ES2696598T3 - Compuestos de balanol para su uso en el tratamiento de dolor - Google Patents

Abstract

Uso de un agente que tiene la fórmula I**Fórmula** en la que n es 1, 2 o 3; Z es N o CH; en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:**Fórmula** en la que Y representa uno de los siguientes grupos funcionales:**Fórmula** en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo**Fórmula** Cuando Y es:**Fórmula** A es:**Fórmula** y Cuando Y es:**Fórmula** A es:**Fórmula** en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino; en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno; y en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:**Fórmula** siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol; en la preparación de un medicamente para el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico en el que el medicamento es para la administración a la neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de balanol para su uso en el tratamiento de dolor

Memoria descriptiva

La presente solicitud reivindica prioridad de Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de Serie 60/713.435 que se presentó el 1 de septiembre de 2005 y de Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N.° de Serie 60/664.071, que se presentó el 21 de marzo de 2005.

Información de la subvención

El tema de esta solicitud se desarrolló, al menos en parte, a cargo de los National Institutes of Health Grants NS12250 y NS35979, por lo que el Gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos en este documento.

1. Introducción

La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva ruta molecular implicada en la hiperexcitabilidad de larga duración de las neuronas sensoriales, que, en animales superiores, se asocia a dolor persistente.

2. Antecedentes de la invención

El dolor se percibe como resultado de la comunicación entre las dos divisiones principales, la central y la periférica, del sistema nervioso. Mientras que las dos divisiones trabajan juntas para producir nuestra experiencia subjetiva, los sistemas nerviosos central y periférico son diferentes desde el punto de vista anatómico y funcional.

Un estímulo doloroso que incide en un receptor especializado del dolor se propaga a lo largo de una rama periférica de una neurona sensorial periférica cuyo cuerpo celular se encuentra dentro de un ganglio de la raíz dorsal (parte del sistema nervioso periférico) y después a lo largo de una rama central de la neurona que entra en la médula espinal (sistema nervioso central). Posteriormente, la señal se transmite a una neurona de segundo orden en la médula espinal, que a su vez transmite la señal al lado opuesto (“contralateral”) de la médula espinal y después a las estructuras de percepción de dolor en el cerebro.

Los receptores del dolor periférico se encuentran en las terminaciones nerviosas libres que pueden responder a estímulos mecánicos, térmicos o químicos. El dolor puede ser agudo o crónico. El dolor agudo se transmite típicamente desde el receptor a lo largo de los axones de las neuronas sensoriales A5, que están cubiertas de una capa delgada con el compuesto aislante, la mielina, que facilita la conducción del impulso. El dolor crónico normalmente viaja a través de las fibras C, que, debido a que no están mielinizadas, transmiten los impulsos lentamente, lo que lleva a la característica típica del dolor crónico y difuso. Los mediadores químicos de la inflamación, tales como la bradiquinina y las prostaglandinas estimulan los receptores del dolor y son agentes importantes en los síndromes de dolor crónico, como el dolor persistente asociado a artritis o a inflamación de los nervios.

La percepción del dolor se puede alterar en varias etapas de la ruta del dolor. Por ejemplo, el estímulo doloroso puede eliminarse administrando un anestésico local al receptor periférico. Clásicamente se sabe que los fármacos, tales como los opioides, intervienen en la etapa del sistema nervioso central de la ruta del dolor y los fármacos antiinflamatorios no esteroideos intervienen en la etapa periférica (aunque ahora se comprende que existe una cierta reactividad cruzada de ambas). Del mismo modo, lo que se percibe como dolor crónico (no debido a una lesión primaria de la médula espinal) se asocia típicamente a la sensibilización de los receptores del dolor periférico, así como a los cambios en la excitabilidad de las neuronas de segundo orden, y por lo tanto, tiene componentes del sistema nervioso tanto periférico como central. Los componentes periféricos y centrales implicados en el dolor crónico se denominan, respectivamente, hiperalgesia “primaria” y “secundaria” (Urban y Gebhart, 1999, citando a Woolf, 1983 y La Motte et al., 1991).

En cuanto a los componentes del sistema nervioso central del dolor crónico, la neurona de la médula espinal que recibe el estímulo del axón del ganglio de la raíz dorsal, presenta cambios en la expresión de genes en el contexto de dolor crónico y se cree que contribuye al fenómeno de la “sensibilización central” o “hiperalgesia espinal”. Se cree que los receptores espinales de N-metil-D-aspartato (“NMDA”) desempeñan un papel importante en este proceso (Urban y Gebhart, 1999, citando a Urban y Gebhart, 1998; Palacek et al., 2003; Lee et al., 1993). La lesión de la médula espinal sin la activación del sistema nervioso periférico también puede producir hiperalgesia espinal que da como resultado un síndrome de dolor central (Zhang et al., 2005). El dolor neuropático central se ha asociado con la fosforilación del factor de transcripción, proteína de unión a elementos de respuesta a AMP cíclico (“CREB”) (Cron et al., 2005).

Con respecto al componente del sistema nervioso periférico del dolor crónico asociado a la lesión nerviosa (“dolor neuropático”), el dolor neuropático persistente es un problema clínico importante que ha resistido principalmente a un tratamiento eficaz. En seres humanos (Gracely et al. 1992) y en sistemas de modelos de mamíferos (Millan, 1999), el dolor persistente después de una lesión nerviosa se asocia a una hiperexcitabilidad de larga duración (LTH, long-term hyperexcitability) de las neuronas sensoriales (SN, sensory neurons) que tienen axones en el nervio lesionado. La LTH se manifiesta como una mayor sensibilidad a los estímulos eléctricos en el cuerpo de la célula SN y en el axón en el sitio de la lesión (Wall y Devor, 1983; Study y Kral, 1996; Zhang et al., 1997; Chen y Devor, 1998; Kim et al., 1998; Abdulla y Smith, 2001). Estos cambios dan como resultado la descarga de potenciales de acción de las SN en reposo o durante una estimulación inocua, lo que lleva a la excitación continua de las neuronas de orden superior en el sistema nervioso central y a la hiperalgesia espinal o secundaria y al dolor persistente. Debido a que la aparición de la LTH implica alteraciones en la expresión génica (Waxman et al., 1994; Wang et al., 2002; Park et al., 2003), una pregunta importante es ¿cómo se producen en el núcleo estos cambios inducidos por una lesión que se produce lejos del cuerpo celular? Responder a esta pregunta ha sido extremadamente difícil utilizando el sistema nervioso complejo de mamíferos.

Un alternativa experimentalmente favorable es el conjunto homogéneo de las SN que residen en los ganglios pleurales bilaterales del molusco Aplysia californica (Walters et al., 2004). La estimulación mecánica nociva de la pared corporal (Walters et a., 1983a) o aplastamiento de axones de SN in vivo o in vitro, genera una LTH con propiedades electrofisiológicas similares a las observadas después de axotomía de las SN de mamíferos (Walters et al., 1991; Walters, 1994; Ambron et al., 1996; Bedi et al., 1998; Ungless et al., 2002; Sung y Ambron, 2004). La LTH aparece después de un retraso, lo que sugiere que su inducción después del aplastamiento del nervio es atribuible a una señal de lesión molecular positiva (Walters 20 et al., 1991; Ambron y Walters, 1996; Lin et al., 2003). Dos estudios confirman esta idea. Primero, el bloqueo del transporte axonal después de una lesión nerviosa en los sistemas nerviosos extirpados impidió la aparición de LTH (Gunstream et al., 1995). En segundo lugar, la LTH se indujo en SN no lesionadas mediante inyección de axoplasma de axones lesionados (Ambron et al., 1995). La LTH también se suscitó en las SN después de la inyección intrasomática de un miembro de ERK (quinasa regulada por señal extracelular) de la familia MAPK (proteína quinasa activada por mitógeno) (Sung et al., 2001). Otros experimentos han sugerido que el cGMP y la PKG (proteína quinasa dependiente de cGMP; proteína quinasa G) probablemente estén implicados (Lewin y Walters, 1999). Sin embargo, a pesar de estas observaciones, se desconoce la identidad de la señal del axón, cómo se activan la PKG y ERK, o cómo pueden interactuar estas quinasas. Además, también se informó que la LTH es inducida por el cAMP que actúa sobre la PKA (proteína quinasa A) en un paradigma de aprendizaje (Dale et al., 1988; Scholz y Byme, 1988).

La Patente de Estados Unidos N.° 6.476.007 de Tao y Johns (“la patente 007”) se relaciona con una ruta de señalización propuesta en el sistema nervioso central en la que la estimulación de un receptor de N-metil-D-aspartato (“NMDA”) conduce a la activación de la óxido nítrico sintasa (“NOS”) y a la producción de óxido nítrico (“NO”), que después estimula a la guanilato ciclasa (“GC”) y la producción de guanosín monofosfato cíclico (cGMP), que a su vez activa la proteína quinasa la dependiente de cGMP (“PKG”). Se observó que la administración del inhibidor de la PKG Rp-8-[4-clorofenil)tio-cGMPS trietilamina en el sistema nervioso central por administración intratecal, después de la inducción de una respuesta inflamatoria, produjo una antinocicepción significativa en ratas 10 y 60 minutos más tarde. Además, se observó una regulación positiva de la expresión de PKG en la médula espinal lumbar 96 horas después de la estimulación nociva que se bloqueó por la administración de un inhibidor NOS neuronal, un inhibidor GC soluble y un antagonista del receptor de NMDa .

Sin embargo, aunque Tao y Johns pretenden abordar el mecanismo de la hiperalgesia inflamatoria del sistema nervioso central, antes de la presente invención seguía existiendo la necesidad de determinar el mecanismo del dolor, y en particular, dolor crónico e hiperexcitabilidad de larga duración, en las neuronas sensoriales del sistema nervioso periférico.

La necesidad de abordar el mecanismo del dolor en el sistema nervioso periférico es importante por varias razones, la primera de ellas es la accesibilidad a los fármacos. El sistema nervioso central está secuestrado del resto del cuerpo por la barrera hematoencefálica, que se crea mediante uniones estrechas entre las células endoteliales del sistema nervioso central e impide que muchos fármacos terapéuticos alcancen el sistema nervioso central. Debido a la permeabilidad extremadamente limitada de la barrera hematoencefálica, el tratamiento de la hiperalgesia espinal según Tao y Johns sería problemático. La capacidad, según la presente invención, para tratar el aspecto de la hiperalgesia primaria del dolor mediante la administración de agentes al sistema nervioso periférico, que no tiene los mismos problemas de permeabilidad, confiere una ventaja sustancial.

Una segunda razón por la que el tratamiento de los mecanismos del dolor periférico es importante, es que el sistema nervioso periférico es el portal de la percepción del dolor. La ventaja que ofrece la presente invención es la de intervenir en el dolor subjetivo cuando aparece por primera vez, tal como en el contexto de un estímulo normalmente no doloroso que produce la percepción de dolor como resultado de una hiperexcitabilidad de larga duración (LTH). El dolor subjetivo puede desencadenarse en personas que padecen dolor crónico mediante estímulos - tal como un toque ligero de una sábana o una brisa pasajera - que normalmente no serían dolorosos. La presente invención se dirige a esta primera etapa de la ruta del dolor.

3. Resumen de la invención

La presente invención se refiere al descubrimiento de una nueva ruta molecular implicada en la hiperexcitabilidad de larga duración de las neuronas sensoriales en el sistema nervioso periférico, que, en animales superiores, se asocia a dolor persistente. Se basa en el descubrimiento de que, después de la lesión de un axón de una neurona sensorial, un aumento en la actividad de la óxido nítrico sintasa (“NOS”) produce un aumento en la producción de óxido nítrico (“NO”), que a su vez activa a la guanilil ciclasa (“GC”), lo que aumenta los niveles de guanosín monofosfato cíclico (“cGMP”). El aumento del cGMP produce la activación de la proteína quinasa G (“PKG”), que después se transporta de forma retrógrada a lo largo del axón al cuerpo de la célula neuronal, donde fosforila a la proteína quinasa erk activada por mitógeno (“MAPKerk”). Después, la MAPKerk activada se transloca en el núcleo celular, donde modula la expresión de los genes relacionados con el dolor.

En diversas realizaciones, la presente solicitud desvela métodos y composiciones para inhibir y/o tratar la hiperexcitabilidad de larga duración y/o el dolor persistente en un sujeto que padece hiperalgesia primaria (sistema nervioso periférico), que comprende administrar al sujeto, un agente que inhiba una etapa en la ruta anterior. En realizaciones particulares, el agente se administra de forma que se suministra a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal. En realizaciones específicas, el agente comprende un péptido que facilita el transporte retrógrado desde la periferia a un cuerpo celular sensorial neuronal. La presente solicitud desvela ensayos que pueden utilizarse para identificar moléculas que pueden modular (inhibir o promover) etapas en esta ruta y, por lo tanto, modular la híperexcitabilidad de larga duración y/o la percepción del dolor.

La presente solicitud desvela un gen PKG clonado de Aplysia califomica, su proteína codificada y sus homólogos, y anticuerpos dirigidos hacia la proteína purificada.

4. Breve descripción de las figuras

Figura 1A-D, A, Parte superior, diagrama esquemático de apPKG que muestra la posición de los dominios de unión del cGMP en tándem conservados, los sitios de unión de ATP y catalítico, y la posición de una secuencia autoinhibidora. Parte inferior, alineación de secuencia Clustal W de la secuencia de aminoácidos de apPKG prevista con las PKG de DG1 (número de registro de GenBank AAB03405; SEQ ID NO: 52) y DG2T3a (AAA28459; SEQ ID NO: 53) de Drosophila, la humana (BAA08297; SEQ ID NO: 54) y II (CAA64318; SEQ ID NO:55), Ip de ratón (AAD16044; SEQ ID NO: 56) y II (AAA02572; SEQ ID NO: 57) y rata II (CAA85284; SEQ ID NO: 58). Los aminoácidos conservados se indican en negrita; los aminoácidos similares se indican en gris claro. B, análisis filogenético de la familia PKG. C, Expresión de apPKG en neuronas. Una transferencia de Northern de tejido múltiple se hibridó con un fragmento de ADNc de apPKG N terminal marcado con 32P. La flecha indica el ARNm de apPKG. Los tamaños de los patrones de ARN se indican a la izquierda de la figura. Se utilizó una sonda marcada con 32P para el ARN ribosómico 5S (flecha) para asegurar la uniformidad de carga. D, localización del ARNm de apPKG en ganglios pleurales y pedales por hibridación in situ con un ARN antisentido marcado con digoxigenina (izquierda) o ARN en sentido (derecha). El ARNm de apPKG se expresa en el grupo sensorial pleural (flecha). Barra de escala 200 pm.

Figura 2A-C. La apPKG es una PKG de tipo I. A, La actividad quinasa de la proteína apPKG recombinante inactiva purificada (100 ng) se midió mediante la transferencia de 32P de [32P]ATP al sustrato BPDEtido en presencia (+) o en ausencia (-) de 8-Br-cGMP 100 nM. La actividad causada por la autofosforilación se sustrajo utilizando una reacción de control peptídica (véase Materiales y Métodos). Tenga en cuenta que la actividad de la quinasa se inhibió en presencia de 10 pM de inhibidor de PKG, Rp-8-pcPT-cGMPS (RP-G). B, Actividad quinasa de apPKG recombinante activa (25 ng) y PKG de bovino de tipo Ia (bPKGIa) (50 ng) en presencia de cuatros sustratos peptídicos PKG de tipo I: péptidos A, RKISASGP (SEQ ID NO: 21); B, RKISASEFDRPLR (SEQ ID NO: 22; BPDEtido); y D, RKRSRAE (SEQ ID NO: 23; H2Btido). El péptido C, QKRPRRKDTP (SEQ ID NO: 24), es un sustrato de PKG de tipo II. C, apPKG fosforila a VASP recombinante en la serina-239. La VASP-GST recombinante purificada (0,5 pg) se incubó con la apPKG activa (100 ng) o con la PKG bovina recombinante (50 ng), o solo en el tampón de quinasa, a temperatura ambiente durante 20 min. Después de SDS-PAGE, se exploró una transferencia de Western con un anticuerpo antifosfo-VASP (Ser 239) (p-VASP S239).

Figura 3A-B. A, expresión de la proteína apPKG en el sistema nervioso. Parte superior, se exploró una transferencia de Western (10 pg de proteína por carril) con el anticuerpo Ab (antibody) de apPKG generado contra un péptido N terminal de la proteína apPKG. Carril, 1 ganglios pedales; carril 2, ganglios pleurales; carril 3, axoplasma extruido de nervios periféricos; carril 4, músculo de la pared corporal; carril 5, masa bucal; carril 6, genitales; carril 7, apPKG recombinante. Las dos señales específicas de apPKG se indican con flechas. Parte inferior, la transferencia se eliminó y volvió a explorarse con un anticuerpo la a-actina para indicar la carga de proteínas. Las posiciones de los marcadores de masa molecular en kilodalton se indican a la izquierda. B, la apPKG se expresa en las neuronas sensoriales de Aplysia. Microscopía confocal de una sección óptica de 2 pm tomada de una serie Z a través del grupo sensorial pleural expuesto al Ab apPKG 24 h después del aplastamiento del nervio in vivo. Se muestran imágenes representativas de grupos sensoriales contralaterales (CC, contralateral clusters) no lesionados y lesionados de secciones en el centro de la neurona para mostrar el núcleo. Un grupo sensorial lesionado teñido en presencia de un segundo Ab solo muestra la tinción de fondo. Barra de escala, 20 pm. Aunque la tinción es principalmente en el citoplasma, también se tiñe el núcleo de algunas neuronas. Ha de tenerse en cuenta que el patrón de tinción de apPKG es esencialmente idéntico entre los grupos sensoriales contralaterales no lesionados y lesionados.

Figura 4A-C. La actividad de apPKG aparece en el ganglio pleural después de un retraso tras el aplastamiento del nervio. A, Los nervios periféricos p5-p9 se aplastaron en un lado. En los momentos indicados, los ganglios pleurales (cuadrados blancos/grises) y pedales (cuadrados punteados/negros) se recogieron de los lados lesionados (negro/gris) y de control contralateral (CC) (blanco/punteado) y se analizaron para determinar la actividad de apPKG utilizando BPDEtido como sustrato en presencia del inhibidor 6-22 amida, específico de PKA. La actividad de apPKG en cada punto se corrigió para autofosforilación y se normalizó a la actividad de apPKG total obtenida mediante la adición de 8-Br-cGMP 1 M a una muestra por duplicado. La actividad relativa de apPKG fue la relación entre la actividad de apPKG de cada muestra y la actividad basal de apPKG en una muestra de un animal sin tratamiento previo. Seis animales fueron examinados independientemente en cada punto de tiempo. El ANOVA de dos vías con medidas repetidas mostró efectos significativos de axotomía, el tiempo y su interacción en los ganglios pleurales (p <0,001 en cada caso). B, la apPKG se activa y transporta de manera retrógrada después de lesión. Los nervios p5-p9 se aplastaron y se ligaron. Veinticuatro horas después, el axoplasma se extruyó desde el sitio del aplastamiento (Ap), desde el sitio del aplastamiento/ligadura (Ap/Lig) y desde el sitio de la ligadura (sitio de Lig) en los nervios de control, como se indica en el esquema entre paréntesis. El axoplasma que contenía las mismas cantidades de proteína de cada segmento, se analizó para determinar la actividad de apPKG como se indicó en A. La línea indica el nivel de actividad basal de apPKG, determinado mediante el ensayo del axoplasma recogido de nervios no lesionados. Las barras de error representan ± SEM (del inglés standard error of the mean, error típico de la media). Un asterisco indica una diferencia significativa en comparación con los grupos restantes (p<0,05; ensayos ANOVA y Newman-Keuls). Un enriquecimiento de apPKG activa en el sitio del Ap/Lig es característico de señales positivas moleculares de lesión. C, la proteína apPKG se transporta de manera retrógrada después de la lesión. Los nervios periféricos se aplastaron y se ligaron como se indicó en B. Veinticuatro horas después, los nervios lesionados y de control se fijaron, se expusieron al anticuerpo (Ab) de apPKG y se procesaron para análisis inmunohistoquímico. Las secciones ópticas (2 |jm) a través de cada nervio se examinaron mediante microscopía confocal. Todas las imágenes tenían el mismo aumento y se tomaron después de exposiciones idénticas al haz confocal. Cada imagen se alineó en la misma dirección; los cuerpos celulares (somata) centrales están a la izquierda del segmento mostrado. 1, Segmento de un nervio de un animal no lesionado. 2, Segmento que contiene el sitio de Lig (flecha) en un nervio contralateral a la lesión. 3, Segmento del nervio que contiene el sitio de Ap (flecha), que se ha expandido durante las 24 h. 4, Segmento del nervio que contiene el sitio de Ap/Lig (flecha). 5, Segmento del nervio expuesto al segundo anticuerpo solamente. Barra de escala, 20 jm para todas las imágenes.

Figura 5A-B. Las SN desarrollan una LTH in vitro. Las propiedades eléctricas de las SN después del tiempo in vitro se compararon con las de las SN de control en el grupo sensorial in vivo (d 0). A, Parte superior, un solo potencial de acción representativo generado en respuesta a un pulso despolarizante de 20 ms que muestra el aumento en la amplitud del pico después de 7 d in vitro. Parte inferior, descarga de potencial de acción en respuesta a un pulso de ensayo intracelular normalizado de 1 s. Tenga en cuenta el disparo repetitivo en las neuronas después de 7 d in vitro. B, Datos que comparan la duración del pico, la amplitud del pico, el umbral del pico y el disparo repetitivo de las SN de control (barras grises) con los de 2-7 d in vitro (barras blancas). Cada barra contiene el número de células examinadas. Las barras de error representan ± SEM. Un asterisco indica diferencia significativa con respecto al valor in vivo (p<0,01; ensayos ANOVA y Newman-Keuls).

Figura 6A-D. La inhibición de NOS, sGC o apPKG impide la inducción de LTH en las SN in vitro. Las SN se retiraron del grupo y se cultivaron in vitro en presencia de Rp-8-pCPT-cGMPS (RpcGMPS), Rp-8-pCPT-cAMPS (RpcAMPS) u ODQ (todos a 10 jM ). Como control (C), otras SN retiradas al mismo tiempo no se expusieron a ningún inhibidor. A, B, el tercer día in vitro, 12 SN expuestas a RpcGMPS, Rp-cAMPS u ODQ, y 12 SN de control se atravesaron con un microelectrodo para evaluar el disparo repetitivo en respuesta a la estimulación en tres corrientes de ensayo (A) y para determinar el umbral del pico (B). El tercer día se examinaron las células, y no más tarde, para evitar una exposición más prolongada a los fármacos. El ANOVA de dos vías con medidas repetitivas mostró que tanto Rp-cGMPS como ODQ redujeron significativamente el disparo repetitivo generado por las corrientes de ensayo de 2 y 3 nA en relación con los controles. Las barras de error indican SEM y los asteriscos indican significación (p<0,0001 en cada caso). De manera similar, Rp-cGMPS y ODQ impidieron significativamente la disminución inducida por lesión en el umbral en comparación con 4 células C (ensayos ANOVA y PLSD (diferencia mínima significativa) de Fisher; p<0,05). Hubo una variabilidad considerable en el umbral en presencia de Rp-cAMPS y la diferencia media con respecto a los controles no fue significativa. C, Detección de ARNm de nNOS en SN individuales mediante RT-PCR. Los fragmentos de longitudes apropiadas se amplificaron con series de cebadores para apnNOS, sensorina A y la isoforma de actina específica de neurona de cinco series distintas de muestras de SN in vivo (0) o después de 16 h in vitro. El tamaño de los fragmentos sintetizados detectados por tinción con bromuro de etidio en geles de agarosa al 2 % fue idéntico al de los previstos a partir de secuencias conocidas en la base de datos. Adicionalmente, los productos de la PCR se verificaron mediante análisis de secuencia de ADN. Finalmente, no hubo amplificación en ausencia de transcriptasa inversa, lo que indica que las preparaciones de ARN no estaban contaminadas con ADN genómico (panel inferior). Las posiciones de los marcadores moleculares se indican a la izquierda. D, Efectos de los inhibidores de NOS sobre LTH. L-Tiocitrulina (50 jM ) y L-NAME (1 mM) se utilizaron como se describe anteriormente. n, Número de SN. Los datos se normalizaron a la excitabilidad promedio de las células de control en la misma preparación. El asterisco indica significación (p <0,001), comparando LTH con y sin inhibidor mediante ensayo ANOVA y de Dunnett. Las barras de error indican SEM.

Figura 7A-F. A, Activación de apMAPK en los ganglios pleurales después del aplastamiento del nervio. Parte superior izquierda, veinticinco microgramos de un lisado de ganglios pleurales recogidos en los momentos indicados después del aplastamiento de los nervios p5-p9 se resolvieron mediante SDS-PAGE y se exploró una transferencia de Western con el Ab pTpYmapk para detectar las ERK-MAPK activas. El anticuerpo reconoció una quinasa de 43 kDa cuya actividad se incrementó en el lado lesionado (I) en relación con el control contralateral (CC) 16 h y más tarde después de la lesión. Parte inferior izquierda, la quinasa activada por lesión fue apMAPK. La transferencia se eliminó y se exploró con el anticuerpo D8, que reconoce a la apMAPK tanto activa como inactiva. D8 reconoció la misma proteína de 43 kDa que fue reconocida por el anticuerpo pTpY. A la derecha, la MAPK pTpY relativa se determinó por densitometría (Sung et al., 2003). Todos los valores se normalizaron a niveles de apMAPK total. Se presenta la relación entre la intensidad de MAPK pTpY normalizada en cada momento y el control sin tratamiento previo normalizado. El valor del control sin tratamiento previo se estableció arbitrariamente en 1,0. El análisis de Western en esta figura se realizó con el mismo material utilizado para evaluar la actividad apPKG en la Figura 4 A. Los valores de apMAPK representan un promedio de seis animales. La línea indica el nivel basal de la actividad de apMAPK de animales sin tratamiento previo. Cada uno de los siguientes experimentos (B-E) se repitió al menos dos veces, y se muestran resultados representativos. B, la apPKG fosforila a la apMAPK endógena en neuronas, pero no en el axoplasma, in vitro. Parte izquierda, se retiraron las neuronas de los ganglios pleurales de un animal no lesionado, se preparó un lisado y se incubaron 25 |jg con 100 ng de proteína apPKG activa o con 1 jM de 8-Br-cGMP en presencia o en ausencia de 10 jM de U0126. Parte derecha, se incubaron veinticinco microgramos de axoplasma con apPKG activa como se ha indicado anteriormente. Se detectó apMAPK activa mediante inmunotransferencia con el anticuerpo de pTPYmapk. C, la apPKG fosforila la serina-383 en Elk1. Cien nanogramos de apPKG y 0,5 jg de proteína Elk1 recombinante purificada se incubaron con 5 jg del lisado neuronal pleural o con 0,2 jg de ERK2 recombinante purificada. La Elk1 fosforilada (p-Elk1) se detectó explorando una transferencia Western con un anticuerpo que reconoce la Ser 383 fosforilada. D, Fosforilación directa de ERK2 en T183 por apPKG. Se incubaron doscientos nanogramos de ERK2 recombinante con 100 ng de apPKG en presencia o en ausencia de 1 jg de BPDEtido. La mezcla de reacción se dividió en tercios, se preparó una transferencia de Western de cada uno de ellos y se detectó ERK2 con AbpTpYmapk(parte superior), AbPYmapk (parte central) y AbpTmapk (parte inferior), respectivamente. E, Activación relativa de ERK2 por apPKG y MEK1. Se utilizaron cien nanogramos de apPKG, la subunidad catalítica de MEKK1 y MEK1 como se indica y la producción de fosfo-Elk1 se midió con AbpElk1 como se muestra en C. F, La lesión del nervio aumenta el nivel de apMAPK pY en el cuerpo celular de neuronas lesionadas (I) en relación con las neuronas del control contralateral (Cc ). Se exploró una transferencia Western preparada utilizando 25 jg de un lisado neuronal pleural, recogido en los momentos indicados después del aplastamiento de los nervios p5-p9, con el anticuerpo monoespecífico pY, AbpYmapk seguido de D8 para detectar la apMAK total como en A. La transferencia muestra los resultados de dos animales para cada punto. N, Lisado del animal sin aplastamiento de nervios.

Figura 8A-B. A, la apPKG no entra en el núcleo de las SN. Se microinyectaron las mismas cantidades de BSA, apPKG o ERK1 marcados con Alexa Fluor 546, en el citoplasma de las SN después de 2 d in vitro. Las neuritas se cortaron después con una aguja fina para provocar una respuesta a la lesión y 30 min más tarde, las células se examinaron por microscopía confocal. La imagen es una sección óptica de 2 jm a través del centro de la célula que muestra el núcleo. Barra de escala, 20 jm . B, Rp-8-pCPT-cGMPs inhibe la translocación nuclear de apMAPK inducida por axotomía. Las SN no tratadas como controles y las expuestas a 10 jM de Rp-8-pCPT-cGMPs (Rp-cGMPs) o RpcAMPs durante 2 d in vitro se inmunotiñeron con el anticuerpo D8 para localizar la apMAPK. Parte superior, ejemplos representativos de secciones ópticas de 2 jm de las SN de control y las expuestas a Rp-8-pCPT-cGMPs o Rp-cAMPs. Barra de escala, 20 jm . Parte inferior, Histograma del valor del medio de la inmunorreactividad de MAPK nuclear. La intensidad de la tinción la determinó una persona que desconocía el tratamiento que recibían las células. n, Número de células para cada tratamiento. El asterisco indica una diferencia significativa con respecto al control (p<0,05 mediante ensayos ANOVA y Newman-Keuls).

Figura 9. La actividad relativa de PKG en varias posiciones del nervio ciático en relación con el punto de lesión se muestra esquemáticamente sobre la gráfica.

Figura 10A-C. A. Balanol-7R; B. 10” desoxibalanol; C. 14” descarboxibalanol.

Figura 11A-B. Dermatomas superficiales. A. vista frontal, B. vista posterior.

5. Descripción detallada de la invención

Para mayor claridad de la descripción, y no como limitación, esta sección se divide en las siguientes subsecciones.

(i) la ruta NO/cGMP/PKG

(ii) ensayos para identificar moduladores de la ruta NO/cGMP/PKG; y

(iii) modulación de la ruta NO/cGMP/PKG;

(iv) modulación de las rutas del dolor utilizando mecanismos de transporte neuronal retrógrado; y

(v) apPKG.

5.1. La ruta NO/cGMP/PKG

La presente invención proporciona un modelo para la inducción de LTH y/o de dolor persistente en el que la lesión nerviosa activa a la óxido nítrico sintasa neuronal (“nNOS”) en el axón, lo que conduce a la producción de NO, lo que produce la activación de la guanilil ciclasa (“GC”) soluble, a la formación de guanosín monofosfato cíclico (“cGMP”) y a la activación de la proteína quinasa G (“PKG”). La PKG activada se transporta de forma retrógrada al cuerpo celular de las neuronas sensoriales (SN), donde activa a la MAPK-erk en el citoplasma, que después entra en el núcleo y activa la transcripción de genes responsables de la aparición de LTH y/o del dolor persistente.

La hiperexcitabilidad de larga duración (“LTH”) (por sus siglas en inglés Long-term hiperexcitability), como se define en el presente documento, es el aumento de la sensibilidad de un axón o cuerpo celular de una neurona sensorial frente a un estímulo. Durante las pruebas electrofisiológicas, la LTH se manifiesta como una disminución en el umbral pico, un aumento en el disparo repetitivo, picos más amplios y/o un aumento en la amplitud del pico. En los animales que perciben dolor, la LTH se asocia a dolor persistente (véase Sung y Ambron, 22 de marzo de 2004).

Las pruebas electrofisiológicas pueden realizarse utilizando métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo específico no limitativo de pruebas electrofisiológicas utilizando neuronas sensoriales de Aplysia californica (en adelante “Aplysia californica" o simplemente “Aplysia") puede realizarse de la siguiente manera (véase Liao et al., 1999). Pueden efectuarse registros intracelulares de cuerpos celulares de SN con microelectrodos de vidrio rellenos de acetato de potasio 3 M (resistencia de electrodo 8-20 M). Los registros pueden efectuarse a 19-21 °C mientras que la preparación se baña en agua de mar artificial (“ASW”, artificial sea water) tamponada, medio L15 o una mezcla 1:1 de ASW y L15, a un pH de 7,6. El umbral del pico del pericarion puede medirse con una serie estándar de pulsos de despolarización de 20 ms. El disparo repetitivo (acomodación del pico) puede cuantificarse contando el número de picos generado por un pulso de despolarización intracelular de 1 s utilizando 2,5 veces la corriente de umbral determinada con el pulso de 20 ms. El disparo repetitivo puede examinarse, por ejemplo, contando el número de picos generado por una serie de pulsos de despolarización de 1 s a 1,25, 2,5 y 5 veces la corriente de umbral, o por 1, 2, 3 y 5 nA. La resistencia de entrada (Rin, input resistance) puede determinarse a partir del cambio de tensión producido durante la inyección de un pulso hiperpolarizante de 1 s (0,5 nA). La excitabilidad del axón puede analizarse pasando corriente entre dos compartimentos a través de una abertura estrecha, sellada con vaselina, que contiene los nervios p7, p8 y p9. El umbral puede determinarse con una serie rápida de pulsos de 2 ms. El disparo repetitivo puede analizarse aplicando dos pulsos de 1 s a 0,4 y 0,8 veces la corriente de umbral de 2 ms.

El dolor persistente incluye un dolor que dura más que el periodo de lesión agua, e incluye síndromes de dolor crónico tal como dolor neuropático (véase Bennett et al., 2005). En realizaciones específicas no limitativas, la duración del dolor persistente es de al menos 1 día, de al menos una semana, de al menos un mes o de al menos un año.

5.2. Ensayos para identificar moduladores de la ruta NO/cGMP/PKG

La presente invención desvela ensayos que identifican moduladores (inhibidores o promotores/inductores) de la ruta NO/cGMP/PKG. Dichos ensayos pueden utilizarse para evaluar a un agente de ensayo para determinar si el agente de ensayo es un agente que modula al menos una etapa de la ruta y por lo tanto modular la LTH. Se puede utilizar un inhibidor de la ruta para inhibir la LTH y se puede utilizar para inhibir y/o tratar el dolor persistente en una neurona sensorial y/o en un sujeto. El término “ inhibir”, como se usa en el presente documento, significa disminuir, retrasar o prevenir. Para desarrollar un sistema de modelo de dolor persistente, puede utilizarse un promotor/inductor de LTH, preferentemente en un animal, tal como Aplysia, que se cree que no siente dolor de una manera subjetiva.

Los ensayos de la presente solicitud utilizan un sistema modelo que comprende una neurona sensorial de ensayo (“TSN”, test sensory neuron) en condiciones fisiológicas que al menos se aproximan al entorno in vivo en el que se encuentra de manera natural la neurona sensorial. La TSN comprende un cuerpo celular que contiene el núcleo, así como un segmento axonal, que constituye al menos una parte del axón de la TSN y, más preferentemente, que constituye el axón completo. En determinadas realizaciones no limitativas, la TSN es una SN de Aplysia. En otras realizaciones no limitativas, la TSN es una SN de vertebrado, preferentemente una SN de mamífero. La TSN puede conservarse aislada en un cultivo, como parte de un grupo de neuronas que pueden ser o no todas las SN, o como un nervio extraído o una sección extraída del mismo (por ejemplo, un segmento extirpado del nervio ciático de rata). En realizaciones alternativas, la TSN puede mantenerse in vivo en un animal. En otras realizaciones no limitativas adicionales, el segmento axonal puede contener al menos una ligadura.

La TSN está lesionada. Por ejemplo, y no como limitación, la lesión puede crearse mediante aplastamiento, corte y/o realizando una lesión química de la TSN utilizando métodos conocidos en la técnica. Otros métodos incluyen inducir una respuesta inflamatoria, isquemia, una reducción del suministro sanguíneo a las neuronas, e hiperglucemia.

En los ensayos de la solicitud, a la TSN se la administra un agente de ensayo, ya sea antes, junto con, o después de una lesión, ya sea en un medio de cultivo administrado por vía sistémica, inyectado localmente, o inyectado directamente o introducido de otra manera en la TSN. En realizaciones no limitativas, el agente de ensayo puede administrarse en un lugar concreto de la célula de la TSN, tal como el cuerpo celular o el axón. Preferentemente, los efectos del agente de ensayo sobre la TSN se comparan con valores comparables en una SN de control (“CSN”), tal como una CSN lesionada. A partir de entonces, se realiza una de las siguientes etapas de evaluación. En realizaciones específicas no limitativas, las etapas de evaluación se realizan a las 48 horas de producirse la lesión.

El ensayo de la presente solicitud determina si el agente modula la actividad de la óxido nítrico sintasa (“NOS”, que preferentemente es nNOS, pero también puede ser eNOS y/o iNOS) en una TSN lesionada, preferentemente en relación con la actividad de NOS en una c Sn lesionada a la que no se la ha administrado un agente de ensayo. Una capacidad para inhibir el aumento de la actividad de NOS (preferentemente nNOS) asociada a una lesión en la NS indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en la actividad de NOS en relación con los valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. La actividad NOS puede medirse, por ejemplo, y no como limitación, midiendo ya sea la cantidad de ARNm de nNOS, la cantidad de proteína nNOS, o la cantidad producida de óxido nítrico (“NO”). Por ejemplo, el ARNm de nNOS puede medirse mediante amplificación por PCR, utilizando cebadores tales como oligonucleótidos que tienen las SEQ ID NO: 15 y 16, mencionadas a continuación, o por hibridación in situ, utilizando una sonda oligonucleotídica complementaria marcada de forma detectable. Por ejemplo, la proteína nNOS puede medirse mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo (policlonal o monoclonal) específico para nNOS, marcado de manera detectable. Por ejemplo, la cantidad producida de NO puede medirse, y cuando la cantidad de material celular es suficiente, midiendo la conversión de L-[14C] arginina a L-[14C]-citrulina como se describe en Smith et al., 2002.

El ensayo de la presente solicitud determina si el agente modula la actividad de la guanilil ciclasa (“GC”) en una TSN lesionada, preferentemente en relación con la actividad de la GC en una CSN lesionada a la que no se la ha administrado el agente de ensayo. Una capacidad para inhibir el aumento en la actividad de GC asociada a una lesión de SN indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en la actividad de GC en relación con los valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. La actividad de GC puede medirse, por ejemplo, y sin limitación, midiendo ya sea la cantidad de ARNm de GC, la cantidad de proteína GC o la cantidad producida de cGMP. Por ejemplo, el ARNm de GC puede medirse por amplificación mediante PCR, utilizando cebadores diseñados en función de la secuencia de ácido nucleico de GC, y la proteína de GC puede medirse mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo (policlonal o monoclonal) específico para GC marcado de manera detectable. Como un ejemplo no limitativo, cuando el volumen de material celular es apropiado, la actividad de GC puede medirse mediante una modificación del método expuesto en Mo et al., 2004. Por ejemplo, puede llevarse a cabo la lisis de una TSN utilizando una concentración 2 veces mayor de tampón de lisis que contenga ditiotreitol 200 pM e inhibidor de proteasa sin EDTA, y la mezcla puede someterse a ultrasonido y mantenerse y conservarse en hielo. La TSN lisada puede someterse a ensayo en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) complementado con MgCl23 mM, EGTA 0,1 mM, albúmina de suero bovino al 0,05 % (p/v), 3-isobutiM-metilxantina 1 mM, creatina fosfato 5 mM, creatina fosfoquinasa 200 pg/ml, GTP 300 pM, 1000 unidades/ml de superóxido dismutasa, ácido úrico 300 pM y cPTIO (2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolino-1-oxil-3-óxido) 200 pM. Se añadió SPER/NO (N-4-1-3-aminopropil-2-hidroxi-2-nitrosohidrazino butil-1,3-propano-diamina) y se pueden retirar alícuotas inactivadas a diversos intervalos, y analizar el cGMP. Por ejemplo, cuando la cantidad de material celular es suficiente, la cantidad de cGMP producida puede medirse mediante un ensayo de quimioluminiscencia (HitHunter, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, N.J.).

El ensayo de la presente solicitud determina si el agente modula la actividad de la proteína quinasa G (“PKG”) en una TSN lesionada, preferentemente en relación con la actividad PGK en una CSN lesionada a la cual no se la ha administrado el agente de ensayo. Una capacidad para inhibir el aumento en la actividad de PKG asociada a una lesión de SN indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en la actividad de PKG en relación con valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. La actividad de PKG puede medirse, por ejemplo, y no como limitación, midiendo la actividad de la quinasa en un extracto de SN. Por ejemplo, la cantidad de actividad de PKG en un extracto de SN puede determinarse midiendo la capacidad del extracto para transferir 32P de [32P]-ATP al BPDEtido (Calbiochem, La Jolla, CA).

El ensayo de la presente invención determina si el agente modula el transporte de la proteína quinasa G (“PKG”) en una TSN lesionada, preferentemente en relación con el transporte de PKG en una CSN lesionada a la que no se la ha administrado el agente de ensayo. Una capacidad para inhibir el transporte de PKG asociado a una lesión de SN indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en el transporte de PKG en relación con los valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. El transporte de PKG puede medirse, por ejemplo, y no como limitación, determinando si un aumento en la actividad de PKG cambia con el tiempo desde la región de la SN que está lesionada hacia el cuerpo celular. Este aumento puede medirse mediante diversos métodos, incluyendo, entre otros, ensayos secuenciales de segmentos axonales, distales a proximales, para determinar la actividad de PKG (véase Figura 9). En otro ejemplo no limitativo, el segmento axonal puede estar ligado y el material axonal puede recogerse de regiones del axón a diferentes distancias relativas de la lesión y/o la ligadura donde, por ejemplo, la cantidad de PKG activada en la región de la lesión disminuye con el tiempo en relación con la cantidad de actividad de PKG en el lado de la ligadura orientada a la lesión (véase la Figura 4).

El ensayo de la presente solicitud determina si el agente modula la fosforilación de la proteína quinasa-erk activada por mitógeno (“MAPKerk”) en una TSN lesionada, preferentemente en relación con la fosforilación de MAPKerk en una CSN lesionada a la que no se la ha administrado el agente de ensayo. Una capacidad para inhibir la fosforilación de MAPKerk asociada a una lesión en SN indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en la fosforilación de MAPKerk con respecto a los valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. La fosforilación de MAPKerk puede medirse determinando el nivel de actividad de MAPKerk en la fosforilación de su sustrato, o detectando la presencia de MAPKerk fosforilada utilizando un anticuerpo que se una selectivamente a la proteína fosforilada en lugar de a la proteína no fosforilada (por ejemplo, pero sin limitación el anticuerpo AbpTpYmapk

El ensayo de la presente solicitud determina si el agente modula la translocación de MAPKerk en el núcleo de una TSN lesionada, preferentemente con relación a la translocación de MPAKerk en el núcleo de una CSN lesionada a la cual no se la ha administrado el agente de ensayo. Una capacidad para inhibir la translocación de MAPKerk en el núcleo asociada a una lesión en SN indica que el agente de ensayo es un inhibidor de LTH. Una capacidad para promover un aumento adicional en la translocación de MAPKerk en el núcleo en relación con los valores de control indica que el agente de ensayo es un promotor de LTH. La translocación de MAPKerk en el núcleo puede medirse utilizando un anticuerpo específico de MAPKerk que mida la cantidad de MAPKerk en el núcleo de la SN utilizando técnicas de inmunohistoquímica de láser confocal.

5.3. Modulación de la ruta NO/cGMP/PKG

De acuerdo con la presente invención, la ruta NO/cGMP/PKG, y por lo tanto el desarrollo de LTH y de dolor persistente, puede modularse utilizando inhibidores desvelados en esta sección o promotores/inductores identificados o que tienen las propiedades expuestas en la sección 5.2 anterior. En realizaciones particulares, se puede administrar un inhibidor a una neurona sensorial que necesite dicho tratamiento en una cantidad eficaz para inhibir la LTH. Cuando la SN a la cual se la administra el inhibidor, es una SN in vivo en un sujeto animal, el inhibidor puede administrarse por vía sistémica (por ejemplo, por inyección intravenosa, administración oral, inhalación, etc.), puede inyectarse localmente (cerca del nervio dañado), puede aplicarse por vía tópica (por ejemplo, junto con un agente para mejorar la permeabilidad de la piel, tal como un compuesto químico o un estímulo eléctrico) o puede administrarse por cualquier otro medio conocido en la técnica, a excepción de la introducción en el sistema nervioso central, tal como la administración intratecal, que no se utilizaría para administrar un inhibidor a una SN. La cantidad de inhibidor a administrar puede determinarse utilizando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, realizando estudios de respuesta a la dosis en uno o más sistemas modelo, tales como el sistema de Aplysia descrito anteriormente o un modelo de mamífero de dolor neuropático periférico, seguido de pruebas clínicas autorizadas en seres humanos. En cuanto a las concentraciones que se exponen a continuación, estas se refieren a la concentración a la que se expone la neurona sensorial o cualquiera de sus componentes, incluido el axón, el cuerpo celular o receptor.

En realizaciones relacionadas, a un sujeto que padece dolor crónico se le puede administrar una cantidad eficaz de un inhibidor. Preferentemente, el dolor crónico tiene un componente de hiperalgesia del sistema nervioso periférico (primario), donde el método inhibe el dolor mediado por el sistema nervioso periférico, pero en realizaciones específicas no limitativas, la presente invención también abarca el tratamiento de la hiperalgesia espinal como un componente de, o la base de (por ejemplo, dolor neuropático central crónico resultante de una lesión de la médula espinal) dolor crónico. Puede utilizarse cualquiera de los modos de administración anteriores, pero si debe tratarse un componente de hiperalgesia espinal, el inhibidor, que se dirige a una neurona que tiene su cuerpo celular en el sistema nervioso central y no en el ganglio de la raíz dorsal, debe administrarse por vía intratecal.

Una cantidad eficaz es una cantidad de inhibidor que disminuye el nivel de dolor percibido subjetivamente por el sujeto, preferentemente, en experimentos controlados, una cantidad determinada que es mayor que el efecto placebo. Por ejemplo, y no como limitación, en determinadas realizaciones de la invención, cuando el dolor percibido se puede cuantificar en una escala de 0 a 10, donde 0 significa que no hay dolor, 1-5 significa dolor leve progresivamente más intenso, 6-7 dolor moderado progresivamente más intenso, 8-9 dolor agudo progresivamente más intenso y 10 es el peor dolor posible, una cantidad eficaz de inhibidor puede disminuir la cuantificación del dolor percibido de la escala de dolor, en al menos 2 puntos, o en al menos 3 puntos.

La presente solicitud desvela un método para el tratamiento de dolor crónico en un sujeto, que comprende administrar, en el lugar en el que aparece el dolor, una cantidad eficaz de un inhibidor como se expone en el presente documento (como alternativa, denominado “inhibidor de LTH”), donde la administración puede ser por inyección local o aplicación tópica (por ejemplo, a través de una crema, una pomada o un dispositivo transdérmico, que puede ser un parche o puede ser un mecanismo, o un mecanismo que contenga o esté asociado de otra manera a un parche), y el lugar puede ser, como ejemplos no limitativos, un lugar donde hay una herida, un tejido que recubre una articulación inflamada o una zona dentro del dermatoma que está asociada al dolor percibido (por ejemplo, L4, L5, S1, C3, C4, C5, C6 o C7, véase más adelante).

5.3.1 Modulación de NOS

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, LTH y/o dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un inhibidor de NOS (preferentemente nNOS y/o eNOS y/o iNOS), tal como, pero sin limitación, L-NAME [clorhidrato de éster metílico de AG-nitro-L-arginina], L-tiocitrulina, o un ácido nucleico antisentido o un ARNi que inhibe la expresión de NOS. Una molécula de ácido nucleico antisentido o un ARNi de este tipo puede hibridarse con la NOS diana en condiciones de hibridación rigurosas, como se define más adelante.

5.3.2 Modulación de los niveles de NO

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o de dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que disminuye los niveles de NO, que incluye, entre otros, la quercetina (que es un depurador de NO (Griffiths et al., 2003)).

5.3.3 Modulación de GC

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o de dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que inhibe el aumento en la actividad de GC, tal como, pero sin limitación, L-H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (“ODQ”), o una molécula de ácido nucleico antisentido o un ARNi que inhibe la expresión de GC. Dicha una molécula de ácido nucleico antisentido o ARNi puede hibridarse con la GC diana en condiciones de hibridación rigurosas como se define más adelante.

5.3.4 Modulación de los niveles de cGMP

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o de dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que disminuye los niveles de cGMP, tal como, pero sin limitación, un agente que aumente la actividad fosfodiesterasa, preferentemente PDE5, tal como, pero sin limitación, la administración de la propia fosfodiesterasa (por ejemplo PDE5), o el activador de PDE5, Ant-cGMP-2'-0-antraniloil cGMP (guanosina 3', 5' monofosfato cíclico, 2'-0-antraniloil cGMP).

5.3.5 Modulación de la actividad de PKG

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o de dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que inhibe la actividad de PKG. El agente inhibe la PKG activada y/o su llegada desde el axón en un cuerpo celular neuronal.

El agente es un inhibidor peptídico de PKG. En Dostmann, 2000, se desvelan ejemplos no limitativos de inhibidores peptídicos de PKG, e incluyen un péptido que comprende las secuencias LRKk Kk KH (SEQ ID NO: 26), LRAKKKKH (SEQ ID NO: 27), LRKAKKKH (SEQ ID NO: 28), LRKKAKKH (SEQ ID NO: 29), LRKKKAKH (SEQ ID NO: 30) o LRKKKKKH (SEQ ID NO: 31). En otras realizaciones, un inhibidor peptídico de PKG puede comprender una secuencia central, RKK o RKKK (SEQ ID NO: 32), y puede tener una longitud de entre aproximadamente 5 y 100, o de entre 5 y 50, o de entre 10 y 30, o de entre 10 y 20, aminoácidos.

Un inhibidor peptídico de PKG de acuerdo con la solicitud puede comprender además uno o más péptidos transportadores, uno o más péptidos portadores, o péptidos tanto transportadores como portadores, así como componentes peptídicos o no peptídicos adicionales que pueden mejorar el transporte, la eficacia y/o la estabilidad. Por lo tanto, la presente solicitud proporciona péptidos que comprenden inhibidor-A-portador, portador-A-inhibidor, inhibidor-I-transportador, transportador-I-inhibidor, portador-A-inhibidor-I-transportador y transportador-I-inhibidor-A-portador, siendo A y I péptidos enlazadores opcionales, siendo el portador un péptido portador, siendo el inhibidor un péptido inhibidor y siendo el transportador un péptido transportador, como se expone en el presente documento, en el que en realizaciones no limitativas el tamaño de todo el péptido tiene una longitud de entre 10 y 100, o de entre 10 y 50, o de entre 10 y 30, o de entre 10 y 20, aminoácidos. La presente solicitud desvela péptidos que comprenden LRKKKKKHXYGRKKRRQRRRPP (SEQ ID NO: 33), YGRKKRRQRRRPPXLRKKKKKH (SEQ ID NO: 34), LRKKKKKHXRQIKlWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 35), RQIKlWFQNRRMKWKKXLRKKKKKH (SEQ ID NO: 36), LRKKKKKHZPKKKRK (SEQ ID NO: 37), PKKKRKZLRKKKKKH (SEQ ID NO: 38), YGRKKRRQRRRPPXLRKKKKKHZPKKKRK (SEQ ID NO: 39), PKKKRKZLRKKKKKHXYGRKKRRQRRRPP (SEQ ID NO: 40), RQIKlWFQNRRMKWKKXLRKKKKKHZPKKKRK (SEQ ID NO: 41), PKKKRKZLRKKKKKHXRQIKlWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 42), siendo A y I moléculas enlazadores opcionales de entre 0 y 5, o de entre 0 y 10, o de entre 0 y 20, aminoácidos, cuyos péptidos pueden tener una longitud de entre 5 y 100, o de entre 5 y 50, o de entre 10 y 30, aminoácidos. La presente solicitud desvela inhibidores peptídicos que son al menos aproximadamente 90 o aproximadamente 94 por ciento homólogos a los péptidos citados anteriormente, según se determinó utilizando un programa informático estándar de evaluación de homología, tal como BLAST o FASTA, y que inhiben la PKG, y que pueden tener una longitud de entre aproximadamente 5 y 100, o de entre 5 y 50, o de entre 10 y 30, o de entre 10 y 20, aminoácidos. La concentración eficaz del inhibidor peptídico puede variar de entre 1 nanomolar y 10 micromolar.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

.. O O u o

~ . x/ , H ii - ^{? u ¿} ¿ H ii

Cuando Y es: -é- n- c 4 -^-o-C-§- -{-n-S -

Ó

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF³SO²NH-, CH³SO²NH-) y tetrazol;

en la preparación de un medicamento para el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, en el que el medicamento es para la administración a la neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un agente de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico en el que el medicamento es para la administración a la neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un agente de acuerdo con la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de dolor crónico en el que el medicamento es para la administración al sistema nervioso central.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un agente de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de dolor crónico en el que el medicametno es para la adminsitración al sistema nervioso central.

En una realización específica, no limitativa, el agente es balanol o una variante de balanol. Las variantes de balanol pueden seleccionarse del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol ligado a un péptido transportador, una variante de balanol ligada a un péptido transportador, balanol ligado a un péptido portador, una variante de balanol ligada a un péptido portador, balanol ligado a un péptido transportador y a un péptido portador, y una variante de balanol ligada a un péptido transportador y a un péptido portador. En realizaciones no limitativas específicas, la concentración de balanol o de la variante de balanol administrada a la neurona, por ejemplo, a través de su axón, puede variar de entre aproximadamente 1 y 500 nM, o de entre aproximadamente 2 y 100 nM, dependiendo de la fuerza del compuesto.

En otra realización específica, no limitativa, el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS. En una realización relacionada, el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS conjugado con uno o más péptidos transportadores. En otra realización relacionada, el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS conjugado con uno o más péptidos portadores. En otra realización adicional relacionada, el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS conjugado con uno o más péptidos transportadores y con uno o más péptidos portadores (véase a continuación la definición de péptidos transportadores y portadores). En realizaciones específicas, no limitativas, la concentración de Rp-8-pCPT-cGMPS puede variar de entre 1 micromolar y 500 micromolar.

5.3.6 Modulación del transporte de PKG

La presente solicitud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o del dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que inhibe el transporte de PKG.

En realizaciones no limitativas de la invención, un agente que inhibe el transporte de PKG puede comprender un péptido transportador, como se expone más adelante, en una cantidad eficaz para inhibir el sistema de transporte retrógado axonal. En realizaciones específicas no limitativas, un agente que inhibe el transporte de PKG puede comprender una pluralidad de péptidos transportadores, por ejemplo, pero sin limitación, comprendidos en bucles de superficie de una molécula señuelo.

5.3.7 Modulación de la actividad MAPKerk

La presente solictud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o del dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que inhibe la activación (fosforilación) de MAPKerk. Dichas moléculas incluyen, pero sin limitación, inhibidores de tirosina quinasa, tales como K252a y genisteína.

5.3.8 Modulación del transporte de MAPKerk

La presente solictud desvela la inhibición de la ruta NO/cGMP/LTH, de LTH y/o del dolor persistente, mediante un método que comprende administrar, a una SN (que puede ser o no una SN in vivo en un sujeto), una cantidad eficaz de un agente que inhibe la translocación de MAPKerk en el núcleo, incluyendo, pero sin limitación, un antagonista de calcio tal como felopidina (Yang et al., 2002), verapamil, diltiazem, nifedipina, etc. o apolipoproteína D (Sarjeant et al., 2003).

5.3.9 Composiciones para el tratamiento del dolor

Las composiciones de la solicitud pueden comprender un agente inhibidor como se describe anteriormente, donde el agente inhibidor comprende opcionalmente una molécula portadora que facilita su translocación a través de una célula neuronal o membrana nuclear. Los ejemplos de moléculas portadoras que pueden utilizarse incluyen, pero sin limitación, la proteína tat del VIH-1 (YGr Kk RRQRRRPP; SEQ ID NO: 43) y péptidos que tienen una longitud de aproximadamente 9-30 o de aproximadamente 9-20 restos que comprenden en su secuencia central RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 44), el homeodominio Antennapedia de Drosophila (RQIKIWFQNRRMKWKK; SEQ ID NO: 45). Otras moléculas portadoras que pueden utilizarse pueden estar ampliamente comprendidas (contienen al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, o al menos un 80 por ciento) de aminoácidos cargados positivamente, tales como arginina (Wendere et al., 2000) y/o lisina (Mai et al., 2002). La invención también incluye péptidos y péptidos derivatizados que son al menos aproximadamente 90 o aproximadamente 95 por ciento homólogos a los péptidos citados anteriormente, según se determina utilizando un programa informático estándar de evaluación de homología, tal como BLAST o FASTA. Opcionalmente, el agente inhibidor puede comprender de manera alternativa o adicional, un péptido transportador, como se describe a continuación.

La presente solicitud desvela dichos agentes inhibidores, ya sea en forma liofilizada o disueltos en un vehículo farmacéutico adecuado. En a solicitud se incluyen composiciones que comprenden más de un agente inhibidor.

La solicitud desvela una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes inhibidores, como se expone anteriormente, junto con al menos un agente que promueve la captación del agente inhibidor en un nervio periférico. Los ejemplos de dichos agentes incluyen agentes potenciadores de la permeabilidad de la membrana, tales como dimetil sulfóxido y/o 2-hidroxipropil-b-ciclodextrina.

La solicitud desvela una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes inhibidores, como se expone anteriormente, junto con al menos un agente que trata una causa de dolor subyacente, que incluye, pero sin limitación, un agente antiinflamatorio (tal como aspirina, un agente antiinflamatorio no esteroideo, tal como ibuprofeno, o un corticosteoride).

La solicitud desvela una composición farmacéutica que comprende uno o más agentes inhibidores, como se expone anteriormente, junto con al menos un agente que tiene un efecto anastésico local, tal como lidocaína.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un dispositivo transdérmico que contiene una cantidad eficaz de un agente de acuerdo con la invención. En una realización específica, no limitativa, el agente de acuerdo con la invención está ligado a un péptido transportador. El dispositivo transdérmico puede ser un parche o un mecanismo que comprenda uno o más agentes inhibidores, como se expone anteriormente, y opcionalmente uno o más agentes adicionales que promueven la captación del agente en un nervio periférico, trata una causa de dolor subyacente y/o tiene un efecto anestésico local, donde se proporcionan ejemplos de compuestos en cada una de estas categorías anteriores. El dispositivo puede utilizar en general tecnología de parches transdérmicos conocida en la técnica, para facilitar la liberación sostenida de sus agentes terapéuticos a través de la piel de un sujeto. En realizaciones específicas no limitativas el dispositivo crea un potencial eléctrico que promueve la captación de uno o más agentes inhibidores en tejido local (iontoforesis), o mejora la transferencia de fármacos utilizando ultrasonido u ondas de radiofrecuencia (véase Bryan, 2004; Patentes de Estados Unidos N.° 5.405.614 y 4.708.716).

5.4 Modulación de las rutas del dolor utilizando los mecanismos de transporte retrógrado neuronal

La presente solicitud desvela un método para modular e inhibir específicamente las rutas del dolor, la percepción del dolor y la hiperalgesia primaria (sistema nervioso periférico), que comprende suministrar un compuesto inhibidor del dolor a un axón de un nervio sensorial, de tal manera que el compuesto inhibidor del dolor se transporta, de forma retrógrada a lo largo del axón, al cuerpo celular de la neurona sensorial en el ganglio de la raíz dorsal. El compuesto inhibidor del dolor no está limitado a los inhibidores de LTH expuestos en el presente documento, sino que puede ser cualquier inhibidor del dolor que actúe en las neuronas sensoriales, tales como inhibidores de prostaglandina (por ejemplo, inhibidores de COX-2), opioides de acción periférica, compuestos anestésicos, etc., ligados a un péptido transportador que facilita el transporte axonal retrógado.

En un ejemplo no limitativo, el péptido transportador es PKKKRK (SEQ ID NO: 46) o un péptido o péptido derivatizado que es al menos aproximadamente 80 por ciento homólogo al mismo según lo determinado utilizando un programa informático estándar de evaluación de homología, tal como BLAST o FASTA, y que facilita el transporte axonal. En otro ejemplo no limitativo, el péptido transportador es el péptido relacionado CTPPKKKRKV (SEQ ID NO: 47) (véase Ambron, 1992), o un péptido o péptido derivatizado que es al menos aproximadamente 70, o al menos aproximadamente 80 o al menos aproximadamente 90 por ciento homólogo al mismo según lo determinado utilizando un programa informático estándar de evaluación de homología tal como BLAST o FASTA y que facilita el transporte axonal. El péptido transportador tiene una longitud de entre 5 y 20 aminoácidos y comprende el péptido KKKRK (SEQ ID NO: 48), PKKKRK (SEQ ID NO: 46), PPKKKRK (SEQ ID NO: 49), TPPKKKRK (SEQ ID NO: 50), o PKKKKRKV (SEQ ID NO: 51).

Por ejemplo, el compuesto inhibidor del dolor (que comprende un agente que inhibe el dolor asociado a una neurona sensorial y a un péptido transportador; preferentemente un inhibidor de LTH como se expuso anteriormente) puede suministrarse a un receptor de dolor periférico en el sitio de la lesión o en el mismo dermatoma que el de la lesión, como axones sensoriales que surgen a lo largo del dermatoma que convergen en el mismo ganglio de la raíz dorsal. La Figura 11A-B presenta los dermatomas sensoriales (del Merck Manual of Diagnosis and Therapy, sección 14, capítulo 165, figura 165-2, que hace referencia a Keegan y Garrett FD, “Anatomical Record 102: 409-437, 1948, utilizado con permiso del Wistar Institute, Filadelfia, PA). Como ejemplos, el dolor de artritis asociado a los dedos se comunica a través de axones cuyos cuerpos celulares residen en los GRD (ganglios de la raíz dorsal) a nivel de C5-T1 y el dolor de rodilla se comunica a través de axones cuyos cuerpos celulares residen en los GRD a nivel de L3-S2.

Por consiguiente, la presente solicitud desvela un método de tratamiento para el dolor en un sujeto, en el que se determina que el dolor está asociado a un ganglio de la raíz dorsal a un nivel particular de la médula espinal, que comprende la aplicación tópica, en la piel que se encuentra dentro del dermatoma correspondiente al nivel de la médula espinal asociado al dolor, de un inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador.

El compuesto inhibidor del dolor puede incluirse en una crema, pomada o dispositivo transdérmico (véase líneas anteriorres), y aplicarse al dermatoma apropiado.

Por ejemplo, una persona que padece lumbalgia como resultado de la compresión del nervio que sale de un foramen óseo en la columna vertebral inferior (radiculopatía lumbar, sacra o lumbosacra), podría tratarse con un parche transdérmico que contuviese un compuesto inhibidor del dolor (que comprende un péptido transportador) y aplicarse al dermatoma correspondiente a nivel de la médula espinal a partir del cual se origina el nervio comprimido, que puede identificarse por los síntomas y la exploración física de la persona. Como ejemplo específico, dado que con frecuencia ^{la radiculopatía involucra a los nervios provistos en los dermatomas} l4, ^{L5 y/o S1, se puede aplicar un parche} transdérmico de acuerdo con la invencicón a la nalga del paciente. Como otro ejemplo específico, no limitativo, una persona con artritis con implicación de las articulaciones de los dedos, los dermatomas C6-C8 podrían llevar un parche de acuerdo con la invención en el antebrazo o en el hombro, por ejemplo, por encima de la espina escapular.

Este aspecto de la solicitud proporciona la ventaja de que trata el dolor a mismo tiempo que evita la administración sistémica de un compuesto antinociceptivo, lo que reduce sustancialmente el potencial de abuso de sustancias y evita los posibles efectos secundarios, tales como los asociados a los inhibidores de COX-2.

5.5 apPKG

La presente solicitiud desvela adicionalmente moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína quinasa G, así como sus proteínas codificadas.

La presente solicitiud desvela un ácido nucleico aislado que codifica una proteína quinasa G del género Aplysia (ap PKG) que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en el GenBank con el N.° de registro AY362340 y la SEQ ID NO: 10 en el presente documento. La presente solicitud desvela una molécula de ácido nucleico aislada que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en el GenBank con el N.° de registro AY362340 y la SEQ ID NO: 9 en el presente documento, así como moléculas de ácido nucleico que son al menos 85, al menos 90 o al menos 95 por ciento homólogas a las mismas, donde la homología se determina mediante un programa informático estándar de determinación de homología, tal como BLAST o FASTA. La presente solicitud desvela moléculas de ácido nucleico aisladas que se hibridan, en condiciones rigurosas, con una molécula de ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO: 9, y que codifican una molécula que tiene actividad proteína quinasa. En el presente documento, las condiciones rigurosas se definen como hibridación con ADN unido a un filtro en NaHPO40,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C y lavando en SSC 0,1x/SDS al 0,1 % a 68 °C (Ausubel G- M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., Nueva York, pág. 2.10.3).

Los ácidos nucleicos de la solicitud pueden incluirse en una molécula de vector, que puede ser un fago, un plásmido, un fagémido o un virus.

Los ácidos nucleicos de la solicitud pueden unirse operativamente a un elemento promotor para crear un casete de expresión.

La presente solicitiud desvela una proteína aislada que tiene una secuencia como se expone en la SEQ ID NO: 10, así como proteínas que son al menos 85, al menos 90 o al menos 95 por ciento homólogas a las mismas y que muestran actividad proteína quinasa. Las proteínas de la invención pueden incluirse en proteínas de fusión. Como ejemplo no limitativo, las proteínas de la solicitud pueden fusionarse con una etiqueta reconocible inmunológicamente, tal como una etiqueta de His (véase la Sección 6, más adelante).

En realizaciones adicionales, la presente solciitiud desvela una proteína aislada que comprende una parte catalítica de apPKG, incluyendo una parte catalítica de apPKG que tiene la secuencia de aminoácidos:

VAKEFENCSLDDLQLVTTLGMGGFGRVELVQLSKEKGKTFALKCLKKKHIVETRQQEHIYSEKKIMMEADSPFITKLHK TFRDRKYVYMLMEVCLGGELWTILRDRGNFDDLTARFCVACVLEAFSYLHAKGIIYRDLKPENLLLDARGYVKLVDFG FAKKIGVGKKTWTFCGTPEYVAPEMLNKGHDHSADYWSLGILMYELLNGTPPFSGSDPMRTYNMLKGIDHIEFPKKISR SAHVLIKKLCRDNPMERLGYGKNGISDIRKNKWF (SEQ ID NO: 25), y secuencias de aminoácidos que son al menos 85 por ciento, al menos 90 por ciento, o al menos 95 por ciento homólogas a las mismas. La parte catalítica de apPKG, y las moléculas que son al menos 85, al menos 90 o al menos 95 por ciento homólogas a las mismas, pueden incluirse en una proteína de fusión, ligadas a otra secuencia de aminoácidos en el extremo N y/o C terminal. La presente solicitud proporciona además moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican dichas proteínas aisladas, que pueden unirse operativamente a un elemento promotor incluido en un casete de expresión y/o en una molécula de vector.

La presente solicitud proporciona además moléculas de anticuerpo que se preparan inmunizando a un animal con una proteína purificada de acuerdo con la invención. Dichas moléculas de anticuerpo pueden ser policlonales o monoclonales, preparadas utilizando técnicas de laboratorio convencionales.

6. Ejemplo 1: Importación de una ¡soforma neuronal de la proteína quinasa nuclear activada por mitógeno que se acopla a la proteína quinasa G, a la hiperexcitabilidad de larga duración inducida por axotomía en neuronas sensoriales de Aplvsia

6.1. Materiales y métodos

Aplastamiento de nervios in vivo. La Aplysia (100-150 g) se anestesió con MgCl2 isotónico, y se realizó una pequeña incisión en un lado de la pared corporal. Los nervios pedales 5-9 se aplastaron a 2 cm de los ganglios pedalespleurales en un lado. La herida se suturó y el animal se llevó de nuevo a su estanque. El protocolo de aplastamientoligamiento seguido fue como se describe en la técnica (Ambron et al., 1995).

Clonación. Se utilizaron los cebadores oligonucleotídicos degenerados 5-tayaaytgyacnmgiacngc (SEQ ID NO: 1) y 5'-ccrcaraangtccangtytt (SEQ ID NO: 2) para amplificar un fragmento de ADNc de apPKG a partir de ADNc del SNC de Aplysia. El producto resultante de la PCR de esta amplificación se clonó en pCR-II (Invitrogen, Carlsbad, CA) y posteriormente se secuenció en la instalación central en la Universidad de Columbia. Los extremos 5' y 3' del ADNc se clonaron utilizando amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE, siglas del inglés rapid amplification of cDNA ends) 5' y 3', respectivamente. Se utilizó un kit de Amplificación de ADNc Marathon (BD Clontech, Palo Alto, CA) para generar ADNc a partir de ARN poli(A+) del SNC de Aplysia, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la reacción 5'-RACE, se utilizó un cebador específico, 5'- cgcctgtccagcacccatagcg (SEQ ID NO: 3). El producto de esta reacción de PCR se confirmó después mediante una segunda amplificación utilizando un cebador 5' específico, anidado, 5'-gggtgaccgctttcacggagg (SEQ ID NO: 4). Para la reacción 3'-RACE, se utilizó un cebador específico, 5'-cggcaaggttctgcgtcgcc (SEQ ID NO: 5). El producto de la PCT se sometió después a una segunda amplificación utilizando un cebador 3', anidado, 5'-ggacgcgaggggatacgtc (SEQ ID NO: 6). Ambos productos 5' y 3'-RACE se subclonaron en pCR-II y se secuenciaron. Para obtener el ADNc de longitud completa en una pieza, se realizó otra PCR con los oligonucleótidos 5'-ggtggaggagatagcggcggttctgtgaacgcc (SEQ ID NO: 7) y 5'-ggaggagtgagggtcagatcc (SEQ ID NO: 8), correspondientes a los extremos 5' y 3' de los productos 5' y 3'-RACE, respectivamente. El producto de la PCR se secuenció y se denominó apPKG y se depositó en la base de datos de GenBank con el número de registro AY363240 (SEQ ID NO: 9). La secuencia de aminoácidos deducida es la SEQ ID NO: 10.

Análisis de secuencias. La alineación de secuencias de diversas pKG y la identificación de restos conservados se realizó utilizando los algoritmos Clustal W y Boxshade proporcionados en la serie de programas disponibles en Biology Workbench (http://workbench.sdsc.edu/.). Expresión y purificación de proteínas. Se añadió una etiqueta de histidina al extremo N terminal de la región codificante de apPKG por amplificación mediante PCR a partir de ADNc del SNC de Aplysia con los siguientes cebadores:

5'-tggcggccgctcatgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggcaacggtgccagttcgaacacgcacttc (SEQ ID NO: 11) y

5'-gcaggctctagagaaatcaatgtcccagccggataactcgtc (SEQ ID NO: 12). El producto de la PCR se subclonó en los sitios Notl y Xbal de pFasBac-1 (Invitrogen) y se confirmó posteriormente mediante secuenciación. La construcción resultante pFB1apPKG contiene una etiqueta de epítopo de histidina N-terminal. La transformación de pFB1apPKG en células Max Efficiency DH10Bac (Invitrogen), la identificación de clones recombinantes y el aislamiento de a Dn del vector lanzadera de baculovirus recombinante (bácmido), se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Se obtuvo un baculovirus recombinante transfectando células Sf9 (Spodoptera frugiperda), que se propagaron como monocapas a 27 °C en medio Sf-900 IISFM (Invitrogen) que contenía penicilina 100 U/ml (Invitrogen) y estreptomicina 0,1 mg/ml (Invitrogen). La transfección con ADN bácmido recombinante se realizó utilizando CelIFectin (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los clones víricos positivos se identificaron por su capacidad para dirigir la expresión de la proteína apropiada, como se reveló mediante inmunotransferencia de extractos de células enteras de células Sf9 transfectadas recogidas 3 d después de la transfección, utilizando un anticuerpo contra la etiqueta de histidina de la proteína. Para la expresión proteica de apPKG, se infectaron células Sf9 con el baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección superior a 10. Después de 72 h, se recogieron las células y la apPKG-His recombinante se purificó en resina de níquel - ácido nitriloacético (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para expresar VASP (fosfoproteína estimulada por vasodilatadores, siglas del inglés vasodilator-stimulated phosphoprotein), la región codificante de VASP se obtuvo primero mediante amplificación por PCR a partir de ADNc de cerebro de ratón con los siguientes cebadores: 5'-gtcgtgggatccccatcgatagcgagacggtcatctgt (SEQ ID NO: 13) y 5'-atcttgaattcctcgagggtcaaggagaaccccgctt (SEQ ID NO: 14). El producto de la PCR se subclonó en los sitios EcoRI y BamHI de pGEX3X (Amersham Biosciences, Arlington Heights, IL) y se confirmó posteriormente mediante secuenciación. La construcción resultante, pGEXVASP, contenía una etiqueta de epítopo GST (glutatión S-transferasa) C-terminal. Las proteínas de fusión VASP-GST, Elk1-GST, MEKKlC (MAP quinasa 1C)-GST, MEK1 (MAP quinasa quinasa 1)-GST y ERK1-GST, se expresaron en células DH5a de Escherichia coli y se purificaron como se describe en la técnica (Sung et al., 1996).

Transferencias Northern. El ARN total se extrajo de varios tejidos y se resolvió mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante; después, el gel se transfirió a una membrana de nailon. La transferencia resultante se hibridó con apPKG marcada con radioactividad y ADNc ribosómico 5S como se ha descrito anteriormente en la técnica (Alberino et al., 1994; Sung et al, 2001).

RT-PCR de células individuales. Las SN individuales se transfirieron a 500 pl de Reactivo Tri (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), y el ARN total se aisló de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de cada muestra se sintetizó utilizando, como cebadores, hexámeros al azar y transcriptasa inversa (SuperScript II). Para amplificar fragmentos específicos mediante PCR (40 ciclos), se utilizaron partes alícuotas (2 pl) de cada muestra, utilizando conjuntos de cebadores específicos para lo siguiente: (1) óxido nítrico sintasa (NOS) neuronal (número de registro de GenBank AAK83069), 5'-gtaccctcacaggacgagtc (SEQ ID NO: 15) y 5'-tccttggacctctcttggtg (SEQ ID NO: 16) (nt 3610-4049); (2) sensorina A neuropéptido específico de SN (número de registro de GenBank X56770), 5'-aacagaaacagtctttcccc (SEQ ID NO: 17) y 5'-tcttgactcaccaactgcc (SEQ ID NO: 18) (nt 43-331); y (3) actina específica de neuronas (número de registro de GenBank U01352), 5'-cagagagaagatgacccag (SEQ ID NO: 19) y 5'-gggtaagagaagcaagaaag (SEQ ID NO: 20) (nt 416-1298).

Ensayos de quinasa. La actividad PKG in vitro se midió como se describe en la técnica (Pohler et al., 1995). En resumen, se incubaron 100 ng de His-apPKG con 5 pg de diversos péptidos en un tampón que contenía lo siguiente (en mM): Tris-HCl 25, pH 7,5, 5 p-glicerol fosfato, 2 D^t T, Na3VO40,1 y MgCh 10. La reacción se inició añadiendo [^y-32P]ATP 10 pM. Se dejó proseguir la incubación durante 20 min a temperatura ambiente y finalizó con EDTA 50 mM (concentración final). Los péptidos marcados se capturaron en filtros P81 (Whatman, Maidstone, Reino Unido). Los filtros se lavaron con ácido fosfórico al 0,5 % y se secaron, y el fosfopéptido-32P unido se detectó mediante recuento por centello líquido. Para los recuentos del fondo, todos los valores obtenidos sin el sustrato. Para evaluar la actividad de apPKG endógena se utilizaron 5 pg de extracto de ganglios o axoplasma en el tampón de quinasa (citado anteriormente) con 5 pg de inhibidor de PKA en presencia o en ausencia de cGMP 1 pM. La actividad de ERK se sometió a ensayo como se describe en la técnica (Sung et al, 2001). En resumen, las proteínas y el ATP 500 pM se incubaron en tampón de quinasa durante 20 min a temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se resolvieron en geles de poliacrilamida con SDS al 10 % y se sometieron a transferencia Western con los anticuerpos (Ab)pTpYmapk, AbpYmapk, AbpTmapk o AbpElk1.

Hibridación in situ. En primer lugar se aislaron ganglios de animales, se desenvainaron y se fijaron durante 3 h en paraformaldehído al 4 % en PBS, a pH de 7,4. Después, los ganglios se lavaron varias veces en PBS 1X y se sometieron a digestión con proteinasa K 80 pg/ml (Ambion, Austin, TX) en PBS 1 p durante 30 min a temperatura ambiente (TA). Después de diversos lavados en PBS 1X, los ganglios se fijaron de nuevo durante 20 min con paraformaldehído al 4 % y después se lavaron varias veces más en PBS 1X. Después de tratamiento con HCl de trietanolamina al 1,32 %, a pH de 8,0 (10 min a TA) y anhídrido acético al 0,24 % en HCl de trietanolamina al 1,32 %, a pH de 8,0 (20 min a TA), y diversos lavados con PBS 1X, los ganglios se prehibridaron en tampón Hyb (formamida al 50 %, SSC 5X, solución de Denhardt 5X, ARNt de levadura 0,25 mg/ml y ADN de esperma de salmón 0,5 mg/ml) a 60 °C durante 2 h, y después se hibridaron durante una noche a 60 °C con tampón Hyb reciente que contenía ARNc antisentido o en sentido marcado con digoxigenina (DIG) (1 pg/ml). Después de la hibridación, los ganglios se lavaron primero durante 30 min en tampón Hyb reciente a 68 °C y después en SSC 0,2X a 68 °C durante 1 h. Después de alcanzar el equilibrio en PBST (PBS 1X y Triton X-100 al 0,1 %), los ganglios se bloquearon en PBST con suero de oveja al 10 %, durante 30 min a TA, y después se incubaron con anticuerpo anti-DIG (1:5000) acoplado a fosfatasa alcalina (Roche, Indianápolis, IN) en PBST 1X que contenía suero de oveja al 1 % durante una noche a 4 °C. Las señales de hibridación se visualizaron con cloruro de nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (Roche).

Transferencia Western. Las muestras proteicas se resolvieron en geles de poliacrilamida con SDS al 10% y posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH); las transferencias se exploraron con diversos anticuerpos primarios específicos de genes y anticuerpos secundarios apropiados conjugados con peroxidasa de rábano picante. La inmunorreactividad se detectó utilizando el sistema de quimioluminiscencia Pico-tag (Pierce, Rockford, IL).

Inmunocitoquímica. Los ganglios, los nervios o las células cultivadas, se fijaron en PBS con paraformaldehído al 4 %, a un pH de 7,4. El anticuerpo primario se diluyó en TBS complementado con Triton X-100 al 0,1-0,5 % en TBS y suero de cabra al 5 % y se incubó durante una noche a una temperatura de 4 °C. Después de varios lavados, se aplicó un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 594 o 488 (Molecular Probes, Eugene, OR) durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente, las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia confocal (microscopio confocal LSM510; Zeiss, Oberkochen, Alemania) y se tomaron imágenes.

Cultivo de células. Las SN se aislaron de los ganglios pleurales de animales de 50-80 gm y se sembraron en placas recubiertas con poli-L-lisina que contenían medio L15 y hemolinfa al 50 % (Dagan y Levitan, 1981; Glanzman et al., 1989). Los cultivos se mantuvieron a 18 °C durante hasta 7 d. El medio se cambió cada 2 d. Los fármacos se retiraron con lavado 1 h antes de realizar los ensayos electrofisiológicos.

Electrofisiología. Antes de iniciar cada registro, la hemolinfa se reemplazó con una mezcla 1:1 de agua de mar artificial y medio de cultivo (sin hemolinfa; pH 7,6). Para la estimulación intracelular y el registro se utilizaron técnicas estándar (Ambron et al., 1996). El umbral del pico del pericarion se midió con una serie estándar de pulsos de despolarización de 20 ms. El disparo repetitivo se cuantificó contando el número de picos generado por una serie de pulsos de despolarización de 2 s a 1, 2, 3, 4 y 5 nA, o pulsos de despolarización de 1 s a 2,5 veces la corriente para el umbral de 20 ms. La amplitud del pico se midió desde la línea inicial hasta el pico del potencial de acción y la duración del pico fue la amplitud del potencial de acción a la mitad de su altura máxima.

Marcaje de proteínas con fluorescencia. Las proteínas BSA, apPKG y ERK1 se marcaron utilizando un kit de marcaje de proteínas con Alexa Fluor 546 (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones de fabricante.

Microinyección de SN. Con un extractor programable Sutter se prepararon pipetas de microinyección. La proteína marcada con Alexa Fluor 546 (0,75 pg/pl en Tris-HCl 10 mM, pH 7,3, NaCl 100 mM y colorante verde rápido 0,05 %) se microinyectó en las SN cultivadas aplicando presión de aire positiva en condiciones definidas (libras por pulgada cuadrada y duración) y utilizando un sistema Picospritzer (Sung et al., 2000).

Materiales. La PKG 1a bovina recombinante, la guanosina 3', 5'-monofosforotioato cíclico, el 8-(4-clorofeniltio)-, el isómero de Rp (Rp-8-pCPT-cGMPS), la adenosina 3', 5'-monofosforotioato cíclico, el isómero de Rp (Rp-cAMPS), la 1-H[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona (ODQ), la L-tiocitrulina, el clorhidrato de éster metílico de WG-nitro-L-arginina (L-NAME), el inhibidor 6-22 amida de la proteína quinasa A y el sustrato BPDEtido de PKG, se adquirieron en Calbiochem (La Jolla, CA). Los péptidos A, C y D y la proteína MAPK p42, se obtuvieron en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los siguientes anticuerpos se obtuvieron y utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante: anti-fosfo-VASP (Ser239) de UpstateCell Signaling Solutions (Lake Placid, NY), anticuerpos policlonales contra MAPK fosforilada (AbpTpYmapk) y fosfo-Elkl (Ser383; AbpElkl) de Cell Signaling Technology (Beverly, MA), y anti-pY MAPK ^{(AbpYmapk), anti-pT} MaPK ^{(AbpTmapk) y a-actina de Sigma (St. Louis, MO).}

6.2. Resultados

Las SN de Aplvsia contienen una PKG neuronal de tipo I

Para investigar el papel de la ruta de PKG en la inducción de LTH, se clonó una PKG de Aplysia (número de registro de GenBank AY363240). El ADNc de apPKG contiene una fase de lectura abierta que codifica una supuesta proteína de 733 aa. De acuerdo con todas las PKG conocidas, la quinasa de Aplysia contiene dos dominios de unión a nucleótidos cíclicos en tándem y un dominio catalítico C terminal (Fig. 1A, parte superior). La proteína prevista codificada por la secuencia de apPKG es muy similar a las proteínas quinasas dependientes de cGMP conocidas con más de 50 % de identidad de aminoácidos con las PKG de Drosophila y con las isoformas de PKG de tipo I y II de ^{mamífero (Fig. 1A, parte inferior). Sin embargo, parece estar más estrechamente relacionada con la} dG1 ^de Drosophila (Fig. 1B).

Para determinar el patrón de expresión de apPKG, se exploró una transferencia Northern de ARN total de varios tejidos de animales adultos con un fragmento de 283 pb marcado con 32P correspondiente a las bases 209-492 del ADNc. La sonda detectó un solo transcrito de 3,0 kb que se expresó en los ganglios, pero no en los músculos ni en los órganos genitales (Fig. 1C). Una sonda marcada con 32P para el ARN ribosómico 5S detectó un transcrito de 0,19 kb en todos los tejidos (Fig. 1C).

Para localizar la fuente del mensaje, la sonda de apPKG se utilizó para generar ribosondas en sentido y antisentido para la hibridación in situ. La sonda antisentido detectó altos niveles de expresión de ARNm de apPKG en el grupo SN y en la mayoría de las neuronas en los ganglios pedales y pleurales (Fig. 1D, panel de la izquierda). La sonda en sentido produjo un marcaje insignificante (Fig. 1D, panel de la derecha).

Las propiedades catalíticas de apPKG se investigaron después expresando primero el ADNc de apPKG en un sistema de baculovirus/Sf9. Cuando las células se cultivaron en presencia de suero se produjo una apPKG recombinante inactivada etiquetada con His y cuando las células se privaron de suero se produjo una apPKG constitutivamente activa. Ambas formas de apPKG recombinante se purificaron mediante cromatografía de afinidad.

La apPKG inactiva se activó con 8-Br-cGMP 100 nM y BPDEtido rápidamente fosforilado, un sustrato peptídico para todas las PKG de tipo I (Glass y Krebs, 1982) (Fig. 2A). La comparación de la apPKG activa con la PKG soluble bovina de tipo 1a recombinante, mostró que ambas quinasas fosforilaron fácilmente diversos sustratos peptídicos de PKG (Fig. 2B). Significativamente, ninguna quinasa fosforiló el péptido C, que es el sustrato preferido de la PKG de tipo II unida a membrana (Hall et al., 1999) (Fig. 2B). También se examinó la proteína VASP, cuya serina en la posición 239 se reconoce específicamente por las PKG solubles de tipo I (Smolenski et al., 1998) y se encontró que las quinasas tanto de bovino como de Aplysia fosforilaron este sitio (Fig. 2C). Estos estudios determinan que la apPKG es un miembro de la familia de PKG solubles de tipo I.

La apPKG se localiza en axones donde se activa por una lesión nerviosa y se transporta de manera retrógrada al cuerpo celular de las SN

Los nervios periféricos p5-p9 de Aplysia inervan la región media de la pared corporal y la cola y contienen axones de las SN (Walters et al., 1983a,b; BilIy yWalters, 1989). Para determinar si la apPKG está en los axones, se generó un anticuerpo policlonal de conejo, AbapPKG, contra un péptido ubicado en el extremo N (aminoácidos 18-128) de la proteína. El anticuerpo AbapPKG se purificó por afinidad y se utilizó para explorar transferencias Western. El AbapPKG reconoció polipéptidos de 80 y 100 kDa en los extractos de ganglios pedales y pleurales, pero no en tejido muscular o genital así como la proteína recombinante de 80 kDa purificada por afinidad (Fig. 3A). Se cree que la banda de 100 kDa es la forma dominante de apPKG, porque es más abundante y tiene una mayor afinidad por el cGMP que el componente de 80 kDa. Ambas bandas también fueron reconocidas por un anticuerpo comercial que se generó contra la PKG de tipo Ia humana (restos de aminoácidos 657-671: 50 % de identidad con la apPKG). La apPKG contiene secuencias consenso de varias quinasas y otras enzimas y el componente de 100 kDa podría contener una o más modificaciones postraduccionales.

Para determinar si la apPKG estaba presente en los axones, el axoplasma se extruyó de los nervios p5-p9. La figura ^{3A muestra que ambos polipéptidos estaban presentes. Las} Sn ^{tienen axones en los nervios p5-p9, y la} inmunocitoquímica con AbapPKG tiñó esencialmente todas las SN en el grupo (Fig. 3B). Para determinar los efectos de la lesión nerviosa en la apPKG axonal, los nervios p5-p9 de un lado se aplastaron, con lo que se axotomizaron los axones en cada nervio. En varios momentos después, se evaluó la actividad de apPKG en los ganglios pedal y pleural ipsilateral (mismo lado) y contralateral (lado opuesto), que incluía el grupo de cuerpos celulares de la SN. Como se muestra en la Figura 4A, antes de que apareciese una actividad significativa de apPKG en el ganglio pleural ipsilateral, hubo un retraso de aproximadamente 16 h después del aplastamiento del nervio. Después, la actividad aumentó durante al menos 24 h, pero no fue significativamente diferente a la de la línea basal a las 48 h. Se detectó poca o ninguna actividad de apPKG en el ganglio pleural de control contralateral (Fig. 4A). Significativamente, la actividad de apPKG en los cuerpos celulares de las neuronas del ganglio pedal ipsilateral se mantuvo en el nivel basal durante las 48 h posteriores a la axotomía (Fig. 4A), lo que indica que la activación de apPKG es selectiva para las neuronas en el ganglio pleural.

El largo retraso antes de que apareciera actividad de apPKG en los cuerpos celulares es coherente con la idea que la quinasa es una señal de lesión positiva. Además, la apPKG contiene una secuencia de localización nuclear (NLS, del inglés nuclearlocalization sequence) que puede proporcionar acceso al sistema de transporte retrógrado (Ambron y Walters, 1996; Schmied y Ambron, 1997; Hanz et al., 2003). Para investigar esta posibilidad se utilizó un protocolo estándar de ligamiento - aplastamiento (Ambron et al., 1995; Johanson et al., 1995) (Fig. 4B). Los nervios p5-p9 se aplastaron unilateralmente y se colocó una ligadura en cada nervio proximal al sitio de aplastamiento. Las proteínas que se transportaron lejos del sitio de aplastamiento (hacia los cuerpos celulares) se acumulan en el axoplasma detrás de la ligadura donde se pueden recoger. Veinticuatro h después, se eliminaron los segmentos nerviosos de 0,5 cm de la siguiente manera; (1) proximal al sitio de aplastamiento (Ap), (2) distal a la ligadura en los nervios aplastados (el sitio de Ap/Lig), y (3) distal a la ligadura en el lado de control (el sitio de Lig) (Fig. 4B, parte superior). Después, el axoplasma se extruyó de cada segmento, así como de los segmentos de los nervios p5-p9 de un animal que no recibió una lesión nerviosa. Cuando se examinaron las mismas cantidades de cada axoplasma para determinar la actividad de la apPKG, hubo un aumento de 10 veces en la actividad de apPKG en el axoplasma del segmento Ap/Lig en relación con la actividad basal en el axoplasma de animales sin lesión (Fig. 4B, parte inferior). Por el contrario, la actividad de apPKG en el segmento Ap fue solo tres veces mayor que la actividad basal, y la del segmento Lig en el nivel basal.

La acumulación de la actividad de apPKG en el sitio de Ap/Lig se confirmó mediante estudios inmunocitoquímicos en los que se utilizó AbapPKG para examinar la distribución de la proteína ap-PKG en nervios no lesionados y lesionados. La tinción de apPKG se distribuyó uniformemente a lo largo de los axones en nervios sin tratamiento previo (Fig. 4C, panel 1). Sin embargo, después del aplastamiento de los nervios, hubo una disminución en la tinción en el sitio de Ap (Fig. 4C, panel 3) y hubo un aumento significativo en las terminaciones de los axones en el sitio de Ap/Lig (panel 4). No hubo aumento en la tinción en el sitio de Lig (Fig. 4C, panel 2). La acumulación tanto de la proteína apPKG como de la actividad en el sitio de Ap/Lig en relación con los sitios de Ap y Lig confirma contundentemente que la apPKG es una señal de lesión positiva (Ambron et al., 1995).

La ruta de la óxido nítrico-cGMP-PKG regula la inducción de LTH en las SN in vitro

Cuando las SN de Aplysia se axotomizan por extracción del ganglio y se disponen individualmente en cultivo, regeneran sus axones y exhiben una disminución en el umbral del pico y un aumento en el disparo repetitivo, que son dos características de la LTH (Ambron et al., 1996; Bedi et al., 1998; Sung y Ambron, 2004). Para examinar la aparición de esta LTH con mayor detalle, las propiedades eléctricas de las SN in vitro se registraron desde el segundo hasta el séptimo día y se compararon con los registros eléctricos de las SN dentro del grupo in situ. Aproximadamente el 10 % de las células analizadas in vitro no tenía un potencial de reposo suficiente o era reacio al disparo y no se incluyó en el estudio. La misma disminución se detectó en el umbral y el aumento en el disparo repetitivo como se informó anteriormente, y también se encontró que las SN axotomizadas exhibían una amplitud significativa de picos y un aumento en la amplitud del pico en relación con los controles (Fig. 5). Los cambios fueron significativos en el segundo día y persistieron hasta al menos el séptimo día. El hecho de que estos mismos cuatro cambios en las propiedades eléctricas se produzcan en las SN de los GRD de ratas hiperexcitables después de la axotomía (Abdulla y Smith, 2001), confirma el uso de las SN de Aplysia disociadas como un sistema modelo para estudios de alteraciones sensoriales que pueden contribuir al dolor neuropático.

Para investigar si la aparición de la LTH requiere actividad de apPKG, se eliminaron las SN del ganglio en presencia del inhibidor de la guanilil ciclasa soluble (sGC), ODQ, el inhibidor de la PKG, Rp-8-pCPT-cGMPS, o el inhibidor de la PKA, Rp-cAMPS. Este último se utilizó porque la PKA tiene propiedades en común con la PKG (Scott, 1991; Francis y Corbin, 1994) y se ha implicado en varias formas de plasticidad sináptica en las SN de Aplysia (Ghirardi et al., 1992; Byrne y Kandel, 1996; Bedi et al., 1998; Muller y Carew, 1998; Chain et al., 1999; Liao et al., 1999; Sutton y Carew, 2000; Antonov et al., 2003). Las células se dejaron regenerar posteriormente en presencia de los inhibidores in vitro, y al tercer día, sus propiedades electrofisiológicas se compararon con las de las SN que se extrajeron de los mismos ganglios al mismo tiempo, pero que no se habían expuesto a un fármaco. Se encontró que tanto Rp-8-pCPT-cGMPS como ODQ impidieron el aumento del disparo repetitivo (Fig. 6A) y la disminución en el umbral del pico (B). Por contra, el inhibidor de PKA no tuvo ningún efecto significativo en ninguno de los parámetros. Ni Rp-8-pCPT-cGMPS ni ODQ inhibieron la aparición de excitabilidad cuando se añadieron a SN cultivadas durante 2 d, lo que confirma los datos indicados en la Figura 4A que muestra que la activación de apPKG es transitoria. En estos experimentos no se evaluó ni la ampliación ni la amplitud de los picos.

Ninguno de estos tratamientos, que utilizaron concentraciones de los fármacos similares o incluso inferiores a las indicadas para las neuronas de mamíferos (Monfort et al., 2002) y Aplysia (Lewin y Walters, 1999), afectaron al potencia de membrana en reposo. Significativamente, tampoco alteraron el grado o el patrón de crecimiento de las neuritas. En cambio, la exposición de las SN a U0126, un inhibidor selectivo de MEK, produjo graves defectos de crecimiento.

La inhibición de la LTH por los inhibidores de sGC y PKG indicó que la síntesis de cGMP y la activación de PKG se producen dentro de las neuronas sensoriales. Se sabe que la NO eleva la producción cGMP a través de sGC (Schlossmann et al., 2003), y que la enzima NOS produce la NO (Bredt y Snyder, 1990; Moroz et al., 1996). Para investigar la probabilidad de que se requiera la activación de NOS para la LTH, se utilizó RT-PCR para detectar los niveles celulares de ARNm de apn-NOS en SN individuales inmediatamente después de su eliminación del ganglio (0 h) o después de 16 h in vitro. Como se muestra en la Figura 6C (panel superior), cuatro de las cinco células expresaron cantidades significativas de ARNm de apn-NOS después de 16 h in vitro, mientras que no se detectó ninguna cantidad en las células de 0 h. En cambio, el ARNm de la sensorina A, neuropéptido específico de SN (Brunet et al., 1991) y de la isoforma de actina específica de neuronas (Desflroseillers et al., 1994), fue abundante en cada célula (Fig. 6C, segundo y tercer paneles, respectivamente).

La L-tiocitrulina es un inhibidor eficaz de apNOS, y se encontró que, como se indicó anteriormente, la exposición de las SN a este fármaco in vitro reducía notablemente la actividad máxima en relación con los controles no tratados (Fig. 6D). Otro inhibidor de NOS, L-NAME también redujo la LTH en las mismas condiciones, pero no fue tan eficaz como la L-tiocitrulina (Fig. 6D). Estos datos indican que la ruta NO-cGMP-PKG es necesaria para inducir la LTH en las SN.

La apMAPK somática se fosforila en su sitio de activación mediante la apPKG

La inducción de LTH en las neuronas sensoriales de Aplysia después de una lesión periférica, requiere la transcripción génica (Lewin y Walters, 1999) y podría efectuarse directamente por la apPKG si la quinasa se transloca al núcleo después de entrar en el cuerpo celular. La inmunotinción reveló un nivel constitutivo bajo de apPGK en algunos núcleos de las SN, pero no hubo aumento después de la axotomía (Fig. 3B). Esto sugirió que la apPKG contribuye a la inducción de LTH activando un factor que se importa al núcleo. Un miembro de ERK de la familia MAPK es un buen candidato para este factor, porque la LTH se puede inducir inyectando ERK1 recombinante en cuerpos celulares de SN (Sung et al., 2001). Para evaluar si después de una lesión se activa la ERK, se aplastaron los nervios p5-p9 in vivo y se utilizó para producir transferencias Western de neuronas lesionadas y de control de los ganglios pleurales, que se exploraron con un anticuerpo (AbpTpYmapk) que reconoce las ERK que se habían activado por fosforilación dual en el sitio de T-E-Y. El anticuerpo reconoció un solo polipéptido de 43 kDa que tenía poca actividad en las neuronas de los ganglios pleurales 4 u 8 h después de la lesión (Fig. 7A, panel superior). Sin embargo, a las 16 h, había más quinasa activa en el lado del aplastamiento en relación con el control contralateral, y el nivel continuó aumentando durante al menos 48 h (Fig. 7A, panel superior).

Las neuronas de Aplysia contienen un homólogo de ERK2, apMAPK (Michael et al., 1998), que entra en el núcleo después de una lesión in vitro (Martin et al., 1997). La apMAPK tiene el mismo dominio catalítico y el sitio de activación de los aminoácidos T-E-Y de las ERK 1 y 2. Para determinar si la apMAPK era la quinasa activada después de una lesión, se exploró la misma transferencia con un anticuerpo, D8, que reconoce específicamente a la apMAPK (Martin et al., 1997) y se encontró que el anticuerpo reconocía la quinasa activada por lesión de 43 kDa (Fig. 7A, panel inferior). El anticuerpo detecta la apMAPK tanto activa como inactiva, y hubo poca diferencia en la cantidad de proteína apMAPK total entre las muestras. El hallazgo de que la actividad de apMAPK comenzó a aumentar justo después de la llegada de la apPKG activa en el cuerpo celular (compárense las Figs. 4A, 7A) sugirió una relación entre la apPKG y la apMAPK. Esta idea se analizó preparando un lisado de neuronas del ganglio pleural y utilizando AbpTpYmapk para controlar muestras para detectar la apMAPK activa. Se detectó poca fosfo-apMAPK endógena en el lisado (Fig. 7B, carril 1), pero la adición de apPKG activa u 8-Br-cGMP mejoró notablemente el nivel de ap-MAPK activa (carriles 2, 3) que fue reconocida por el anticuerpo D8. Sorprendentemente, la activación no fue bloqueada por U0126, un potente inhibidor de la quinasa MEK aguas arriba (Fig. 7B, carril 4). Curiosamente, la adición de apPKG activa aa axoplasma no activó la apMAPK (Fig. 7B, carriles 5, 6) (véase Análisis). Otro estudio con el lisado mostró que la ap-MAPK activada por apPKG fosforilaba a su sustrato fisiológico, Elk1, en la Ser383 apropiada (Fig. 7C, carril 3).

La activación de apMAPK en presencia de U0126 sugirió que la apPKG activa a la apMAPK directamente y por lo tanto la apPKG activa se incubó con ERK2 de mamífero recombinante. ERK2 fue un sustituto de apMAPK. Sin embargo, ambas quinasas contienen el sitio de aminoácidos T-E-Y diana. Al igual que en lisado, apPKG activó ERK2 para fosforilar Elk1 (Fig. 7C, carril 6). Cuando se repitió el experimento, la ^e RK2 activada fue reconocida por AbpTpYMAPK, lo que indica que estaba doblemente fosforilada (Fig. 7D, parte superior, carril 2). La activación fue específica, porque se redujo en presencia de BPDEtido (Fig. 7D, parte superior, carril 3). ERK2 se activa al máximo cuando los aminoácidos T e Y están fosforilados, aunque las PKG son serina/treonina quinasas. Por tanto, es relevante, que la ERK2 bacteriana recombinante tiene un nivel de actividad bajo que es atribuible a la presencia de un fosfato en la fracción Y (Cha y Shapiro, 2001). De hecho, el anticuerpo contra ERKpY185 reconoció el sustrato ERK2 recombinante en una transferencia Western (Fig. 7D, central). No hubo aumento en la fosforilación de Y cuando ERK2 se incubó con apPKG (Fig. 7D, central, carril 2). Sin embargo, cuando se exploró una transferencia por duplicado con un anticuerpo contra ERKpT183, hubo un aumento en la fosforilación de la T en presencia de apPKG (Fig. 7D, parte inferior, carril 2). Este anticuerpo reacciona específicamente con la treonina monofosforilada y las ERK doblemente fosforiladas. Este resultado indica que la ap-PKG puede activar completamente a ERK2 mediante la fosforilación de ERK2 que ya contiene un fosfato en Y-185.

A continuación se examinó si la incubación de apPKG y ERK2 recombinante producía una ERK2 activa con actividad enzimática comparable a la producida por MEK1, que produce la quinasa activada al máximo. La actividad de ERK2 se midió mediante la fosforilación de Elk1 en Ser383, y MEK1 se activó mediante la subunidad catalítica de MEKK1 (Xu et al., 1995). Como se esperaba, apPKG produjo una ERK2 con actividad similar a la producida por MEK1 (Fig. 7E). Este resultado indica que, además de MEK1, PKG es un activador de ERK2.

Debido a que PKG fosforila T183 en ERK2 que ya tiene un fosfato en Y185 (Fig. 7D), una pregunta esencial es si la apMAPK monosforilada en Y está disponible para la fosforilación por apPKG después de la axotomía. Esta pregunta se respondió aplastando primero p5-p9 in vivo. Después, las muestras se transfirieron y se exploraron con un anticuerpo contra ERKpY185. De hecho, la apMAPKpY estuvo presente en las neuronas de los ganglios pleurales 8 h después de la lesión, y su expresión aumentó en el lado del aplastamiento en relación con el control contralateral a las 16 h (Fig. 7F, panel superior). La apMAPKpY no se detectó en dos animales analizados que no había recibido tratamiento previo (Fig. 7F, panel superior). La exploración de la transferencia con un anticuerpo que detecta la apMAPK tanto activa como inactiva, mostró que había poca diferencia en la cantidad de proteína apMAPK total entre las muestras (Fig. 7F, panel inferior). Por lo tanto, la presencia de apMAPKpY en el pericarion 16 h después de la lesión, junto con la llegada de apPKG desde el sitio de aplastamiento (Fig. 4A), debería dar como resultado la activación completa de la apMAPK.

El nivel de apMAPK en el núcleo de SN in vitro se reduce cuando se inhibe la actividad de apPKG

La evidencia anterior indica que la apPKG no entra el núcleo de las SN en respuesta al aplastamiento de nervios in vivo (Fig. 3B). Sin embargo, las PKG de tipo I tienen una NLS (secuencia de localización nuclear) supuesta (Gudi et al., 1997) y la apPKG tiene un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente (453KCLKKKHI) en el dominio de unión a a Tp que podría funcionar como una NLS. La importación de proteínas en el núcleo de las neuronas de Aplysia se evaluó fácilmente inyectando directamente afines marcados con fluorescencia en el cuerpo celular (Ambron et al., 1992; Schmied et al., 1993; Gunstream et al., 1995). Por lo tanto, se inyectó apPKG recombinante marcada con Alexa en el pericarion de las SN después de 2 d in vitro, se cortaron las neuritas para iniciar una respuesta de lesión, y, 30 min después, se examinaron las células mediante microscopía de fluorescencia. Toda la proteína marcada permaneció en el citoplasma (Fig. 8A). Como era de esperar, el BSA marcado con Alexa también permaneció en el citoplasma después de la inyección (Ambron et al., 1992; Schmied et al., 1993; Gunstream et al., 1995). En cambio, la ERK1 de vertebrado recombinante activa marcada con Alexa inyectada, que se importa al núcleo en una variedad de tipos de células (Karin, 1994), entró rápidamente en el núcleo donde se distribuyó en parches distintos (Fig. 8A).

Se han observado parches similares después de la importación de otras proteínas en los núcleos de Aplysia (Ambron et al., 1992; Schmied et al., 1993; Gunstream et al., 1995).

La incapacidad de la apPKG para entrar en el núcleo de las SN de Aplysia es coherente con la idea de que contribuye a la inducción de LTH al promover la importación nuclear de apMAPK. Si es así, la inhibición de la ruta apPKG debería bloquear la entrada de apMAPK inducida por la axotomía en el núcleo. Por lo tanto, las SN se expusieron in vitro, ya sea al bloqueador de PKG, Rp-8-pCPTcGMPS, o al bloqueador PKA, Rp-cAMPS, en las condiciones que inducen la LTH (Fig. 6A). En el tercer día, las células se fijaron, se permeabilizaron y se expusieron al anticuerpo D8 para visualizar LA ap-MPAK. La microscopía confocal mostró que las células no tratadas y las expuestas a Rp-cAMPS tenían los mismos niveles de tinción nuclear (Fig. 8B). En cambio, hubo una reducción drástica en la tinción nuclear en las células tratadas con Rp-8-pCPTcGMPS (Fig. 8B). Por lo tanto, tanto la inducción de LTH como la presencia de ap-MAPK en el núcleo dependen de la actividad de apPKG.

6.3. Análisis

El dolor neuropático persistente en seres humanos después de una lesión nerviosa es física y psicológicamente debilitante. Debido a que un componente importante de este dolor es a menudo la LTH que aparece en las neuronas aferentes primarias, es importante comprender cómo la axotomía induce la LTH. Una LTH con propiedades similares aparece en las SN nociceptivas de Aplysia después de la axotomía, y se aprovecharon las ventajas experimentales de estas neuronas para definir una ruta de señalización responsable de la inducción de LTH. Una gran sorpresa fue que esta ruta involucra la fosforilación de apMAPK por PKG. Esta es una alternativa a la cascada de MAP quinasa tradicional y sugiere que, después de producirse una lesión nerviosa, la PKG y la MAPK tienen papeles exclusivos.

La apPKG es una señal de lesión positiva en las SN

Se clonó una PKG de tipo I de Aplysia cuyo ARNm se encuentra en las SN y en otras neuronas en el ganglio pleural (Fig. 1D). Cuando los nervios periféricos se aplastaron in vivo, la actividad de apPKG apareció en los cuerpos celulares de las neuronas de los ganglios pleurales, pero solo después de un retraso de aproximadamente 16 h (Fig. 4A). Un retraso similar en la respuesta a la lesión nerviosa se ha atribuido a señales de lesión positivas (Schmied et al., 1993; Sung et al., 2001; Lin et al., 2003). Las transferencias Western exploradas con AbapPKG mostraron que la apPKG está presente en el axoplasma extruido de los nervios periféricos (Fig. 3A). Además, como las proteínas se transportan de forma retrógrada a lo largo de los axones de Aplysia a una velocidad de 1,5 mm/h (Ambron et al., 1992; Schmied et al., 1993; Gunstream et al., 1995), el retraso es coherente con el transporte de la apPKG desde el sitio del aplastamiento, que se localizó a 2 cm del ganglio. Cuando se colocó una ligadura proximal al sitio del aplastamiento, se descubrió que la apPKG activada y la proteína apPKG total se acumulaban en el lado distal de la ligadura, en relación con el sitio del aplastamiento (Fig. 4B, C). Estos hallazgos determinan que la apPKG es una señal de lesión positiva.

El mecanismo responsable del transporte inducido por lesión no se conoce. Aunque la apPKG contiene varios sitios posibles de miristoilación que podrían unirse a las vesículas después de la lesión, se encontró que la apPKG era soluble después del fraccionamiento subcelular. Hanz et al. (2003) han demostrado que las proteínas que contienen una NLS se transportan de forma retrógrada a través de dineína e importinas en el nervio ciático de rata, y que la apPKG se puede transportar utilizando un mecanismo similar.

La aparición de la LTH en las SN de Aplysia axotomizadas in vitro depende de NOS, sGC, apPKG y apMAPK

La LTH que aparece en las SN (Fig. 5) y en las SN nociceptivas de mamíferos después de una lesión nerviosa (Abdulla y Smith, 2001) tiene propiedades electrofisiológicas similares. Si esta congruencia refleja mecanismos conservados, entonces la LTH podría ser inducida por rutas comunes en ambos tipos de células. Las SN se examinaron in vitro y se encontró que la reducción inducida por axotomía en el umbral del pico y el aumento en la hiperexcitabilidad fueron bloqueados por Rp-8-pCPT-cGMPS, ODQ y L-tiocitrulina, inhibidores de apPKG, sOC y NOS, respectivamente (Fig. 6A,B,D). Además, Rp-8-pCPT-cGMPS también causó una reducción de casi el triple en el nivel de apMAPK en el núcleo de las NS (Fig. 8B). Estos hallazgos apuntaron a una relación directa entre la activación de NOS y apPKG, la entrada de apMAPK en el núcleo y la inducción de LTH. El hallazgo de que la expresión de ARNm de NOS en las SN aumentó después de la lesión (Fig. 6C), implica que el nivel de la proteína NOS podría ser la etapa limitante de velocidad en la ruta. La expresión de ARNm de NOS neuronal (nNOS) y de proteína también aumenta en las neuronas de los GRD (ganglios de la raíz dorsal) después de cortar sus axones periféricos (Verge et al., 1992; Fiallos-Estrada et al., 1993; Zhang et al., 1993).

El cAMP y la PKA también se han implicado en la inducción y el mantenimiento de LTH (Scholz y Byrne, 1988; Goldsmith y Abrams, 1992; Bedi et al., 1998), y en este caso esto fue una preocupación porque la PKA y la PKG tienen propiedades en común. Sin embargo, se encontró que la exposición de las SN a Rp-cAMPS, un inhibidor de PKA permeable a la membrana, no impidió la inducción de LTH ni bloqueó la entrada de apMAPK en el núcleo. Esto confirma hallazgos anteriores de que los inhibidores de la PKA no pudieron bloquear la LTH inducida por estimulación nociva (Lewin y Walters, 1999).

La activación de apPKG y de ap-MAPK a través de una lesión fue interesante, porque sugería un posible vínculo entre estas dos quinasas (Zaragoza et al., 2002). De hecho, cuando se añadió apPKG activa a un lisado neuronal, no solo activó a la ap-MAPK (Fig. 7B), sino que lo hizo a través de una ruta que no requería MEK, el activador aguas arriba ubicuo de las ERK. Esta respuesta fue fisiológicamente relevante, porque la apMAPK activada fosforiló su sustrato nuclear Elk1 en la Ser383 (Fig. 7C), que es esencial para la actividad transcripcional (Marais et al., 1993; Whitmarsh et al., 1995). Cuando la apPKG activa se incubó con ERK2 recombinante de vertebrado, que tiene el mismo sitio de activación T-E-Y que la apMAPK, se estableció una interacción directa entre las quinasas. Se encontró que la ERK2 estaba activada (Fig. 7C) y doblemente fosforilada (D, parte superior). El último hallazgo indicó que la ERK2 estaba completamente activa, y se confirmó con otro estudio en el que las mismas cantidades de ap-PKG o de MEK1 activaron a la ERK2 a niveles comparables (Fig. 7E).

Los indicios de que la apPKG produje una ERK2 activada al máximo, crean una paradoja, porque las PKG son serinatreonina quinasas que no pueden fosforilar la tirosina. Sin embargo, dado que la ERK2 recombinante ya contiene fosfotirosina-185 (Fig. 7D, en el centro), la fosforilación de la treonina-183 por la apPKG (Fig. 7D, parte inferior) debe producir una ERK2 completamente activada. La fosforilación de apMAPKpY por apPKG es llamativa, porque la ERK2pY185 se había detectado en células de vertebrados (Yao et al., 2000; Cha y Shapiro, 2001; Zhou y Zhang, 2002), y la confirmación indica que la expresión de apMAPKpY aumenta en las neuronas de Aplysia después de una lesión nerviosa (Fig. 7F). La apMAPKpY podría producirse por una fosfatasa que elimina el fosfato de la apMAPK doblemente fosforilada, o por una tirosina quinasa activada por lesión que fosforila la tirosina en el sitio de aminoácidos T-E-Y. La posibilidad de que la inducción de LTH requiera la convergencia de apPKG y de una tirosina quinasa en apMAPK conferiría más control sobre esta ruta. Esto es razonable dado que la lTh altera radicalmente la función de las neuronas lesionadas y conduce a cambios significativos en el comportamiento del animal.

La apMAPK también está presente en el axoplasma, pero no se activa por una lesión nerviosa (Sung et al., 2001; Lin et al., 2003), lo cual es paradójico, dado que la lesión activa a la apPKG axoplasmática. Una explicación sería que las dos quinasas están ubicadas en diferentes axones. Sin embargo, cuando se añadió apPKG activa al axoplasma extruido de los nervios periférico, la apMAPK no se activó en las mismas condiciones que causaron su activación en el pericarion (Fig. 7B). Evidentemente, hay un mecanismo en el axón que protege a la apMAPK de la apPKG. Sin embargo, estas observaciones significan que, después de su activación en el axón por una lesión, la apPKG debe transportarse de nuevo al pericarion para influir en los acontecimientos nucleares a través de apMAPK.

Con respecto a la ruta molecular descrita en el presente documento, queda la posibilidad de que la lesión del nervio pueda causar la translocación de apMAPK o la activación de PKG somática por otras rutas también. Una ruta de señalización NO-cGMP-PKG-MAPK también podría ser importante para la LTH inducida por la inflamación que se desarrolla alrededor de un sitio de lesión nerviosa, tanto en mamíferos (Millan, 1999; Zimmermann, 2001) como en Aplysia (Clatworthy et al., 1995; Clatworthy y Grose, 1999; Farr et al., 1999, 2001). ¿Cómo podría la apMAPK nuclear regular la LTH?, la apMAPK puede fosforilar a CREB2 (proteína 2 de unión a elementos de respuesta a cAMP), un represor del sitio de elementos de respuesta a cAMP (c Re , cAMP response element) Bartsch et al., 1995; Michael et al., 1998), C/EBP (CCAAT/proteína de unión al potenciador), un factor de transcripción que se une al sitio de elementos de respuesta a estrógenos (ERE, estrogen response element) (Alberini et al., 1994) y Elk1, un factor de transcripción que regula el sitio de elementos de respuesta al suero (SER, serum response element) (Lin et al., 2003). La unión a los tres sitios aumenta después de una lesión nerviosa, pero con evoluciones temporales diferentes.. Por lo tanto, la unión de C/EBP y CREB a ERE y CRE, respectivamente, es rápida, pero con una vida relativamente corta (Dash et al., 1998; Sung et al., 2001), mientras que la unión de Elk1 a SER es bifásica, con una fase temprana que dura algunas pocas horas y una segunda fase que persiste durante semanas (Lin et al., 2003). CREB se fosforila en las neuronas de GRD en respuesta a una actividad intensa (Ji y Woolf, 2001), y el sitio CRE es necesario para la respuesta de la LTH frente a estímulos nocivos en las SN de Aplysia (Lewin y Walters, 1999). Estas consideraciones apuntan a CREB2 y C/EBP como dianas de apMAPK durante la inducción inicial de la LTH en las SN. La persistencia de la LTH durante semanas puede estar mediada por la fosforilación de Elk1 mediante apMAPK. Esta ruta es selectiva, porque la inhibición de NOS, sGC o PKG, impidió la aparición de LTH en las SN disociados, pero no bloqueó el crecimiento. Si el vínculo entre esta ruta y la LTH representa una relación fundamental y ampliamente conservada, entonces las intervenciones terapéuticas que se dirigen a esta ruta pueden utilizarse para mitigar el dolor persistente después de una lesión nerviosa sin bloquear la regeneración del axón.

7. Ejemplo: Bloqueo de la actividad de PKG en la rata

La FIG. 9 muestra que la activación de PKG puede bloquearse en el sitio de la lesión utilizando un inhibidor de PKG, Rp-8-pCPT-cGMPS (“RP-G”). El experimento se llevó a cabo de la siguiente manera. Utilizando un protocolo estándar, se anestesió a una rata, y el nervio ciático se expuso y se lesionó en ausencia o en presencia de RP-G, o de un inhibidor de PKA, Rp-8-pCPT-cAMPS (“RP-A”). Cuatro horas más tarde, el nervio se seccionó como se muestra en el esquema del gráfico anterior en la FIG. 9, y cada segmento se analizó para determinar la actividad de PKG. En ausencia de inhibidor (barras negras), la PKG activa se había transportado hacia los cuerpos celulares y se enriqueció en P3. RP-A (barras grises) no cambio este patrón. En cambio, RP-G (barras blancas) anuló la actividad.

Esta solicitud proporciona, entre otras cosas, las siguientes cláusulas:

1. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que disminuye la actividad de la proteína quinasa G.

2. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un inhibidor peptídico de la actividad de la proteína quinasa G.

3. El método de la cláusula 2, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKK.

4. El método de la cláusula 2, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKKK.

5. El método de la cláusula 2, 3 o 4, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido portador.

6. El método de la cláusula 5, en el que el péptido portador se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRRPP, RKKRRQRRR y RQIKIWFQNRRMKWKK.

7. El método de la cláusula 2, 3 o 4, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido transportador.

8. El método de la cláusula 7, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK.

9. El método de la cláusula 5, en el que el péptido inhibidor comprende un péptido transportador.

10. El método de la cláusula 9, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK.

11. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

Cuando Y es:

A es:

y

Cuando Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF³SO²NH-, CH³SO²NH-) y tetrazol.

12. El método de la cláusula 11, en el que el agente es balanol.

13. El método de la cláusula 11, en el que el agente es una variante de balanol.

14. El método de la cláusula 13, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido transportador, una variante de balanol unida a un péptido transportador, balanol unido a un péptido portador, una variante de balanol unida a un péptido portador, balanol unido a un péptido transportador y un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido transportador y un péptido portador.

15. El método de la cláusula 1, en el que el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS.

16. El método de cláusula 1, en el que el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS unido a un péptido transportador.

17. El método de cláusula 1, en el que el agente es una molécula de ácido nucleico antisentido o ARNi que inhibe la expresión de la proteína quinasa G.

18. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la óxido nítrico sintasa neuronal seleccionado del grupo que consiste en clorhidrato de éster metílico de WG-nitro-L-arginina, L-tiocitrulina y un ácido nucleico antisentido o ARNi que inhibe la expresión de nNOS.

19. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que disminuye la óxido nítrico celular.

20. El método de la claúsula 19, en el que el agente es quercetina.

21. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la guanilil ciclasa seleccionado del grupo que consiste en 1-H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona y una molécula de ácido nucleido antisentido o ARNi que inhibe la expresión de la guanilil ciclasa.

22. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que disminuye el guanosín monofosfato cíclico celular.

23. El método de la cláusula 22, en el que el agente es una fosfodiesterasa.

24. El método de la cláusula 23, en el que la fosfodiesterasa es PDE5.

25. El método de la cláusula 22, que es un agente que aumenta la actividad fosfodiesterasa.

26. El método de la cláusula 25, en el que el agente es Ant-cGMP-2’-0-antraniloil cGMP.

27. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico, que comprende administrar, a una neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la translocación de la proteína quinasa erk activada por mitógeno en el núcleo.

28. El método de la cláusula 27, en el que el agente es un bloqueador del canal de calcio.

29. El método de la cláusula 28, en el que el agente es felodopina.

30. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que disminuye la actividad de la proteína quinasa G.

31. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un inhibidor peptídico de la actividad de la proteína quinasa G.

32. El método de la cláusula 31, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKK. 33. El método de la cláusula 32, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKKK.

34. El método de la cláusula 31,32 o 33, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido portador.

35. El método de la cláusula 34, en el que el péptido portador se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRRPP, RKKRRQRRR y RQIKIWFQNRRMKWKK.

36. El método de la cláusula 31,32 o 33, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido transportador.

37. El método de la cláusula 36, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK. 38. El método de la cláusula 34, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido transportador. 39. el método de la cláusula 38, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK. 40. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

Cuando Y es:

A es:

y

Cuando Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF³SO²NH-, CH³SO²NH-) y tetrazol.

41. El método de la cláusula 40, en el que el agente es balanol.

42. El método de la cláusula 40, en el que el agente es una variante de balanol.

43. El método de la cláusula 42, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido transportador, una variante de balanol unida a un péptido transportador, balanol unido a un péptido portador, una variante de balanol unida a un péptido portador, balanol unido a un péptido transportador y un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido transportador y un péptido portador.

44. El método de la cláusula 30, en el que el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS.

45. El método de cláusula 30, en el que el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS unido a un péptido transportador.

46. El método de cláusula 30, en el que el agente es una molécula de ácido nucleico antisentido o ARNi que inhibe la expresión de la proteína quinasa G.

47. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la óxido nítrico sintasa neuronal seleccionado del grupo que consiste en clorhidrato de éster metílico de WG-nitro-L-arginina, L-tiocitrulina y un ácido nucleico antisentido o ARNi que inhibe la expresión de nNOS.

48. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que disminuye la óxido nítrico celular.

49. El método de la cláusula 8, en el que el agente es quercetina.

50. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que inhibe la guanilil ciclasa seleccionado del grupo que consiste en L-H[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona y una molécula de ácido nucleido antisentido o ARNi que inhibe la expresión de la guanilil ciclasa.

51. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que disminuye el guanosín monofosfato cíclico celular.

52. El método de la cláusula 51, en el que el agente es una fosfodiesterasa.

53. El método de la cláusula 52, en el que la fosfodiesterasa es PDE5.

54. El método de la cláusula 51, que es un

agente que aumenta la actividad fosfodiesterasa.

55. El método de la cláusula 54, en el que el agente es Guanosina 3',5'-monofosfato cíclico, 2'-0-antraniloil cGMP.

56. Un método de inhibición de la hiperexcitabilidad de larga duración en una neurona sensorial, que comprende administrar, a la neurona sensorial, una cantidad eficaz de un agente que inhible la translocación de la proteína quinasa-erk activada por mitógeno en el núcleo.

57. El método de la cláusula 56, en el que el agente es un bloqueador del canal de calcio.

58. El método de la cláusula 57, en el que el agente es felodopina.

59. Un método de tratamiento de dolor en un sujeto, en el que se determina que el dolor está asociado a un ganglio de la raíz dorsal a un nivel particular de la médula espinal, que comprende la aplicación tópica, en la piel que se encuentra dentro del dermatoma correspondiente al nivel de la médula espinal asociado al dolor, de un inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador.

60. El método de la claúsula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un agente antiinflamatorio.

61. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un opioide.

62. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un inhibidor de proteína quinasa G.

63. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un inhibidor de óxido nítrico sintasa.

64. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un inhibidor de guanilato ciclasa.

65. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un inhibidor de MAPKerk quinasa.

66. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor que comprende un péptido transportador, comprende además un bloqueador del canal de calcio.

67. El método de la cláusula 59, en el que el inhibidor del dolor comprende una pluralidad de péptidos transportadores.

68. El método de una cualquiera de las cláusulas 60-67, en el que el inhibidor del dolor está incluido en un parche transdérmico.

69. El método de una cualquiera de las cláusulas 60-67, en el que el inhibidor del dolor está incluido en un dispositivo transdérmico.

70. Un dispositivo transdérmico que contiene un inhibidor de proteina quinasa G.

71. El dispositivo transdérmico de la cláusula 70, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKK.

72. El dispositivo transdérmico de la cláusula 70, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKKK.

73. El dispositivo transdérmico de la cláusula 70, 71 o 72, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido portador.

74. El dispositivo transdérmico de la cláusula 73, en el que el péptido portador se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRRPP, RKKRRQRRR y RQIKIWFQNRRMKWKK.

75. El dispositivo transdérmico de la cláusula 70, 71 o 72, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido transportador.

76. El dispositivo transdérmico de la cláusula 75, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK.

77. El dispositivo transdérmico de la cláusula 73, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido transportador.

78. El dispositivo transdérmico de la cláusula 77, en el que el péptido transportador comprende la secuencia PKKKRK.

79. Un dispositivo transdérmico que contiene una cantidad eficaz de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno; y en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF³SO²NH-, CH³SO²NH-) y tetrazol.

80. El dispositivo transdérmico de la cláusula 79, en el que el agente es balanol.

81. El dispositivo transdérmico de la cláusula 79, en el que el agente es una variante de balanol.

82. El dispositivo transdérmico de la cláusula 81, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido transportador, una variante de balanol unida a un péptido transportador, balanol unido a un péptido portador, una variante de balanol unida a un péptido portador, balanol unido a un péptido transportador y un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido transportador y un péptido portador.

83. El dispositivo transdérmico de la cláusula 79, 80, 81 u 82, en el que el compuesto de fórmula I está unido a un péptido transportador.

84. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las siguientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe un aumento en el nivel de actividad de la óxido nítrico sintetasa en la neurona sensorial de ensayo lesionada,

en el que una inhibición de un aumento en el nivel de actividad de la óxido nítrico sintetasa en la neurona sensorial de ensayo lesionada, indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

85. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las sigientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe un aumento en el nivel de actividad de la guanil ciclasa en la neurona sensorial de ensayo lesionada,

en el que una inhibición de un aumento en la actividad de la guanilil ciclasa en la neurona sensorial de ensayo lesionada, indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

86. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las sigientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe un aumento en el nivel de actividad de la proteína quinasa G en la neurona sensorial de ensayo lesionada,

en el que una inhibición de un aumento en la actividad de la proteína quinasa G en la neurona sensorial de ensayo lesionada, indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

87. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las sigientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe el transporte de la proteína quinasa G en la neurona sensorial de ensayo lesionada,

en el que la inhibición del transporte de proteína quinasa G en la neurona sensorial lesionada, indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

88. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las sigientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe un aumento en la fosforilación de MPAKerk en la neurona sensorial de ensayo lesionada,

en el que la inhibición de la fosforilación de MAPKerk en la neurona sensorial lesionada, indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

89. Un método de determinación de si un agente de ensayo es un inhibidor de la hiperexcitabilidad de larga duración, que comprende las siguientes etapas:

(i) proporcionar una neurona sensorial de ensayo que comprende un segmento axonal;

(ii) crear una lesión en el segmento axonal;

(iii) administrar el agente de ensayo a la neurona sensorial de ensayo ya sea antes, junto con, o después de la creación de la lesión de acuerdo con la etapa (ii); y

(iv) determinar si el agente de ensayo inhibe la translocación de MAPKerk en el núcleo de la neurona sensorial lesionada,

en el que la inhibición de la translocación de MAPKerk en el núcleo de la neurona sensorial lesionada indica que el agente de ensayo es un inhibidor de hiperexcitabilidad de larga duración.

90. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una molécula de ácido nucleico que es al menos 90 por ciento homóloga a una molécula de ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO: 9.

91. La molécula de ácido nucleico aislada de la cláusula 90, en la que la molécula de ácido nucleico que es al menos 90 por ciento homóloga a una molécula de ácido nucleico que tiene la SEQ ID NO: 9, está unida operativamente a un elemento promotor.

92. La molécula de ácido nucleico aislada de la cláusula 90, que está incluida en un vector.

93. La molécula de ácido nucleico aislada de la cláusula 91, que está incluida en un vector.

94. Una proteína aislada que es al menos 90 por ciento homóloga a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, y que tiene actividad proteína quinasa.

95. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto, que comprende administrar, en el sistema nervioso central del sujeto, una cantidad eficaz de un inhibidor peptídico de la actividad proteína quinasa G.

96. El método de la claúsula 95, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKK.

97. El método de la cláusula 95, en el que el inhibidor peptídico comprende la secuencia peptídica RKKK.

98. El método de la cláusula 95, 96 o 97, en el que el inhibidor peptídico comprende un péptido portador.

99. El método de la cláusula 89, en el que el péptido portador se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRRPP, RKKRRQRRR y RQIKlWFQNRRMKWKK.

100. Un método de tratamiento de dolor crónico en un sujeto, que comprende administrar, en el sistema nervioso central del sujeto, una cantidad eficaz de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo, Cuando Y es:

A es:

y

Cuando Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF³SO²NH-, CH³SO²NH-) y tetrazol.

101. El método de la cláusula 100, en el que el agente es balanol.

102. El método de la cláusula 100, en el que el agente es una variante de balanol.

103. El método de la cláusula 102, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido portador.

104. El método de la cláusula 95, en el que el agente es Rp-8-pCPT-cGMPS unido a un péptido portador.

105. El método de cláusula 95, en el que el agente es una molécula de ácido nucleico antisentido o ARNi que inhibe la expresión de la proteína quinasa G.

8. Referencias

Abdulla F A, Smith P A (2001) Axotomy- and autotomy-induced changes in the excitability of rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol 85: 630-643.

Alberini C M, Ghirardi M, Metz R, Kandel E R (1994) C/EBP is an immediate-early gene required for the consolidation of long-term facilitation in Aplysia. Cell 76: 10991114.

Ambron R T, Walters E T (1996) Priming events and retrograde injury signals. A new perspective on the cellular and molecular biology of nerve regeneration. Mol Neurobiol 13: 61-79.

Ambron R T, Schmied R, Huang C, Smedman M (1992) A signal sequence mediates the retrograde transport of proteins from the axon periphery to the cell body and then into the nucleus. J Neurosci 12: 2813-2818.

Ambron R T, Dulin M F, Zhang X P, Schmied R, Walters E T (1995) Axoplasm enriched in a protein mobilized by nerve injury induces memory like alterations in Aplysia neurons. J Neurosci 15: 3440-3446.

Ambron RT, Zhang XP, Gunstream JD, Povelones M, Walters ET (1996) Intrinsic injury signals enhance growth, survival, and excitability of Aplysia neurons. J Neurosci 16: 7469-7477.

Antonov I, Antonova I, Kandel ER, Hawkins RD (2003) Activity-dependent presynaptic facilitation and hebbian LTP are both required and interact during classical conditioning in Aplysia. Neuron 37: 135-147.

Bartsch D, Ghirardi M, Skehel PA, Karl KA, Herder SP, Chen M, Bailey CH, Kandel ER (1995) Aplysia CREB2 represses long-term facilitation: relief of repression converts transient facilitation into long-term functional and structural change. Cell 83: 979-992.

Bedi SS, Salim A, Chen S, Glanzman DL (1998) Long-term effects of axotomy on excitability and growth of isolated Aplysia sensory neurons in cell culture: potential role of cAMP. J Neurophysiol 79: 1371-1383.

Billy AJ, Walters ET (1989) Long-term expansion and sensitization of mechanosensory receptive fields in Aplysia support an activity-dependent model of whole-cell sensory plasticity. J Neurosci 9: 1254-1262.

Bredt DS, Snyder SH (1990) Isolation of nitric oxide synthetase, a calmodulin-requiring enzyme. Proc Natl Acad Sci USA 87: 682-685.

Brunet JF, Shapiro E, Foster SA, Kandel ER, lino Y (1991) Identification of a peptide specific for Aplysia sensory neurons by PCR-based differential screening. Science 252: 856-859.

Bryan J (2004) Transdermal drug delivery may be a common technique in the future. Pharmaceutical J. 273: 292-293. Byrne JH, Kandel ER (1996) Presynaptic facilitation revisited: state and time dependence. J Neurosci 16: 425-435. Cha H, Shapiro P (2001) Tyrosine-phosphorylated extracellular signal regulated kinase associates with the Golgi complex during G2/M phase of the cell cycle: evidence for regulation of Golgi structure. J Cell Biol 153: 1355-1367. Chain DG, Casadio A, Schacher S, Hegde AN, Valbrun M, Yamamoto N, Goldberg AL, Bartsch D, Kandel ER, Schwartz JH (1999) Mechanisms for generating the autonomous cAMP-dependent protein kinase required for long-term facilitation in Aplysia. Neuron 22: 147-156.

Chen Y, Devor M (1998) Ectopic mechanosensitivity in injured sensory axons arises from the site of spontaneous electrogenesis. Eur J Pain 2: 165-178.

Clatworthy AL, Grose E (1999) Immune-mediated alterations in nociceptive sensory function in Aplysia californica. J Exp Biol 202: 623-630.

Clatworthy AL, Illich PA, Castro GA, Walters ET (1995) Role of peri-axonal inflammation in the development of thermal hyperalgesia and guarding behavior in a rat model of neuropathic pain. Neurosci Lett 184: 5-8.

Crown ED, Ye Z, Johnson KM, XU GY, AcAdoo DJ, Westlund KN, Hulsebosch CE (2005) Upregulation of the phosphorylated form of CREB in spinothalamic tract cells following spinal cord injury: relation to central neuropathic pain. Neurosci Lett 384: 139-144.

Dagan D, Levitan IB (1981) Isolated identified Aplysia neurons in cell culture. J Neurosci 1: 736-740.

Dale N, Schacher S, Kandel ER (1988) Long-term facilitation in Aplysia involves increase in transmitter release. Science 239: 282-285.

Dash PK, Tian LM, Moore AN (1998) Sequestration of cAMP response element-binding proteins by transcription factor decoys causes collateral elaboration of regenerating Aplysia motor neuron axons. Proc Natl Acad Sci USA 95: 8339­ 8344.

DesGroseillers L, Auclair D, Wickham L, Maalouf M (1994) A novel actin cDNA is expressed in the neurons of Aplysia californica. Biochim Biophys Acta 1217: 322-324.

Farr M, Mathews J, Zhu DF, Ambron RT (1999) Inflammation causes a long-term hyperexcitability in the nociceptive sensory neurons of Aplysia. Learn Mem 6: 331340.

Farr M, Zhu DF, Povelones M, Valcich D, Ambron RT (2001) Direct interactions between immunocytes and neurons after axotomy in Aplysia. J Neurobiol 46: 89-96,

Fiallos-Estrada CE, Kummer W, Mayer B, Bravo R, Zimmermann M, Herdegen T (1993) Long-lasting increase of nitric oxide synthetase immunoreactivity, NADPH-diaphorase reaction and c-JUN co-expression in rat dorsal root ganglion neurons following sciatic nerve transection. Neurosci Lett 150: 169-173.

Francis SH, Corbin JD (1994) Structure and function of cyclic nucleotide dependent protein kinases. Annu Rev Physiol 56: 237-272.

Ghirardi M, Braha O, Hochner B, Montarolo PG, Kandel ER, Dale N (1992) Roles of PKA and PKC in facilitation of evoked and spontaneous transmitter release at depressed and nondepressed synapses in Aplysia sensory neurons. Neuron 9: 479-489.

Glanzman DL, Kandel ER, Schacher S (1989) Identified target motor neuron regulates neurite outgrowth and synapse formation of Aplysia sensory neurons in vitro. Neuron 3: 441-450.

Glass DB, Krebs EG (1982) Phosphorylation by guanosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase of synthetic peptide analogs of a site phosphorylated in histone H2B. J Biol Chem 257: 1196-1200.

Goldsmith BA, Abrams TW (1992) cAMP modulates multiple K+ currents, increasing spike duration and excitability in Aplysia sensory neurons. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11481-11485.

Gracely RH, Lynch SA, Bennett GJ (1992) Painful neuropathy: altered central processing maintained dynamically by peripheral input. Pain 51: 175-194.

Griffiths C, Wykes V, Bellamy TC, Garthwaite J. (2003) A new and simple method for delivering clamped nitric oxide concentrations in the physiological range: application to activation of guanylyl cyclase-coupled nitric oxide receptors. Mol Pharmacol. 64(6): 1349-56.

Gudi T, Lohmann SM, Pilz RB (1997) Regulation of gene expression by cyclic GMP-dependent protein kinase requires nuclear translocation of the kinase: identification of a nuclear localization signal. Mol Cell Biol 17: 5244-5254.

Gunstream JD, Castro GA, Walters ET (1995) Retrograde transport of plasticity signals in Aplysia sensory neurons following axonal injury. J Neurosci 15: 439-448.

Hall KU, Collins SP, Gamm DM, Massa E, DePaoli-Roach AA, Uhler MD (1999) Phosphorylation-dependent inhibition of protein phosphatase-1 by G-substrate. A Purkinje cell substrate of the cyclic GMP-dependent protein kinase. J Biol Chem 274: 3485-3495.

Hanz S, Perlson E, Willis D, Zheng JQ, Massarwa R, Huerta JJ, Koltzenburg M, Kohler M, van-Minnen J, Twiss JL, Fainzilber M (2003) Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve. Neuron 40: 1095-1104.

Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US92/07124, Publicación No. W093/03730.

Ji RR, Woolf CJ (2001) Neuronal plasticity and signal transduction in nociceptive neurons: implications for the initiation and maintenance of pathological pain. Neurobiol Dis 8: 1-10.

Johanson SO, Crouch MF, Hendry IA (1995) Retrograde axonal transport of signal transduction proteins in rat sciatic nerve, Brain Res 690: 55-63.

Karin M (1994) Signal transduction from the cell surface to the nucleus through the phosphorylation of transcription factors, Curr Opin Cell Biol 6: 415-424.

Kim YI, Na HS, Kim SH, Han HC, Yoon YW, Sung B, Nam HJ, Shin SL, Hong SK (1998) Cell type-specific changes of the membrane properties of peripheraNy-axotomized dorsal root ganglion neurons in a rat model of neuropathic pain. Neuroscience 86: 301-309.

LaMotte RH, Shain CN, Simone DA, Tsai EFP (1991) Neurogenic hyperalgesia: psychophysical studies of underlying mechanisms. J Neurophysiol 66: 190-211.

Lee JH, Orice RH, Williams FG, Mayer B, Beitz AJ (1993) Nitric oxide synthase is found in some spinothalamic neurons and in neuronal processes that appose spinal neurons that express Fos induced by noxious stimulation. Brain Res 608: 324-333.

Lewin MR, Walters ET (1999) Cyclic GMP pathway is critical for inducing long-term sensitization of nociceptive sensory neurons. Nat Neurosci 2: 18-23.

Liao X, Gunstream JD, Lewin MR, Ambron RT, Walters ET (1999) Activation of protein kinase A contributes to the expression but not the induction of long-term hyperexcitability caused by axotomy of Aplysia sensory neurons. J Neurosci 19: 12471256.

Lin H, Bao J, Sung YJ, Walters ET, Ambron RT (2003) Rapid electrical and delayed molecular signals regulate the serum response element after nerve injury: convergence of injury and learning signals. J Neurobiol 57: 204-220.

Mai et al. (2002) Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J Biol Chem 277: 30208-30218.

Marais R, Wynne J, Treisman R (1993) The SRF accessory protein Elk-1 contains a growth factor-regulated transcriptional activation domain. Cell 73: 381-393.

Martin KC, Michael D, Rose JC, Barad M, Casadio A, Zhu H, Kandel ER (1997) MAP kinase translocates into the nucleus of the presynaptic cell and is required for long-term facilitation in Aplysia, Neuron 18: 899-912.

Michael D, Martin KC, Seger R, Ning MM, Baston R, Kandel ER (1998) Repeated pulses of serotonin required for longterm facilitation activate mitogen-activated protein kinase in sensory neurons of Aplysia. Proc Natl Acad Sci USA 95: 1864-1869,

Mo E, Amin H, Bianco IH, Garthwaite J. (2004) Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279(25): 26149-58.

Millan MJ (1999) The induction of pain: an integrative review. Prog Neurobiol 57: 1-164.

Monfort P, Munoz MD, Kosenko E, Felipo V (2002) Long-term potentiation in hippocampus involves sequential activation of soluble guanylate cyclase, cGMP-dependent protein kinase, and cGMP-degrading phosphodiesterase. J Neurosci 22: 10116-10122.

Moroz LL, Chen D, Gillette MU, Gillette R (1996) Nitric oxide synthase activity in the molluscan CNS. J Neurochem 66: 873-876.

Muller U, Carew TJ (1998) Serotonin induces temporally and mechanistically distinct phases of persistent PKA activity in Aplysia sensory neurons. Neuron 21: 1423-1434.

Palecek J, Paleckova V, Willis WD (2003) Fos expression in spinothalamic and postsynaptic dorsal column neurons following noxious visceral and cutaneous stimuli. Pain 104: 249-257.

Park SY, Choi JY, Kim RU, Lee YS, Cho HJ, Kim DS (2003) Down regulation of voltage-gated potassium channel a gene expression by axotomy and neurotrophins in rat dorsal root ganglia. Mol Cells 16: 256-259.

Sarjeant JM, Lawrie A, Kinnear C, Yablonsky S, Leung W, Massaeli H, Prichett W, Veinrot IP, Rossart E, Rabinovitch M (2003) Apolipoprotein D inhibits platelet derived growth factor BB-induced vascular proliferated [sic] by preventing translocation of phosphorylated signal regulated kinase 1/2 to the nucleus. Arterioscler. Throm. Vase. Biol. 23: 2172­ 2177.

Pohler D, Butt E, Meissner J, Muller S, Lohse M, Walter U, Lohmann SM, Jarchau T (1995) Expression, purification, and characterization of the cGMP-dependent protein kinases I_and II using the baculovirus system. FEBS Lett 374: 419-425.

Schlossmann I, Feil R, Hofmann F (2003) Signaling through NO and cGMP-dependent protein kinases. Ann Med 35: 21-27.

Schmied R, Ambron RT (1997) Anuclear localization signal targets proteins to the retrograde transport system, thereby evading uptake into organelles in Aplysia axons. J Neurobiol 33: 151-160.

Schmied R, Huang CC, Zhang XP, Ambron DA, Ambron RT (1993) Endogenous axoplasmic proteins and proteins containing nuclear localization signal sequences use the retrograde axonal transport/nuclear import pathway in Aplysia neurons. J Neurosci 13: 4064-4071,

Scholz KP, Byrne JH (1988) Intracellular injection of cAMP induces a long term reduction of neuronal K+ currents. Science 240: 1664-1666.

Scott JD (1991) Cyclic nucleotide-dependent protein kinases. Pharmacol Ther 50: 123-145.

Setyawan J, Koide K, Diller TC, Bunnage ME, Taylor SS, Nicolaou KC, Brunton LL (1999) Inhibition of protein kinases by balanol: specificity within the serine/threonine protein kinase subfamily. Mol Pharmacol. 56(2): 370-6.

Smith AR, Visioli F, Hagen TM (2002) Vitamin C matters: increased oxidative stress in cultured human aortic endothelial cells without supplemental ascorbic acid. FASEB J 10.1096/fj.01-0825fje.

Smolenski A, Bachmann C, Reinhard K, Honig-Liedl P, Jarchau T, Hoschuetzky H, Walter U (1998) Analysis and regulation of vasodilator stimulated phosphoprotein serine 239 phosphorylation in vitro and in intact cells using a phosphospecific monoclonal antibody. J Biol Chem 273: 20029-20035.

Study RE, Kral MG (1996) Spontaneous action potential activity in isolated dorsal root ganglion neurons from rats with a painful neuropathy. Pain 65: 235-242.

Sung YJ, Ambron RT (2004) Pathways that elicit long-term changes in gene expression in nociceptive neurons following nerve injury: contributions to neuropathic pain. Neurol Res 26: 195-203.

Sung YJ, Hwang MC, Hwang YW (1996) The dominant negative effects of H-Ras harboring a Gly to Ala mutation at position 60. J Biol Chem 271: 30537-30543.

Sung YJ, Conti J, Currie JR, Brown WT, Denman RB (2000) RNAs that interact with the fragile X syndrome RNA binding protein FMRP. Biochem Biophys Res Commun 275: 973-980.

Sung YJ, Povelones M, Arabron RT (2001) RISK-1: a novel MAPK homologue in axoplasm that is activated and retrogradely transported after nerve injury. J Neurobiol 47: 67-79.

Sung YJ, Dolzhanskaya N, Nolin SL, Brown T, Currie JR, Denman RB (2003) The fragile X mental retardation protein FMRP binds elongation factor 1A mRNA and negatively regulates its translation in vivo. J Biol Chem 278: 15669-15678. Sung YJ and Ambron, RT (March 22, 2004) Pathways that elicit long-term changes in gene expression in nociceptive neurons following nerve injury: contributions to neuropathic pain. Neurological Research 26: 195-203.

Sung, YJ, Walters, ET and Ambron, RT (25 de agosto de 2004) A neuronal isoform of protein ldnase G couples mitogen-activated protein kinase nuclear import to axotomy-induced long-term hyperexcitability in Aplysia sensory neurons. J. Neurosci. 24(34): 7583-7595.

Sutton MA, Carew TJ (2000) Parallel molecular pathways mediate expression of distinct forms of intermediate-term facilitation at tail sensory motor synapses in Aplysia. Neuron 26: 219-231.

Ungless MA, Gasull X, Walters ET (2002) Long-term alteration of S-type potassium current and passive membrane properties in Aplysia sensory neurons following axotomy. J Neurophysiol 87: 2408-2420.

Patente de Estados Unidos 4.708.716 de Sibalis, D. Transdermal drug applicator. Presentada el 16 de septiembre de 1985 y publicada el 24 de noviembre de 1987.

Patente de Estados Unidos No. 5.405.614 de D'Angelo; JP y Schur, H. Electronic transdermal drug delivery system. Presentada el 11 de enero de 1993 y publicada el 11 de abril de 1995.

Patente de Estados Unidos No. 6.476.007 de Tao, Y y Johns, RA. Isoform-specific inhibition for treatment of pain and reduction of anesthetic threshold. Presentada el 8 de diciembre de 2000 y publicada el 5 de noviembre de 2002. Urban MO y Gebhart GF (1999) Supraspinal contributions to hyperalgesia. Proc Natl Acad Sci USA 96: 7687-7692. Urban MO y Gebhart GF (1998) The glutamate synapse: a target in the pharmacological management ofhyperalgesic pain states. Prog Brain Res 116 : 407420.

Verge VM, Xu Z, Xu XJ, Wiesenfeld-Hallin Z, Hokfelt T (1992) Marked increase in nitric oxide synthase mRNA in rat dorsal root ganglia after peripheral axotomy: in situ hybridization and functional studies. Proc Natl Acad Sci USA 89: 11617-11621.

Wall PD, Devor M (1983) Sensory afferent impulses originate from dorsal root ganglia as well as from the periphery in normal and nerve injured rats. Pain 17: 321-339.

Walters ET (1994) Injury-related behavior and neuronal plasticity: an evolutionary perspective on sensitization, hyperalgesia, and analgesia. Int Rev Neurobiol 36: 325-427.

Walters ET, Byrne JH, Carew TJ, Kandel ER (1983a) Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. I. Response properties and synaptic connections. J Neurophysiol 50: 1522-1542.

Walters ET, Byrne JH, Carew TJ, Kandel ER (1983b) Mechanoafferent neurons innervating tail of Aplysia. II. Modulation by sensitizing stimulation. J Neurophysiol 50: 1543-1559.

Walters ET, Alizadeh H, Castro GA (1991) Similar neuronal alterations induced by axonal injury and learning in Aplysia. Science 253: 797-799.

Walters ET, Bodnarova M, Billy AJ, Dulin MF, Diaz-Rios M, Miller MW, Moroz LL (2004) Somatotopic organization and functional properties of mechanosensory neurons expressing sensorin-A mRNA in Aplysia californica. J Comp Neurol 471: 219-240.

Wang H, Sun H, Della Penna K, Benz RJ, Xu J, Gerhold DL, Holder DJ, Koblan KS (2002) Chronic neuropathic pain is accompanied by global changes in gene expression and shares pathobiology with neurodegenerative diseases. Neuroscience 114: 529-546.

Waxman SG, Kocsis JD, Black JA (1994) Type III sodium channel mRNA is expressed in embryonic but not adult spinal sensory neurons, and is reexpressed following axotomy. J Neurophysiol 72: 466-470.

Wenderef al. (2000) The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13003-13008.

Whitmarsh AJ, Shore P, Sharrocks AD, Davis RJ (1995) Integration of MAP kinase signal transduction pathways at the serum response element. Science 269: 403-407.

Woolf CJ (1983) Evidence for a central component of post-injury pain hypersensitivity. Nature 306: 686-688.

Xu S, Robbins D, Frost J, Dang A, Lange-Carter C, Cobb MH (1995) MEKK1 phosphorylates MEK1 and MEK2 but does not cause activation of mitogenactivated protein kinase. Proc Natl Acad Sci USA 92: 6808-6812.

Yang Z, Madinova A, Kozai T, Joch H, Aebi U, Luscher TF (2002) Felodipine inhibits nuclear translocation of p42/44 mitogen-activated protein kinase and human smooth muscle growth. Cardiovasc. Res. 53(1): 227-231.

Yao Z, Dolginov Y, Hanoch T, Yung Y, Ridner G, Lando Z, Zharhary D, Seger R (2000) Detection of partially phosphorylated forms of ERK by monoclonal antibodies reveals spatial regulation of ERK activity by phosphatases. FEBS Lett 468: 37-42.

Zaragoza C, Soria E, Lopez E, Browning D, Balbin M, Lopez-Otin C, Lamas S (2002) Activation of the mitogen activated protein kinase extracellular signal regulated kinase 1 and 2 by the nitric oxide-cGMP-cGMP dependent protein kinase axis regulates the expression of matrix metalloproteinase 13 in vascular endothelial cells. Mol Pharmacol 62: 927-935. Zhang H, Xie W, Xie Y (2005) Spinal cord injury triggers sensitization of wide dynamic range dorsal horn neurons in segments rostral to injury. 2 de agosto de 2005 Brain Res, epub antes de imprimir. PMID 16083864.

Zhang JM, Donnelly DF, Song XJ, Lamotte RH (1997) Axotomy increases the excitability of dorsal root ganglion cells with unmyelinated axons. J Neurophysiol 78: 2790-2794.

Zhang JM, Song XJ, LaMotte RH (1999) Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol 82: 3359-3366.

Zhang X, Verge V, Wiesenfeld-Hallin Z, Ju G, Bredt D, Synder SH, Hokfelt T (1993) Nitric oxide synthase-like immunoreactivity in lumbar dorsal root ganglia and spinal cord of rat and monkey and effect of peripheral axotomy. J Comp Neurol 335: 563-575.

Zhou B, Zhang ZY (2002) The activity of the extracellular signal-regulated kinase 2 is regulated by the differential phosphorylation in the activation loop. J. Biol Chem 277: 13889-13899.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente que tiene la fórmula I

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

Cuando Y es:

A es:

y

Cuando Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol;

en la preparación de un medicamente para el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico en el que el medicamento es para la administración a la neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal.

2. Un agente que tiene la fórmula I

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

Cuando Y es:

A es:

y

C u a n d o Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol;

para su uso en el tratamiento de dolor crónico en un sujeto que padece hiperalgesia del sistema nervioso periférico en el que el medicamento es para la administración a la neurona sensorial en un ganglio de la raíz dorsal.

3. El uso de la reivindicación 1 o el agente de la reinvidicación 2, en el que el agente es balanol.

4. El uso de la reivindicación 1 o el agente de la reinvidicación 2, en el que el agente es una variante de balanol.

5. El uso o el agente de la reivindicación 4, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido transportador, una variante de balanol unida a un péptido transportador, balanol unido a un péptido portador, una variante de balanol unida a un péptido portador, balanol unido a un péptido transportador y un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido transportador y un péptido portador.

6. Un dispositivo transdérmico que contiene una cantidad eficaz de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol;

7. El dispositivo transdérmico de la reivindicación 6, en el que el agente es balanol.

8. El dispositivo transdérmico de la reivindicación 6, en el que el agente es una variante de balanol.

9. El dispositivo transdérmico de la reivindicación 8, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido transportador, una variante de balanol unida a un péptido transportador, balanol unido a un péptido portador, una variante de balanol unida a un péptido portador, balanol unido a un péptido transportador y un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido transportador y un péptido portador.

10. El dispositivo transdérmico de la reivindicación 6, 7, 8 o 9, en el que el agente que tiene la fórmula I está unido a un péptido transportador.

11. El uso de un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo,

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol;

en la preparación de un medicamento para el tratamiento de dolor crónico en el que el medicamento es para la administración al sistema nervioso central.

12. Un agente que tiene la fórmula I:

en la que n es 1,2 o 3; Z es N o CH;

en la que X representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que Y representa uno de los siguientes grupos funcionales:

en la que A representa grupos arilo o heteroarilo no sustituidos o sustituidos con uno o más grupos alquilo inferior, alcoxi inferior, hidroxi, alcoxi, amino, alquilamino o halógeno, de manera que, donde A es un grupo arilo o heteroarilo, C u a n d o Y es:

A es:

y

Cuando Y es:

A es:

en la que R es hidrógeno, alquilo inferior,o amidino;

en la que R1, R2, R4, R5 es independientemente hidrógeno, hidroxilo, alcoxi inferior, amino o halógeno;

y

en la que R3 es alquilo, arilo, heteroarilo, alcoxi, ariloxi, o un grupo seleccionado de los siguientes:

siendo R6-R10 independientemente hidrógeno, hidroxi, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, trifluorometilo, carboxi, alcoxicarbonilo, amino, alquilamino, alquilcarbonilamino, alquilsulfonilamino (por ejemplo, CF3SO2NH-, CH3SO2NH-) y tetrazol;

para su uso en el tratamiento del dolor crónico en el que el medicamento es para la administración al sistema nervioso central.

13. El uso de la reivindicación 11, o el agente de la reivindicación 12, en el que el agente es balanol o una variante de balanol.

14. El uso o el agente de la reivindicación 13, en el que la variante de balanol se selecciona del grupo que consiste en balanol-7R, 14-descarboxi-balanol, 10-desoxi-balanol, balanol unido a un péptido portador y una variante de balanol unida a un péptido portador.