ES2931104T3 - Uso de 2-fenil-6-(1H-imidazol-1-il)quinazolina para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, preferentemente la enfermedad de Alzheimer - Google Patents
Uso de 2-fenil-6-(1H-imidazol-1-il)quinazolina para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, preferentemente la enfermedad de Alzheimer Download PDFInfo
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Abstract
La invención se refiere a un compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1H-imidazol-1-il)quinazolina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa. La enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en la enfermedad de Alzheimer, la demencia con cuerpos de Lewy, la demencia frontotemporal, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington, las enfermedades priónicas, la demencia asociada al VIH y cualquier forma de trastornos cognitivos ligados a la neurodegeneración, preferentemente la enfermedad de Alzheimer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, preferentemente la enfermedad de Alzheimer
Campo de la invención
La presente invención proporciona 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina para tratar enfermedades neurodegenerativas, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades neurodegenerativas (EN) son una causa creciente de mortalidad y morbilidad en todo el mundo, particularmente en los ancianos. Comprenden patologías muy difusas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la demencia con cuerpos de Lewy, la demencia frontotemporal, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Huntington y las enfermedades priónicas, con un enfoque particular en las similitudes y diferencias entre estos síndromes.
Las enfermedades neurodegenerativas representan un gran desafío para la ciencia básica y la medicina clínica debido a su prevalencia, bioquímica y patología complejas. Por lo tanto, el tratamiento relacionado con nuevos mecanismos representa una necesidad médica no satisfecha.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es el tipo más común de demencia asociada con el deterioro cognitivo progresivo y la pérdida de memoria. Es la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos y afectará a aproximadamente 14 millones de personas en este país para 2050.
Los tratamientos actuales para la EA brindan pocos beneficios sintomáticos y la aprobación más reciente por parte de the US Food and Drug Administration se produjo en 2003. Desde entonces, se han registrado más de 400 estudios clínicos de agentes terapéuticos para la EA, con una tasa de fallo de casi 100% en aquellos ensayos para los que se han dado los resultados. La falta de avances en el tratamiento y la prevención de la EA, principalmente dirigidos a la proteína p-amiloide o la proteína tau de filamentos helicoidales emparejados que se acumula en el cerebro de una persona con EA, es frustrante y es necesario un cambio de perspectiva, buscando nuevas vías y dianas para obtener agentes modificadores de la enfermedad nuevos y eficaces.
La EA se caracteriza por distintos cambios tisulares asociados con la acumulación de péptidos extracelulares de amiloide-p (Ap), derivados de la escisión de la proteína precursora de amiloide (PPA) y depósitos intracelulares de tau hiperfosforilada. Los agregados de Ap y tau son neurotóxicos y desencadenan procesos neurodegenerativos en el cerebro, lo que sugiere que Ap y tau son fundamentales para impulsar la patogénesis de la EA. Además, muchos genes que afectan al riesgo de EA se expresan en la microglía (Zhang B, Cell, 2013), y durante el envejecimiento y la etapa de la enfermedad, la microglía y los astrocitos cambian su fenotipo de activación. Estos hallazgos plantean la posibilidad de que la activación inmunitaria innata pueda contribuir activamente a la patogenia de la EA. En presencia de estímulos dañinos, incluidas proteínas mal plegadas como Ap, las células microgliales generan una respuesta inmunitaria aguda en el cerebro. Si la respuesta no se resuelve, la activación crónica de la microglía y la incorporación de astrocitos desvían sus funciones fisiológicas y beneficiosas.
Los compuestos de imidazol(ina)/guanidina provocan efectos centrales y periféricos a través de la interacción con sitios no adrenorreceptores, los llamados receptores de imidazolina (Escribá P, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999) que se han clasificado en dos tipos principales: el subtipo de sitios de unión (BS) a I1, identificado por fármacos como la clonidina e implicados en la regulación de la presión arterial; sitios de unión a I2, identificados en primer lugar por idazoxano (ligando mixto de receptores de I2BS y a2-adrenérgicos) y caracterizados por ligandos selectivos desprovistos de afinidad por receptores de I1-BS y a2-adrenérgicos (p. ej., 2-BFI, BU224). Además, se identificó un I3BS como un subtipo típico de imidazolina presente en las células beta pancreáticas e involucrado en la secreción de insulina y reconocido por efaroxano.
Uno de los ligandos endógenos para receptores de imidazolina es la agmatina, un producto intermedio de amina en la biosíntesis de poliaminas. La agmatina se distribuye ampliamente en el cuerpo y posiblemente actúa como neurotransmisor y/o neurotransmodulador en el cerebro. Además de los receptores de imidazolina, la agmatina también se une a otros receptores diana como los receptores a2-adrenérgicos, de N-metil-D-aspartato (NMDA) y de serotonina con menor afinidad para producir funciones físicas.
Los I2BS están ampliamente distribuidos y en el cerebro se expresan en las neuronas, pero principalmente en las células gliales (Ruggiero DA, Brain Res., 1998), ubicados principalmente en la membrana externa de la mitocondria.
Se han presentado acciones tanto neuroprotectoras como antiinflamatorias de los fármacos de imidazolina (Regunathan S, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999), pero la farmacología de I2BS aún es esquiva. Los receptores de I2 representan un grupo de sitios de unión alojados en diversas proteínas, cuya naturaleza y significación biológica aún
no están claros (Escribá P, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999).
Algunas pruebas experimentales recopiladas durante las últimas 3 décadas muestran que los ligandos de I2 pueden ejercer al menos efectos neuroprotectores parciales con diferentes mecanismos y en diferentes modelos de neurodegeneración.
El tratamiento crónico con fármacos de imidazolina se ha establecido desde hace mucho tiempo para aumentar la expresión de GFAP en astrocitos (Olmos G, Br. J. Pharmacol., 1994).
En astrocitos y macrófagos, el idazoxano es capaz de inhibir la actividad inducible de NOS (iNOS) y, por lo tanto, reducir los niveles de neurotoxicidad mediada por NO (Feinstein D, Mol. Pharmacol., 1999).
Se ha demostrado que BU224 (ligando de I2 selectivo) regula a la baja factores proapoptóticos en la corteza cerebral de rata y, como tal, puede mediar en acciones neuroprotectoras mediante la inhibición de componentes clave de la señalización apoptótica canónica en el cerebro (Garau C J, Psycopharmacol., 2013).
2-BFI (ligando de I2 selectivo) muestra un efecto neuroprotector en modelos tanto in vitro como in vivo de accidente cerebrovascular isquémico. El 2-BFI in vitro previene la peroxidación lipídica y la apoptosis mitocondrial en una privación de oxígeno-glucosa de los astrocitos (Tian J, J.Neurosci. Res., 2018), mientras que en una lesión cerebral inducida por la oclusión de la arteria cerebral media, un modelo de isquemia cerebral transitoria en ratas, el 2-BFI induce la expresión de Bcl-2 (un gen con un papel clave en la supervivencia neuronal durante la isquemia cerebral) (Han Z, Brain Res., 2010) y protege la integridad de la barrera hematoencefálica, reduciendo la expresión de la metaloproteasa de matriz 9 (MMP-9) y regulando al alza las proteínas de unión estrecha y el colágeno IV (Zhang ZJ, Stroke Cerebrovasc. Dis., 2018).
Los ligandos del receptor de I2 se unen con baja afinidad al receptor de NMDA y modulan su actividad de manera no competitiva y reversible, de forma similar a la memantina que reduce la toxicidad del glutamato mediada por NMDA in vitro e in vivo (Jiang SX, Eur. J. Pharmacol., 2010). Los fármacos de imidazolina I2 inhiben la toxicidad neuronal inducida por Ap al reducir la activación de Erk1/2 (Montolio M, J. Med. Chem., 2012).
El tratamiento crónico con 2-BFI atenúa la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (un modelo de esclerosis múltiple en ratones) restaurando las actividades enzimáticas de B-CK y CaATPasa y manteniendo la activación de calpaína dependiente de calcio en los niveles basales (Wang P, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2011), disminuyendo los niveles de citocinas proinflamatorias IL-17A e IFN-gamma y aumentando el nivel de citocina antiinflamatoria IL-10 (Zhu YB, Neurochem. Res., 2015).
En un modelo de EA (mediante la inyección de Ap1-42 en el hipocampo de rata), el 2-BFI mejora las capacidades de aprendizaje y memoria, reduciendo el estrés oxidativo, regulando a la baja la liberación de factores inflamatorios e inhibiendo la apoptosis de las células neurales (Tian JS, J. Integr. Neurosci., 2017).
BU224 es parcialmente neuroprotector contra la señalización excitotóxica inducida por ácido kaínico (Keller BJ, Psycopharmacol., 2016).
El tratamiento agudo con BU224 aumenta la relación p-FADD/FADD del hipocampo (un índice de supervivencia celular) y reduce la escisión de p35 en p25 neurotóxico (Abás S, ACS Chem. Neurosci., 2017).
El tratamiento con agmatina, el ligando endógeno del receptor de imidazolina, mejora significativamente las funciones cognitivas, recuperando los déficits de memoria inducidos en ratas diabéticas (Bhutada P, Prog. Neuro-Psychopharmacology Biol. Psychiatry 2012).
Por otro lado, se han observado aumentos en la densidad de I2R utilizando ensayos de unión a radioligandos durante el envejecimiento y en cerebros con EA, probablemente debido a su ubicación en los astrocitos (García-Sevilla, Neurosci. Lett., 1998).
La proteína cinasa C (PKC) es una familia de serina/treonina proteína cinasas dependiente de fosfolípidos que comprende una extensa red de señalización en el cerebro. Los estudios de clonación molecular han revelado 12 isoenzimas de PKC, que se dividen en tres subgrupos: (1) PKC clásicas, (2) PKC nuevas y (3) PKC atípicas. Las isoformas de PKC representan un papel clave en diversas funciones cognitivas, incluido el aprendizaje y la memoria. En particular, la PKCs, clasificada como una PKC nueva (que no requiere calcio para su activación), es una serina/treonina cinasa sensible a éster de forbol/diacilglicerol (DAG) e independiente del calcio. Es un regulador clave de diversos eventos de transducción de señales y, por lo tanto, su demanda de estar presente en varias ubicaciones subcelulares se satisface mediante la translocación de la cinasa por proteínas conductoras específicas para la isoenzima. La translocación aberrante de la cinasa podría confundir las salidas de señalización y, por lo tanto, ser perjudicial para la fisiología celular. Debido a esta compleja biología, su papel en los trastornos neurodegenerativos sigue siendo controvertido. Si bien algunos artículos sugieren que la inhibición de la activación de PKCs da como resultado una protección general contra enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo: en la enfermedad de Alzheimer Zara S, Bain Research 2011; en la neurodegeneración inducida por isquemia, Kumar V, J Neuro Res.2019), la mayoría de los artículos del pasado apuntaban a un papel protector de la activación de la PKCs en estas
enfermedades. Este concepto condujo a la propuesta de un activador de esta cinasa (briostatina-1) como candidato clínico para la enfermedad de Alzheimer, por ejemplo en los documentos US 2008/0004332 y US 2016/0025704. En el primero, se afirma que un inhibidor de PKC en tejidos periféricos podría asociarse al activador de PKC solo para amortiguar los posibles efectos secundarios inducidos por la activación de PKC en los tejidos periféricos, donde "tejidos periféricos significa tejidos distintos del cerebro". Desafortunadamente, en mayo de 2017 se comunicó que, en el estudio de prueba de concepto de Fase II, este enfoque que usa la PKCs briostatina-1 no logró cumplir con el criterio principal de valoración, que medía las mejoras en las puntuaciones de la batería de deterioro grave (SIB) en comparación con el placebo. GRIÑÁN-Fe Rr É CHRISTIAN Y OTROS: "Behavioral and Cognitive Improvement Induced by Novel Imidazoline I2-Receptor Ligands in Female SAMP8 Mice”, NEUROTHERAPEUTICS, vol. 16, n° 2, 20 de noviembre de 2018, páginas 416-431 divulga el uso de dos ligandos de imidazolina I2 específicos, MCR9 y MCR5, en un modelo de la enfermedad de Alzheimer.
Compendio de la invención
Los inventores descubrieron que el compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (denominado también CR4056) se puede usar para tratar una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo formado por enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Esta molécula combina 1) una fuerte actividad hacia los sitios de unión a I2, 2) una inhibición duradera de la translocación de PKCs hacia la membrana celular en las neuronas y 3) una sorprendente capacidad para cruzar la barrera hematoencefálica. La combinación de estas tres características da como resultado una sorprendente eficacia en modelos de deterioro de la memoria y de la enfermedad de Alzheimer para CR4056. Esto resultó ser particularmente innovador ya que la técnica anterior excluye explícitamente el uso de inhibidores de PKC que penetran en el cerebro en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para usar en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Cuando en la presente invención se hace referencia a una enfermedad neurodegenerativa, se entiende una enfermedad seleccionada del grupo de trastornos crónicos progresivos caracterizados por la pérdida gradual de neuronas en áreas discretas del sistema nervioso central (SNC).
La enfermedad neurodegenerativa según la invención es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH, preferentemente enfermedad de Alzheimer.
El o los mecanismos que subyacen a la naturaleza progresiva de esta enfermedad neurodegenerativa siguen sin conocerse, pero una reacción inflamatoria oportuna y bien controlada es esencial para la integridad y el funcionamiento adecuado del SNC.
El compuesto 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (también llamado CR4056) es un ligando del receptor de imidazolina-2 primero en su clase caracterizado por una potente actividad analgésica en diferentes modelos animales de dolor inflamatorio, neurogénico, neuropático, posoperatorio, fibromiálgico y osteoartrítico (documentos WO2008014822 A1, WO2009152868 A1, Ferrari F, JPainRes, 2011; Lanza M, B. J. of Pharmacol., 2014).
Además, CR4056 está dotado de una capacidad duradera (pero aún reversible) para inhibir la translocación de PKCs a la membrana celular de las neuronas primarias activadas por estímulos inflamatorios. Esta actividad duradera es característica de CR4056 y no la comparten otros compuestos antiinflamatorios o analgésicos. Sin embargo, esta actividad es resistente al idazoxano (un antagonista prototípico del receptor de I2) y parece, por lo tanto, independiente de la vía clásica inducida por los ligandos de I2. Sin estar vinculados por ninguna teoría, los inventores consideraron que la inhibición de la translocación de PKCs a la membrana plasmática en neuronas activadas por estímulos inflamatorios podría ser un objetivo sorprendentemente mejor para controlar la neurodegeneración y descubrieron que CR4056 era el mejor candidato para hacerlo.
Finalmente, CR4056 está dotado de una peculiar capacidad para atravesar la barrera hematoencefálica y dirigirse al sistema nervioso central: se estudió la presencia de CR4056 en el cerebro en ratas 1 h después de la administración oral única a una dosis de 30 mg/kg suspendida en Methocel al 0,5%. Los niveles medios de CR4056 en el cerebro eran 32272 ng/g. La relación media en cerebro/plasma era de 11,8, lo que sugiere una marcada capacidad de CR4056 para concentrarse en el cerebro.
Los inventores probaron CR4056 en modelos in vitro e in vivo (transgénicos o farmacológicos) para enfermedades neurodegenerativas, específicamente para la enfermedad de Alzheimer, y descubrieron que, sorprendentemente,
CR4056 reducía significativamente la activación de la microglía, contribuyendo así a la neuroprotección, mejoraba significativamente el rendimiento cognitivo y era capaz de revertir el deterioro de la memoria en modelos tanto transgénicos como farmacológicos de la enfermedad de Alzheimer.
Desde el punto de vista de la seguridad, incluso a concentraciones suprafarmacológicas y considerando el tropismo particular de CR4056 por el cerebro, CR4056 no mostraba efectos adversos centrales en ratas. En particular, no se observaron cambios neuroconductuales (evaluados mediante la prueba de Irwin) ni alteraciones de la coordinación motora y la actividad locomotora (evaluadas mediante pruebas de varilla giratoria y de campo abierto). Estos hallazgos indican que CR4056 podría ser un fármaco seguro para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y, en particular, la enfermedad de Alzheimer.
Descripción de las figuras
La Figura 1 presenta el transcurso del tiempo (A) y la supresión (B) del efecto de CR4056 sobre la translocación de PKCs inducida por bradicinina (BK 1 gM). En el Panel A, los símbolos abiertos representan el porcentaje de neuronas positivas para la translocación de PKCs después de la estimulación con BK en ausencia del fármaco. Los símbolos rellenos representan neuronas preincubadas con CR4056 (10 gM) durante diferentes tiempos antes de la estimulación durante 30 segundos con BK+CR4056. El primer símbolo relleno indica el efecto de CR4056 coincubado durante 30 segundos con BK, el segundo símbolo relleno indica 10 segundos de preincubación de CR4056 y el último indica 24 horas de preincubación de CR4056. El efecto de CR4056 era altamente significativo en todo momento (prueba de la t, p<0,05, n=6). En el Panel B, la translocación de PKCs inducida por BK se evaluó antes (símbolo abierto) y después de la preincubación de CR4056 (10 gM) en diferentes intervalos de tiempo (de 10 minutos a 8 horas) (símbolos llenos). El primer punto de datos se obtuvo al final de la preincubación de 10 minutos, cuando CR4056 todavía estaba presente. Los puntos de datos subsiguientes se obtuvieron después de un enjuague intensivo para asegurar la eliminación completa del fármaco de la solución extracelular (n=3).
La Figura 2 presenta los resultados de la activación de la microglía espinal a las 72 horas después de la inyección de CFA. La cuantificación de la activación de la microglía en el asta dorsal L5 SC ipsilateral se determinó como el número de microglía positiva a Iba1, que muestra un cuerpo celular claramente hinchado con procesos reducidos, dentro del marco seleccionado analizado de las láminas superficiales. Los datos representan la media de 5 animales/grupo. ANOVA ordinario monodireccional seguido de comparación múltiple de Dunnet (**p< 0,05).
La Figura 3 presenta resultados de una prueba de evitación pasiva en el modelo de pérdida de memoria inducida por escopolamina. Las ratas tratadas con escopolamina (Esco, 1 mg/kg) o solución fisiológica (Sal) recibían 10 mg/kg de CR4056 dos veces al día o su vehículo (mC). Prueba de la t de Student. *p<0,05; **P<0,01 (n=6).
La Figura 4 presenta los resultados de la prueba del laberinto acuático de Morris en el modelo de pérdida de memoria inducida por escopolamina. Las ratas tratadas con escopolamina (Esco, 1 mg/kg) o solución fisiológica (Sal) recibían 20 mg/kg/día de CR4056 o su vehículo (MC). Los datos representaban el tiempo medio empleado en llegar a la plataforma oculta durante cuatro días. ANOVA bidireccional. Prueba de comparación de Tukey. ** P<0,01.
La Figura 5 presenta los resultados de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos en el modelo de pérdida de memoria inducida por escopolamina. Datos presentados como % de tiempo dedicado a la exploración de objetos nuevos y antiguos en la fase de prueba. *p<0,05; **P<0,01; Prueba de la t de Student (n=6).
La Figura 6 presenta los resultados de la prueba de reconocimiento de objetos nuevos en el modelo en ratones 5XFAD transgénicos de la enfermedad de Alzheimer. (Obj C = objeto nuevo) *p<0,0001, prueba de la t de Student no apareada.
Descripción detallada de la invención
Los inventores descubrieron que el compuesto 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (también llamado CR4056) puede usarse para tratar una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Cuando en la presente invención se hace referencia a una enfermedad neurodegenerativa, se entiende una enfermedad seleccionada del grupo de trastornos crónicos progresivos caracterizados por la pérdida gradual de neuronas en áreas discretas del sistema nervioso central (SNC).
Una enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de
Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH, preferentemente enfermedad de Alzheimer.
El o los mecanismos que subyacen a la naturaleza progresiva de esta enfermedad neurodegenerativa siguen sin conocerse, pero una reacción inflamatoria oportuna y bien controlada es esencial para la integridad y el funcionamiento adecuado del SNC.
La invención proporciona además CR4056 para el uso en un método para tratar o prevenir el desarrollo de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición farmacéutica según la presente invención, tratando o reduciendo así el riesgo de desarrollar una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Según la invención, dicha enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH, preferentemente enfermedad de Alzheimer.
El compuesto 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina se puede utilizar como base libre o en forma de sal. Preferentemente, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal elegida entre hidrocloruro, hidrobromuro, hidrogenosulfato y sulfato, maleato, fumarato, oxalato, metanosulfonato, succinato, ascorbato, tartrato, acetato, salicilato, citrato, aspartato, etilendiaminotetraacetato, benzoato y glutamato. Se presentan más ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables en SM Berge y otros, J.Pharm. Sci. 1977, 66,2.
El compuesto 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina también puede estar en forma polimórfica o en forma de hidrato como se describe en el documento EP2438058A.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacológica que comprende el compuesto 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y un vehículo para el uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
Preferentemente, la composición de la invención se usa para tratar la enfermedad de Alzheimer. La composición a utilizar puede comprender también excipientes farmacéuticamente aceptables y puede administrarse en una forma farmacéutica adecuada para la vía de administración deseada.
Los aditivos farmacéuticamente aceptables pueden ser excipientes, ligandos, agentes dispersantes, colorantes, humectantes, comúnmente utilizados para la preparación de comprimidos, cápsulas, píldoras, soluciones, suspensiones, emulsiones para administración oral. También se contemplan soluciones inyectables para administración parenteral, que comprende la administración subcutánea, espinal y transdérmica.
La composición farmacéutica según la presente invención es preferentemente para administración intravenosa, oral, transdérmica, intratecal, intranasal, intraperitoneal o intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas según la presente invención se pueden usar solas o en combinación con o pueden comprender uno o más fármacos adicionales. Estos fármacos pueden ser fármacos conocidos para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
La composición para el uso en el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa puede comprender 2-fenil-6-(1H-imidazol-1-il)quinazolina (CR4056) o una sal farmacéuticamente aceptable en una cantidad de 15 a 250 mg con respecto a la forma de dosis unitaria, dando como resultado una ingesta diaria de 15 a 500 mg.
La presente invención también se refiere a una preparación combinada que comprende CR4056 o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y al menos uno de los antagonistas del receptor de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico) y/o inhibidores de la acetilcolinesterasa para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH, preferentemente enfermedad de Alzheimer.
CR4056 debe administrarse en las dosificaciones indicadas anteriormente, opcionalmente combinado con medicamentos que pertenecen a clases de fármacos actualmente aprobados para tratar los síntomas cognitivos de la enfermedad de Alzheimer, es decir, antagonistas del receptor de NMDA (ácido N-metil D-aspártico) e inhibidores de
la acetilcolinesterasa.
En particular, el antagonista del receptor de NMDA es la memantina y el inhibidor de la acetilcolinesterasa se selecciona de donepezilo, rivastigmina y galantamina.
La dosificación de memantina (Namenda® o Ebixa®), donepezilo (Aricept®), rivastigmina (Exelon®) y galantamina (Razadyne® o Reminyl®) cumple con las recomendaciones del fabricante, respectivamente, información de la etiqueta de Namenda (2007), información de la etiqueta de Aricept, información de la etiqueta de Exelon (2006) e información de la etiqueta de Razadyne (2008).
La invención se describirá ahora con referencia a ejemplos usando modelos in vitro e in vivo (transgénicos y no) para enfermedades neurodegenerativas.
Parte experimental
Ejemplo 1: efectos in vitro de 2-fenil-6-(1 h-imidazol-1 -il)quinazolina sobre la expresión de genes inflamatorios Métodos
Para estos experimentos se utilizó un modelo de astrocitos, la línea celular de glioblastoma-astrocitoma humano U373 MG (Uppsala). Las células adherentes se cultivaron en medio DMEM suplementado con FBS al 10% a 37°C con CO2.
72 horas después de la siembra, las células se trataron durante 1 hora con 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) (10 pM) preparada según el documento EP2066653 y a continuación se estimularon con la citocina proinflamatoria IL-1 p (2 ng/ml) durante 6 y 24 h más.
Al final del período de incubación, se obtuvo el ARN total y se retrotranscribió utilizando el High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). Los niveles de expresión de COX-2, IL-1 p, IL-6 y TNFa se evaluaron mediante análisis por RT-PCR, realizado usando el 7500 Fast Real-Time PCR System de Applied Biosystems utilizando ensayos TaqMan específicos y, como control endógeno, el 18S Pre-Developed TaqMan® Assay (Thermo Fisher Scientific). El análisis de datos, con normalización en valores amplificados de 18S, era según las instrucciones específicas de Thermo Fisher Scientific para la cuantificación relativa de la expresión génica. Todos los datos individuales eran el resultado de al menos tres mediciones diferentes para cada muestra.
Resultados
La 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056), después de un período de incubación de 6 horas, reduce la expresión génica de COX2 e IL-1p, teniendo un efecto inhibidor del 45% sobre COX2 y del 20% sobre la expresión génica de IL-1 p. En este momento, la expresión génica de IL-6 y TNFa parecía no estar aún modulada por CR4056. Después de 24 h de estimulación, CR4056 reducía la expresión génica de todos los marcadores inflamatorios analizados teniendo un efecto inhibidor del 48% sobre COX2, 29% sobre IL-1 p, 39% sobre IL-6 y 52% sobre la expresión génica de TNFa, como se presenta en la tabla posterior.
Tabla I.
Porcentaje de inhibición de la expresión génica observado en células U373 estimuladas con 2 ng/ml de IL-1 p y expuestas a CR4056 10 pM durante el tiempo indicado.
Conclusiones
Los resultados presentados anteriormente mostraban que CR4056 tiene un efecto modulador sobre la producción de citocinas proinflamatorias en una línea celular de astrocitoma. Este efecto podría contribuir al efecto neuroprotector. Ejemplo 2: Efecto in vitro de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) sobre la translocación de PKCe a la membrana plasmática en cultivos de neuronas
Métodos
Se obtuvieron ganglios de raíz dorsal (DRG) de rata a partir de espinas dorsales recién aisladas después de eliminar
cuidadosamente los troncos nerviosos y el tejido conectivo. Los ganglios más grandes, cortados en 2-4 piezas más pequeñas, se incubaron a continuación durante 1 hora a 37°C en colagenasa al 0,125% (Worthington, Freehold, NJ) disuelta en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% más penicilina/estreptomicina al 1% y L-glutamina al 1% (Euroclone, Milán, Italia). Después de la digestión enzimática, los ganglios se disociaron mecánicamente y las neuronas se sembraron en placas a una densidad tal que las neuronas cubrieran aproximadamente el 30% de la superficie del cubreobjetos en una sola capa, en placas de Petri que contenían pocillos con un cubreobjetos con fondo de vidrio (revestidos previamente con 10 pg/ml de poli-L-lisina y 20 pg/ml de laminina, Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Las células se incubaron durante 2-3 días en DMEM como se describe anteriormente, más 1,5 pg/ml de citosina 1 -d-arabinofuranósido (ARA-C, Sigma-Aldrich) para ralentizar la proliferación de células no neuronales y 100 ng/ml de factor crecimiento nervioso (NGF, Sigma-Aldrich) para aumentar la salud celular y la expresión de receptores que están vinculados a la translocación de PKCs tras la estimulación. La activación de los receptores membranarios acoplados a la ruta de la fosfolipasa C conduce a la translocación de PKCs del citoplasma a la membrana plasmática. Para estudiar el comportamiento de PKCs se empleó una técnica bien establecida (Vellani V, Neuroscience, 2006). Esta técnica consiste en la activación de PKCs rápidamente inducida (30 segundos) por mediadores inflamatorios como la bradicinina (BK) o la procineticina 2 (PK2), seguida de la fijación con paraformaldehído al 4% y sacarosa al 4% en solución salina tamponada con fosfato (PBS, dilución al 50%), tinción para PKCs y cuantificación del número de neuronas en las que se observa translocación. Se preaplicó CR4056 en el medio de cultivo durante 10 min o se coaplicó con el estímulo. Después de la fijación, las células se permeabilizaron con T riton X-100 al 0,2 % (Sigma-Aldrich, Milán, Italia) y se expusieron durante la noche a un anticuerpo policlonal de conejo altamente específico para PKCs. Después de un enjuague intensivo, la PKCs se visualizó con un anticuerpo secundario (dilución 1:200 anticuerpo caprino contra inmunoglobulinas de conejo Alexa Fluor 488, Thermo Fisher Scientific, Monza, Italia) aplicado durante 2-4 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Se detectaron células que mostraban translocación de PKCs con un microscopio confocal (Leica SP2, Leica, Suiza) midiendo la intensidad de la fluorescencia a lo largo de una línea trazada a través del citoplasma y la membrana, evitando así el núcleo. Las neuronas en las que la intensidad de la fluorescencia en la membrana plasmática en toda la célula era 1,5 veces o superior a la intensidad citoplasmática media se consideraron positivas.
Resultados
CR4056 inhibía en función de la dosis la translocación de PKCs obtenida bien con BK o bien con PK2 con valores de CI50 respectivamente de 0,20 y 0,17 pM. Cuando se aplicaba CR4056 durante 10 minutos, las curvas de respuesta a la dosis se aproximaban a la saturación a aproximadamente 10 pM. Esta concentración se probó en diferentes intervalos de tiempo para investigar la cinética del efecto de CR4056. Prolongar (hasta 24 horas) o reducir (10 segundos) el tiempo de preincubación no cambiaba la magnitud del efecto. A continuación, se analizó el tiempo necesario para suprimir el efecto de este fármaco. En la Figura 1A y B, la translocación de PKCs se presenta en diferentes momentos después de CR4056 (10 pM): en primer lugar, justo después de la aplicación de 10 minutos y a continuación después de lavados repetidos y prolongados con grandes volúmenes de medio de cultivo (DMEM FBS al 10%, 37°C) se esperaba que se eliminara cualquier rastro de CR4056 del entorno extracelular (supresión). El efecto de CR4056 permanecía sin cambios hasta 1 hora después de la supresión, a continuación disminuía lentamente y se revertía por completo en 3-4 horas. A continuación, se probó la sensibilidad del ensayo de translocación de PKCs al idazoxano. Se aplicó previamente idazoxano durante 10 minutos a altas concentraciones (10 y 100 pM), hasta CR4056 1 pM, una concentración que induce un bloqueo submáximo de la translocación de PKCs. Ambas concentraciones de idazoxano eran completamente ineficaces.
Conclusiones
Los resultados presentados anteriormente mostraron que CR4056 bloqueaba de manera eficaz la translocación de PKCs en neuronas provocadas con estímulos proinflamatorios, que el efecto de CR4056 tenía un inicio rápido, pero se eliminaba muy lentamente de las células, y que la ruta utilizada por CR4056 para lograr este efecto era resistente al idazoxano, demostrando la participación de los receptores de I2 no clásicos. Este mecanismo peculiar de la actividad antiinflamatoria de CR4056 en las neuronas podría contribuir a la eficacia general de este producto en los procesos neurodegenerativos y en el deterioro cognitivo, además de sus efectos conducidos por I2 establecidos.
Ejemplo 3: Efecto in vivo de la 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) sobre la activación de la microglía en el modelo inflamatorio del CFA
Métodos
La activación de las células microgliales se evaluó mediante tinción de inmunofluorescencia, midiendo la expresión de la molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (lba-1) en la médula espinal L5 ipsilateral en el modelo de adyuvante completo de Freund (CFA).
Se indujo inflamación monolateral inyectando 100 pl de CFA (1 mg/ml diluido 1:1 con solución salina) en la superficie plantar de la pata trasera derecha de ratas.
Se administró CR4056 (6 mg/kg, vía oral) 72 horas después del CFA y, después de 90 minutos, los animales se anestesiaron profundamente con una sobredosis de uretano (1,5 gkg-1, i.p.) y a continuación se perfundieron
transcardíacamente con 250 ml de solución salina al 0,9% que contenía heparina al 1% (5000 UIml-1), seguida de 500 ml de formalina al 10% (es decir, paraformaldehído al 4%, Bio-Optica Spa, Milán, Italia). Se recogió el segmento L5 de la médula espinal, se fijó posteriormente durante la noche a 4°C y se incrustó en bloques de parafina para el corte. Se cortaron secciones transversales de la médula espinal con un microtomo rotatorio completamente automatizado con 5 gm de espesor, se montaron sobre portaobjetos revestidos con poli-L-lisina y a continuación se procesaron para inmunofluorescencia. La recuperación del antígeno se realizó utilizando tampón de citrato 10 mM (pH 6,0) durante 20 minutos a 90°C. Las secciones se bloquearon con suero normal de caballo al 10% en PBS que contenía Triton-X al 0,3% durante 90 minutos a temperatura ambiente y, a continuación, se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpo policlonal primario de conejo anti-molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (lba1). (1:350; Wako Chemicals, Neuss, Alemania n° 019-19741). Para la detección secundaria, se incubaron secciones durante 1 hora a temperatura ambiente con anticuerpo secundario de burro contra inmunoglobulinas de conejo Alexa-Fluor 488 (1:400; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. de A. n° A-21206). Los portaobjetos se montaron con medio de montaje FluoroShield con 4',6-diamidino-2-fenilindol o DAPI (Sigma-Aldrich, Milán, Italia n° F6057) para teñir por contraste los núcleos. Las secciones de la médula espinal se visualizaron con Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. de A.). El lado contralateral de cada sección se identificó con un pequeño corte en el asta ventral. Se identificaron las láminas I-III de las astas dorsales tomando como referencia el atlas del cerebro de rata de Paxinos y Watson (Paxinos and Watson, 1982). Para cada sección, se capturó una imagen representativa del asta dorsal tanto ipsilateral como contralateral (láminas I-III) de la médula espinal L5 con un aumento de 20x, utilizando tiempos de exposición constantes en todas las secciones, y a continuación se analizó. Se contaron manualmente las células microgliales positivas a Iba1 que mostraban un estado ameboide/activado (es decir, cuerpos celulares claramente hinchados con procesos reducidos). Los resultados se expresan como el porcentaje de la relación ipsilateral/contralateral del número de células microgliales positivas a Iba1 que muestran un estado activado. Para cada animal (n=5 por grupo) se analizaron 6 secciones no consecutivas y los resultados se promediaron.
Resultados
El modelo de rata artrítica inducida por CFA es un paradigma del dolor inflamatorio crónico. La inyección intraplantar de CFA daba como resultado una mayor sensibilidad al calor dañino, así como una mayor sensibilidad a la estimulación táctil mecánica en una lesión del tejido periférico, e inducía un aumento significativo de la relación de células microgliales morfológicamente activadas positivas a Iba1, es decir, activación de microglía, en las láminas I-III de las astas dorsales ipsilaterales frente a las contralaterales de la médula espinal L5.
CR4056, después de una sola administración (6 mg/kg, vía oral), restauraba por completo las condiciones basales de la microglía previamente activada por el tratamiento con CFA (Figura 2).
Conclusiones
Durante el curso de varias enfermedades, las células de la microglía pierden su firma y funciones moleculares homeostáticas y se inflaman crónicamente y provocan efectos perjudiciales. Esto es evidente para las enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Parkinson, pero también para el envejecimiento y el trastorno del espectro autista (Butovsky O, Nature Rev Neurosience 2018, Henstridge CM, Frontiers in Cellular Neuroscience, 2019; Wes PD, Glia 2016; Salter, MW, Nat. Med., 2017) y dolor crónico (Malcangio M, Pain, 2016).
En este modelo animal, CR4056 reducía significativamente la activación de la microglía, como se destaca por la reducción de las células positivas a Iba1, contribuyendo así a la neuroprotección.
Ejemplo 4: Efecto in vivo de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) en un modelo de deterioro de la memoria inducido por escopolamina: evitación pasiva
Métodos
La escopolamina, un antagonista no selectivo de los receptores muscarínicos, produce un bloqueo de la actividad del receptor muscarínico de acetilcolina, y la aparición concomitante de amnesia cognitiva transitoria y cambios electrofisiológicos, que se asemejan a los observados en la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la administración de escopolamina puede considerarse como un modelo psicofarmacológico de la enfermedad de Alzheimer (Lenz RA, Psycopharmacology (Berl), 2012).
La evitación pasiva es un modelo conductual de deterioro de la memoria.
El aparato constaba de una caja de dos compartimentos: compartimentos luminoso y oscuro separados por una puerta. La rata se colocó en el centro del compartimento luminoso, con la puerta entre los dos compartimentos cerrada. Después de 4 segundos, se abrió la puerta y se registró el tiempo de latencia, es decir, el tiempo que tardaba la rata en introducir las cuatro patas en el compartimento oscuro.
Una vez que la rata se introducía por completo en el compartimento oscuro, la puerta se cerró e inmediatamente se aportó una descarga suave a las patas a través del piso de rejilla. Así, durante la fase inicial el animal aprendía que el paso al compartimento oscuro tenía consecuencias negativas.
Cuarenta y ocho horas después del entrenamiento, la rata se colocó en el compartimiento luminoso y se siguió el mismo procedimiento del entrenamiento excepto que no se aplicó descarga al suelo de rejilla. El rendimiento de la memoria se correlacionaba positivamente con la latencia para escapar del compartimiento luminoso.
Para inducir el deterioro de la memoria, se administró escopolamina (1 mg/kg sc) 30 minutos antes del experimento de aprendizaje.
Se administró CR4056 (10 mg/kg dos veces al día) por vía oral inmediatamente después del experimento de aprendizaje, para evitar posibles sesgos debido a su efecto analgésico.
Resultados
La Figura 3 muestra que, en el día de la prueba, los animales simulados (no tratados con escopolamina) aumentaban significativamente el tiempo de latencia para escapar del compartimento luminoso, en comparación con el entrenamiento. En los animales tratados con escopolamina no había incremento del tiempo de latencia.
10 mg/kg de CR4056 dos veces al día contrarrestaban el deterioro de la memoria (que se muestra como un mayor tiempo de latencia de escape) inducido por la escopolamina.
El tiempo de latencia de escape en animales simulados tratados con CR4056 no era diferente de su vehículo (metilcelulosa, MC).
Conclusiones
CR4056 podía revertir el deterioro de la memoria en un modelo farmacológico de la enfermedad de Alzheimer y la demencia.
Ejemplo 5: Efecto de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) sobre el modelo conductual de deterioro de la memoria inducido por escopolamina en la rata: laberinto acuático de Morris
Métodos
Se utilizó la prueba del laberinto acuático de Morris para evaluar la función cognitiva diferenciada en dos fases: en primer lugar, la adquisición y localización espacial de una plataforma oculta y, posteriormente, el procesamiento, la consolidación, la retención y a continuación la recuperación de la información adquirida para ubicar con éxito la plataforma para escapar del agua.
La navegación ubicada requería que las ratas aprendieran a nadar desde cualquier posición inicial hasta la plataforma de escape, adquiriendo así una memoria a largo plazo de la ubicación espacial de la plataforma. Los animales se colocaron en diversos cuadrantes del estanque y se registró el tiempo transcurrido y la distancia recorrida para llegar a la plataforma oculta. Se colocaron diversos objetos en la sala de pruebas para que los animales usaran estas señales visuales como un medio para navegar en el laberinto. Después de repetidas entradas en el laberinto, los animales se volvieron cada vez más eficientes para ubicar la plataforma, escapando así del agua al aprender la ubicación de la plataforma en relación con las señales visuales distales.
Para inducir el deterioro de la memoria, se administraba escopolamina (1 mg/kg, sc) 30 minutos antes de la prueba, mientras que se administraba CR4056 (20 mg/kg, vía oral) 60 minutos antes del experimento. Se realizaron cuatro experimentos durante cuatro días y el tiempo de latencia final presentado era la media de todos los días.
Resultados
20 mg/kg de CR4056 revertían el deterioro de la memoria inducido por la escopolamina. Como se presenta en la Figura 4, las ratas tratadas con escopolamina necesitan más tiempo para ubicar la plataforma oculta en comparación con el grupo de control. La administración conjunta de CR4056 con escopolamina reducía significativamente el tiempo necesario para llegar a la plataforma con respecto a los animales tratados con escopolamina sola.
Conclusiones
El tratamiento con CR4056 revertía el deterioro de la capacidad mnemotécnica que caracterizaba al modelo animal de demencia obtenida con tratamiento con escopolamina.
Ejemplo 6: Efecto de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) en un modelo en ratón de deterioro de la memoria inducido por escopolamina: reconocimiento de objetos nuevos
Métodos
La prueba de reconocimiento de objetos nuevos se utilizó para evaluar la función cognitiva basándose en la capacidad de los ratones para reconocer diversos objetos propuestos en la prueba en pista. Durante la fase de entrenamiento se colocaron un par de objetos idénticos en la prueba en jaula. 24 horas después de la primera fase, durante la fase de prueba, uno de los dos objetos fue reemplazado por uno nuevo diferente. Se registró el tiempo de exploración de cada
objeto en la fase de entrenamiento y prueba. El enfoque típico de los ratones era una exploración similar de los objetos en la fase de entrenamiento y una preferencia por el nuevo objeto durante la fase de prueba. La administración de sustancias que pueden empeorar el rendimiento cognitivo (es decir, escopolamina) provocaba la eliminación del recuerdo del objeto antiguo y una exploración igual de 2 objetos diferentes. Se administró 1 mg/kg de escopolamina ip 20 minutos antes del entrenamiento, mientras que se administraron 6 y 20 mg/kg de CR4056 por vía oral 40 minutos antes del entrenamiento.
Resultados
6 y 20 mg/kg de CR4056 aumentaban el tiempo de exploración del nuevo objeto (preferencia por) durante la fase de prueba. Los ratones tratados con escopolamina sola no mostraron preferencia por el nuevo objeto (Figura 5).
Conclusiones
CR4056 mejoraba de forma dependiente de la dosis el rendimiento mnemotécnico de los ratones en este modelo farmacológico de demencia inducida por escopolamina, lo que confirma los resultados obtenidos previamente en ratas.
Ejemplo 7: Efecto de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) en el modelo en ratones transgénicos 5XFAD de enfermedad de Alzheimer: reconocimiento de objetos nuevos
Métodos
Se utilizaron como modelo de la enfermedad de Alzheimer ratones 5XFAD transgénicos, que sobreexpresan la proteína precursora de amiloide humana (APP695) con mutaciones sueca (K670N/M671L), de Florida (1716V) y de Londres (V717I) de la enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), así como presenilina 1 (PS1) humana con mutaciones de FAD M146L y L286V.
Se trataron ratones 5XFAD transgénicos hembra de 6 meses de edad y controles silvestres (WT) por vía oral (sonda) con 30 mg/kg de CR4056 o vehículo una vez al día durante un período de 10 días (n= 4 WT/vehículo, 8 WT/CR4056, 2 5XFAD/vehículo y 3 5XFAD/CR4056). Después de tratamientos repetidos, se probó la memoria dependiente del hipocampo utilizando la tarea de reconocimiento de objetos nuevos. La prueba de reconocimiento de objetos mide la memoria de trabajo y espacial. En la fase de entrenamiento, los animales se colocaron en la pista con objetos construidos con grandes ladrillos de plástico. En la fase de prueba, un objeto fue reemplazado por un nuevo objeto. Los animales fueron devueltos a la pista y se les permitió explorar. Se observó y registró la exploración de objetos. Los ratones deben reconocer que se ha colocado un nuevo objeto y, por lo tanto, explorar este objeto durante más tiempo.
Resultados
El día de la prueba, el grupo del vehículo de 5XFAD mostraba déficits cognitivos, mientras que los animales 5XFAD tratados con CR4056 mostraban una mejora significativa en la memoria de trabajo y espacial (Figura 6).
Conclusiones
El ratón 5XFAD es un modelo de la enfermedad de Alzheimer caracterizado por agregados intraneuronales de Ap, neurodegeneración, pérdida de neuronas, deterioro de la memoria acompañado de activación glial (Oakley H, The journal of Neuroscience, 2006; Mirzaei N, Glia 2006).
En este modelo transgénico, CR4056 mejoraba significativamente el rendimiento mnemotécnico, de acuerdo con los resultados obtenidos en el modelo farmacológico de demencia inducida por escopolamina.
Ejemplo 8: Penetración en el cerebro de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056)
Métodos
Se determinó CR 4056 en plasma de rata y en cerebro y plasma de rata usando un método de LC/MS/MS. Se trataron ratas Sprague Dawley macho, Harlan, por vía oral con una suspensión de CR 4056 (Methocel 0,5%) a la dosis de 30 mg/kg. La administración oral se realizó mediante sonda gástrica a 3 animales por grupo (5 ml/kg). El compuesto se detectó en plasma y en cerebro 1 hora después del tratamiento.
Cada cerebro de rata se pesó y se cortó por la mitad. Cada hemisferio cerebral se pesó y se homogeneizó con dos metodologías diferentes. Una era la licuación por Ultra turrax tube drive (IKA), agregando una parte alícuota de solución tamponadora (formiato de amonio 10 mM pH 3,5) tres veces el peso del hemisferio. A continuación, se añadieron 30 pl de la solución de extracto a 0,25 ml de metanol en un tubo de Eppendorf de 1,5 ml, se mezclaron con turbulencia y se centrifugaron durante 5 min a 13500 rpm a 4°C. El sobrenadante se transfirió a placas de 96 pocillos profundos de 2 ml redondas (Axygen) y se inyectó en el sistema de LC/MS/MS. La segunda era la molienda criogénica con Mikro Dismembrator (Sartorius). Cada hemisferio cerebral se pesó, se colocó en un recipiente de teflón de 20 ml con esfera de acero (7,85 g/ml de 10 mm de diámetro) y se congeló por inmersión en nitrógeno líquido durante 5 minutos. El cerebro ultracongelado se molió con Mikro Dismembrator a 2500 rpm durante 30 segundos, el ciclo de congelación/molienda se repitió dos veces. Se pesó con precisión una porción de polvo (aprox. 10 mg) en un tubo de
Eppendorf de 1,5 ml, a continuación se añadieron 0,25 ml de metanol. Después de mezclar con turbulencia y centrifugar durante 5 min a 13500 rpm a 4°C, el sobrenadante se colocó en placas de 96 pocillos profundos de 2 ml redondas (Axygen) y se inyectó en el sistema de LC/MS/MS. Ambos métodos utilizados para la homogeneización daban resultados similares que muestran que la eficacia de extracción era similar para ambos métodos.
Resultados
En la siguiente tabla se muestran los niveles plasmáticos y cerebrales individuales y la relación de cerebro-plasma después de la administración oral (30 mg/kg) de la suspensión de CR 4056 a ratas Sprague Dawley macho en condiciones de ayuno (las ratas se sacrificaron 60 minutos después de la administración oral).
Por lo tanto, este experimento demostraba que CR4056 era capaz de ingresar eficazmente al cerebro, por lo que tenía un efecto directo en el sistema nervioso central (SNC).
Claims (9)
1. Un compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables para el uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
2. El compuesto para el uso según la reivindicación 1, donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
3. El compuesto para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la sal farmacéuticamente aceptable de 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina es una sal elegida entre hidrocloruro, hidrobromuro, hidrogenosulfato y sulfato, maleato, fumarato, oxalato, metanosulfonato, succinato, ascorbato, tartrato, acetato, salicilato, citrato, aspartato, etilendiaminotetraacetato, benzoato y glutamato.
4. Una composición farmacológica que comprende el compuesto de fórmula 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y un vehículo para el uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
5. La composición para el uso según la reivindicación 4, donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
6. La composición para el uso según la reivindicación 4 o 5, donde la 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) o una sal farmacéuticamente aceptable se encuentra en una cantidad de 15 a 250 mg con respecto a la forma de dosificación unitaria, dando como resultado una ingesta diaria de 15 a 500 mg.
7. La composición para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, donde la composición comprende al menos un fármaco adicional.
8. Una preparación farmacéutica combinada que comprende 2-fenil-6-(1 H-imidazol-1 -il)quinazolina (CR4056) o una de sus sales farmacéuticamente aceptables y al menos uno de los antagonistas del receptor de NMDA (ácido N-metil-D-aspártico) y/ o inhibidores de acetilcolinesterasa para uso simultáneo, secuencial o separado en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, donde la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, demencia con cuerpos de Lewy, demencia frontotemporal, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, enfermedades priónicas y demencia asociada al VIH.
9. La preparación farmacéutica combinada para el uso según la reivindicación 8, donde la enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer.
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