares y músculos esqueléticos. Cualquiera que sea el origen de la enfermedad, tanto nerviosa como en la atrofia muscular espinal infantil o la esclerosis lateral amiotrófica, o muscular, todas provocan una alteración de la función motora de los pacientes, que puede ir desde la discapacidad hasta la muerte prematura cuando se alcanzan músculos vitales. El manejo de estas enfermedades neuromusculares aún hoy sigue siendo sintomático y representa un coste económico considerable dado el nivel de discapacidad de los pacientes, la progresividad de estas patologías y las necesidades humanas y materiales que requieren. La investigación y el desarrollo de terapias para aliviar los síntomas motores y la dependencia del paciente tienen cierto interés social y económico.

Entre estas enfermedades neuromusculares, se describen dos que afectan específicamente a las neuronas motoras: la atrofia muscular espinal infantil (o AME), cuyos síntomas aparecen en la infancia, y la esclerosis lateral amiotrófica (o ELA), cuyos síntomas aparecen en la edad adulta. Estas dos enfermedades neurodegenerativas, con causas y manifestaciones clínicas diferentes, tienen en común una denervación muscular progresiva, responsable de la amiotrofia (AI-Chalabi y Hardiman, 2013; Crawford y Pardo, 1996).

La atrofia muscular espinal infantil representa la causa más común de mortalidad infantil genéticamente inducida, con una prevalencia de 1/6.000 a 1/10.000 nacimientos (Crawford y Pardo, 1996). Se describen tres tipos principales de gravedad, en función de la edad de aparición de los síntomas y de la progresión del daño clínico, que van desde el tipo 1, el más grave, hasta el tipo 3, cuya esperanza de vida puede ser superior a los 40 años. Los pacientes con AME presentan daño simétrico de los músculos esqueléticos por atrofia de fibras musculares aisladas o agrupadas en fascículos. Casi todas las AME son predominantemente proximales, es decir, afectan a los músculos del tronco y cerca del tronco. Paulatinamente, el déficit motor se extiende, en primer lugar, a los músculos de los miembros inferiores y luego, en segundo lugar, a los músculos de los miembros superiores, afectando preferiblemente a los músculos extensores. Aunque presenta una gran heterogeneidad clínica, los análisis genéticos han podido demostrar que todas las formas de AME están causadas por una mutación del genSMN1,para “Survival Of Motor Neurons” ( ‘Supervivencia de las neuronas motoras”,), ubicado en la región cromosómica 5q13. En el genoma humano, existe una copia centromérica inversa de este gen, el genSMN2,que se puede encontrar en varias copias (Lorson et al., 1998), pero que solo compensa parcialmente la pérdida de función del genSMN1.En efecto,s MN2presenta diferencias de 5 nucleótidos conSMN1,incluyendo uno a nivel del exón 7, favoreciendo su escisión al empalmar el 90 % de los ARNm producidos por el genSMN2.Este empalme alternativo conduce a la producción de una proteína SMNñ7 truncado e inestable. Así, solo el 10 % de las proteínas producidas por el genSMN2son completas y funcionales (Vitte et al., 1997; Lefebvre et al., 1997). Por lo tanto, se ha demostrado una relación entre el número de copias del genSMN2,su nivel de expresión y la gravedad de la enfermedad. La proteína SMN es una pequeña proteína ubicua, localizada en dominios discretos de los núcleos, llamada Gemas por“Gemini of Coiled Bodies”,y en el citoplasma de las células. Aunque la proteína SMN tiene funciones específicamente neuronales, como el crecimiento axonal (McWhorter et al., 2003) y el transporte axonal (Akten et al., 2011; Peter et al., 2011), también participa en funciones ubicuas como la biogénesis de ribonucleoproteínas nucleares (Buhler et al., 1999; Liu et al., 1997; Zhang et al., 2008) o la regulación de la traducción del ARNm (Sánchez et al., 2013). Por lo tanto, ni la expresión de la proteína SMN ni sus funciones celulares pueden explicar directamente la degeneración específica de las neuronas motoras.

Sin embargo, el desarrollo de diferentes modelos animales y el avance de la investigación fundamental han permitido demostrar que la deleción condicional del gensmnsolo a nivel de neuronas no se reproducen todos los síntomas de la AME, ni la degeneración de la neurona motora (Frugier et al., 2000). Otros estudios han descrito un papel de la proteína SMN en el correcto funcionamiento de los astrocitos (Rindt et al., 2015), las células de Schwann (Hunter et al., 2014) y el corazón (Bevan et al., 2010; Heier et al., 2010; Shabadi et al., 2010; Biondi et al., 2010), el hígado (Vitte et al., 2004) y los vasos (Somers et al., 2016), lo que sugiere un papel desempeñado por el metabolismo energético en la progresión y la gravedad de la enfermedad. Otros estudios se han centrado en la unidad motora en la AME y han destacado alteraciones específicas en las uniones neuromusculares (Kariya et al., 2008; Kong et al., 2009; Muray et al., 2008; Biondi et al., 2008), un constituyente esencial para la supervivencia de las neuronas motoras. De hecho, se ha demostrado que la proteína SMN participa en el buen funcionamiento de las uniones neuromusculares actuando sobre el conjunto de vesículas de neurotransmisores, la actividad sináptica (Torres-Benito et al., 2011), pero también en la maduración de las uniones, etapa crucial que permite que adquieran su funcionalidad y su mantenimiento (Kariya et al., 2008; Biondi et al., 2008). Por otra parte, la invalidación del gensmnsolo en las células musculares provoca graves alteraciones musculares (Cifuentes-Díaz et al., 2001; Rajendra et al., 2007; Lee et al., 2011), como distrofia severa (Cifuentes-Díaz et al., 2001), mala organización de la estructura sarcomérica que permite la contracción (Walker et al., 2008), una reducción en la correcta fusión de las células madre musculares (Nicole et al., 2003) y, por lo tanto, en su diferenciación (Shafey et al., 2005). Además, las células miogénicas de pacientes con AME son pobres en ciertos factores, como los CANP(“Calcium-Activated Neutral Protease”en terminología anglosajona), esencial para el establecimiento de contactos neuromusculares (Fidzianska et al., 1984; Vrbova et al., 1989). Finalmente, se señaló,in vitro,que las neuronas motoras en cocultivo con células musculares de AME degeneran más rápidamente (Vrbova et al., 1989).

Hasta la fecha, se han considerado enfoques muy diferentes para desarrollar un tratamiento para la AME. Las estrategias de investigación actuales se centran, en su mayor parte, en modificar la expresión de SMN directa o indirectamente, ya sea aumentando la expresión del gen SMN2, modificando el empalme de los transcritos de SMN2, o terapias génicas dirigidas a reintroducir el gen correcto. Algunas investigaciones se centran en enfoques independientes del SNM desarrollando terapias celulares o centrándose en la activación de la neuroprotección (olesoxima) o en la mejora de la función muscular (activador de troponina).

A pesar de decenas de ensayos clínicos en curso en AME, hasta la fecha, las autoridades solo han aprobado dos moléculas.

El primero, un activador de troponina (CK-2127107), tiene como objetivo aumentar la sensibilidad sarcomérica al calcio para mejorar la resistencia y el rendimiento de la función muscular (Hwee et al., 2015). Esta molécula fue designada recientemente como medicamento huérfano para la AME por las agencias reguladoras estadounidenses (mayo de 2017).

El segundo, un oligonucleótido antisentido (ASO), tiene como objetivo promover la inclusión del exón 7 de transcritos producidos por genesSMN2,permitiendo así sobreexpresar la proteína SMN completa por las células de la médula espinal después de inyecciones intratecales (Hache et al., 2016; Chiriboga et al., 2016). Esta molécula, desarrollada por la empresa Biogen y denominada Nusinersen, ha sido aprobada por las autoridades americanas y europeas y constituye la primera molécula terapéutica comercializada para tratar la atrofia muscular espinal infantil grave, tipo 1 y tipo 2. Los primeros resultados obtenidos con ASO dirigido al intrón 7, ya sea en modelos animales (Hua et al., 2010; Passini et al., 2011) o durante ensayos clínicos de fase II y III en pacientes con AME grave (Finkel et al., 2016), son muy impresionantes y prometedores para esta enfermedad letal. Sin embargo, persisten varias áreas grises con respecto al uso de un oligonucleótidoin vivoinyectado en el sistema nervioso central solo y/o a largo plazo. En primer lugar, la comunidad científica carece de perspectiva sobre la tolerancia a largo plazo de los pacientes a este tipo de moléculas exógenas que tienen como objetivo la expresión genética. Además, otra cuestión se refiere a los riesgos inherentes a la sobreexpresión significativa e incontrolada de la proteína SMN, una proteína cuya función se ha asociado con la proliferación celular (Grice et al., 2011). Además, la eficacia de Nusinersen parece tanto más importante cuanto que el inicio del tratamiento se produce en forma temprana en relación con la progresión de la enfermedad, situación clínica difícil de obtener dado el momento del diagnóstico y la evolución clínica de las familias. Finalmente, en la AME, es importante destacar la importancia del papel que juegan las alteraciones multitisulares en la progresión de la enfermedad. Sin embargo, Nusinersen es una molécula que no atraviesa la barrera hematoencefálica, por lo que requiere tratamiento por vía intratecal, lo que solo permite apuntar a neuronas y células gliales sin apuntar a otros órganos como músculos, hígado, páncreas y sistema vascular. Por lo tanto, sus alteraciones podrían limitar los efectos terapéuticos de Nusinersen. Por último, los pacientes que padecen AME tipo 3, para quienes el nivel de expresión de la proteína SMN es mucho mayor y para quienes el pronóstico vital rara vez se ve comprometido, aún no se ha aprobado ninguna autorización de tratamiento, lo que deja huérfana esta terapia.

Por lo tanto, parece esencial desarrollar enfoques fisiológicos y/o farmacológicos complementarios a Nusinersen para potenciar sus efectos protectores y limitar al máximo la evolución clínica de los pacientes, su dependencia y su tratamiento clínico.

Las fitoecdisonas representan una importante familia de esteroles polihidroxilados. Estas moléculas son producidas por diversas especies de plantas (helechos, gimnospermas, angiospermas) y participan en la defensa de estas plantas contra las plagas. La fitoecdisona mayoritaria en el reino vegetal es la 20-hidroxiecdisona.

La patente FR 3021 318 describe que las fitoecdisonas y más particularmente la 20-hidroxiecdisona (20E) han sido objeto de numerosos estudios farmacológicos. Estos estudios han puesto de relieve las propiedades antidiabéticas y anabólicas de esta molécula. Sus efectos estimulantes sobre la síntesis de proteínas en los músculos se observan en ratasin vivo(Syrov et al., 2000; Toth et al., 2008; Lawrence et al., 2012) y en miotubos C2C12 murinosin vitro(Gorelick-Feldman et al., 2008). Algunos de los efectos descritos con anterioridad en modelos animales se han encontrado en estudios clínicos, que aún son pocos. Así, la 20-hidroxiecdisona promueve el aumento de la masa muscular en deportistas jóvenes (Simakin et al., 1988). Finalmente, la patente francesa FR 3021 318 describe, además, el uso de 20-hidroxiecdisona y derivados de 20-hidroxiecdisona, para el tratamiento y prevención de la sarcopenia y la obesidad sarcopénica (Lafont et al., 2017).

MOHSENI RASHIN ET AL; JOURNALOF MOLECULAR NEUROSCIENCE, vol. 67, núm. 2, (2018-12-07), páginas 247-257, divulga el uso de ecdisona ponasterona A (PNA) para promover la diferenciación de células madre mesenquimales derivadas de adipocitos en neuronas motoras cuyo gen SMN2 es funcional y permite expresar la proteína SMN2, lo que finalmente permite compensar la falta de proteína SMN2 en AME.

Presentación de la invención

La presente invención tiene como objetivo limitar la pérdida de neuronas motoras relacionada con enfermedades neuromusculares, así como las consecuencias de esta degeneración. Las fitoecdisonas representan una familia importante de fitoesteroles polihidroxilados estructuralmente relacionados con las hormonas de muda de insectos. Estas moléculas son producidas por muchas especies de plantas y participan en su defensa contra plagas de insectos. La fitoecdisona mayoritaria es la 20-hidroxiecdisona.

Los inventores han descubierto inesperadamente que las fitoecdisonas y los derivados semisintéticos de las fitoecdisonas mejoran significativamente la supervivencia así como la evolución del peso de los mamíferos que padecen atrofia muscular espinal. Además, las fitoecdisonas y sus derivados semisintéticos limitan la atrofia y aplasia muscular presentes en esta patología y limitan significativamente la pérdida de neuronas motoras en mamíferos afectados por atrofia muscular espinal.

Para ello, la invención se refiere a una composición que comprende 20-hidroxiecdisona y/o al menos un derivado semisintético de 20-hidroxiecdisona, para su uso en el tratamiento de una afección específica de las neuronas motoras en mamíferos que padecen una enfermedad neuromuscular que comprende una alteración de la función muscular debida a la afectación específica de las neuronas motoras, siendo la enfermedad neuromuscular la atrofia muscular espinal infantil.

En realizaciones particulares, la invención también cumple con las siguientes características, implementadas por separado o en cada una de sus combinaciones técnicamente efectivas.

Ventajosamente, la 20-hidroxiecdisona y sus derivados se purifican hasta obtener calidad farmacéutica.

La 20-hidroxiecdisona utilizada se presenta preferiblemente en forma de un extracto de plantas ricas en 20-hidroxiecdisona o de una composición que comprende 20-hidroxiecdisona como agente activo. Los extractos de plantas ricos en 20-hidroxiecdisona son, por ejemplo, extractos deStemmacantha carthamoides(también llamadoLeuzea carthamoides), Cyanotis arachnoideayCyanotis vaga.

Los extractos obtenidos se purifican preferiblemente hasta el grado farmacéutico.

En una realización, la 20-hidroxiecdisona está en forma de un extracto vegetal o parte de una planta, eligiéndose dicha planta entre plantas que contienen al menos un 0,5 % de 20-hidroxiecdisona en peso seco de dicha planta, comprendiendo dicho extracto al menos un 95 %. , y preferiblemente al menos 97 %, de 20-hidroxiecdisona. Dicho extracto se purifica preferiblemente a grado farmacéutico. Dicho extracto se denomina posteriormente BIO101. Es sorprendente que contenga entre un 0 y un 0,05 %, en peso seco del extracto, de impurezas, tales como compuestos menores, que puedan afectar a la seguridad, a la disponibilidad o a la eficacia de una aplicación farmacéutica de dicho extracto.

De acuerdo con una forma de realización de la invención, las impurezas son compuestos con 19 o 21 átomos de carbono, como por ejemplo rubrosterona, dihidrorubrosterona o postesterona.

La planta a partir de la cual se produce BIO101 se elige preferiblemente deStemmacantha carthamoides(también llamadoLeuzea carthamoides), Cyanotis arachnoideayCyanotis vaga.

Los derivados de 20-hidroxiecdisona se obtienen por semisíntesis y pueden obtenerse en particular del modo descrito en la solicitud de patente europea N° EP 15732785.9.

De acuerdo con una realización preferida, la alteración de la función muscular se debe a una alteración de la función de las neuronas motoras o a su degeneración.

En una realización, la función muscular deteriorada es la del músculo estriado esquelético.

En una realización, el deterioro de la función muscular está relacionado con aplasia y/o atrofia.

En una realización particular, la enfermedad de la neurona motora resulta de una alteración genética en el mamífero que padece la enfermedad neuromuscular. Por alteración genética nos referimos a una mutación tal como una sustitución o inserción de nucleótido(s) o una eliminación de nucleótido(s).

La invención se refiere a la composición para su uso en mamíferos en el tratamiento de la atrofia muscular espinal infantil (AME).

En una realización particular, la invención se refiere a la composición para su uso en mamíferos en el tratamiento de una enfermedad neuromuscular esporádica (ligada a la mutación aleatoria de un gen causal o de uno o más genes de susceptibilidad) o en forma familiar en la se encuentra una mutación en el gen SMN1 que se produce en el contexto de la AME.

En una realización particular, el tratamiento de la afección específica de la neurona motora implica mejorar la supervivencia de la neurona motora y/o acelerar la maduración de las uniones neuromusculares.

En una realización particular, las fitoecdisonas se administran a una dosis de entre 3 y 15 miligramos por kilogramo por día en humanos. Por fitoecdisona se entiende aquí tanto las fitoecdisonas en general como sus derivados, así como la 20-hidroxiecdisona (en particular en forma de extracto) y sus derivados.

Preferiblemente, las fitoecdisonas se administran a una dosis de 200 a 1000 mg/día, en una o más dosis, en un ser humano adulto, y a una dosis de 5 a 350 mg/día, en una o más dosis, en un ser humano, niño o lactante. Por fitoecdisona se entiende aquí tanto las fitoecdisonas en general como sus derivados, así como la 20-hidroxiecdisona (en particular en forma de extracto) y sus derivados.

En realizaciones, la composición comprende al menos un compuesto considerado como un derivado de fitoecdisona, siendo dicho al menos un compuesto de la fórmula general (I):

[Quím. 1]

en donde:

V-U es un enlace simple carbono-carbono e Y es un grupo hidroxilo:

X es un oxígeno,

q es un grupo carbonilo;

R1 se selecciona de: un grupo (C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (C<1>-C<6>)W(C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (CrCa)W (Cr C<6>)CO<2>(C-<i>-C<6>); un grupo (C-i-Ca)A, en donde A representan un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo de tipo OH, OMe, (C-i-Ca), N(C-i-Ca), CO<2>(C-i-Ca); un grupo CH<2>Br;

en donde W es un heteroátomo seleccionado de N, O y S, preferiblemente O y aún más preferiblemente S.

En el contexto de la presente invención, por “(C-i-Ca)” se entiende cualquier grupo alquilo de 1 a a átomos de carbono, lineal o ramificado, en particular, los grupos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, t-butilo, n -pentilo, n-hexilo. Ventajosamente, se trata de un grupo metilo, etilo, isopropilo o t-butilo, en particular un grupo metilo o etilo, más particularmente un grupo metilo.

En una realización preferida, en la fórmula (I):

Y es un grupo hidroxilo;

R1 se selecciona de: una agrupación (C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (C<1>-Ca)W(C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (C<1>-Ca)W(C-r C<6>)CO<2>(C<1>-C<6>); un grupo (C<1>-Ca)A, en donde A representa un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo de tipo OH, OMe, (C<1>-Ca), N(Cr Ca), CO<2>(C<1>-C<6>);

en donde W es un heteroátomo seleccionado de N, O y S, preferiblemente O y más preferiblemente S.

En realizaciones, la composición comprende al menos un compuesto seleccionado de los siguientes compuestos: N° 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-17-(2-morfolinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona,

N° 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(3-hidroxipirrolidin-1-il)acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

N° 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(4-hidroxi-1-piperidil)acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

N° 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2-hidroxietil)-1 -piperidil]acetM]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

N° 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-dimetilaminopropil(metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

N° 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetN-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]etil]sulfanilacetato de etilo;

N° 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona;

N° 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2-hidroxietNsulfanN)acetN]-10,13-dimetN-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H ciclopenta[a]fenantren-6-ona.

En realizaciones, la composición comprende al menos un compuesto considerado como un derivado de fitoecdisona, teniendo dicho al menos un compuesto la fórmula general (II):

[Quím. 2]

El compuesto de fórmula (II) se denomina posteriormente BIO103.

En realizaciones, la composición se incorpora en una formulación farmacéutica aceptable capaz de administrarse por vía oral.

En el contexto de la presente invención, “farmacéuticamente aceptable” significa aquello que es útil en la preparación de una composición farmacéutica, que generalmente es segura, no tóxica y que es aceptable para uso farmacéutico tanto veterinario como humano.

Breve descripción de las figuras

La invención se comprenderá mejor con la lectura de la siguiente descripción, dada a título de ejemplo no limitativo, y realizada con referencia a las figuras que representan:

La Figura 1A representa la curva de evolución del peso de ratones con AME tratados con un vehículo o con BIO101 desde el nacimiento (P0) hasta los 11 días posnatales (P11). Aquí y en el resto de la descripción, P corresponde al número de días después del nacimiento (postnatal), n corresponde al tamaño de la muestra y p corresponde al “valor p” utilizado para cuantificar la significancia estadística de un resultado;

La Figura 1B es una representación de Kaplan-Meier de las curvas de supervivencia pre-P11 de ratones con AME tratados con vehículo o con BIO101 de P0 a P11;

La Figura 2 es un histograma que representa el número total de fibras musculares en un músculoTibialis anterior (tibial)ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo), o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 3A es una imagen transversal representativa del músculoTibialis anteriorteñido con hematoxilina eosina, de ratones de control sanos (control);

La Figura 3B es una imagen transversal representativa del músculoTibialis anteriorteñido con Hematoxilina Eosina, de ratones AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11;

La Figura 3C es una imagen transversal representativa del músculoTibialis anteriorteñido con Hematoxilina Eosina, de ratones con AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 3D es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoTibialis anterior (Tibialis)de ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 3E es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoPlantarisde ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 3F es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoSoleusde ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 4A es un histograma que representa la distribución de las fibras musculares del músculoTibialis anterior (Tibialis)según su área transversal, en ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 4B es un histograma que representa la distribución de fibras musculares del músculoPlantarissegún su área transversal, en ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 4C es un histograma que representa la distribución de las fibras musculares del músculoSoleussegún su área transversal, en ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5A representa una transferencia Western que ilustra la fosforilación de AKT del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5B representa un histograma que ilustra la cuantificación mediante densitometría de la fosforilación de AKT del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5C muestra una transferencia Western que ilustra la fosforilación de ERK del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5D representa un histograma que ilustra la cuantificación mediante densitometría de la fosforilación de ERK del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11 o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5C representa una transferencia Western que ilustra el nivel de expresión de la proteína SMN del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratada con vehículo (AME VH) de P0 a P11 o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 5F representa un histograma que ilustra la cuantificación por densitometría de la proteína SMN del músculoPlantarisde ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6A representa una transferencia Western que ilustra la fosforilación de AKT en la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6B representa un histograma que ilustra la cuantificación por densitometría de la fosforilación de AKT en la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con el vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6C representa una transferencia Western que ilustra la fosforilación de ERK en la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6D representa un histograma que ilustra la cuantificación por densitometría de la fosforilación de ERK en la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), de ratones con AME tratados con el vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6E representa una Western Blot que ilustra el nivel de expresión de la proteína SMN en la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con vehículo (AME VH) de P0 a P11, o A<m e>tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 6F representa un histograma que ilustra la cuantificación por densitometría de la proteína SMN a nivel lumbar de la médula espinal de ratones de control sanos (CTL VH), ratones con AME tratados con el vehículo (AME VH) de P0 a P11, o AME tratados con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 7A es una imagen representativa del marcaje por inmunofluorescencia de neuronas motoras (anti-colina acetiltransferasa) en una sección transversal de la región lumbar de la médula espinal de ratones de control sanos (control de vehículo);

La Figura 7B es una imagen representativa del marcaje por inmunofluorescencia de neuronas motoras (anti-colina acetiltransferasa) en una sección transversal de la región lumbar de la médula espinal de ratones con AME tratados con vehículo de P0 a P11 (AME vehículo);

La Figura 7C es una imagen representativa del marcaje por inmunofluorescencia de neuronas motoras (anti-colina acetiltransferasa) en una sección transversal de la región lumbar de la médula espinal de ratones con AME tratados con BIO101 de P0 a P11 (AME BIO101);

La Figura 7D representa un histograma del número total de neuronas motoras por sección por médula espinal hemiventral de ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 en P11;

La Figura 7E representa un histograma del número de neuronas motoras laterales y distales por sección por médula hemiespinal ventral de ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 7F es un histograma que representa la distribución de neuronas motoras según su superficie de soma, por sección a través de la médula espinal hemiventral de ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, AME tratada con BIO101 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 8 es un histograma que representa la distribución del número de diferentes tipos de neuronas motoras (lentas, intermedias y rápidas) en los grupos de ratones de control sanos (control de vehículo n>5), AME tratada con el vehículo (AME de vehículo, n= 5) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n>6) de P0 a P11; Las neuronas motoras lentas se caracterizan por la expresión de marcadores ChAT+ERRp+, las neuronas motoras rápidas por la expresión de marcadores ChAT+MMP9+ y las neuronas motoras intermedias por la expresión de marcadores ChAT+ERRp-MMP9- Se considera significativa alcanzada para p<0,05. “*” indica una diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones de control del vehículo. “#” indica una diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones con AME del vehículo.

La Figura 9A representa fotografías del marcado por inmunofluorescencia de la unión neuromuscular mediante los diferentes marcadores de la cara presináptica (Neurofilamento y SNAP25) y de la cara postsináptica (abungarotoxina). El marcaje con bisbencimida permite identificar los núcleos. La barra de escala representa 10 pm.

La Figura 9B es un histograma que representa la distribución del porcentaje de los diferentes tipos de uniones neuromusculares según su estado de maduración (forma denominada “pretzel”: madura; perforada: actualmente en maduración;

o uniformes: inmaduros) en el músculoPlantarisen los grupos de ratones de control sanos (control de vehículo, n=4), AME tratada con vehículo (AME vehículo, n=4) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n=4) de P0 a P11. “*” indica una diferencia significativa (p<0,05) en comparación con el grupo de ratones de control con vehículo.

La Figura 9C es un histograma que representa la distribución del porcentaje de los diferentes tipos de uniones neuromusculares según su estado de maduración (forma denominada “pretZel”: madura; perforada: actualmente en maduración;

o uniformes: inmaduros) en el músculoSoleusen los grupos de ratones de control sanos (control de vehículo, n=4), AME tratada con vehículo (AME vehículo, n=4) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n=4) de P0 a P11. “*” indica una diferencia significativa (p<0,05) en comparación con el grupo de ratones de control con vehículo. “#” indica una diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones con AME del vehículo.

La Figura 9D es un histograma que representa la distribución del porcentaje de los diferentes tipos de uniones neuromusculares según su estado de maduración (forma denominada “pretZel”: madura; perforada: actualmente en maduración;

o uniformes: inmaduros) en el músculoTibialis anterioren los grupos de ratones de control sanos (control de vehículo, n=4), AME tratada con vehículo (AME vehículo, n=4) de P0 a P11, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n=4) de P0 a P11 . “*” indica una diferencia significativa (p<0,05) en comparación con el grupo de ratones de control con vehículo. “#” indica una diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones con AME del vehículo.

La Figura 10A representa las prestaciones del motor evaluadas por la pruebaOpen fielden los días P5, P7 y P9 ratones de control sanos (control de vehículo, n=13), AME tratada con vehículo (AME vehículo, n=11) de P0 a P9, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n=12) de P0 a P9. El número de “*” indica la diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones de control con vehículo (*=p<0,05, **=p<0,01, ***=p<0,001 y ****=p< 0,0001). La Figura 10B representa la fatiga muscular evaluada mediante la prueba de agarre en los días P5, P7 y P9 de ratones de control sanos (control de vehículo, n=17), AME tratada con el vehículo (AME de vehículo, n=11) de P0 a P9, o AME tratada con BIO101 (AME BIO101, n=10) de P0 a P9. El número de “*” indica la diferencia significativa en comparación con el grupo de ratones de control con vehículo (*=p<0,05, **=p<0,01 y ***=p<0,001).

La Figura 11A representa la curva de peso de ratones con AME tratados con vehículo o con BIO103 de P0 a P11; La Figura 11B es una representación de Kaplan-Meier de las curvas de supervivencia pre-P11 de ratones con AME tratados con vehículo o con BIO101 de P0 a P11;

La Figura 12A es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoTibialis anterior (Tibialis)ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO103 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 12B es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoPlantarisde ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO103 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 12C es un histograma que representa el área de la sección transversal de las fibras musculares del músculoSoleusde ratones de control sanos (control de vehículo), AME tratada con el vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratada con BIO103 (AME BIO101) de P0 a P11;

La Figura 13A es un histograma que representa la distribución de fibras musculares del músculoTibialis anterior (Tibialis)dependiendo del área de la sección transversal, ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratados con BIO103 (AME BIO103) de P0 a P11;

La Figura 13B es un histograma que representa la distribución de fibras musculares del músculoPlantarisdependiendo del área de la sección transversal, ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratados con BIO103 (AME BIO103) de P0 a P11;

La Figura 13C es un histograma que representa la distribución de fibras musculares del músculoSoleusdependiendo del área de la sección transversal, ratones con AME tratados con vehículo (AME vehículo) de P0 a P11, o AME tratados con BIO103 (AME BIO103) de P0 a P11.

Descripción de las realizaciones

La invención se describirá a continuación en el contexto particular de algunos de sus campos de aplicación preferidos y no limitativos.

1. Proceso de purificación de BIO101

BIO101 se prepara a partir de aproximadamente un 90 % de 20-hidroxiecdisona pura, siguiendo las siguientes etaoas: i) disolución en caliente de 20-hidroxiecdisona pura a aproximadamente el 90 % en metanol, filtración y concentración parcial,

ii) adición de 3 volúmenes de acetona,

iii) enfriamiento a una temperatura comprendida entre 0 y 5 °C, con agitación,

iv) filtración del precipitado obtenido,

v) enjuagues sucesivos con acetona y agua, y

vi) secado.

Esta purificación implica un proceso de recristalización adecuado a esta molécula y susceptible de realizarse a escala industrial.

La filtración de la etapa i) se lleva a cabo utilizando un filtro de partículas de 0,2 pm.

La concentración parcial de la etapa i) se lleva a cabo ventajosamente mediante destilación al vacío, a una temperatura de alrededor de 50 °C, en presencia de MeOH.

La etapa de secado vi) se lleva a cabo al vacío a una temperatura de aproximadamente 50 °C.

2. Proceso de síntesis de BIO103

BIO103 se obtiene mediante semisíntesis a partir de 20-hidroxiecdisona y luego purificación hasta grado farmacéutico según el siguiente proceso de preparación:

Esquema de síntesis de BIO103 en 3 etapas:

I) escisión oxidativa de la cadena lateral de 20-hidroxiecdisona entre los carbonos C20 y C22 para obtener postesterona (protocolo conocido por el experto en la técnica),

II) introducción de un átomo de bromo en la posición C21,

III) reacción del compuesto bromado así obtenido con etanotiol.

3. Actividad biológica de BIO101 y BIO103.

a. Análisis fenotípico de los efectos de BIO101.

Se utilizó un modelo de ratón con AME grave sobre un fondo genético FVB/NRj, caracterizado por la invalidación del exón 7 del gen murinoSmny expresando 2 copias del transgén humanoSMN2 (Smnü7/ü7; huSMN+/+)(Hsieh et al., 2000). Los ratones resultantes de estos cruces tienen el genotipo “FVB/NRj-Smnñ7/ñ7 huSMN2+/+ 2 copias” se describen como “AME”. Estos ratones se caracterizan por un defecto de crecimiento progresivo que se observa a partir de los 4 días posnatales y presentan una degeneración de aproximadamente el 50 % de las neuronas motoras del asta ventral de la médula espinal al final de la vida, atrofia muscular progresiva y una esperanza de vida media de aproximadamente 12 días (Hsieh et al., 2000). Ratones con el genotipo “FVB/NRj-Smn”/ñ7 huSMN2+/+ 2 copias” no presentan ningún fenotipo particular y se utilizan como ratones denominados “control”. Los ratones fueron tratados mediante alimentación forzada diaria a una dosis de 50 mg/kg, ya sea con la molécula BIO101 complejada con un vehículo (en este caso ciclodextrina) o con el vehículo solo (VH). El peso y la supervivencia se analizaron diariamente hasta el P11. En el resto de la descripción, n corresponde al tamaño de la muestra y p corresponde al “valor p” utilizado para cuantificar la significancia estadística de un resultado.

Los resultados demuestran que BIO101 solo (n=18, con n para el tamaño de la muestra), en el tratamiento oral diario desde el nacimiento de los ratones, permite limitar significativamente (p<0,05) la pérdida de peso visible de los animales 9 días posnatal en comparación con los animales tratados con el vehículo (n=22) (Figura 1A) y reduce significativamente (p<0,05) la mortalidad pre-P11 de los animales tratados (Figura 1B).

b. Análisis de los efectos tróficos musculares de BIO101

En P11, una hora después de su última alimentación forzada, los ratones tratados fueron anestesiados con pentobarbital al 1 % a 6 pl/g de ratones y luego los músculos extensoresSoleus,una tipología mixta, extensorPlantaris,con tipología rápida y flexorTibialis,con tipología rápida, fueron tomados para realizar estudios histológicos o moleculares.

Después de la recolección, los músculosSoleus, PlantarisyTibialis seincluyeron individualmente en medio de conservación y luego se congelaron en isopentano enfriado. Para cada músculo, se realizaron secciones transversales mediales de 10 pm de espesor. Estas secciones se tiñeron con hematoxilina-eosina, se deshidrataron y se montaron en medio de inclusión. Las imágenes de estas secciones se tomaron con un microscopio (con aumento de x200). Para obtener imágenes con sensación de relieve, se utilizó la técnica de contraste de interferencia diferencial. A partir de estas imágenes, se contó el número de fibras musculares de cada músculo y el área de sección transversal del 20 % de estas fibras utilizando un software de procesamiento de imágenes (Figura 2). El análisis histológico de secciones transversales de los músculos tomadas, teñidas con hematoxilina-eosina, muestra un efecto beneficioso de BIO101 sobre la aplasia muscular (número de fibras musculares). En efecto, en elTibialis,el número de fibras musculares de ratones con AME tratados con BIO101 aumenta significativamente en comparación con el número de fibras de animales tratados con vehículo (respectivamente 2358 y 2069 fibras (14 %), p<0,05).

Curiosamente, la atrofia muscular presente en ratones con AME está limitada por el tratamiento, independientemente de la naturaleza y tipología de los músculos. De hecho, el tratamiento con BIO101 permite limitar de modo significativo la atrofia de los tres músculos estudiados: flexor o extensor.

La atrofia de las fibras musculares en un contexto de AME (Figura 3A) en comparación con ratones de control sanos (Figura 3B) es claramente visible en las secciones histológicas deTibialisy la cuantificación del área de sección transversal de las fibras musculares muestra que esta atrofia es del 56,1 % en elTibialisde ratones con AME (n=4) en comparación con ratones de control (n=4) (Figura 3D). Esta atrofia se reduce significativamente (p<0,05) al 32,7 % en P11 gracias al tratamiento con BIO101 (n=4) (Figura 3C y Figura 3D). Es lo mismo para elPlantaris,en donde observamos una atrofia significativa de las fibras musculares del 46 % en ratones con AME en comparación con ratones de control sanos (p<0,05) y en donde el tratamiento con BIO101 limita significativamente esta atrofia al 17,9 % (p<0,05) (Figura 3E) y en elSoleus(50,2 % para ratones con AME en comparación con el control (p<0,01) versus 37,8 % con tratamiento con BIO101, p<0,05) (Figura 3F).

Para realizar un análisis más detallado de los efectos de BIO101 sobre la atrofia, se evaluó la distribución de las fibras musculares por categorías de área de sección transversal. Dependiendo de su naturaleza, las fibras musculares tienen un área de sección transversal diferente. Las fibras de tipo I, caracterizadas por una contracción lenta, son de menor tamaño que las fibras tipo II, caracterizadas por una contracción rápida. La reducción significativa de la atrofia por la molécula BIO101 observada con el tratamiento de ratones con AME de P0 a P11, resulta en un efecto significativo de este tratamiento en la distribución de las fibras según su área de sección transversal en los tres músculos de los ratones estudiados. BIO101 en comparación con ratones con AME tratados con vehículo (Figuras 4A, 4B y 4C). En el músculoTibialisen ratones con AME tratados con BIO101 de P0 a P11, se observa un aumento significativo en la proporción de fibras con un área de sección transversal entre 400 y 800 pm2, mientras que la proporción de fibras que tienen un área de sección transversal entre 100 y 200 pm2 disminuyó significativamente (p<0,05) en comparación con el grupo de ratones con AME vehículo (Figura 4A). En el músculoPlantarisy en elSoleusde AME tratada con BIO101 de P0 a P11, se observa un aumento en la proporción de fibras con un área de sección transversal entre 200 y 400 pm2 acompañado de una disminución en aquellos con un área de sección transversal entre 0 y 100 pm2 para el músculoPlantaris(Figura 4B) y aquellos que tienen un área de sección transversal entre 100 y 200 pm2 para elSoleus(Figura 4C).

c. Análisis moleculares

Estudios anteriores han demostrado una subactivación de la vía AKT/CREB y una sobreactivación de la vía ERK/Elk-1 asociada con una baja expresión de la proteína SMN en el asta ventral de la médula espinal de ratones transgénicos “FVB/NRj-Smnñ7/ñ7 huSMN2+/+ 2 copias” utilizado como modelo de ratón grave de atrofia muscular espinal tipo II, lo que sugiere un papel de estas vías en la enfermedad (Branchu et al., 2013).

El músculoPlantariscongelado se homogeneizó en tampón de extracción mediante molienda mecánica. Se recogió el sobrenadante que contenía el extracto proteico y luego se ensayaron los extractos proteicos según el método de Lowry. Se realizó electroforesis en gel SDS-PAGE y luego las proteínas separadas se transfirieron a membranas. Los anticuerpos primarios utilizados son los siguientes: anti-SMN monoclonal de ratón (1:5000), anti-Ser 473 fosfo-AKT policlonal de conejo (1:1000), anti-AKT policlonal de conejo (1/100), anti-fosfo-AKT de conejo ERK 1/2 (1:500), anti-MAP quinasa 1/2 (ERK 1/2) (1:1000). Después de enjuagarlas, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios anti-ratón (1:5000) o anti-conejo (1:5000) conjugados con peroxidasa. Después del uso de los anticuerpos primarios, los complejos anticuerpo-antígeno se rompieron mediante incubación en una solución de disociación y luego las membranas se incubaron nuevamente con la anti-AKT y anti-MAP quinasa 1/2 (ERK 1/2) de conejo (1:1000). Los complejos de anticuerpos se revelaron mediante quimioluminiscencia y se obtuvieron imágenes mediante un dispositivo de adquisición de imágenes digitales de una muestra de gel, membrana o película. La densidad óptica de cada banda específica se cuantificó con un software de procesamiento de imágenes restando el fondo y normalizando con la densidad óptica de las bandas de p-actina. Para los controles tratados con vehículo, se determinó que los valores obtenidos eran 1, y los valores de los otros grupos se normalizaron con respecto a estos controles y se expresaron como cantidades relativas. Los animales de cada grupo se obtuvieron realizando experimentos independientes y utilizando diferentes membranas en las que se comparó cada grupo con los controles. Los valores cuantitativos de pAKT a nivel dePlantarisrepresentan 3 ratones por grupo tratados con vehículo (control o AME) y 4 ratones tratados con BIO101. Los valores cuantitativos de pERK al nivel dePlantarisrepresentan al menos 4 ratones por grupo. Los valores cuantitativos de SMN representan n=2. En cuanto a los valores cuantitativos de pAKT a nivel de médula espinal, representan n=2 ratones por grupo para pAKT y pERK, mientras que representan n=4 por grupo para el nivel SMN.

El análisis molecular en el músculoPlantarisconfirma que la vía AKT está efectivamente infraactivada (Figuras 5A y 5B) en beneficio de la vía ERK (Figuras 5C Y 5D) en ratones con AME en comparación con ratones de control con vehículo (CTL VH) (Branchu et al., 2013). El tratamiento de 11 días con BIO101 permite invertir esta relación en los músculos de los ratones tratados de P0 a P11 aumentando muy fuertemente la fosforilación de AKT (pAKT) (Figura 5B) mientras que el nivel de fosforilación de ERK (pERK) se reduce considerablemente (Figura 5D). Ya se ha demostrado que esta situación beneficiosa está implicada en la sobreexpresión de la proteína SMN (Branchu et al., 2013). Como era de esperar, la proteína SMN casi no se expresa en animales con AME en comparación con animales de control sanos. Sin embargo y sorprendentemente, no se pudo observar ninguna modificación del nivel de expresión de SMN después del tratamiento con BIO101, lo que sugiere una regulación molecular original (Figuras 5E y 5F).

Este equilibrio de las vías de señalización entre ERK y AKT también se encuentra en la médula espinal de ratones con AME. De hecho, se observa una clara reducción en la fosforilación de AKT (pAKT) en ratones con AME (Figuras 6A y 6B) en comparación con ratones de control sanos (CTL VH), mientras que la fosforilación de ERK (pERK) aumenta (Figura 6C y 6D). El tratamiento diario de ratones con AME durante 11 días con BIO101 restablece parcialmente este equilibrio en la médula espinal de los animales aumentando el nivel de pAKT y disminuyendo el de pERK (Figuras 6B y 6D). Como se esperaba en este modelo, la proteína SMN no se expresa en ratones con AME. Como se observa en el músculoPlantaris,el tratamiento con BIO101 no permite restaurar el nivel de SMN en ratones con AME tratados durante 11 días (Figuras 6E y 6F).

d. Análisis de neuronas motoras

Se llevó a cabo un estudio cuantitativo y cualitativo de las poblaciones de neuronas motoras en secciones gruesas de la región lumbar de la médula espinal (L1-L5) de ratones de control sanos o AME tratados con el vehículo o con BIO101 durante 11 días mediante marcaje inmunofluorescente de la colina acetiltransferasa (ChAT) como se describió con anterioridad (Biondi et al., 2008; Boyer et al., 2013). Luego, el análisis se perfeccionó mediante un estudio de las diferentes subpoblaciones de neuronas motoras caracterizando su ubicación en la médula espinal (posición lateral o medial), así como la distribución del tamaño de su soma.

Los ratones anestesiados fueron perfundidos intracardialmente con PBS. Se extrajeron, fijaron y luego enjuagaron las médulas espinales de los ratones. La región lumbar de la médula espinal (L1-L5) se incluyó en una solución de agarosa al 4 %. Se realizaron secciones transversales de 50 pm utilizando un vibratomo a lo largo de toda la muestra. Luego se utilizó una sección cada 5 secciones de médula espinal para análisis inmunohistoquímicos. Después de la saturación con glicina 0,1 M, los tejidos se permeabilizaron, se bloquearon y luego se marcaron con un anticuerpo policlonal primario de cabra anticolina acetiltransferasa (ChAT) (1/400e). Luego, las secciones se lavan y luego se incuban con el anticuerpo secundario policlonal anti-cabra acoplado a cianina 3 (1:400e). Los núcleos se marcan con bisbencimida (1/1000e), luego las secciones se lavan nuevamente antes de montarlas con un inhibidor de fotoblanqueo con tinte fluorescente. La especificidad del marcado se verifica mediante un marcado de control realizado en ausencia del anticuerpo primario.

Las imágenes se obtuvieron mediante una cámara montada en un microscopio con un aumento de x200 y acoplada a una unidad central de procesamiento de tipo microordenador que incluye en particular un software apropiado para la adquisición de imágenes. Todos los recuentos se realizaron utilizando un software de procesamiento de imágenes.

En la inmunofluorescencia, las neuronas motoras marcadas con el anticuerpo anti-ChAT son claramente identificables en gris claro en las figuras a la altura del asta ventral de la médula espinal (Figuras 7A, 7B y 7C). Se determinó el número de neuronas motoras por sección por médula hemisespinal ventral para cada uno de los tres grupos de ratones. Como era de esperar, el número de neuronas motoras (n = 5) en ratones con AME disminuyó significativamente (Figura 7B) en comparación con el número de neuronas motoras (n=5) encontradas en el grupo de ratones de control sanos (Figura 7A). De hecho, esta degeneración motoneuronal es del 25 % entre estos dos grupos (p<0,05)

(Figura 7D). Curiosamente, se observa que, después de 11 días de tratamiento diario con BIO101, el número de neuronas motoras es significativamente mayor (p<0,05) en estos ratones con AME (Figura 7C) que en ratones con AME tratados con vehículo (n=5). Así, se observa que el tratamiento con BIO101 limita significativamente la degeneración de las neuronas motoras debido a la patología y que el tratamiento ejerce un efecto neuroprotector significativo con una pérdida de neuronas motoras que se limita al 13 % en el grupo tratado con la molécula BIO101 (Figura 7D).

A continuación, se perfeccionó el análisis cuantitativo, por un lado, estudiando las diferentes subpoblaciones de neuronas motoras analizando su localización en la médula espinal (posición lateral o medial) y, por otro lado, estudiando la distribución de la superficie de su soma.

Se observa que el número de neuronas motoras laterales (que inervan los músculos distales) es mayor en los ratones con AME tratados con BIO101 en comparación con los ratones con AME que recibieron el vehículo, mientras que no hay un efecto significativo sobre las neuronas motoras medianas (Figura 7E).

El análisis de la superficie de la neurona motora del soma muestra, como era de esperar, una atrofia de las neuronas motoras en ratones con AME tratados con vehículo en comparación con ratones de control sanos con un aumento significativo en el número de neuronas motoras que tienen una superficie de su soma es inferior a 600 pm2 (p<0,05). Al mismo tiempo, se observa en ratones con<a>M<e>una pérdida de neuronas motoras que tienen un soma con una superficie superior a 900 pm2 (p<0,05) (Figura 7F). El tratamiento con BIO101 permite limitar esta atrofia de las neuronas motoras limitando significativamente el número de neuronas motoras pequeñas con una superficie del soma inferior a 300 pm2 (p<0,05) (Figura 7F). Es importante destacar que en ELA se ha descrito que las unidades motoras no se ven afectadas de manera homogénea por el proceso de la enfermedad. De hecho, el modelo de ratón presintomático de la enfermedad destacó la degeneración preferencial de las unidades motoras de tipo FF(“Fast Fatiguable“)que involucran neuronas motoras con una gran superficie (Pun et al., 2006). También se ha informado de una degeneración diferencial similar en pacientes (Dengler et al., 1990; Theys, Peeters y Robberecht, 1999). Por lo tanto, reducir la proporción de neuronas motoras con una superficie pequeña en favor de aquellas con una superficie somática mayor podría ser un enfoque interesante en el contexto de una patología como la ELA.

Además del análisis cuantitativo del número de neuronas motoras y del tamaño de su soma, así como del estudio cualitativo de su localización (mediana o lateral en la médula espinal ventral), estudiamos el impacto del tratamiento con BIO101 en la protección de subpoblaciones de neuronas motoras (neuronas motoras lentas, neuronas motoras intermedias y neuronas motoras rápidas). Este análisis cualitativo de subpoblaciones de neuronas motoras se llevó a cabo en secciones gruesas de la región lumbar de la médula espinal (L1-L5) de ratones de control o AME tratados o no con BIO101 mediante marcaje inmunofluorescente de colina acetiltransferasa tal como se describió con anterioridad (Biondi et al. al., 2008; Branchu et al., 2013) así como un análisis del tipo de neuronas motoras mediante coetiquetado en inmunofluorescencia con “Estrogen-related receptor-B“(ERRp), marcador específico de neuronas motoras lentas, o con la“Matrix metallopeptidase 9“(MMP9), marcador específico de neuronas motoras rápidas.

Los ratones anestesiados fueron perfundidos intracardialmente con PBS. Se extrajeron, fijaron y luego enjuagaron las médulas espinales de los ratones. La región lumbar de la médula espinal (L1-L5) se incluyó en una solución de agarosa al 4 %. Se realizaron secciones transversales de 50 pm utilizando un vibratomo a lo largo de toda la muestra. Luego se utilizó una sección cada 5 secciones de médula espinal para análisis inmunohistoquímicos. Después de la saturación con glicina 0,1 M, los tejidos se permeabilizaron, bloquearon y luego marcaron con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-ChAT de cabra (1/400e), anticuerpo anti-ERRp de ratón (1/400e), anticuerpo de conejo anti-MMP9 (1/600e). Después de tres enjuagues, se incuban los siguientes anticuerpos secundarios con las secciones: anticuerpo Cy5 anti-cabra de burro (1/400e), anticuerpo anti-ratón Alexa 488 de burro (1/400e), anticuerpo Cy3 anti-conejo de burro (1/400e). Los núcleos se marcan con bisbencimida (1/1000e), luego las secciones se lavan nuevamente antes de montarse con un inhibidor de fotoblanqueo de tintes fluorescentes. La especificidad del marcado se verifica mediante un marcado de control realizado en ausencia del anticuerpo primario.

Las imágenes se obtuvieron mediante una cámara montada en un microscopio con un aumento de x200 y acoplada a una unidad central de procesamiento de tipo microordenador que incluye en particular un software apropiado para la adquisición de imágenes. Todos los recuentos se realizaron utilizando un software de procesamiento de imágenes.

El número de neuronas motoras lentas (ChAT ERRp) no varió significativamente en los grupos, ya sean ratones sanos tratados con vehículo, ratones con AME tratados con vehículo o con BIO101 (Figura 8). En el grupo de animales con AME tratados con el vehículo, se observó una pérdida significativa en el número promedio de neuronas motoras rápidas (ChAT+ MMP9) en comparación con el grupo de ratones de control sanos (11 versus 16 respectivamente; p<0,05). Esta pérdida beneficia a las neuronas motoras de tipo intermedio (ChAT+ ERRb-MMP9-), cuyo número es significativamente mayor en el grupo de ratones vehículo de AME en comparación con el número presente en los ratones de control sanos (7 versus 4; p<0,05).

Curiosamente, el tratamiento con BIO101 de ratones con AME promueve preferiblemente la supervivencia de las neuronas motoras de tipo rápido (ChAT+ MMP9). De hecho, en el grupo de ratones con AME tratados con BIO101, el número de neuronas motoras rápidas es significativamente mayor que en el grupo de ratones con AME que recibieron el vehículo (14 frente a 11; p<0,05).

Por lo tanto, el tratamiento con BIO101 limita la pérdida de neuronas motoras observada en este modelo de AME grave, en particular protegiendo a los ratones de la pérdida de neuronas motoras rápidas.

e. Análisis de uniones neuromusculares.

La AME se caracteriza por una alteración específica de las uniones neuromusculares inducida por la falta de proteína SMN y por la denervación inducida por la muerte específica de las neuronas motoras (Kariya et al., 2008; Biondi et al., 2008; Chali et al., 2016). Realizamos un estudio morfológico de las uniones neuromusculares para determinar el grado de maduración y fragmentación de la estructura madura denominada “pretzel”. Para ello, realizamos marcajes específicos de las caras presináptica (Sinaptofisina y Neurofilamento) y postsináptica (a-bungarotoxina) mediante inmunofluorescencia (Leroy et al., 2014), sobre fibras musculares arrancadas de los músculosSoleus, PlantarisyTibialisen ratones AME tratados o no, con la molécula BIO101.

Se realizaron secciones longitudinales de 75 |jm de espesor con un vibratomo. Luego, las secciones se saturan en glicina 0,1 M con agitación suave y luego se lavan con PBS. Luego se bloquean y permeabilizan con una solución de PBS-BSA 4 %-suero de cabra 5 %-tritón 0,5 %. Anticuerpos antineurofilamentos primarios (1/800e) y antisinaptofisina (SNAP25; 1/200e) (para identificar la cara presináptica de la unión neuromuscular) se incuban durante 48 horas y se revelan con un anticuerpo secundario (AlexaFluor® 647 anti-conejo; 1/400e), luego se lavó. Finalmente, las secciones se incuban con un AlexaFluor® 555 directamente acoplado con anti-a-bungarotoxina (1/500e). Las secciones se lavan y los núcleos se marcan con bisbencimida (1/1000e) y luego se montan entre portaobjetos y cubreobjetos con un inhibidor del fotoblanqueo de tintes fluorescentes para su observación en imágenes microscópicas de epifluorescencia (Figura 9A). Las uniones neuromusculares se definen y cuantifican según tres categorías, desde las más inmaduras hasta las más maduras: placa uniforme, perforada o en forma de “pretzel”.

En todos los músculos estudiados(Plantaris, SoleusyTibialis),el porcentaje de uniones neuromusculares uniformes en animales con AME aumenta considerablemente en comparación con los ratones de control sanos. Este retraso en la maduración de las uniones neuromusculares es esperado y ya ha sido descrito en la literatura (Biondi et al., 2008). De hecho, en el músculo extensor rápido plantar, el porcentaje de uniones neuromusculares inmaduras en P10 es del 89,7 % frente al 49,7 % en ratones de control sanos (p<0,05) (Figura 9B), en el músculo extensor lentoSoleus,el porcentaje de uniones neuromusculares inmaduras es del 84,3 % versus el 45,7 % en ratones de control sanos (p<0,05) (Figura 9C), en el músculo flexor rápidoTibialis,el porcentaje de uniones neuromusculares inmaduras es del 69.3 % versus el 28,7 % en ratones de control sanos (p<0,05) (Figura 9D). Cuando los ratones con AME son tratados diariamente con BIO101, desde el nacimiento hasta P10, se observa una mayor maduración de las uniones neuromusculares en todos los músculos evaluados, con una disminución del porcentaje de placas inmaduras a favor de las placas perforadas, que demuestran una aceleración de la maduración. De hecho, en el músculoPlantaris,el 16.3 % de las uniones son de tipo perforado en comparación con el 10,4 % en los animales con AME que recibieron el vehículo (p=ns) (Figura 9B). Esta diferencia es significativa en los músculosSoleus(26,5 % de uniones perforadas en el grupo tratado con AME versus 15,7 % en el grupo de ratones con AME tratados con vehículo, p<0,05, Figura 9C) y en elTibialis(45,7 % de uniones perforadas en el grupo de AME tratado versus 30,7 % en el grupo de ratones con AME tratados con vehículo, p<0,05, Figura 9D). Así, estos resultados muestran que el tratamiento con BIO101 acelera la maduración de las uniones neuromusculares.

f. Análisis de las habilidades motoras en un modelo de ratón con AME grave

Se llevaron a cabo análisis fenotípicos de ratones con AME tipo 2 grave tratados o no de P0 con BIO101. Se llevó a cabo una prueba de las habilidades motoras de los ratones longitudinalmente cada dos días de P5 a P9. Los inventores evaluaron las capacidades de movimiento espontáneo mediante la pruebaOpen field,así como fatiga muscular por“grip test”(“prueba de agarre”), como se describió con anterioridad (Biondi et al., 2008; Branchu et al., 2013; Chali et al., 2016).

El dispositivo utilizado para la pruebaOpen fieldes diferente dependiendo de la edad de los ratones. Para los animales de P0 a P6, consta de una caja de plástico de 15 * 15 * 5 cm con una cuadrícula del campo dividida en 25 losas de 3 cm * 3 cm. Para los animales de P7 a P21, consta de una caja de plástico de 28 * 28 * 5 cm con una cuadrícula de campo dividida en 16 fichas de 7 cm * 7 cm. Los ratones fueron evaluados individualmente y el dispositivo de evaluación se lavó después de cada sesión. A cada ratón colocado inicialmente en el centro del campo se le permitió moverse libremente durante 5 minutos. El experimentador registró las medidas de comportamiento durante estos 5 minutos y se registró el número total de fichas cruzadas.

Como era de esperar, en todos los momentos evaluados (P5, P7 y P9), los ratones con AME tratados con el vehículo mostraron un rendimiento motor significativamente reducido en comparación con los ratones de control sanos (Figura 10A). De hecho, el número de mosaicos que son capaces de cruzar es 10 en P5, 6 en P7 y 8 en P9 versus 17 en P5, 12 en P7 y 24 en P9 en el grupo de ratones de control sanos (con p< 0,01, p <0,0001 y p<0,001 respectivamente). En P5, el tratamiento con BIO101 de ratones con AME no mejora su rendimiento motor (11 mosaicos) en comparación con los ratones con AME tratados con el vehículo (10 mosaicos). En P7, la movilidad de los ratones tratados con BIO101 aumentó significativamente (10 mosaicos cruzados) en comparación con los ratones con AME que recibieron el vehículo (6 mosaicos cruzados con p<0,05). En P9, esta diferencia no es significativa, pero el tratamiento con BIO101 tiende a tener un efecto beneficioso en ratones que pueden cruzar 11 mosaicos en el grupo de ratones con AME BIO101 en comparación con 8 mosaicos en el grupo de vehículos AME, p = ns).

Para evaluar la fatiga muscular, se probó la fuerza de agarre de las extremidades anteriores de los ratones de P5 a P9(grip test,“prueba de agarre”). Los ratones están suspendidos por sus patas delanteras de una delgada varilla de metal suspendida en el aire, horizontalmente. Se registra el tiempo dedicado a aguantar. Cada ratón fue sometido a cinco intentos sucesivos con un período de descanso de un minuto entre dos pruebas. Solo se conserva el mejor test para la evaluación de las funciones musculares.

La fatigabilidad muscular, probada por la prueba de agarre, muestra, como se esperaba, que los ratones con AME tratados con vehículo tienen una función muscular significativamente disminuida en comparación con los ratones de control sanos (Figura 10B). En efecto, el tiempo durante el cual pueden permanecer suspendidos de la varilla metálica es de 0,2 segundos en P5, 6,2 segundos en P7 y 5,6 segundos en P9 frente a 3,3 segundos en P5, 11,4 segundos en P7 y 16,1 segundos en P9 en el grupo de ratones de control sanos (con p<0,01, p<0,01 y p<0,001, respectivamente). En P5, el tratamiento con BIO101 de ratones con AME mejoró significativamente su rendimiento muscular (2,3 segundos) en comparación con los ratones con AME tratados con vehículo (0,2 segundos; p<0,05). En P7, el tratamiento con BIO101 tiende a aumentar, pero no significativamente, el tiempo de suspensión de los ratones con AME en comparación con los ratones con AME que recibieron el vehículo (12,2 segundos frente a 6,2 segundos respectivamente con p=ns). Finalmente, en P9, BIO101 mejora muy significativamente este parámetro en ratones tratados con BIO101 (20,9 segundos) en comparación con ratones con AME tratados con vehículo (5,6 segundos, con p<0,01).

En conclusión, BIO101 tiene efectos beneficiosos sobre las habilidades motoras voluntarias, así como sobre la fatiga muscular de los animales con AME.

g. Análisis fenotípico de los efectos de BIO103.

Se utilizó el mismo modelo de ratón de tipo II para caracterizar los efectos fenotípicos de la molécula BIO103 en un modelo grave de AME. Los ratones fueron tratados mediante alimentación forzada diaria a una dosis de 50 mg/kg, ya sea con la molécula BIO103 formando un complejo con el vehículo (en este caso, ciclodextrina) o con el vehículo solo (VH). El peso y la supervivencia se analizaron diariamente hasta el P11.

Los resultados demuestran que BIO103 (n=12), en el tratamiento oral diario desde el nacimiento de los ratones, tiende a limitar la pérdida de peso de los animales aunque la diferencia no alcanza el umbral de significancia, en comparación con los animales tratados con el vehículo (n=22) (Figura 11A). Por otro lado, significativamente (p<0,05), BIO103 aumenta la supervivencia pre-P11 de los animales tratados (66,6 % de supervivencia en P11) en comparación con los ratones que recibieron el vehículo (36,3 % de supervivencia en P11) (Figura 11B).

f. Análisis de los efectos tróficos musculares de BIO103

El análisis histológico de secciones transversales teñidas con hematoxilina eosina de los músculos tomados muestra un efecto beneficioso de BIO103 sobre la atrofia muscular (área de sección transversal de fibras musculares).

Al igual que ocurre con la molécula BIO101, la atrofia muscular presente en ratones con AME está limitada por el tratamiento, cualquiera que sea la naturaleza y tipología de los músculos. De hecho, el tratamiento con BIO103 limita significativamente la atrofia de los tres músculos estudiados.

La cuantificación de la superficie de las fibras musculares muestra, como era de esperar, que esta atrofia es muy marcada y es del 56,1 % en elTibialisde ratones con AME (n=4) en comparación con ratones de control (n=4). Esta atrofia se reduce significativamente (p<0,05) al 22,1 % en P11 gracias al tratamiento con BIO103 (n=4)

(Figura 12A). Es lo mismo para elPlantaris,por lo cual se observa una atrofia significativa de las fibras musculares del 46 % en ratones con AME en comparación con ratones de control sanos (p<0,05) y el tratamiento con BIO103 limita significativamente esta atrofia al 15,3 % (p<0,05) (Figura 12B) y en elSoleus(50,2 % para ratones con AME en comparación con el control (p<0,01) versus 37,1 % con tratamiento con BIO103, p<0,05) (Figura 12C).

Para realizar un análisis más detallado de los efectos de BIO103 sobre la atrofia, se evaluó la distribución de las fibras musculares por categorías de área de sección transversal. La reducción significativa de la atrofia por la molécula BIO103 observada con el tratamiento de ratones con AME de P0 a P11, resulta en un efecto significativo de este tratamiento en la distribución de las fibras según su área de sección transversal en los tres músculos estudiados de los ratones con AME tratados con BIO103 en comparación con ratones con AME tratados con vehículo (Figuras 13A, 13B y 13C). En el músculoTibialisde ratones con AME tratados con BIO103 de P0 a P11, se observa un aumento significativo en la proporción de fibras con un área de sección transversal superior a 400 pm2, mientras que la proporción de fibras pequeñas que tienen un área de sección transversal inferior a 200 pm2 disminuyó significativamente (p<0,05) en comparación con el grupo de ratones con AME vehículo (Figura 13A). En el músculoPlantaris(Figura 13b ) y en elSoleus(Figura 13C) de AME tratada con BIO101 de P0 a P11, se observa un aumento en la proporción de fibras musculares con un área de sección transversal superior a 300 pm2 acompañado de una disminución en aquellos con un área de sección transversal inferior a 200 pm2.

4. Conclusión

Teniendo en cuenta las propiedades de BIO101 y BIO103 sobre la aplasia, la atrofia muscular y la degeneración de las neuronas motoras de los mamíferos afectados por atrofia muscular espinal infantil, se puede proponer, por lo tanto, el uso de fitoecdisonas, y en particular de BIO101 y BIO103, solas o además de un tratamiento destinado a corregir los efectos de una alteración genética, para preservar el tejido muscular y las neuronas motoras, y así ralentizar la progresión de enfermedades neuromusculares que resultan en el deterioro de la función muscular y/o la pérdida de neuronas motoras. Las enfermedades neuromusculares incluyen la atrofia muscular espinal.

De manera más general, cabe señalar que los modos de realización y de realización de la invención considerados con anterioridad se han descrito a modo de ejemplos no limitativos y que, por lo tanto, son posibles otras variantes.

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Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Composición que comprende al menos 20-hidroxiecdisona y/o al menos un derivado semisintético de 20-hidroxiecdisona para su uso en el tratamiento de una afección específica de las neuronas motoras en mamíferos que padecen atrofia muscular espinal infantil (AME), siendo dicho al menos un derivado semisintético de 20-hidroxiecdisona seleccionado de: - un compuesto de la fórmula general (I): [Quím. 1]

   en donde: R1 se selecciona de: un grupo (C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (C<1>-C<6>)W(C<1>-Ca)W(C<1>-Ca); un grupo (CrCa)W (Cr C<6>)CO<2>(C-i-C<6>); un grupo (C-i-Ca)A, en donde A representa un heterociclo opcionalmente sustituido por un grupo de tipo OH, OMe, (C-i-Ca), N(C-i-Ca), CO<2>(C-rCa); un grupo CH<2>Br; en donde W es un heteroátomo seleccionado de N, O y S, preferiblemente O y aún más preferiblemente S. - el compuesto de la fórmula (II): [Quím. 2]
2. 2. Composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la 20-hidroxiecdisona está en forma de extracto vegetal o parte de una planta, en donde dicha planta se selecciona de plantas que contienen al menos un 0,5 % de 20-hidroxiecdisona en peso seco de dicha planta, en donde dicho extracto comprende al menos el 95 %, y preferiblemente al menos el 97 % de 20-hidroxiecdisona.
3. 3. Composición para su utilización de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende notablemente entre un 0 y un 0,05 %, en peso seco del extracto, de impurezas que pueden afectar a la seguridad, a la disponibilidad o a la eficacia de una aplicación farmacéutica de dicho extracto.
4. 4. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en donde la planta se selecciona deStemmacantha carthamoides, Cyanotis arachnoideayCyanotis vaga.
5. 5. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la alteración de la función muscular está provocada por una alteración de la función de las neuronas motoras o de su degeneración. a.
6. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la afección de las neuronas motoras resulta de una alteración genética en el mamífero afectado por la enfermedad neuromuscular.
7. 7. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a a, en donde la función muscular alterada es la del músculo estriado esquelético.
8. 8. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la alteración de la función muscular está ligada a una aplasia y/o una atrofia.
9. 9. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la 20-hidroxiecdisona y/o dicho al menos un derivado semisintético de la 20-hidroxiecdisona se utiliza para tratar al menos una alteración genética responsable de la AME.
10. 10. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la enfermedad neuromuscular resulta de una mutación del gen SMN1.
11. 11. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el tratamiento de la afección específica de las neuronas motoras comprende la mejora de la supervivencia de las neuronas motoras y/o la aceleración de la maduración de las uniones neuromusculares.
12. 12. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la 20-hidroxiecdisona y/o dicho al menos un derivado semisintético de la 20-hidroxiecdisona se administra a una dosis de entre 3 y 15 miligramos por kilogramo por día en humanos.
13. 13. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la 20-hidroxiecdisona y/o dicho al menos un derivado semisintético de la 20-hidroxiecdisona se administra a una dosis de 200 a 1000 mg/día, en uno o más dosis, en un ser humano adulto, y una dosis de 5 a 350 mg/día, en una o más dosis, en niños o lactantes.
14. 14. Composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde dicho al menos un compuesto de la fórmula general (I) se selecciona de: - N° 1: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-17-(2-morfolinoacetil)-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 2: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(3-hidroxipirrolidin-1-il)acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 3: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(4-hidroxi-1-piperidil)acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 4: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperidil]acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 5: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-[2-(3-dimetilaminopropil(metil)amino)acetil]-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 6: 2-[2-oxo-2-[(2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-6-oxo-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]etil]sulfanilacetato de etilo; - N° 7: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-17-(2-etilsulfanilacetil)-2,3,14-trihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona; - N° 8: (2S,3R,5R,10R,13R,14S,17S)-2,3,14-trihidroxi-17-[2-(2-hidroxietilsulfanil)acetil]-10,13-dimetil-2.3.4.5.9.11.12.15.16.17- decahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-6-ona.