CN112237629A

CN112237629A - ERK/mTOR信号通路调节剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN112237629A
Application number: CN201910640993.1A
Authority: CN
Inventors: 唐小华; 徐雪琴; 张茜; 万茹
Original assignee: Wenzhou Central Hospital
Current assignee: Wenzhou Central Hospital
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2021-01-19

Abstract

本发明公开了ERK/mTOR信号通路调节剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用，ERK/mTOR信号通路调节剂包括激动剂和抑制剂，其中具体的ERK/mTOR信号通路的激动剂包括PLPPR4蛋白，其激动剂主要应用在制备促进神经元树突发育和/或轴突再生的药物或者试剂盒中，ERK/mTOR信号通路抑制剂在制备神经元树突或者轴突的抑制发育细胞模型或者动物模型中的应用。

Description

ERK/mTOR信号通路调节剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及到ERK/mTOR信号通路调节剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用。

背景技术

智力障碍(intellectual disability，ID)是常见的出生缺陷，又称智力低下、精神发育迟滞(mental retardation，MR)，是一组以18周岁前起病、明显的认知功能障碍和两个或两个以上适应行为缺陷为特征的神经发育残疾性疾病。ID病因复杂，可以分为遗传因素和非遗传因素，遗传因素是导致中重度ID的重要病因，包括基因拷贝数变异、基因突变和其它基因组变异，前两者至少占ID的30％。非遗传因素也是导致轻度智力障碍的重要病因，比如孕期营养不良、宫内感染、毒物接触、出生后患病等。

从基因的功能和分子信息网络分布观察，ID基因有一定聚集性，一般与神经细胞的生长发育，神经元的发育和迁移，突触功能以及功能基因的转录、翻译有关。人类大脑开始发育直至成熟过程中，脑组织内的神经细胞存在广泛的联系。这种联系基于神经细胞的结构和功能，通过突触的形成和消除进行动态调节。大多数神经元的树突上覆盖有小的突起，称为树突棘，它们是兴奋性突触输入信号的重要部位。树突棘具有高度动态的形态特征，当遇到刺激时，可以快速地进行结构改变，这种特性称为突触可塑性。神经细胞的突触可塑性与大脑的学习、记忆和认知等功能有关。

ERK1/2信号通路可在神经元凋亡中起作用；mTOR激活能使多巴胺能神经元的轴突末端扩大，其合成和分解代谢在轴突再生中起重要作用。mTOR与神经发育关系密切，mTOR表达的下调可引起大脑功能异常，mTOR还与自闭症有关mTOR信号通路相关蛋白有：PI3K、AKT、AMPK、TSC1、TSC2、PTEN等，其中磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphatase and tensinhomolog，PTEN)是具有脂质和蛋白磷酸酶两种活性的蛋白质。PTEN是AKT的活性抑制剂，通过抑制AKT从而抑制下游的mTOR，调控神经细胞的生长、发育、迁移和神经元轴突和树突的发育并参与早期神经系统的发育。AMP依赖的蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)，可以通过调控TSC1/2的表达影响mTOR。有研究表明mTOR通过影响ULK1和ULK2来调控神经细胞自噬，从而影响神经发育。

PLPPR4基因与神经元的可塑性相关，因此也叫做可塑性相关基因(plasticity-related genes 1，PRG1)。但是PLPPR4基因与智力障碍疾病之间的直接关系以及具体的作用机理是未可知的，现有研究表明PLPPR4基因缺失会导致智障，并且可能参与调节系列信号通路来最终影响神经元的可塑性，因而研究PLPPR4基因对应调控的信号通路对神经元功能缺失导致的神经系统疾病领域发挥重要作用，在药物筛选和疾病治疗领域有着明显的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明通过研究PLPPR4基因在神经元功能缺失导致的神经系统疾病中的作用机理，进而明确其参与的信号通路，进而发现PLPPR4基因参与调控了ERK/mTOR信号通路，本发明的目的在于提供ERK/mTOR信号通路在制备神经发育障碍相关疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明提供ERK/mTOR信号通路调节剂在制备调控神经元发育的药物或者试剂盒中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述ERK/mTOR信号通路调节剂包括激动剂和抑制剂，所述ERK/mTOR信号通路激动剂在制备促进神经元树突发育和/或轴突再生的药物或者试剂盒中的应用；

所述ERK/mTOR信号通路抑制剂在制备神经元树突或者轴突的发育不良细胞模型或者动物模型中的应用。

作为本发明的进一步改进，ERK/mTOR信号通路激动剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述ERK/mTOR信号通路抑制剂在制备神经元树突或者轴突的发育不良细胞模型或者动物模型后，筛选治疗神经发育障碍相关疾病的药物中的应用。

作为本发明的进一步改进，所述调节剂包括PLPPR4蛋白，该PLPPR4蛋白作为ERK/mTOR信号通路的激动剂，通过在神经元中过表达PLPPR4蛋白，使PLPPR4蛋白通过正调控ERK/mTOR信号通路和促进神经元发育。

作为本发明的进一步改进，所述激动剂包括编码PLPPR4蛋白的核酸分子，所述编码PLPPR4蛋白的核酸分子如序列SEQ ID NO.5所示。

作为本发明的进一步改进，所述激动剂包括一种包括如序列SEQ ID NO.5所示的编码PLPPR4蛋白的核酸分子的重组载体。

作为本发明的进一步改进，所述激动剂还可以包括foskolin蛋白激酶或PMA蛋白激酶或Curcumin或MHY1485或L-leucine；其中foskolin蛋白激酶或PMA蛋白激酶或Curcumin作为p-ERK1/2的激动剂，其中MHY1485或L-leucine作为p-mTOR的激动剂。

抑制剂包括MK-8353或AZ6197或Astex或Rapamycin或Sapanisertib(INK-128)；其中MK-8353或AZ6197或Astex抑制p-ERK1/2表达，其中Rapamycin或Sapanisertib(INK-128)抑制p-mTOR表达。

本发明另外提供一种诱导神经元轴突再生或者树突发育的方法，包括如下步骤：通过过表达PLPPR4激活未成熟的神经细胞中的ERK/mTOR信号通路；所述ERK/mTOR信号通路为：PLPPR4过表达通过增加p-ERK1/2的表达从而增加p-mTOR表达，进而促进轴突再生和树突在发育，增加神经元突触可塑性。

作为本发明的进一步改进，包括如下至少一种方法

(1)上调PLPPR4；

(2)上调p-ERK1/2表达；

(3)上调p-mTOR表达。

本发明发现PLPPR4基因参与调控了ERK/mTOR信号通路，PLPPR4的过表达激活了ERK-mTOR信号通路，在过表达PLPPR4时，p-ERK1/2和p-mTOR蛋白表达上调,进而促进神经元的树突和轴突发育，能够用于治疗树突和轴突发育不良引起的神经疾病，在敲除PLPPR4或者抑制PLPPR4表达时，p-ERK1/2和p-mTOR蛋白表达下调，导致了神经元的部分凋亡，以及神经元的树突和轴突发育不良。本发明为ID的诊断和治疗提供新的理论依据和有效的药物作用靶点，预防出生缺陷发生，意义重大。

附图说明

图1为T克隆扩增电泳图；

图2 A为PLPPR4-T质粒片段双酶切图；2B为空质粒双酶切图：其中泳道1为pcDNA3.1-myc/his未酶切载体作对照，2泳道为pcDNA3.1-myc/his空载体酶切电泳图；

图3为重组质粒克隆扩增电泳图；

图4为在HEK293细胞、N2a细胞、SH-SY5Y细胞中，pEGFP-N1质粒转染后显微镜下观察结果；

图5为HEK293细胞、N2a细胞、SH-SY5Y细胞转染pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒，用Cy3标记的荧光二抗处理后，100×油镜下观察，荧光主要分布在细胞膜上scale bar:20μm；

图6为表达PLPPR4的N2a细胞中PLPPR4的mRNA表达水平；

图7为用Myc抗体和PLPPR4单克隆抗体分别检测PLPPR4-Myc融合蛋白，β-Tubulin为内参蛋白的电泳图；

图8为在过表达PLPPR4的N2a细胞中各蛋白表达水平的变化。8A显示p-p85蛋白表达下调，p110β和p110γ蛋白表达上调，p110α和p85蛋白表达水平不变；8B显示p-AKT蛋白表达下调，AKT、p-GSK3α、p-GSK3β蛋白表达水平不变；8C显示p-ERK1/2和p-mTOR蛋白表达上调，p-SRC、SRC、ERK1/2、m-TOR蛋白表达水平不变；8D和E为三次重复试验的western blot图用Image Quant TL软件计算出条带灰度值，β-Tubulin为内参蛋白。应用GraphpadPrism5.0软件对数据之间进行单因素方差分析，结果表示为平均值±标准误(SEM)(＊P<0.05，＊＊P<0.01和＊＊＊P<0.001)；

图9为9A为western blot检测2μM的SCH772984处理过表达PLPPR4的N2a细胞后ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白水平的变化，β-Tubulin为内参蛋白；9B为三次重复实验western blot图用Image Quant TL软件计算出条带灰度值应用Graphpad Prism5.0软件对数据进行分析，结果表示为平均值±标准误(SEM)(＊P<0.05，＊＊＊P<0.001)；

图10为PLPPR4表达正常的对照组和PLPPR4缺失的ID患者中，其神经元的形态表现的电镜图。

具体实施方式

下面将结合附图以及实施例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明。

1、载体构建

1.1、以本实验室保留pEGFP-PLPPR4载体为模板进行PCR扩增得到PLPPR4cDNA片段，其序列号如SEQ ID NO.5所示，用1.2％的琼脂糖凝胶，120V 50min电泳，切胶回收。

1.2、T克隆PCR扩增电泳检测

在对扩增片段切胶回收后，连接T载体过夜，进行感受态细胞转化后涂含Amp抗生素的琼脂平板，培养过夜得到阳性单克隆菌落，选用PLPPR4基因第七号外显子5＇端引物，其序列物如SEQ ID NO.1所示：CGGGCCAAGTGGTTAAAAGC，以及BGH通用引物，其序列物如SEQ IDNO.2所示：TAGAAGGCACAGTCGAGG，对菌落进行PCR扩增电泳鉴定，鉴定的目的片段大约为798bp，选择位于500～1000之间的最亮的条带，L泳道和V泳道，如图1所示，并将菌液送检。

1.3、PLPPR4-T质粒酶切鉴定取测序结果正确的PLPPR4-T克隆菌液，接入含Amp抗生素的液体培养基中摇菌16h，用普通质粒试剂盒提取PLPPR4-T质粒，与pcDNA3.1-myc/his载体经XbaⅠ和KpnⅠ内切酶进行双酶切，酶切后电泳结果如图2所示，将PLPPR4载体以及pcDNA3.1-myc/his载体酶切后的片段切胶回收，快速酶25℃连接5min，进行感受态细胞的转化。

1.4、pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒PCR扩增电泳检测

感受态细胞转化后，对生长出来的单克隆菌落选用PLPPR4第二号外显子3＇端引物，其序列物如SEQ ID NO.3所示：ATAGCAGCTAAATCCAGAGTGC，及载体通用5＇端引物，其序列物如SEQ ID NO.4所示：CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC进行菌液PCR鉴定，目的片段大小大约为396bp，电泳结果如图3所示，将7号泳道的菌液进行测序鉴定。

1.5、pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒测序鉴定

菌液测序由杭州擎科生物公司完成，进行序列比对后确定pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒构建成功。

2、荧光显微镜观察蛋白荧光信号

2.1、荧光显微镜观察蛋白在细胞内定位

2.1.1用本实验室保存的pEGFP-PLPPR4质粒和pEGFP-N1质粒分别转染HEK293细胞、N2a细胞、SH-SY5Y细胞，24h后细胞固定，封片，荧光显微镜观察。如图4所示，pEGFP-N1质粒转染的HEK293细胞，N2a细胞、SH-SY5Y细胞，荧光占满整个细胞，而pEGFP-PLPPR4质粒转染的上述三种细胞，荧光往细胞膜上迁徙，可以得出的是PLPPR4蛋白主要表达在细胞膜。

2.1.2用上述所构建的pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒分别转染HEK293细胞、N2a细胞、SH-SY5Y细胞，24h后细胞固定，封闭，敷一抗(后回收置于4℃)，敷荧光二抗，封片，荧光显微镜观察，如图5所示，PLPPR4蛋白主要表达在膜上。

3、用实时荧光定量PCR和western blot分别检测过表达PLPPR4的N2a细胞中PLPPR4的mRNA表达水平和相关信号通路的蛋白质水平。

3.1实时荧光定量PCR检测目的基因表达结果显示，在mRNA水平上，N2a细胞本底表达PLPPR4量很低，在转染pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒72h后，N2a细胞表达PLPPR4显著增加(P<0.001，差异具有统计学意义)，如图6所示。

3.2在N2a细胞中，western blot检测出其本底表达PLPPR4的量很低，在转染pcDNA3.1-PLPPR4-myc/his质粒72h后，PLPPR4表达量显著升高，见图7所示。与空载体转染的N2a细胞相比，过表达PLPPR4的N2a细胞中，p-p85和p-AKT的蛋白表达下调(差异具有统计学意义)，p110β、p110γ、p-ERK1/2、p-mTOR蛋白表达上调(差异具有统计学意义)，如图8，在过表达PLPPR4的N2a细胞中各蛋白表达水平的变化。图8A显示p-p85蛋白表达下调，p110β和p110γ蛋白表达上调，p110α和p85蛋白表达水平不变；图8B显示p-AKT蛋白表达下调，AKT、p-GSK3α、p-GSK3β蛋白表达水平不变；图8C显示p-ERK1/2和p-mTOR蛋白表达上调，p-SRC、SRC、ERK1/2、m-TOR蛋白表达水平不变；图8D和E为三次重复试验的western blot图用ImageQuant TL软件计算出条带灰度值，β-Tubulin为内参蛋白。应用Graphpad Prism5.0软件对数据之间进行单因素方差分析，结果表示为平均值±标准误(SEM)(＊P<0.05，＊＊P<0.01和＊＊＊P<0.001)。

4、用ERK1/2磷酸化抑制剂SCH772984处理后，western blot检测过表达PLPPR4的N2a细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、mTOR、p-mTOR蛋白水平的变化。

4.1、用浓度为2μM的ERK1/2磷酸化抑制剂SCH772984处理实验组后，裂解细胞，提蛋白，western blot检测结果为：与未用SCH772984处理的对照组相比，当p-ERK1/2蛋白表达量下降时，p-mTOR蛋白表达量也下降，且差异具有统计学意义，如图9所示，所以PLPPR4的过表达通过增加p-ERK1/2的表达从而增加p-mTOR表达。p-mTOR的表达增加调控神经元轴突和树突的发育，能使多巴胺能神经元的轴突末端扩大，其合成和分解代谢促进了轴突和树突再生。在PLPPR4表达缺失的ID患者中，其在神经元的形态表现上主要为树突棘数量变少，其细胞电镜图如图10所示。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

<110> 温州中心医院

<120> ERK/mTOR信号通路调节剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

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Claims

1.ERK/mTOR信号通路调节剂在制备调控神经元发育的药物或者试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述ERK/mTOR信号通路调节剂包括激动剂和抑制剂，所述ERK/mTOR信号通路激动剂在制备促进神经元树突发育和/或轴突再生的药物或者试剂盒中的应用；

所述ERK/mTOR信号通路抑制剂在制备神经元树突或者轴突的抑制发育细胞模型或者动物模型中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，ERK/mTOR信号通路激动剂在制备改善或治疗神经发育障碍相关疾病药物中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ERK/mTOR信号通路抑制剂在制备神经元树突或者轴突的抑制发育细胞模型或者动物模型后，筛选治疗神经发育障碍相关疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述调节剂包括PLPPR4蛋白，该PLPPR4蛋白作为ERK/mTOR信号通路的激动剂，通过在神经元中过表达PLPPR4蛋白，使PLPPR4蛋白通过正调控ERK/mTOR信号通路和促进神经元发育。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述激动剂包括编码PLPPR4蛋白的核酸分子或包括编码PLPPR4蛋白的核酸分子的重组载体，所述编码PLPPR4蛋白的核酸分子如序列SEQ ID NO.5所示。

7.一种诱导神经元轴突再生或者树突发育的方法，其特征在于,包括如下步骤：通过过表达PLPPR4激活未成熟的神经细胞中的ERK/mTOR信号通路；所述ERK/mTOR信号通路为：PLPPR4过表达通过增加p-ERK1/2的表达从而增加p-mTOR表达，进而促进轴突再生和树突发育，增加神经元突触可塑性。

8.根据权利要求7所述的一种诱导神经元轴突再生或者树突发育的方法，其特征在于：包括如下至少一种方法

(1)上调PLPPR4；

(2)上调p-ERK1/2表达；

(3)上调p-mTOR表达。