CN115429782B - 乙酸盐在制备预防或治疗神经系统发育障碍药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乙酸盐在制备预防或治疗神经系统发育障碍药物中的应用，属于医药技术领域。乙酸盐作为神经系统发育障碍疾病预防和治疗的新型药物，通过改变组蛋白乙酰化修饰水平进而改善由BAF复合体(如Arid1a)缺失引起的神经元形态异常，突触可塑性的改变，改善神经元认知缺陷，同时研究表明BAF复合体(如Arid1a)调节突触可塑性和海马依赖性认知功能。乙酸盐可作为一种潜在的预防或者治疗控制神经系统发育障碍及相关疾病的药物组成。

Description

乙酸盐在制备预防或治疗神经系统发育障碍药物中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及乙酸盐在制备预防或治疗神经系统发育障碍药物中的应用。
背景技术
神经系统发育障碍和缺陷会导致多种难治疾病，我国是世界上人口出生缺陷的高发国家之一，神经发育异常导致的智力障碍(ID)、自闭症、脑瘫、神经管缺损等疑难疾病给家庭和社会带来巨大的心理和经济负担。
智力障碍(ID)，其特点是智力功能和适应行为受到严重限制，其全球患病率估计约为1％(Maulik等，2013)。由于发育迟缓，ID患者通常在儿童早期就被发现，ID是大多数发育障碍的主要特征(Vissers等，2016)。Coffin-Siris综合征(CSS)是一种典型的ID障碍，其特征是发育迟缓、智力障碍、第五指甲和/或脚趾甲发育不全以及多器官异常。外显子组测序研究已确定CSS是由编码BRM相关因子(BAF)复合物(也称为SWI/SNF染色质重塑复合物)，包括ARID1A、ARID1B、SMARCA4、SMARCB1、SMARCA2、SMARCE1和PHF6 的单个亚基的基因中的显性从头突变引起的,(Bartsocas&Tsiantos,1970；Son&Crabtree, 2014b；Tsurusaki等,2012b)。ARID1A，也称为BAF250A，是主要的BAF复合亚基之一。尽管人类遗传学研究表明ARID1A的种系突变和微复制都可能导致CSS(Bidart等，2017； Santen等，2013；Tsurusaki等，2012b)，但ARID1A的功能丧失与CSS发病机制仍未探索。ARID1A在神经发育过程中或在特定神经元中是否可能具有独特的功能，以及ARID1A 的功能障碍与CSS的ID表型之间是否存在联系在很大程度上仍然难以捉摸。
到目前为止，还没有针对ID等神经系统发育障碍的药物和/或基因治疗，目前的治疗方法侧重于行为教育和物理治疗的管理。因此，重要的是要确定致病的遗传因素，以便开发更有效的ID等神经系统发育障碍治疗方法。
发明内容
本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗智力障碍，CSS综合征，自闭症等神经系统发育障碍至少一种症状或病理表征的方法，所述方法包括：向有此需要的受试者使用能够调节BAF复合物缺失(如ARID1A)引起的修饰水平的变化的治疗剂(在本文中，简称为乙酸盐)。本发明还提供了能够调节BAF复合物组分(如ARID1A)引起的修饰水平的变化的治疗剂在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中防治神经系统发育障碍的至少一种症状或病理表征。
在某些实施方案中，所述神经系统发育障碍的至少一种症状或病理表征选自神经元形态以及树突棘密度的改变，突触传递，神经元功能异常，智力缺损，认知功能障碍等。
在某些实施方案中，所述药物能够改善神经发育障碍相关疾病的至少一种症状或病理表征，例如改善神经元形态以及树突棘密度，恢复突触传递的功能，改善神经元电生理功能，提高认知功能(比如学习认知缺陷)。
在某些实施方案中，所述神经系统发育障碍选自智力障碍，CSS综合征，自闭症，脑瘫、神经管缺损等。
在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。
在本文中，“基因表达”指基因所含信息转化成基因产物的过程。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA、shRNA、RNAi、 miRNA或任何其它类型的RNA)或由mRNA翻译产生的蛋白。基因产物还包括经过修饰的 RNA和经过修饰的蛋白，RNA修饰过程如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑，蛋白修饰过程如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化。
在某些实施方案中，本文所述的试剂，是一个短链脂肪酸(SCFA)，是肠道微生物的发酵副产物，其中最丰富的SCFA是乙酸盐。其药物学上可接受的盐或酯、前药、立体异构体、水合物、溶剂合物、晶型、它们的代谢物形式、或它们的任意组合或混合物)，例如可以是片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、冻干粉剂)、吸入剂、喷雾剂等形式。可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、直肠、肠胃外或局部给药。
在某些实施方案中，本文所述的乙酸盐试剂是一种能够补充修饰变化的激活剂，其能够通过提高组蛋白修饰的乙酰化水平进而调控基因的表达变化。
此外，还可以使用药学领域已知的其它载体材料和给药方式。包含本文所述的乙酸盐药物组合物可以通过任何公知的制药工艺制备，例如有效的制剂和给药方法。关于有效制剂和给药方法的上述考虑因素是本领域中公知的，并且描述于标准教科书中。药物的制剂描述在，例如，Hoover，John E.，Remington′s Pharmaceutical Sciences.MackPublishing Co.，Easton， Pennsylvania，1975；Liberman等人编辑，PharmaceuticalDosage Forms，Marcel Decker，New York，N.Y.，1980；以及Kibbe等人编辑，Handbook ofPharmaceutical Excipients(第3版)， American Pharmaceutical Association，Washington，1999。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过深入的研究，发现了神经系统发育障碍的治疗性靶点，并进一步得到了一类针对上述靶点的药物，其能够显著的改善神经系统发育障碍(例如ID，自闭症)所导致的神经元形态以及树突棘密度的改变，突触传递，神经元功能异常，智力缺损，认知功能障碍等症状。
附图说明
图1A为实施例1中Arid1a基因敲除小鼠的示意图。
图1B为实施例1中Arid1afl/+(WT)、cHet和cKO小鼠皮层提取的裂解物对应的蛋白免疫印迹图，柱状散点图数据为平均值±标准差；**p<0.01，*p<0.05。
图1C为实施例1中Arid1afl/+(WT)、cHet和cKO小鼠的海马提取的裂解物对应的蛋白免疫印迹图，柱状散点图数据为平均值±标准差；***p<0.001，**p<0.01。
图1D为实施例1中Arid1afl/+、cHet小鼠齿状回(DG)、皮质、CA1、CA3区域的ARID1A免疫荧光染色图，比例尺，20微米。
图1E为实施例1中Arid1afl/+、cHet和cKO小鼠组的存活曲线图，与其他组相比，纯合子(cKO)组的小鼠存活率显著降低，****p<0.0001，大多数Arid1afl/fl；Nex-Cre(cKO)小鼠死于P28。
图1F为实施例1中Arid1afl/+、cHet和cKO小鼠P0-P28体重的定量比较图，*p<0.05，****p<0.0001。
图2A为实施例1中小鼠在30分钟内的总移动距离统计结果图，cHet小鼠在30分钟的开矿场试验中具有与Arid1afl/+同窝小鼠相当的运动性(n.s＝不显著，数据代表平均值±标准差)。
图2B为实施例1中小鼠在30分钟内进入中心区的距离统计结果图，与Arid1afl/+同窝小鼠相比，cHet小鼠在30分钟开矿场试验期间进入中心区域的次数较少(P＝0.0552，数据代表平均值±标准差)。
图2C为实施例1中小鼠在寻找平台时的延迟情况图，与对照组小鼠相比，cHet小鼠在水迷宫试验的5天训练中花费更多时间到达平台。柱状散点图数据为平均值±标准差；**p<0.01，*p<0.05。
图2D为实施例1中小鼠在寻找平台时的用时统计结果图，在测试试验中，cHet小鼠与 Arid1afl/+小鼠相比表现出空间学习障碍。柱状散点图数据为平均值±标准差；*p<0.05。
图2E为实施例1中小鼠穿越平台的次数统计结果图，在水迷宫测试试验中，cHet小鼠的平台穿越次数比Arid1afl/+小鼠少，柱状散点图数据为平均值±标准差；*p<0.05。
图2F为实施例1中小鼠搜索隐藏盒的用时统计结果图，在训练阶段，cHet小鼠首次进入隐藏盒的时间延迟，表明Arid1a缺失导致空间记忆受损。**p<0.01。
图2G为实施例1中小鼠进入逃逸洞的用时统计结果图，测试试验表明cHet小鼠也有空间记忆缺陷。柱状散点图数据为平均值±标准差；***p<0.001。
图2H为实施例1中访问逃逸洞的次数统计结果图，访问逃逸洞的频率低于Arid1afl/+小鼠，柱状散点图数据为平均值±标准差；*p<0.05。
图3A为实施例2中Arid1afl/+和cHet小鼠CA1海马切片中自发微型兴奋性突触后电流 (mEPSCs)的代表图。
图3B为实施例2中Arid1afl/+和cHet海马CA1神经元中振幅(B,左)和频率(B,右)自发微型兴奋性突触后电流(mEPSC)的量化图，*p<0.05，误差线，平均值±标准差。
图3C为实施例2中从Arid1afl/+和cHet小鼠制备的切片中，以50毫秒脉冲间隔ms记录配对脉冲比的代表性记录图。
图3D为实施例2中双脉冲易化图，不同脉冲间隔(20ms、40ms、50ms、100ms、200ms、300ms和500ms)的配对脉冲促进(PPF)研究显示，50ms间隔的配对脉冲比率存在显着差异。
图3E为实施例2中Arid1afl/+或cHet小鼠CA1区频率刺激诱导的长期增强(LTP)的时间过程图。
图3F为实施例2中诱导55–60min后测量的LTP平均幅度图(每组4只小鼠的n＝8片；从1片中收集10个fEPSP斜率(％)值；柱状散点图数据代表平均值±标准差；**p<0.01)。
图4A为实施例3中成年(2个月大)Arid1afl/+小鼠和cHet小鼠海马CA1区的高尔基染色图，比例尺，100微米。
图4B为实施例3中Arid1afl/+小鼠和cHet小鼠海马CA1区的神经元的树突长度图。柱状散点图数据代表平均值±标准差；***p<0.001。
图4C为实施例3中Arid1afl/+小鼠和cHet小鼠海马CA1区的神经元的树突结点图。柱状散点图数据代表平均值±标准差；**p<0.01，***p<0.001。
图4D为实施例3中Arid1afl/+小鼠和cHet小鼠海马CA1区的神经元的树突末端图，柱状散点图数据代表平均值±标准差；**p<0.01，***p<0.001。
图4E为实施例3中Sholl分析表明，与Arid1afl/+小鼠的神经元相比，cHet小鼠的CA1 锥体神经元基底表现出树突复杂性降低。柱状散点图数据代表平均值±标准差；*p<0.05。
图4F为实施例3中Sholl分析表明，与Arid1afl/+小鼠的神经元相比，cHet小鼠的CA1 锥体神经元顶端表现出树突复杂性降低。柱状散点图数据代表平均值±标准差；*p<0.05；**p<0.01。
图4G为实施例3中CA1锥体神经元顶端次级树突上树突棘的代表性图，比例尺，5微米。
图4H为实施例3中次级树突上测量的每10微米的树突棘密度图，柱状散点图数据代表平均值±标准差；***p<0.001。
图5A为实施例4中Arid1afl/+和cHet小鼠前脑组织中H3K27ac的免疫荧光染色图，H3K27ac的相对荧光强度随着皮质中Arid1a的丢失而降低(*p<0.05，柱状散点图数据代表平均值±标准差)，比例尺，20微米。
图5B为实施例4中Arid1afl/+和cHet小鼠前脑组织中H3K27ac的蛋白质印迹分析图，柱状散点图数据代表平均值±标准差，**p<0.01。
图5C为实施例4中乙酸盐注射时间表，cHet小鼠每天用磷酸盐缓冲液(PBS)或乙酸盐处理4周。
图5D为实施例4中PBS或乙酸盐处理的cHet小鼠的前脑组织中H3K27ac的免疫荧光染色图，在cHet小鼠的皮质中用乙酸盐处理后，H3K27ac的相对荧光强度升高(*p<0.05，柱状散点图数据代表平均值±标准差)。
图5E为实施例4中PBS或乙酸盐处理的cHet小鼠前脑组织中的H3K27ac的蛋白质印迹分析图，****p<0.0001，柱状散点图数据代表平均值±标准差。
图5F为实施例4中小鼠在训练期间测量找到平台的时间结果图。
图5G为实施例4中小鼠在测试期间测量找到平台的时间结果图。柱状散点图数据为平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01。
图5H为实施例4中小鼠在测试中测量穿越平台的次数结果图，柱状散点图数据为平均值±标准差；*p<0.05。
图5I为实施例4中在训练阶段，PBS或乙酸盐处理Arid1afl/+和cHet小鼠中找到隐藏盒的时间。
图5J为实施例4中在测试阶段，PBS或乙酸盐处理Arid1afl/+和cHet小鼠中首次找到隐藏盒的时间，****p<0.0001，柱状散点图数据为平均值±标准差。
图5K为实施例4中在测试阶段，PBS或乙酸盐处理Arid1afl/+和cHet小鼠中访问逃逸洞的次数。**p<0.01；***p<0.001，柱状散点图数据为平均值±标准差。
图6A为实施例4中Arid1afl/+和cHet小鼠被注射PBS或乙酸盐，每个实验组的海马切片中fEPSP的平均迹线。
图6B为实施例4中Arid1afl/+和cHet小鼠被注射PBS或乙酸盐，诱导55–60min后测量的LTP平均振幅(每组4只小鼠的n＝8片；从1片中收集10个fEPSP斜率(％)值；柱状散点图数据为平均值±标准差，****p<0.0001。
图6C为实施例4中Arid1afl/+和cHet小鼠被注射PBS或乙酸盐，从每个实验组制备的切片中以50毫秒的间隔显示配对脉冲比的代表性轨迹。
图6D为实施例4中以不同的脉冲间隔(20ms、40ms、50ms、100ms、200ms、300ms 和500ms)记录双脉冲促进(PPF)。
图6E为实施例4中PBS或乙酸盐处理的cHet小鼠CA1锥体神经元顶端树突次级分支代表图(n＝4只小鼠,每组20个神经元)，比例尺，5微米。
图6F为实施例4中在图6E中的次级树突上测量每10微米的树突棘密度，****p<0.0001。
图7A为实施例5中不同浓度(10um,100um，1mM)乙酸盐或水处理后，WT和ARID1A KOhESCs分化40天的神经元。
图7B为实施例5中用不同浓度(10um,100um，1mM)乙酸盐或水处理后，由hESC衍生神经元中的总神经突长度进行量化统计，柱状散点图数据为平均值±标准差，**p<0.01，***p<0.001。
图7C为实施例5中水处理后，WT和ARID1A KO hESC的神经分化第40天神经元总神经突长度的Sholl分析。
图7D为实施例5中水或100um乙酸盐处理后，WT hESC在神经分化第40天神经元的总神经突长度进行Sholl分析(n>＝34个神经元，三个生物学重复)。
图7E为实施例5中水或100um乙酸盐处理后，ARID1A KO1 hESC在神经分化第40天神经元的总神经突长度进行Sholl分析(n>＝34个神经元，三个生物学重复)。
图7F为实施例5中水或100um乙酸盐处理后，ARID1A KO2 hESC在神经分化第40天神经元的总神经突长度进行Sholl分析(n>＝34个神经元，三个生物学重复)。图7G为实施例5中在水或乙酸盐处理后，WT和ARID1A KO hESC分化55天的神经元树突(MAP2)以及突触前和突触后蛋白复合物的定位，突触素和PSD-95蛋白。
图7H为实施例5中在水或乙酸盐处理后，WT和ARID1A KO hESC分化55天的神经元突触素蛋白的定量统计。柱状散点图数据为平均值±标准差，*p<0.05，***p<0.001。
图7I为实施例5中在水或乙酸盐处理后，WT和ARID1A KO hESC分化55天的神经元PSD-95蛋白的定量统计。柱状散点图数据为平均值±标准差，***p<0.001。
具体实施方式
1.实验动物
Arid1afl/fl小鼠(由密歇根大学王忠博士赠送)在Arid1a基因的第8外显子两侧具有loxP 位点(Gao等，2008a)。Nex-Cre小鼠(C57BL/6背景)由约翰霍普金斯大学的Feng-Quan Zhou实验室友情提供(Goebbels等，2006)。Arid1afl/fl小鼠与兴奋性神经元特异性启动子驱动的转基因小鼠Nex-Cre杂交，产生Arid1afl/+；Nex-Cre(以下称为cHet)动物。Arid1afl/+； Nex-Cre小鼠与Arid1afl/fl小鼠进一步杂交，获得纯合Arid1afl/fl；Nex-Cre(以下简称cKO) 小鼠。
2.行为学分析
小鼠被安置在恒温(23℃)的房间中，有规律的12小时光照/黑暗循环。使用2至3个月大的雄性小鼠进行行为分析。在行为测试前24小时，我们将小鼠转移到测试室进行适应。
开旷场试验：为了检测小鼠的运动能力，将小鼠放置在一个中间有一个正方形(18×18厘米)的开放空间(长72厘米×宽72厘米×高36厘米)中，允许小鼠在迷宫中自由探索30分钟，测定运动距离和轨迹。
水迷宫实验：一个圆形水箱(直径120厘米)装满水，用无毒的白色油漆使水变得不透明。在水箱给定象限的中心，一个圆形平台(直径13厘米)隐藏在水面以下1厘米处。小鼠在水迷宫中连续训练4天，每次训练由4次试验组成。对于每次试验，将小鼠从箱壁上释放寻找并在平台上停留20秒，每只小鼠允许60秒时间寻找平台。测试实验在最后一次训练后 24小时进行。在测试期间，平台被移除并记录任务表现。使用摄像机记录小鼠在水池中的游泳轨迹和游泳速度，以及在每个象限中花费的时间。
巴恩斯迷宫：采用Barnes Maze测试评估小鼠的空间学习和记忆能力(Attar等人，2013)。巴恩斯迷宫由一个直径122厘米的圆形平台制成，有20个均匀间隔的洞(直径5厘米，距离边缘2厘米)，只有一个洞具有一个可移动的隐藏盒，位于迷宫顶部的逃生洞正下方，此洞命名为逃逸洞。测试从第一天开始，让小鼠适应噪音环境并引导进入逃逸洞。随后第2与第 3天小鼠被训练5次，每次试验允许小鼠2分钟寻找逃逸洞。在2分钟结束前没有找到逃逸洞的小鼠被温柔地引导到逃逸洞口。小鼠在两次试验之间被放回笼子30分钟。最后一次训练48小时后，取下逃逸洞下的隐藏盒，让小鼠在探查路径中搜索2分钟，测定运动轨迹以确定其空间记忆能力。
3.动物的药物治疗
乙酸钠购自Sigma-Aldrich(货号A13184)。小鼠通过腹膜内注射乙酸盐200mg/kg(溶解在PBS中)或对照注射磷酸盐缓冲液(PBS)(200ul/每只小鼠)。治疗后一个月进行动物行为测试。
4.免疫组织化学(IHC)
用4％多聚甲醛固定大脑，并将其连续切成40微米厚的冠状切片。切片在4％PFA中后固定15min，在封闭液(2％BSA，0.3％Triton X-100)中处理2h，在4℃的封闭液中与一抗孵育过夜。我们在研究中使用的一抗如下：兔抗Arid1a(1:1000，货号HPA005456，Sigma)，猪抗Vgult1(1:1000，货号ab5905，密理博)，兔抗H3K27ac(1:1000，货号ab4729，Abcam)、鸡抗MAP2(1:1000、货号822501、Biolegend)、兔抗PSD-95(1:1000，货号ab16659， Abcam)、小鼠抗突触素(1:1000，货号ab13552，Abcam)。切片或盖玻片在PBS中洗涤，并与二级AlexaFluor偶联抗体(Invitrogen)在室温下孵育1.5小时，在PBS中洗涤3次并用粘附抗褪色培养基固定。我们使用共焦激光扫描显微镜获取图像，使用ImageJ分析结果。
5.神经元形态分析
体内神经元和树突棘密度分析：使用高尔基染色试剂盒分析体内神经元和树突棘密度。一般来说，将8周大的小鼠大脑浸入高尔基溶液A+B(FD Rapid Golgi Stain Kit，PK401，FD NeuroTechnologies)中，在室温下转移到溶液C中3天。用Leica CM1950低温恒温器将脑组织切成冠状切片(200微米)。所有切片均安装在3％明胶涂层载玻片上。染色后，载玻片在乙醇中脱水并用Permount固定。使用LSM 710共聚焦显微镜对神经元和次级顶端树突棘进行成像。Fiji的Simple Neurite Tracer插件用于追踪树突分支并计算它们的长度。
体外神经元和树突棘密度分析：体外培养40天的神经元(DIV-40)用4％多聚甲醛固定，用PBS洗涤，然后用含有0.1％Triton X-100的2％山羊血清封闭1小时。抗体(MAP2，货号mab3418，Millipore，1:1,000)在4℃下孵育过夜，然后与二抗一起孵育。使用LSM710 共聚焦显微镜对神经元树突进行成像。DIV-55的免疫染色神经元用于神经元树突棘密度分析。使用带有63倍油透镜的LSM710共聚焦显微镜对次级树突棘进行成像。
6.电生理学检测
海马切片的制备和记录：使用8至12周龄的小鼠记录海马区兴奋性突触后电位(fEPSP)。实验在室温22–25℃下进行。之前描述了海马切片的制备(Cheng等人，2018a)。简而言之，将大脑移入冰冷的人工脑脊液(aCSF)浴中，其中包括：124mM NaCl、1.5mM MgCl2、3.3mM KCl、1.3mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、11mM葡萄糖和2.5mM CaCl2，用95％ O2/5％CO2饱和，并使用振动切片机(Campden仪器，7000smz)制备海马切片(400微米)。这些切片保持持续充氧，并在至少1小时后开始记录。使用装有2MNaCl的玻璃移液管(2-3 MΩ)从CA1的辐射层记录fEPSP。使用双极同心刺激电极(FHC Inc.,Bowdoin,ME)将刺激脉冲(0.033Hz)传送到Schaffer侧枝。在稳定基线记录至少15分钟后，在基线刺激强度下通过100Hz强直刺激(1列100Hz持续1秒)诱导LTP。对于PPF记录，调整刺激强度以唤起最大2/3的fEPSP。使用20、40、50、100、200、300和500毫秒的刺激间隔评估PPF。分别收集和分析pClamp 10.6和Clampfit 10.6(Axon Instruments，CA，美国)的数据。
用硼硅酸盐玻璃微量移液器(电阻6-10MΩ)进行全细胞电压钳或电流钳记录，其中充满含有135mM葡萄糖酸钾、7mM NaCl、2mM MgATP、10mM HEPES、0.3的内部溶液mMNa2GTP和2mM MgCl2，用KOH调节至pH 7.4。细胞外液含有：124mM NaCl、3.3mM KCl、1.5mMMgCl2、1.3mM NaH2PO4、26mM NaHCO3、11mM葡萄糖和2.5mM CaCl2(pH 7.4)。对于微型兴奋性突触后电流(mEPSC)记录，细胞的电压钳位在-60mV。记录移液管充满溶液，其中含有(以mM为单位)：115甲磺酸铯、15CsCl、2MgCl2、10EGTA、10HEPES、 4ATP(Mg)和1QX-314，渗透压调节至290mOsm，pH调节至7.2由CsOH提供。将荷包牡丹碱(10微米)和河豚毒素(TTX；1mM)添加到浴液中以分离AMPA受体介导的 mEPSC。通过红外微分干涉对比视频显微镜(Nikon，Eclipse fn1，Japan)获得整个贴片移液器显微操作。在电流钳模式下，使用Multi-clamp700B放大器(Molecular Devices，Palo Alto， CA，美国)和AxonTM Digidata 1440A数字化仪(Molecular Devices)记录细胞内膜电位。对于电压钳记录，细胞保持在-60mV。使用2kHz低通滤波器以10kHz对数据进行数字化。使用Clampex 10.6软件(Axon Instruments，CA，美国)收集数据，并使用Clampfit 10.6软件(Axon Instruments，CA，美国)进行分析。
自发微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)：在电压钳的全细胞配置下测量mEPSC。膜电位保持在-70mV。在记录之前进行电池电容和串联电阻的补偿。记录只有高电阻密封(>1GΩ) 和串联电阻<25MΩ。为了分离AMPA受体介导的mEPSC，在aCSF中加入10nM甘氨酸、 10微米荷包牡丹碱(GABAA受体拮抗剂)和D-AP-5(NMDA受体拮抗剂)。同时，0.5微米TTX包含在细胞外溶液中。
7.蛋白免疫印迹
脑组织用含PMSF的RIPA缓冲液(P0013B，Beyotime)匀浆。用BCA试剂盒(ThermoFisher) 测定每个样品的蛋白质浓度，并将等量的总蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶上。电泳后，蛋白质被转移到PVDF膜上。将膜在TBST(TBS+0.05％Tween-20)中的5％牛奶在室温下封闭1 小时，并在4℃下与一抗一起孵育过夜。使用了以下抗体：抗微管蛋白(HRP偶联)(1:5000， BE3312，EASYBIO)，小鼠抗β-肌动蛋白(1:10000，A5441，Sigma)，兔抗Arid1a(1:2000， HPA005456，Sigma)、兔抗H3K27ac(1:1000,ab4729,abcam),兔抗PSD95(1:1000,ab16659,abcam)。与HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时。蛋白质条带通过增强化学发光试剂(ECL，Pierce)进行可视化，并使用ImageJ进行量化。
8.人类胚胎干细胞(hESC)培养和神经分化
人胚胎干细胞系H9由中国科学院动物研究所胡宝洋博士友情提供。H9细胞在涂有基质胶(BD Biosciences)的六孔板上培养并维持在TesR-E8培养基(STEMCELLTechnologies, Vancouver,BC,加拿大)中。对于神经分化，H9细胞用消化酶(BDBiosciences)解离成单细胞并维持在含有10uM Rock抑制剂(Y27632，Selleck，上海，中国)的N2培养基 (DMEMF/12,1×N2,1×NEAA)中从第0天到第7天，然后在含有1ug/ml层粘连蛋白的N2培养基中维持7天。
每隔一天更换一次培养基。14天后，典型的玫瑰花环出现并被采摘。这些玫瑰花环结构在N2B27培养基(DMEM/F12、1×N2、1×B27、0.2mM视黄酸和20ng/mL FGF2)中被诱导为神经球，直到第20天。收集神经球，消化酶消化解离并重新接种于分化培养基中，包括DMEM/F12、1×N2、1×B27、10ng/mLBDNF、10ng/mL GDNF、1mM cAMP和200nM 抗坏血酸在poly-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的24孔板，可维持40-60天，每2天更换一次培养基。
9.统计分析
我们应用Shapiro-Wilk和Kolmogorov-Smirnov检验来评估数据集的正态分布。在本研究中，所有数据集均通过了正态性检验。使用带有学生t检验(t检验)的GraphPadPrism 8 软件生成数据的统计分析，协方差的单向或双向分析，如每个图的图表中指定的。所有数据均以平均值±标准差表示，统计学显着性定义为*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
实施例1前脑兴奋性神经元中的Arid1a缺失导致学习和记忆缺陷
我们通过将Arid1afl/fl小鼠与Nex-Cre转基因小鼠杂交来特异性地删除兴奋性神经元中的 Arid1a(图1A)。蛋白免疫印迹(图1B，C)和免疫荧光染色(图1D)分析证实，与同窝对照Arid1afl/+(WT)相比，Arid1a在Arid1afl/fl；Nex-Cre(cKO)的皮质和海马中缺失，在Arid1afl/+；Nex-Cre(cHet)小鼠中几乎一半缺失。大约80％的cKO小鼠在出生后5周龄时死亡(图1E)。然而，cHet小鼠存活到成年并且具有与WT同窝小鼠相似的体重(图1F)。
为了分析兴奋性神经元中的Arid1a缺失是否影响认知，我们首先进行了旷场试验以排除运动能力对小鼠行为表现的影响。两组小鼠在30分钟内的总移动距离和进入中心区的距离没有显著差异(图2A-B)，表明Arid1afl/+和cHet小鼠之间的运动能力相似。在水迷宫实验中，与Arid1afl/+动物相比，Arid1a cHet小鼠在训练阶段在寻找平台方面表现出相当大的延迟(图2C)。在随后的测试阶段，cHet小鼠显示出寻找平台的时间更长和穿越平台的次数更少(图2D-E)，说明在兴奋性神经元中敲除Arid1a影响空间学习和记忆。为了进一步验证cHet小鼠的空间学习和记忆受损，我们进行了巴斯迷宫测试，确实发现cHet小鼠花费更多时间搜索隐藏盒(图2F-G)，并且它们访问逃逸洞的次数少于Arid1afl/+小鼠在训练阶段和测试阶段(图2H)。总的来说，这些数据表明兴奋性神经元中Arid1a的单倍体不足会导致学习和记忆的缺陷。
实施例2 Arid1a cHet小鼠突触传递和可塑性受损
为了研究Arid1a在海马突触传递中的功能，我们测量了海马CA1神经元中自发微型兴奋性突触后电流(mEPSCs)的频率和幅度。与对照组相比，在Arid1a缺失的CA1神经元中，mEPSCs的幅度和频率显着降低(图3A-B)。此外，我们在20、40、50、100、200、 300和500毫秒的脉冲间隔内进行了双脉冲促进。与Arid1afl/+小鼠相比，我们发现Arid1a缺失小鼠的配对脉冲比显着降低(图3C-D)。最后，由于长时程增强(LTP)被认为是研究学习和记忆的细胞模型，我们通过检查Arid1afl/+和cHet小鼠急性海马切片中的LTP来测试 Arid1a是否调节长时程突触可塑性。与Arid1afl/+小鼠相比，cHet小鼠的LTP减弱(图3E)，诱导后55-60分钟的LTP幅度在cHet小鼠中较低(图3F)。
实施例3兴奋性神经元中Arid1a的缺失显示体内神经突复杂性和树突棘密度降低
突触传递和可塑性极其依赖于神经元形态和棘突(Cheng等人，2018b；Goebbels等人， 2006)。为了确定Arid1a缺失是否影响神经元形态，我们进行了高尔基体染色并分析了Arid1afl/+和cHet小鼠海马CA1区的神经突复杂性。与Arid1afl/+小鼠相比，cHet小鼠的末端、节点和交叉点的基底和顶端树突数量显著减少，表明Arid1a的部分缺失导致神经突复杂性缺陷(图4A-F)，图4B-D显示部分损失Arid1a显著降低了cHet神经元中的树突长度、树突结点和树突末端。此外，与Arid1afl/+神经元相比，cHet神经元在海马中的树突棘密度降低(图4G-H)。这些结果表明ARID1A在维持突触密度和神经突复杂性中起关键作用。
实施例4补充乙酸盐可改善Arid1a缺失引起的认知缺陷
据报道，染色质重塑因子Arid1a与H3K27ac相关(Mathur等人，2017年)。与Arid1afl/+相比，cHet小鼠前脑组织的H3K27ac水平显著降低(图5A-B)。文献研究表明，补充乙酸盐可以通过监测组蛋白H3和H4的特定赖氨酸残基的乙酰化状态来减轻MK-801诱导的慢性认知行为表型(Singh等，2016)，并且乙酸盐的添加可以阻断H3K9/27hESC中的乙酰化损失(Moussaieff等人，2015)。鉴于H3K27ac水平在Arid1a缺失时显着降低，因此我们推断试剂恢复H3K27ac活性可能用于重塑染色质或基因转录，并可能改善与Arid1a缺失相关的认知受损行为。
结合参考文献，我们选择了两个剂量。发现连续28天腹腔注射乙酸盐显著增加了前脑组织中H3K27的乙酰化水平(图5C-E)。重要的是，在Arid1a cHet小鼠中补充乙酸盐可以挽救它们在水迷宫(图5F-H)和巴斯迷宫测试(图5I-K)中受损的空间学习和记忆。
然后我们测试了补充乙酸盐是否可以挽救受损的突触传递和可塑性。结果表明，补充乙酸盐可恢复受损的LTP(图6A-B)，并在cHet小鼠中以50ms的脉冲间隔增加配对脉冲比 (图6C-D)。最后，我们测试了乙酸盐处理后神经元形态缺陷是否可以逆转。我们的数据显示乙酸盐确实增加了Arid1a cHet小鼠的树突棘密度(图6E-F)。总之，这些发现表明补充乙酸盐可以改善与兴奋性神经元中Arid1a缺失相关的认知缺陷。
实施例5乙酸盐可挽救由hESC衍生神经元中ARID1A缺失引起的神经元畸形
我们测试了乙酸盐是否对人类hESC源性神经元有影响。我们用乙酸盐(10M,100M,1mM) 处理人ARID1A KO和WT神经元，并量化其形态学特征。与对照组相比，我们观察到乙酸盐处理的ARID1A KO神经元的神经突长度增加(图7A,B)，分支数量显著增加(图7A,C-F)，且呈剂量依赖性。重要的是，用乙酸盐(100M)处理ARID1A KO神经元后，突触素和PSD-95 数量显著增加(图7G-I)。因此，我们的结果表明，乙酸盐可以改善人ARID1A KO神经元的形态学缺陷。
讨论
神经系统发育障碍相关疾病一直是生物医药领域的重大瓶颈问题，现有治疗手段不能有效缓解病情的现状亟需运用新思路并从新视角研发新型防治策略。染色质重塑复合物变异是重要的神经发育障碍疾病的遗传学机制，BAF复合物突变导致CSS综合征。在神经发育障碍中，BAF复合物突变还涉及到Kleefstra综合征、孤独症谱系障碍、精神分裂症等疾病。 BAF复合物功能丧失与神经系统发育障碍发病机制之间的联系仍未探索。
BAF复合物被证明是乙酰转移酶催化的组蛋白乙酰化所必需的(Naidu等人，2009；Wilson等人，2020)。在衰老的小鼠大脑中，记忆障碍与学习期间组蛋白乙酰化的改变以及未能招募与记忆巩固相关的海马基因表达程序有关(Peleg等，2010)。组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可上调组蛋白乙酰化水平，可改善阿尔茨海默病模型的认知表现(Graff等，2012)。
特别有趣的是，我们发现BAF复合物组分Arid1a缺失引起的大脑中特定的认知和神经回路损伤可以通过乙酸盐干预来克服，可能是通过靶向组蛋白去乙酰化。为其他单基因脑疾病模型中的类似治疗提供了不同的结果(Mukai等人，2019；Rotaru等人，2018；Tillotson等人，2017)。我们的研究结果表明，在Arid1a缺失小鼠中添加乙酸盐可以完全挽救行为异常和突触可塑性缺陷。此外，我们的数据显示，补充乙酸盐可以抵消hESC中ARID1A缺乏导致的神经元相关缺陷。与这一概念一致，公共数据库表明，在敲除或过表达ARID1A后，与组蛋白乙酰化相关的信号通路在生物途径中得到了强烈的富集。因此，基于人类多能细胞的人体系统更有利于筛选神经系统发育疾病的潜在干预药物。
综上所述，本发明人鉴定表明乙酸盐作为神经系统发育障碍疾病预防和治疗的新型药物，通过改变组蛋白乙酰化修饰水平进而改善由BAF复合体(如Arid1a)缺失引起的神经元形态异常，突触可塑性的改变，改善神经元认知缺陷。同时研究表明BAF复合体(如Arid1a)调节突触可塑性和海马依赖性认知功能。我们的结果支持与H3K27ac相关的BAF复合体(如Arid1a)作为前脑中的神经调节剂在调节突触可塑性、学习和记忆以及认知功能方面的重要作用。以上实验数据支持一种观点：乙酸盐的干预途径是一种有益的针对神经系统发育障碍防治的策略。乙酸盐可作为一种潜在的治疗或者预防控制神经系统发育障碍相关疾病的药物组成。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (3)

1.乙酸盐在制备预防或治疗神经系统发育障碍药物中的应用，其特征在于，所述神经系统发育障碍包括智力障碍、CSS综合征中的至少一种；所述神经系统发育障碍是由神经元中Aridla的缺失引起的；所述乙酸盐为乙酸钠。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物剂型包括片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂、吸入剂或喷雾剂中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗神经系统发育障碍主要是改善神经元形态以及树突棘密度，恢复突触传递的功能，改善神经元电生理功能，提高认知功能。
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