JP2022540286A

JP2022540286A - 神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するための２－フェニル－６－（１ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの使用

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Publication number: JP2022540286A
Application number: JP2021566936A
Authority: JP
Inventors: ルチオクラウディオロヴァーティ; ジャンフランコカゼッリ; エマヌエーレサラ
Original assignee: Rottapharm Biotech SRL
Current assignee: Rottapharm Biotech SRL
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2022-09-15
Also published as: US20240091227A1; EP3735974A1; EP3965769B1; ES2931104T3; CN113811304A; WO2020229329A1; EP3965769A1; US20220257598A1

Abstract

本発明は、神経変性疾患の治療に使用するための式２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの化合物またはその薬学的に許容される塩に関する。神経変性疾患はアルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病、ＨＩＶ関連認知症、および神経変性に関連するあらゆる形態の認知障害からなる群から選択される疾患、好ましくはアルツハイマー病である。【図面】なし

Description

本発明は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療する２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンを提供する。

神経変性疾患（ＮＤ）は、世界中で、特に高齢者において、死亡率と罹患率の増加している原因である。ＮＤとしては、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病など、特にこれらの症候群間の類似点と相違点に焦点が当てられ、びまん性の高い病態があげられる。

神経変性疾患は、その有病率、複雑な生化学および病理学のため、基礎科学および臨床医学にとって大きな課題となっている。したがって、新しいメカニズムに関連した治療は、アンメットメディカルニーズ（いまだ満たされていない医療ニーズ）の代表例である。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性認知機能低下および記憶喪失に関連する認知症の最も一般的なタイプである。これは、米国で第６位の死因であり、２０５０年までにこの国で推定１，４００万人を苦しめるであろう。

ＡＤに対する現在の治療法は、症状に対する利益をほとんどもたらさず、米国食品医薬品局による最近の承認は２００３年に行われた。それ以来、ＡＤの治療薬に関する４００以上の臨床試験が登録されており、結果が報告されている試験での失敗率はほぼ１００％である。ＡＤ患者の脳内に蓄積するβアミロイドタンパク質や対らせん状細線維タウタンパク質を主な標的としたＡＤの治療および予防の進歩がみられないことは苛立たしく、新しい効果的な疾患修飾薬を得るための新たな経路や標的の探索、視点の変化が必要とされている。

ＡＤは、アミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ）の切断に由来する細胞外アミロイド－β（Ａβ）ペプチドの蓄積に関連する明確な組織変化、および過リン酸化タウの細胞内沈着によって代表される。Ａβとタウ凝集体は神経毒性があり、脳の神経変性過程を誘発することから、ＡβとタウがＡＤの病因の中心であることが示唆される。さらに、ＡＤのリスクに影響を及ぼす多くの遺伝子がミクログリアに発現しており(Zhang B, Cell, 2013）、加齢や疾患の病期において、ミクログリアや星状膠細胞はその活性化表現型を変化させる。これらの知見は、自然免疫活性化がＡＤ病因に積極的に寄与する可能性を提起する。アミロイドβなどのミスフォールドしたタンパク質を含む有害な刺激があると、ミクログリア細胞は脳内で急性免疫応答を起こす。反応が消失しなければ、ミクログリアの慢性的な活性化と星状膠細胞の動員により、その生理的および有益な機能が転換する。

イミダゾール（イミダゾリン）／グアニジン化合物は、非アドレナリン受容体部位、いわゆるイミダゾリン受容体との相互作用を介して中枢および末梢作用を誘発する（Escriba P, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999）。この受容体は２つの主要なタイプに分類される。Ｉ１結合部位（ＢＳ）サブタイプ：クロニジンなどの薬物によって同定され、血圧調節に関与する。Ｉ２結合部位：イダゾキサン（混合型Ｉ２ＢＳおよびα２アドレナリン受容体リガンド）によって最初に同定され、およびＩ１－ＩＢＳおよびα２アドレナリン受容体親和性を欠く選択的リガンド（例：２－ＢＦＩ、ＢＵ２２４）によって特徴づけられる。さらに、膵β細胞に存在し、インスリン分泌に関与し、エファロキサンによって認識される典型的なイミダゾリンサブタイプとしてＩ３ＢＳが同定された。

イミダゾリン受容体の内因性リガンドの１つは、ポリアミン生合成のアミン中間体であるアグマチンである。アグマチンは体内に広く分布し、おそらく脳内で神経伝達物質および／または神経伝達調節因子として作用する。アグマチンはイミダゾリン受容体以外にも、α２アドレナリン受容体、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体、セロトニン受容体などの他の標的受容体にも低親和性で結合し、物理的作用を発揮する。

Ｉ２ＢＳは広く分布し、脳内ではニューロン上に発現しているが、主にミトコンドリアの外膜に局在するグリア細胞上に発現している（Ruggiero DA, Brain Res., 1998）。

イミダゾリン薬物の神経保護作用および抗炎症作用の両方が報告されているが(Regunathan S, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999）、I2BSの薬理学は依然として不明である。Ｉ２受容体は様々なタンパク質上に存在する一群の結合部位であり、その性質および生物学的意義は依然として不明である（Escriba P, Ann. N. Y. Acad. Sci., 1999）。

過去３０年間に収集されたいくつかの実験的証拠は、Ｉ２リガンドが異なる機序で、また神経変性の異なるモデルにおいて、少なくとも部分的な神経保護作用を発揮する可能性があることを示している。

慢性イミダゾリン薬物治療は、星状膠細胞におけるＧＦＡＰ発現を増加させるために長い間確立されてきた(Olmos G, Br. J. Pharmacol., 1994）。

星状膠細胞およびマクロファージにおいて、イダゾキサンは誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）活性を阻害することができ、それによってＮＯ媒介神経毒性のレベルを低下させる(Feinstein D, Mol. Pharmacol., 1999）。

ＢＵ２２４（選択的Ｉ２リガンド）はラット脳皮質におけるアポトーシス促進因子をダウンレギュレートすることが実証されており、それ自体、脳における標準的アポトーシスシグナリングの重要な成分の阻害により神経保護作用を媒介する可能性がある(Garau C J, Psychopharmacol.,2013）。

２－ＢＦＩ（選択的Ｉ２リガンド）は、虚血性脳卒中のインビトロおよびインビボモデルの両方で神経保護作用を示す。インビトロ２‐ＢＦＩは星状膠細胞の酸素‐グルコース欠乏において脂質過酸化とミトコンドリアアポトーシスを防ぐ(Tian J, J.Neurosci. Res.,2018）が、一方、中大脳動脈閉塞、一過性脳虚血のラットモデル、によって誘発された脳損傷において、２－ＢＦＩはＢｃｌ‐２発現（脳虚血中のニューロン生存において重要な役割を有する遺伝子）を誘発し(Han Z, Brain Res.,2010）、血液脳関門完全性を保護し、マトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ‐９）発現を低下させ、タイトジャンクションタンパク質とコラーゲンＩＶをアップレギュレートする(Zhang ZJ, Stroke Cerebrovasc. Dis.,2018）。

Ｉ２受容体リガンドは低親和性でＮＭＤＡ受容体に結合し、インビトロおよびインビボでのＮＭＤＡ媒介グルタミン酸毒性を減少させるメマンチンと同様に、非競合的かつ可逆的にその活性を調節する(Jiang SX, Eur. J. Pharmacol., 2010）。

Ｉ２イミダゾリン薬物は、Ｅｒｋ１／２活性化を減少させることによってＡβ誘導性ニューロン毒性を阻害する(Montolio M, J. Med. Chem., 2012）。

２－ＢＦＩによる慢性治療は、Ｂ－ＣＫおよびＣａＡＴＰアーゼ酵素活性を回復させ、カルシウム依存性カルパイン活性化を基礎レベルで維持する実験的自己免疫性脳脊髄炎（多発性硬化症のマウスモデル）を減弱させ(Wang P, Biochem. Biophys. Res. Commun., 2011）、炎症誘発性サイトカインＩＬ－１７ＡおよびＩＦＮ－γのレベルを低下させ、抗炎症性サイトカインＩＬ－１０のレベルを上昇させる(Zhu YB, Neurochem. Res., 2015）。

ＡＤモデル（ラット海馬におけるＡβ１－４２の注射による）において、２－ＢＦＩは学習および記憶能力を改善し、酸化ストレスを低下させ、炎症性因子の放出をダウンレギュレートし、ニューロンアポトーシスを阻害する(Tian JS, J. Integr. Neurosci., 2017）。

ＢＵ２２４は、カイニン酸誘導性興奮毒性シグナル伝達に対して部分的に神経保護的である(Keller BJ, Psychopharmacol., 2016）。

ＢＵ２２４による急性治療は海馬ｐ‐ＦＡＤＤ／ＦＡＤＤ比（細胞生存の指標）を増加させ、神経毒性ｐ２５へのｐ３５の切断を減少させる(Abas S, ACS Chem. Neurosci.,2017）。

内因性イミダゾリン受容体リガンドであるアグマチンによる治療は認知機能を有意に改善し、糖尿病ラットで誘発される記憶障害を回復させる(Bhutada P, Prog. Neuro-Psychopharmacology Biol. Psychiatry 2012）。

一方、放射性リガンド結合アッセイを用いたＩ２Ｒの密度の増加は、おそらく星状膠細胞におけるそれらの位置に起因して、加齢中およびＡＤ脳において観察されている（Garcia-Sevilla, Neurosci. Lett., 1998）。

プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）は、脳内の広範なシグナル伝達網を構成するセリン／トレオニンプロテインキナーゼのリン脂質依存性ファミリーである。分子クローニング研究により、１２のＰＫＣアイソザイムが明らかになり、これらは３つのサブグループ：（１）古典的ＰＫＣ、（２）新規ＰＫＣ、（３）非定型ＰＫＣに分けられる。ＰＫＣアイソフォームは、学習および記憶を含む種々の認知機能において重要な役割を果たす。特に、新規ＰＫＣ（それらの活性化にカルシウムを必要としない）として分類されるＰＫＣεは、ホルボールエステル／ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）感受性およびカルシウム非依存性セリン／トレオニンキナーゼである。それはさまざまなシグナル伝達イベントの重要な調節因子であり、したがって、それがいくつかの細胞内位置に存在する必要性はアイソザイム特異的なシャウファー（chauffeur）タンパク質によるキナーゼのトランスロケーションによって満たされる。キナーゼの異常なトランスロケーションは、シグナル伝達のアウトプットを誤らせる可能性があり、故に、細胞生理にとって有害である。この複雑な生物学のため、神経変性疾患におけるその役割は未だ論争中である。いくつかの論文はＰＫＣε活性化の阻害が神経変性疾患に対する全体的な保護をもたらすことを示唆しているが（例えば、アルツハイマー病について、Zara S, Brain Research 2011; 虚血により誘導される神経変性について、Kumar V, J Neuro Res 2019）、過去の論文の大部分はこれらの疾患におけるＰＫＣε活性化の保護的役割を指摘している。この概念に基づき、例えば、米国特許出願公開第２００８／０００４３３２号および米国特許出願公開第２０１６／００２５７０４号において、アルツハイマー病の臨床候補としてのこのキナーゼの活性化因子（ブリオスタチン－１）の提案に至った。前者では、末梢組織におけるＰＫＣの阻害剤が、末梢組織（ここで、末梢組織は脳以外の組織を意味する）においてＰＫＣを活性化することによって誘発される可能性のある副作用をただ減弱させるために、ＰＫＣ活性化因子と関連している可能性があると述べられている。残念ながら、２０１７年５月に、概念研究の第２相証明において、ＰＫＣε ブリオスタチン－１を用いたこのアプローチは、重度障害バッテリー（ＳＩＢ）スコア対プラセボの改善を測定した主要評価項目を満足しなかったことが伝えられた。

本発明者らは、式２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの化合物（ＣＲ４０５６とも呼ばれる）が神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療に使用できることを見出した。

この分子は、１）Ｉ２結合部位に対する強い活性、２）ニューロンにおけるＰＫＣεの細胞膜へのトランスロケーションの長期にわたる阻害、３）血液脳関門を通過する際立った能力、を組み合わせている。これら３つの特徴の組み合わせは、ＣＲ４０５６に、記憶障害およびアルツハイマー病のモデルにおける驚くべき有効性をもたらす。先行技術が神経変性疾患の治療における脳浸透剤ＰＫＣ阻害剤の使用を明示的に排除していることから、これは特に革新的な結果であった。

従って、第１の態様において、本発明は神経変性疾患の治療における使用のための式２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの化合物またはその薬学的に許容される塩に関し、ここで、神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患である。

本発明において、神経変性疾患に言及する場合、それは、中枢神経系（ＣＮＳ）の別個の領域におけるニューロンの漸進的な消失によって特徴付けられる慢性、進行性障害の群から選択される疾患を意図する。

本発明による神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患であり、好ましくはアルツハイマー病である。

このような神経変性疾患の進行性の性質の基礎となるメカニズムは未だ不明であるが、ＣＮＳの完全性と適切な機能のためにはタイムリーでよく制御された炎症反応が不可欠である。

化合物２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６としても名付けられた）は、炎症性、神経原性、神経障害性、術後、線維筋痛症様、および変形性関節症疼痛の様々な動物モデルにおいて強力な鎮痛活性を特徴とするファーストインクラスのイミダゾリン－２受容体リガンドである（WO2008014822 A1、WO2009152868 A1、Ferrari F、JPAINI、2011; Lanza M、B. J. of Pharmacol、2014）。

さらに、ＣＲ４０５６には、炎症性刺激によって誘発される一次ニューロンの細胞膜へのＰＫＣεのトランスロケーションを阻害する能力であって長期間持続する（しかし依然として可逆的である）能力が付与されている。この長期間持続する活性はＣＲ４０５６に特徴的であり、他の抗炎症化合物または鎮痛化合物によって共有されているものではない。しかし、この活性はイダゾキサン（原型Ｉ２受容体アンタゴニスト）抵抗性であり、したがって、Ｉ２リガンドによって誘導される古典経路とは独立しているように思われる。いずれの理論にも拘束されずに、発明者らは、炎症性刺激によって誘発されるニューロンにおけるＰＫＣεの細胞膜へのトランスロケーションの阻害が神経変性を制御するための驚くほど優れた標的となり得ると考え、ＣＲ４０５６がそれを行うための最良の候補であることを見出した。

最後に、ＣＲ４０５６には血液脳関門を通過して中枢神経系を標的とする特異な能力が付与されている：０．５％Ｍｅｔｈｏｃｅｌに懸濁した３０ｍｇ／ｋｇの用量で単回経口投与１時間後のラットにおいて、脳内のＣＲ４０５６の存在を検討した。脳におけるＣＲ４０５６の平均レベルは３２２７２ｎｇ／ｇであった。平均脳／血漿比は１１．８であり、ＣＲ４０５６の脳内濃縮能が顕著であることが示唆された。

本発明者らは神経変性疾患、特にアルツハイマー病について、インビトロおよびインビボモデル（トランスジェニックまたは薬理学的）でＣＲ４０５６を試験し、驚くべきことに、ＣＲ４０５６がミクログリア活性化を有意に低下させ、それが神経保護に寄与し、それがアルツハイマーのトランスジェニックおよび薬理学的モデルの両方において認知能力を有意に改善し、記憶障害を逆転させることができることを見出した。

安全性の観点からは、超薬理学的濃度であっても、また、脳に対するＣＲ４０５６の特定の親和性を考慮しても、ＣＲ４０５６はラットにおいて中枢性有害作用を示さなかった。特に、神経行動学的変化（Ｉｒｗｉｎ試験により評価）及び運動協調性及び自発運動の障害（ロータロッドテスト及びオープンフィールドテストにより評価）は認められなかった。これらの知見は、ＣＲ４０５６が神経変性疾患、特にアルツハイマー病を治療するための安全な医薬になり得ることを示している。

図１は、ブラジキニン（ＢＫ１μＭ）により誘導されるＰＫＣεトランスロケーションに対するＣＲ４０５６効果の経時変化（Ａ）とウォッシュアウト（Ｂ）を報告したものである。パネルＡでは、白抜きの記号が薬物非存在下でのＢＫ刺激後のＰＫＣεトランスロケーションに陽性のニューロンの割合を表す。塗りつぶされた記号はＢＫ＋ＣＲ４０５６で３０秒間刺激する前に、ＣＲ４０５６（１０μＭ）で異なる時間プレインキュベートしたニューロンを表す。最初の塗りつぶし記号はＢＫと３０秒間共インキュベーションされたＣＲ４０５６の効果を示し、２番目の塗りつぶし記号はＣＲ４０５６の１０秒のプレインキュベーションを示し、最後は、ＣＲ４０５６の２４時間のプレインキュベーションを示す。ＣＲ４０５６の効果は、常に高い有意性を示した（ｔ検定、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。パネルＢでは、異なる時間間隔（１０分～８時間）でのＣＲ４０５６（１０μＭ）のプレインキュベーションの前（白抜きの記号）および後（塗りつぶし記号）に、ＢＫ誘導ＰＫＣεトランスロケーションを評価した。最初のデータポイントは、ＣＲ４０５６が依然として存在する１０分間のプレインキュベーションの終わりに得られた。その後のデータポイントは細胞外溶液（ｎ＝３）からの薬物の完全な除去を確実にするために、十分なすすぎの後に得られた。図２は、ＣＦＡ注射後７２時間での脊髄ミクログリア活性化の結果を報告する。同側Ｌ５ＳＣ背角におけるミクログリア活性化の定量は、表層板の分析した選択したフレーム内で、突起の減少した明らかに膨張した細胞体を示す、Ｉｂａ１陽性ミクログリアの数として測定した。データは各群５匹の平均値を示す。通常の一方向ＡＮＯＶＡ（分散分析）とそれに続くダンネット（Ｄｕｎｎｅｔ）の多重比較（＊＊ｐ＜０．０５）。図３は、スコポラミン誘発記憶喪失のモデルにおける受動的回避試験の結果を報告する。スコポラミン（Ｓｃｏ、１ｍｇ／ｋｇ）または生理学的溶液（Ｓａｌ）で処置したラットにＣＲ４０５６１０ｍｇ／ｋｇ（一日２回）またはそのビヒクル（ＭＣ）を投与した。スチューデントのｔ検定＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１（ｎ＝６）。図４は、スコポラミン誘発記憶喪失のモデルにおけるモリス水迷路試験の結果を報告する。スコポラミン（Ｓｃｏ、１ｍｇ／ｋｇ）または生理学的溶液（Ｓａｌ）で処置したラットに、ＣＲ４０５６２０ｍｇ／ｋｇ／ｄｉｅまたはそのビヒクル（ＭＣ）を与えた。データは、４日間にわたる隠れたプラットフォームに到達するのに費やされた平均時間を表した。双方向ＡＮＯＶＡ。Ｔｕｋｅｙ比較試験。＊＊Ｐ＜０．０１。図５は、スコポラミン誘発記憶喪失のモデルにおける新規物体認識試験の結果を報告する。データは、試験段階における新旧の物体の探索に費やされた時間の％として提示された。＊ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；スチューデントのｔ検定（ｎ＝６）。図６は、アルツハイマー病のトランスジェニック５ＸＦＡＤマウスモデルにおける新規物体認識試験の結果を報告している。（ＯｂｊＣ＝新しい物体）＊ｐ＜０．０００１、対応のないスチューデントのｔ検定。

本発明者らは、化合物２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６とも呼ばれる）が神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病を治療するために使用され得ることを見出した。

神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患、好ましくはアルツハイマー病である。

本発明はさらに、それを必要とする対象における神経変性疾患の発症を治療または予防するための方法を提供し、前記方法は治療的有効量の本発明の化合物または医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって神経変性疾患を発症するリスクを治療または低減する。

本発明によると、前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患、好ましくはアルツハイマー病である。

化合物２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンは、遊離塩基として、または塩の形態で使用することができる。好ましくは、薬学的に許容される塩が塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸水素塩および硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、エチレンジアミノテトラアセテート、安息香酸塩およびグルタミン酸塩から選択される塩である。薬学的に許容される塩のさらなる例はS.M. Berge et al, J.Pharm Sci. 1977, 66,2に報告されている。

化合物２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンはまた、ＥＰ２４３８０５８Ａに記載されるように、結晶多形形態または水和物形態であり得る。

第２の態様において、本発明は神経変性疾患の治療において使用するための、化合物２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンまたはその薬学的に許容される塩および担体を含む薬理学的組成物に関し、ここで、神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびHIV関連認知症からなる群より選択される疾患である。

好ましくは、本発明の組成物はアルツハイマー病を治療するために使用される。

使用するための組成物はまた、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、所望の投与経路に適した薬学的形態で投与することができる。

薬学的に許容される添加剤は、経口投与のための錠剤、カプセル、丸剤、溶液、懸濁液、乳剤の調製に一般的に使用される、賦形剤、リガンド、分散剤、着色剤、湿潤剤であり得る。注射可能な溶液もまた、皮下、脊髄および経皮投与を含む非経口投与のために意図される。

本発明による医薬組成物は、好ましくは静脈内、経口、経皮、髄腔内、鼻腔内、腹腔内または筋肉内投与のためのものである。

本発明による医薬組成物は単独で、または１つもしくは複数のさらなる薬物と組み合わせて使用することができ、またはそれを含むことができる。これらの薬物は、神経変性疾患、好ましくはアルツハイマー病の治療のために公知の薬物であり得る。

神経変性疾患の治療に使用するための組成物は２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）または薬学的に許容される塩を、単位剤形に対して１５～２５０ｍｇの量で含み、１５～５００ｍｇの１日摂取をもたらすことができる。

本発明はまた、ＣＲ４０５６またはその薬学的に許容される塩ならびにＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸）受容体アンタゴニストおよび／またはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の少なくとも１つを含む、神経変性疾患の治療における同時、連続または分離使用のための組み合わせ製剤に関し、ここで、神経変性疾患は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患、好ましくはアルツハイマー病である。

ＣＲ４０５６は、アルツハイマー病の認知症状を治療するために現在承認されている薬物のクラスに属する薬物、すなわちＮＭＤＡ（Ｎ－メチルＤ－アスパラギン酸）受容体拮抗薬およびアセチルコリンエステラーゼ阻害剤と任意に組み合わせて、上記に示された投与量で投与する。

特に、ＮＭＤＡ受容体拮抗薬はメマンチンであり、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤はドネペジル、リバスチグミンおよびガランタミンから選択される。

メマンチン（ナメンダ（（Ｎａｍｅｎｄａ、登録商標）またはエビキサ（Ｅｂｉｘａ、登録商標））、ドネペジル（アリセプト（Ａｒｉｃｅｐｔ、登録商標））、リバスチグミン（エキセロン（Ｅｘｅｌｏｎ、登録商標））、ガランタミン（ラザダイン（Ｒａｚａｄｙｎｅ、登録商標）またはレミニル（Ｒｅｍｉｎｙｌ、登録商標））の投与は、それぞれ製造業者の推奨、それぞれナメンダラベル情報（２００７）、アリセプトラベル情報、エキセロンラベル情報（２００６）、およびラザダインラベル情報（２００８）に準拠する。

次に、本発明を、神経変性疾患のためのインビトロおよびインビボモデル（トランスジェニック、および非トランスジェニック）を使用することによって、実施例を参照して記載する。

実験部
実施例１：炎症性遺伝子の発現に対する２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンのインビトロ効果
方法
星状膠細胞のモデル、ヒトグリア芽細胞腫星状膠細胞腫細胞系Ｕ３７３ＭＧ（ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ））を用いた。接着細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中、３７℃でＣＯ₂の下で増殖させた。平板培養の７２時間後、ＥＰ２０６６６５３に従って調製した２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）（１０μＭ）で細胞を１時間処理し、次いで炎症誘発性サイトカインＩＬ－１β（２ｎｇ／ｍＬ）でさらに６時間および２４時間刺激した。

インキュベーション期間の終わりに、全ＲＮＡを得て、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。ＣＯＸ－２、ＩＬ－１β、ＩＬ－６およびＴＮＦαの発現レベルを、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍを使用して、特異的ＴａｑＭａｎアッセイおよび内因性対照として１８ＳＰｒｅ－ＤｅｖｅｌｏｐｅｄＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行う、ＲＴ－ＰＣＲ分析によって評価した。１８Ｓ増幅値を正規化したデータ分析は、Thermo Fisher Scientific specific instructions for gene expression relative quantificationに従って行った。全ての個々のデータは、各サンプルについての少なくとも３つの異なる測定の結果であった。

結果
２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）は６時間のインキュベーション後、ＣＯＸ２及びＩＬ‐１β遺伝子発現を減少させ、ＣＯＸ２発現に対して４５％、ＩＬ‐１β遺伝子発現に対して２０％の阻害作用を有する。この時点では、ＩＬ‐６とＴＮＦαの遺伝子発現はＣＲ４０５６によってまだ調節されていないようであった。

２４時間の刺激後、ＣＲ４０５６は下表で報告されているように、分析された全ての炎症マーカーの遺伝子発現を減少させ、ＣＯＸ２発現に対して４８％、ＩＬ－１β発現に対して２９％、ＩＬ－６発現に対して３９％およびＴＮＦα遺伝子発現に対して５２％の阻害作用を有していた。

ＩＬ－１β２ｎｇ／ｍｌで刺激され、１０μＭＣＲ４０５６に、表に示す時間曝露されたＵ３７３細胞において観察された遺伝子発現阻害のパーセンテージ。

結論
上記の報告結果は、ＣＲ４０５６が星状細胞腫細胞系における炎症誘発性サイトカインの産生に対して調節効果を有することを示した。この効果は神経保護効果に寄与する可能性がある。

実施例２：培養ニューロンにおける細胞膜へのＰＫＣεトランスロケーションに対する２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）のインビトロ効果
方法
ラット後根神経節（ＤＲＧ）は、神経幹と結合組織を注意深く除去した後、新鮮に分離した脊椎から得た。次いで、２～４個のより小さな断片に切断したより大きな神経節を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％Ｌ－グルタミン（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、ミラノ、イタリア）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に溶解した０．１２５％コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）中、３７℃で１時間インキュベーションした。酵素消化後、神経節を機械的に解離させ、ニューロンを、ガラス底カバースリップを有するウェルを含むペトリ皿（１０μｇ／ｍＬポリ－Ｌ－リジンおよび２０μｇ／ｍＬラミニン、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリアでプレコート）において、ニューロンが単一層でカバースリップ表面の約３０％を覆うような密度で平板培養した。細胞を、上記のようにＤＭＥＭ中で２～３日間インキュベーションし、１．５μｇ／ｍｌのシトシン１－ｄ－アラビノフラノシド（ＡＲＡ－Ｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、非ニューロン細胞の増殖を減速させ、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えて、細胞健康および刺激時のＰＫＣεトランスロケーションに連結される受容体の発現を増加させた。ホスホリパーゼＣ経路と共役した膜受容体の活性化は、ＰＫＣεの細胞質から細胞膜へのトランスロケーションをもたらす。ＰＫＣε挙動を研究するために、十分に確立された技術を使用した（Vellani V, Neuroscience, 2006）。この技術は、ブラジキニン（ＢＫ）またはプロキネチシン２（ＰＫ２）のような炎症性メディエーターによって急速に（３０秒）誘導されるＰＫＣεの活性化、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、５０％希釈）中の４％パラホルムアルデヒドおよび４％スクロースでの固定、ＰＫＣεについての染色、およびトランスロケーションが観察されるニューロンの数の定量化を含む。ＣＲ４０５６を、培養培地中に１０分間予め適用するか、または刺激と同時に適用した。固定後、細胞を０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）で透過性にし、ＰＫＣεに高度に特異的なウサギポリクローナル抗体に一晩曝露した。十分なすすぎの後、暗細胞の中で、ＰＫＣεを、室温で２～４時間適用した二次抗体（１：２００希釈ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ウサギ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，モンツァ、イタリア）で、可視化した。ＰＫＣεトランスロケーションを示す暗細胞を細胞質および膜を通って引かれた線に沿って蛍光強度を測定することによって核を避けつつ、共焦点顕微鏡（ＬｅｉｃａＳＰ２，Ｌｅｉｃａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて観測した。細胞全体にわたる細胞膜での蛍光強度が平均細胞質強度の１．５倍以上であったニューロンを陽性とみなした。

結果
ＣＲ４０５６は、それぞれ０．２０および０．１７μＭのＩＣ₅₀値で、ＢＫまたはＰＫ２のいずれかで得られたＰＫＣεトランスロケーションを用量依存的に阻害した。ＣＲ４０５６を１０分間適用した場合、用量応答曲線は約１０μＭで飽和に近づいた。この濃度を異なる時間隔で試験して、ＣＲ４０５６効果の動態を調べた。プレインキュベーション時間の延長（２４時間まで）または短縮（１０秒）は、効果の程度を変化させなかった。次に、この薬物の効果を洗い流すのに必要な時間を分析した。図１ＡおよびＢにおいて、ＰＫＣεトランスロケーションはＣＲ４０５６（１０μＭ）後の異なる時点で報告される：最初に、１０分間の適用の直後、次いで、細胞外環境から任意の痕跡量のＣＲ４０５６を除去することが予想される大容量の培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、３７℃）での長期間にわたる洗浄（ウォッシュアウト）を繰り返した後。ＣＲ４０５６の効果はウォッシュアウト後１時間まで不変のままであり、その後、ゆっくりと減少し、３～４時間で完全に逆転した。

次に、イダゾキサンに対するＰＫＣεトランスロケーションアッセイの感度を試験した。イダゾキサンを、１μＭのＣＲ４０５６（ＰＫＣεトランスロケーションの最大量より少ないブロックを誘導する濃度）に向けて、高濃度（１０および１００μＭ）で１０分間プレ適用した。両濃度のイダゾキサンは全く効果がなかった。

結論
以上の報告結果から、ＣＲ４０５６は炎症誘発性刺激を負荷したニューロンにおけるＰＫＣεのトランスロケーションを効率的に遮断し、ＣＲ４０５６効果は速い発現を示したが、細胞からは非常にゆっくりと除去され、この効果を達成するためにＣＲ４０５６が用いる経路はイダゾキサン抵抗性であることが示され、非古典的Ｉ２受容体の関与が実証された。このようなニューロンにおけるＣＲ４０５６の特異な抗炎症作用のメカニズムは確立されているＩ２誘導作用以外に、神経変性過程および認知障害における本剤の全体的な有効性に寄与する可能性がある。

実施例３：ＣＦＡ炎症モデルにおけるマイクログリア活性に対する２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）のインビボ効果
方法
ミクログリア細胞の活性化を免疫蛍光染色により評価し、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）モデルにおける同側Ｌ５脊髄のイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ‐１）の発現を測定した。

ラットの右後足の足底表面に１００μＬのＣＦＡ（生理食塩水で１：１に希釈した１ｍｇ／ｍＬ）を注射することにより、単側性炎症を誘発した。

ＣＲ４０５６（６ｍｇ／ｋｇ、経口）をＣＦＡの７２時間後に投与し、９０分後に、動物をウレタンの過量投与（１．５ｇ／ｋｇ－１、腹腔内）で深く麻酔し、次いで、１％ヘパリン（５０００ＵＩ／ｍＬ－１）を含む２５０ｍＬの０．９％生理食塩水、続いて５００ｍＬの１０％ホルマリン（すなわち、４％パラホルムアルデヒド、Ｂｉｏ－ＯｐｔｉｃａＳｐａ、ミラノ、イタリア）で経心潅流した。脊髄のＬ５セグメントを採取し、４℃で一晩後固定し、切片化のためにパラフィンブロックに包埋した。脊髄の横断切片を、５μｍの厚さの完全に自動化されたロータリーミクロトームでスライスし、ポリ－Ｌ－リジンでコーティングされたスライド上にマウントし、次いで、免疫蛍光のために処理した。抗原回収は、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて９０℃で２０分間行った。切片を、０．３％トリトン－Ｘを含有するＰＢＳ中の１０％正常ウマ血清で室温で９０分間ブロックし、次いでウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ１）一次ポリクローナル抗体（１：３５０；ＷａｋｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ノイス（Ｎｅｕｓｓ）、ドイツ、＃０１９－１９７４１）と共に４℃で一晩インキュベーションした。二次検出のために、切片をＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ４８８ロバ抗ウサギ二次抗体（１：４００；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ，ＵＳＡ＃Ａ－２１２０６）と共に室温で１時間インキュベーションした。スライドを、核を対比染色するために、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールまたはＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア、＃Ｆ６０５７）を含むＦｌｕｏｒｏＳｈｉｅｌｄマウント培地でマウントした。脊髄切片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＥＶＯＳＦＬＡｕｔｏＣｅｌｌＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で可視化した。各切片の対側部位は、腹側角の小切片で同定した。ＰａｘｉｎｏｓおよびＷａｔｓｏｎ（ＰａｘｉｎｏｓａｎｄＷａｔｓｏｎ，１９８２）のラット脳アトラスを参考にして、背角のラミナＩ－ＩＩＩを同定した。各切片について、Ｌ５脊髄の同側および対側背角（層Ｉ～ＩＩＩ）の両方の代表的な画像を、すべての切片にわたる一貫した曝露時間を使用して、２０倍の倍率で捕捉し、次いで分析した。アメーバ様／活性化状態を示すＩｂａ１陽性ミクログリア細胞（すなわち、突起が減少した明らかに膨張した細胞体）を手動で計数した。結果は、活性化状態を示すＩｂａ１陽性ミクログリア細胞数の同側／対側比のパーセンテージとして表される。各動物（群あたりｎ＝５）について、６つの非連続切片を分析し、結果を平均した。

結果
ＣＦＡ誘発関節炎ラットモデルは、慢性炎症性疼痛のパラダイムである。ＣＦＡの足底内注射は末梢組織損傷において侵害熱に対する感受性の増加ならびに機械的触覚刺激に対する感受性の増加をもたらし、Ｌ５脊髄同側対対側背角のラミナＩ～ＩＩＩにおいて、Ｉｂａ１陽性、形態学的に活性化されたミクログリア細胞の比率、すなわちミクログリア活性化の有意な増加を誘導した。

ＣＲ４０５６は単回投与（６ｍｇ／ｋｇ、経口）により、ＣＦＡ処理によりあらかじめ活性化したミクログリアの基礎状態を完全に回復させた（図２）。

結論
いくつかの疾患の経過中に、ミクログリア細胞はそのホメオスタシスな分子的特徴および機能を失い、慢性的に炎症を起こし、有害な作用を誘発するようになる。これは、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病を含む神経変性疾患だけでなく、老化および自閉症スペクトラム障害（Butovsky O, Nature Rev Neuroscience 2018, Henstridge CM, Frontiers in Cellular Neuroscience, 2019; Wes PD, Glia 2016; Salter, MW, Nat. Med., 2017）および慢性疼痛(Malcangio M, Pain, 2016）についても明らかである。

この動物モデルにおいて、ＣＲ４０５６はＩｂａ１陽性細胞の減少によって強調されるように、ミクログリア活性化を有意に低下させ、故に、神経保護に寄与した。

実施例４：スコポラミン誘導記憶障害モデルに対する２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）のインビボ効果：受動的回避
方法
非選択的ムスカリン性受容体拮抗薬であるスコポラミンはムスカリン性アセチルコリン受容体の活性を遮断し、一過性認知健忘および電気生理学的変化を同時に発現させるが、これはアルツハイマー病で観察されるものと類似している。したがって、スコポラミン投与はアルツハイマー病の精神薬理学的モデルとして考慮される可能性がある（Lenz RA, Psychopharmacology(Berl),2012）。

受動的回避は、記憶障害の行動モデルである。

装置は、ドアによって分離された明るい区画と暗い区画の２区画ボックスから構成されていた。２つの区画の間のドアを閉じた状態で、ラットを明るい区画の中心に置いた。４秒後、ドアを開け、潜時、すなわちラットが４つの足全てを暗い区画に入れるのに要した時間を記録した。

ラットが暗い区画内に完全に移動したら、ドアを閉じ、直ちにグリッド床を通して軽度の足衝撃を与えた。従って、初期段階の間に、その動物は、暗い区画への移動が否定的な結果を有することを学習した。

訓練の４０身長時間後、ラットを明るい区画に置き、グリッド床に衝撃を加えなかったことを除いて、訓練と同じ手順に従った。記憶性能は、明るい区画から出るまでの潜時と正に相関した。

記憶障害を誘発するために、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ皮下）を学習試行の３０分前に投与した。

ＣＲ４０５６（１０ｍｇ／ｋｇ（一日２回））は、その鎮痛効果によるバイアスの可能性を避けるため、学習試行の直後に経口投与した。

結果
図３は、試験日において、ｓｈａｍ動物（スコポラミンで処理されていない）が訓練と比較して、明るい区画を出るまでの潜時を有意に増加させたことを示す。スコポラミンを投与した動物では、潜時の延長は認められなかった。

ＣＲ４０５６１０ｍｇ／ｋｇ（一日２回）は、スコポラミンによって誘発された記憶障害（脱出潜時の増加として示される）を打ち消した。

ＣＲ４０５６で処置した模擬動物における脱出潜時は、そのビヒクル（メチルセルロース、ＭＣ）と異ならなかった。

結論
ＣＲ４０５６は、アルツハイマー病および認知症の薬理学的モデルにおいて記憶障害を逆転させることができた。

実施例５：２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）がスコポラミン誘導記憶障害挙動モデルに及ぼす効果：モリス水迷路
方法
モリス水迷路試験を用いて、２つの段階で別個の認知機能を評価した。すなわち、第１に、隠れたプラットフォームの獲得および空間的局在化、続いて、水を逃れるためにプラットフォームの位置をうまく突き止めるための、獲得された情報の処理、統合、保持、回収。

場所ナビゲーションは、ラットが任意の開始位置から避難プラットフォームまで泳ぐことを学習し、それによって、プラットフォームの空間的位置の長期記憶を獲得することを必要とした。動物をプールの種々の象限に入れ、経過した時間および隠れたプラットフォームに到達するために通過した距離を記録した。この動物が迷路をナビゲートする手段としてこれらの視覚的手がかりを使用するように、様々な物体を試験室に置いた。迷路に繰り返し入った後、動物はプラットフォームの位置を突き止めるのにますます効率的になり、したがって遠位視覚的合図に対するプラットフォームの位置を学習することによって水を逃れる。

記憶障害を誘発するために、試験の３０分前にスコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ、皮下）を投与し、試験の６０分前にＣＲ４０５６を投与（２０ｍｇ／ｋｇ、経口）した。４回の試験を４日間にわたって実施し、報告された最終潜時は全日の平均であった。

結果
ＣＲ４０５６の２０ｍｇ／ｋｇはスコポラミンにより誘発される記憶障害を回復させた。図４に報告されるように、スコポラミンで処置されたラットは、対照群と比較して、隠れたプラットフォームの位置を特定するためにより多くの時間を必要とする。ＣＲ４０５６とスコポラミンとの同時投与は、スコポラミン単独で処理した動物に関してプラットホームに到達するのに要する時間を有意に減少させた。

結論
ＣＲ４０５６処理はスコポラミン処理で得られた認知症の動物モデルを特徴づける記憶能力の障害を回復させた。

実施例６：スコポラミン誘導記憶障害モデルにおける２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）の効果：新規物体認識試験
方法
新規物体認識試験を用いて、アリーナ試験で提案された種々の物体をマウスが認識する能力に基づいて認知機能を評価した。訓練段階の間、一対の同一物体をケージ試験に入れた。第１段階の２４時間後、試験段階の間に、２つの物体のうちの１つを新しい異なる物体に置き換えた。各物体の探索時間を訓練および試験段階で記録した。マウスの典型的なアプローチは、訓練段階における物体の同様の探索、および試験段階中の新しい物体に対する優先性であった。認知能力を悪化させ得る物質（すなわちスコポラミン）の投与により、古い物体を思い出せなくなり、２つの異なる物体を同じように探索するようになった。

スコポラミン１ｍｇ／ｋｇを訓練の２０分前に腹腔内投与し、ＣＲ４０５６の６ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇは訓練の４０分前に経口投与した。

結果
ＣＲ４０５６の６ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇは、試験段階の間、新しい物体の探索時間（優先性）を増加させた。スコポラミン単独で処置したマウスは、新たな物体に対する優先性を示さなかった（図５）。

結論
ＣＲ４０５６はスコポラミンにより誘導される認知症のこの薬理学的モデルにおけるマウス記憶性能を用量依存的に改善し、これはラットで得られた以前の結果を裏付けるものであった。

実施例７：アルツハイマー病のトランスジェニック５ＸＦＡＤマウスモデルにおける２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）の効果：新規物体認識試験
方法
スウェーデン（Ｋ６７０Ｎ／Ｍ６７１Ｌ）、フロリダ（Ｉ７１６Ｖ）およびロンドン（Ｖ７１７Ｉ）家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）変異を有するヒトアミロイド前駆体蛋白質（ＡＰＰ６９５）を過剰発現するトランスジェニック５ＸＦＡＤマウス、ならびにＭ１４６ＬおよびＬ２８６ＶＦＡＤ変異を有するヒトプレセニリン１（ＰＳ１）をアルツハイマー病モデルとして用いた。

６ヶ月齢の雌トランスジェニック５ＸＦＡＤマウスおよび野生型対照（ＷＴ）を、３０ｍｇ／ｋｇのＣＲ４０５６またはビヒクルで１０日間、１日１回経口（胃管栄養法）処置した（ｎ＝４ＷＴ／ビヒクル、８ＷＴ／ＣＲ４０５６、２５ＸＦＡＤ／ビヒクル、および３５ＸＦＡＤ／ＣＲ４０５６）。反復処置に続いて、新規物体認識タスクを用いて海馬依存性記憶を試験した。物体認識試験は、作業記憶および空間記憶を測定する。訓練段階では、動物を、大きなプラスチックれんがから構築された物体と共にアリーナに置いた。試験段階では、１つの物体を新しい物体に置き換えた。動物をアリーナに戻し、探索させた。物体の探索を観察し、記録した。マウスは新しい物体が置かれたことを認識すべきであり、したがって、この物体をより長時間探索すべきである。

結果
試験日に、５ＸＦＡＤビヒクル群は認知障害を示したが、ＣＲ４０５６で処置した５ＸＦＡＤ動物は作業記憶および空間記憶において有意な改善を示した（図６）。

結論
５ＸＦＡＤマウスは、グリア活性化を伴うニューロン内Ａβ凝集、神経変性、ニューロン消失、記憶障害を特徴とするアルツハイマー病のモデルである（Oakley H, The journal of Neuroscience, 2006; Mirzaei N, Glia 2006）。

このトランスジェニックモデルにおいて、ＣＲ４０５６はスコポラミンによって誘発された認知症の薬理学的モデルで得られた結果と一致して、記憶能力を有意に改善した。

実施例８：２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）の脳浸透
方法
ＣＲ４０５６を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を用いて、ラット血漿およびラット脳および血漿中で測定した。雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ）を、３０ｍｇ／ｋｇの投与量でＣＲ４０５６懸濁液（Ｍｅｔｈｏｃｅｌ０．５％）で経口的に処置した。経口投与は１群当たり３匹に胃強制経口で行なった（５ｍｌ／ｋｇ）。化合物は、処置の１時間後に血漿中および脳中で検出された。

各ラット脳を重み付けし、半分に切断した。各大脳半球を重み付けし、２つの異なる方法でホモジナイズした。１つは、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘチューブドライブ（ＩＫＡ）による流動化であり、緩衝溶液（１０ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ３．５）のアリコートを半球の重量の３倍添加した。次いで、３０μｌの抽出溶液を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の０．２５ｍｌのメタノールに添加し、ボルテックス混合し、４℃で１３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を、２ｍＬ丸の９６深ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ）に移し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。第２のものは、ＭｉｋｒｏＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）による極低温粉砕であった。各大脳半球を秤量し、鋼球（７，８５ｇ／ｍＬ直径１０ｍｍ）を有する２０ｍＬテフロン容器に入れ、液体窒素に５分間浸漬することによって凍結させた。深く凍結した脳を、ＭｉｋｒｏＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いて２５００ｒｐｍで３０秒間粉砕し、凍結／粉砕サイクルを２回繰り返した。粉末の一部を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中で正確に秤量し（約１０ｍｇ）、次いで０．２５ｍｌのメタノールを添加した。４℃で１３５００ｒｐｍで５分間ボルテックス混練および遠心分離した後、上清を２ｍＬ丸の９６深ウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ）に入れ、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。均質化のために使用された両方の方法は、抽出効率が両方の方法について同様であることを示す同様の結果を与えた。

結果
絶食状態の雄ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙラットにＣＲ４０５６懸濁液（３０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した後の個々の血漿および脳レベルならびに脳血漿比を以下の表に示す（ラットはＰＯ投与の６０分後に屠殺した）。

この実験は、上記のように、ＣＲ４０５６が脳に効果的に入り、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接効果を有することを示した。

Claims

神経変性疾患の治療での使用のための式２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの化合物またはその薬学的に許容される塩であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患である化合物。
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項１に記載の使用のための化合物。
２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの薬学的に許容される塩が、塩酸塩、臭化水素塩、硫酸水素塩および硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、コハク酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、エチレンジアミノテトラアセテート、安息香酸塩ならびにグルタミン酸塩から選択される塩である、請求項１または２に記載の使用のための化合物。
神経変性疾患の治療での使用のための、式２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリンの化合物またはその薬学的に許容される塩および担体を含む薬理学的組成物であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患である薬理学的組成物。
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である。請求項４に記載の使用のための組成物。
２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）または薬学的に許容される塩が単位剤形に対して１５～２５０ｍｇの量であり、１５～５００ｍｇの１日摂取を生じる、請求項４または５に記載の使用のための組成物。
前記組成物が少なくとも１つのさらなる薬物を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
２－フェニル－６－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）キナゾリン（ＣＲ４０５６）またはその薬学的に許容される塩と、ＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸）受容体アンタゴニストおよび／またはアセチルコリンエステラーゼ阻害剤のうちの少なくとも１つとを含む、神経変性疾患の治療における、同時、連続、または別々の使用のための組み合わせ医薬製剤であって、前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、プリオン病およびＨＩＶ関連認知症からなる群より選択される疾患である組み合わせ医薬製剤。
前記神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項８に記載の使用のための組み合わせ医薬製剤。