ES2535452B1

ES2535452B1 - Potenciación del efecto del metotrexato mediante el uso combinado con estatinas lipofílicas

Info

Publication number: ES2535452B1
Application number: ES201331207A
Authority: ES
Inventors: José Manuel GARCÍA CASTELLANO
Original assignee: DALANA3 S L; DALANA3 SL
Current assignee: DALANA3 S L; DALANA3 SL
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2013-08-02
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2033-08-02
Also published as: RU2016107372A3; MX2016001307A; EP3028704A4; US10172857B2; EP3028704A1; BR112016002194A2; CA2920073A1; AU2014298327A1; WO2015015039A9; RU2016107372A; ES2535452A1; WO2015015039A1; JP2016525564A; ES2880444T3; US20160175310A1; CN105682660A; EP3028704B1

Abstract

Potenciación del efecto del metotrexato mediante el uso combinado con estatinas lipofílicas.#La invención proporciona el uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento o prevención comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofílica y el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa y la estatina lipofílica junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Description

Potenciación del efecto del metotrexato mediante el uso combinado con estatinas I¡pafíl ieas

5 La presente invención se enmarca en el campo de la medicina clínica, particularmente en el campo de la oncología y las enfermedades autoinmunes como la psoriasis y la artritis reumatoide. En concreto la invención proporciona una terapia mejorada para dichas enfermedades mediante la combinación del metotrexato con estatinas lipataieas.

10 ESTACO DE LA TÉCNICA

El metotrexato ((2S)-2-[(4-{((2,4-diaminopleridi n-6-il)melil](meliI)am ino}benzoil)am ino] pentanodioico, número CAS 59-05-2, fórmula 1, abreviado como MfX) es un antimetabolito que posee actividad antiproliferativa y antiinflamatoria al inhibir competitivamente a la

15 enzima dihidrofolato reductasa (DHFR), enzima que regula la cantidad de folato intracelular disponible para la síntesis de ácidos nucleicos en fase S del ciclo celular e impide la conversión de homocisteína a metionina durante la síntesis de proteínas.

O OH

20 Fórmula I

El MTX es usado como quimioterápico de primera línea para el tratamiento de algunas enfermedades neoplásicas, como el osteosarcana. Se administra en diversas neoplasias en dosis muy elevadas (3 a 12 g/m2 de superficie de paciente), en pacientes con función renal

25 normal y se acministra con hiperhidratación (3 m2 de superficie de paciente) y alcalinización. También se usa para el tratamiento de algunas enfermedades inflamatorias entre las que destaca la artritis psoriásica y la artritis reumatoide.

Sin embargo, es un fármaco que produce en ocasiones mportantes y severos efectos secundarios adversos que condicionan una elevada morbi-mortalidad en los pacientes que hacen uso del fármoco. En algunos casos incluso obliga a la interrupción prematura de la quimioterapia en un tercio de los pacientes a pesar de haber realizado un adecuado rescate

con ácido folínico.

Se ha descrito mielosupresión, mucositis y neurotoxicidad con encefalopatía aguda o crónica en los pacientes tratados con MTX. La encefalopatía aguda generalmente se desarrolla en el 3%-15% de los pacientes dentro de los primeros 5 a 14 días después del inicio del tratamiento, y pueden incluir cefalea, náuseas, vómitos, letargia, alteración del estado mental, visión borrosa, afasia, hemiparesia y convulsiones. En estos casos, la mayoría de los pacientes pueden reanudar el tratamiento con el MTX sin secuelas neurol6gicas permanentes, aunque en el 10%-56% pueden experimentar recidiva con la reexposición. A ello se le puede añadir una encefalopatía crónica que se desarrolla lentamente, pudiendo progresar, y pudiendo dañar la función neurológica de forma permanente.

La administración de MfX en dosis altas es de vital importancia en los niños afectados de osteosarccmas. En estos casos, el retraso en la eliminación de MfX y la exposición prolongada a este fármaco puede llevar a una toxicidad importante, sobre todo a un fallo renal agudo por una obstrucción renal secundaria al depósito de cristales de MTX y sus metabolitos (17-hidroxi-metotrexato) en los túbulos renales, o bien por toxicidad directa del fármaco sobre estos túbulos .

Ante este problema existe la necesidad de encontrar terapias capaces de disminuir los efectos secundarios nocivos del tratamiento con MfX a la vez que se mantiene o mejora su actividad antijnflamatoria, inmunomoduladora yantitumoral.

EXPLICACION DE LA INVENCION

El inventor ha encontrado que el uso combinado de una estatina lipofílica y un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR), como por ejemplo el metotrexato (MTX), proporciona un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer y de enfermedades autoinmunes para las cuales está indicado el tratamiento con estos fármacos inhibidores de la DHFR. Tal y como se muestra en los ejemplos que siguen a continuación, el uso de una estatina lipofílica en terapia de combinación con MfX fX>tencia el efecto antitumoral del

MfX, permitiendo disminuir la dosis de MTXsin afectar a la efectividad del tratamiento. Esta terapia combinada proporciona enormes beneficios en pacientes que sufren una enfermedad para cuyo tratamiento está indicada la administración de un inhibidor de la

DHFR, cemo por ejemplo pacientes de cáncer y de algunas enfermedades autoinmunes , ya que, como consecuencia de estar expuestos a menores dosis de inhibidor de la DHFR, dichos pacientes sufren menes efectos secundarios sin perjuicio de la efectividad de su tratamiento.

Así pues, un primer aspecto de la invención proporciona un inhibidor de la enzima DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, ¡x>limiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipotaica y un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Este aspecto se puede reformular como el uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásca, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipof~ica yel inhibidor de la enzima DHFR. La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásca, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, en un paciente que lo necesite, donde dicho método de tratamiento comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofílica y un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Las estatinas lipofílicas son aquellas que son poco solubles en agua. En una realización particular de la invención la estatina lipof~ica que se utiliza en terapia combinada con el MfX

es smvastatina (número CAS: 79902-63-9, formula 11) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En otra realización particular, la estatina lipofilica es atorvastatina (número CAS: 134523-00-5, fórmula V) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En otra realización particular, la estatina lipofiica es f1uvastatina (número CAS: 93957-54-1 ,

5 fórmula IV) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En otra realización particular, la estatina lipofilica es lovastatina (número CAS: 75330-75-5, fórmula 111).

H0'(t0

°

~9H

,' "

10 Fórmula 11 Fórmula III

, OH

fj r"") 'j'H 'j'H \1

~N ~OH

OH OH O

F Fórmula IV Fórmula V

15 .A.demás, la invención contempla utilizar para la terapia de combinación con estatinas

lipornicas cualquier análogo o derivado del MTX que puedan utilizarse como alternativa

terapéutica al MTX y actúen según un mecanismo de acción igualo muy similar al del MTX

Entre estos destacan otros fármacos inhibidores de la enzima dihidrofolato reductasa, tales

como trmetrexato (5-metil-6-[(3,4,5-trimetoxyfenil) aminometiij quinazolina-2,4-diamina,

20 compuesto de fórmula VI) y el pemetrexel (ácido 5-metil-6-[(3,4,5-trimetoxifenil) aminometil] quinazolina-2,4-diamina, compuesto de fórmula VII). Como será evidente para el experto en la materia, estos equivalentes, analogos y derivados del MTX son susceptibles de

interactuar con las estatinas lipofílicas y ver su efecto potenciado por ellas , al igual que el MTX, y por lo tanto muestran las mismas ventajas al ser empleados en terapia combinada con éstas .

H N

o I

Fórmula VI

HN

j¡

H2N~ ~

N

N H

Fórmula VII

Cualquier sal farmacéuticamente aceptable de un inhibidor de la DHFR o de una estatina lipefDica puede ser utilizada para los fines de la invención. El término "sal farmacéuticamente

aceplable" se refiere a sales preparadas a partir de bases farmacéuticanente aceplables no

tóxicas. No existen Iimitaciones en relación a las sales, salvo que cuando se usan para fines 15 terapéuticos deben ser aceptables farmacéuticamente.

Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos para la terapia combinada de la

invención pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en el estado de la técnica.

Por ejemplo, se pueden preparar a partir del compuesto madre, el cual contiene una porción

20 ácida o básica, mediante métodos convencionales en la práctica química. Generalmente

dichas sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar el ácido o base libre de dichos

compuestcs con una cantidad estequiométricaTlente adecuada del ácido o sal farmacéuticamente aceptable en presencia de agua, de un disolvente orgánico o de una mezcla de ambos. Cuando las sales se preparan a partir de compuestos madre básicos, dichas sales se preparan a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables ,

5 incluyendo ácidos orgánicos e inorgánicos. Dichos ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, benzosulf6nico, benzoico, canforsulf6nico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, láctico, maléico, málico, mandélico, metanosulfónico, fosfórico, sLCcínico, sulfúrico, tartárico, p-toluenosulfónico y similares .

10 La invención contempla que los compuestos para su uso en la terapia combinada pueden estar en forma cristalina, bien como compuestos de solvatación libre o como solvatos (por ejemplo hidratos). Los métodos para solvatación son conocidos en el estado de la técnica.

La presente invención también contempla el uso de un profármoco de un inhibidor de la

15 DHFR o de una estatina lipofílica. Por "profármaco" se entiende una sustancia que se administra en una forma inactiva (o menos activa) pero que tras su administración se transforma en su correspondiente fármaco activo como consecuencia de los procesos metabólicos habituales en el paciente. En partc ular, el término profármoco se refiere a ésteres aceptable e hidrolizables fisiológicamente.

20 Por el término "éster aceptable e hidrolizable fisiológicamente" se entiende un éster en que el grupo hidroxilo está esterificado yel cual es hidrolizable bajo condiciones fisiológicas para dar un ácido el cual es por sí mismo tolerable fisiológicamente a las dosis a las que se administra. Ejemplos de tales ésteres incluyen acetatos y benzoatos del MTX o de las

25 estatinas lipof~icas.

La invención también contempla la administración del inhibidor de DHFR en formato conjugado con sustancias como liposomas, glicerol, albúmina, diglicéridos, aminoácidos como fenilalanina o prolina, o péptidos como Arginina-Glicina-Asparagina o un péptido

30 "hairpin". La conjugación del fármaco con estas sustancias puede incrementar su biodisponibilidad.

En una realización particular, el inhibidor de DHFR en la terapia combinada de la invención es MTX. En otra realización, la terapia combinada de la invención se lleva a cabo con MfX y

35 simvastatina.

La terapia de combinación de la presente invención proporciona una ventaja adicional que consiste en la posibilidad de utilizar la terapia combinada no sólo con fines terapéuticos, sino también con fines preventivos, concretamente, con el fin de evitar recidivas (o recaídas) en los pacientes que han respondido satisfactoriamente a un tratamiento previo para el cáncer

o enfermedad autoi nmune.

Así, otro aspecto de la invención proporciona un inhibidor de DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticaTlente aceptable del mismo, para su uso en la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis , artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofílica y el inhibidor de DHFR. Este aspecto se puede reformular cemo el uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed;

: o una sal farmacéuticaTlente aceptable del m ismo, para la preparación de un medicamento para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis , artritis ¡::soriásca, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento o prevención comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofmca y el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa. La presente invención también proporciona un método para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupa que consiste en cáncer, psoriasis , artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis en un paciente que lo necesite, donde dicho método de tratamiento comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada

: o secuencial una estatina lipomica y un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Los efectos secundarios del uso de la administración de los inhibidores de DHFR como el MfX según la práctica clínica vigente son considerables , de modo que no se ha contemplado su uso en pacientes en los que la patología ha remitido o desaparecido gracias a un tratamiento anterior. Al poder emplear menores concentraciones de, por ejemplo, MTX con mayor efectividad terapéutica, la terapia combinada de la invención puede usarse para

evitar una recaída del paciente que ha respondido a una terapia previa para el tratamiento de una enfermedad que se beneficia de la administración del MTX, como por ejemplo, un cáncer. En este sentido es importante señalar que el inventor ha encontrado que la potenciación del efecto del inhibidor de DHFR por la estatina lipofílica es particularmente relevante a dosis bajas, particularmente a dosis de MTX comprendidas de 1 a 3 mg/m' de superficie corporal del paciente.

En cuanto a las enfermedades susceptibles de beneficiarse de la terapia combinada de la presente invención se encuentran aquellas enfermedades para las cuales está indicada la administración de los inhibid ores de DHFR, tales como el MfX, en particular el cáncer y algunas enfermedades autoinmunes. En una realización particular la terapia combinada de la invención puede utilizarse para el tratamiento de un cáncer seleocionado del grupo que consiste en osteosarcoma, corioadenoma destruens, coriocarcinoma, mola hidatidiforme, leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, linfoma de células grandes, linfoma de alto grado, linfoma de alto grado, linfoma no Hodking, linfosarcoma, linfoma de Burkitt, linfoma de células T cutáneo, mesotelioma pleural, cáncer de mama, cáncer de ovario, tumor epidermoide de cabeza, h.nlor epidermoide de cuello, carcinoma pumonar de células pequeñas y cáncer de la vejiga urinaria. En una realización particular, la terapia combinada de la invención es para el tratamiento de osteosarcoma. En otra realización particular el cáncer es leucemia linfocítlca aguda.

Otro grupo de enfermedades que se pueden beneficiar de la terapia combinada de inhibidor de DHFR y estatinas lipofílicas está constituido par algunas enfermedades autoinm unes, particularmente psoriasis, artritis psoriásca, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis ysarcoidosis.

Como será evidente para el experto en la materia, la terapia combinada de la presente invención es eficaz no sólo cuando los principios octivos, el inhibidor de DHFR y la estatina lipataica, se utilizan en una sola composición, sino también cuando se utilizan en dos composiciones diferentes, ya sean administradas de forma simultánea o por separado en cualquier orden y con un intervalo terapéuticamente efectivo. Además , el experto en la materia entenderá que el inhibidor de DHFR puede ser prescrito par el médico especialista para ser utilizado junto con una estatina lipotaiea en una terapia de combinación con el fin de tratar o prevenir la recidiva de una enfermedad que se beneficie de la administración del

inhibidor de DHFR, y viceversa.

Así, un aspecto de la invención se refiere a un inhibidor de la enzima DHFR seleccionado

del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis cuando se usa en terapia de combinación con una estatina lipofílic8. Este aspecto se puede reformular como el uso de un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásca, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho medicamento es para uso en terapia combinada con una estatina lipotaica. La invención también se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasls, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermataniositisy sarcoidosls en un pociente que lo necesite, donde dicho método can prende administrar a un sujeto un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en terapia de combinación con una estatina lipotaica.

Otro aspecto de la invención se refiere a un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en la prevención de recidivas de cáncer cuando se usa en terapia de com binación con una estatina lipofílica. Este aspecto se puede reformular como el uso de MTX, un profármaco o una sal fannacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para la prevención de recidivas de una enfennedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosls, donde dicho medicamento es para uso en terapia combinada con una estatina lipotaica. La invención también se refiere a un método para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis en un paciente que lo necesite, donde dicho método comprende administrar a un sujeto un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en terapia de combinación con una estatina lipatalea.

Además la presente invención proporciona un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticcmente aceptable del mismo y de una estatina lipof~ica para su uso en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis ysarcoidosis. Este aspecto se puede reformular como el uso de un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y de una estatina lipofílica para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis. La invención también proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis en un paciente que lo necesite, donde dicho método comprende administrar a un sujeto un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo yuna estatina lipofílica.

En otro aspecto la invención proporciona un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéutica11ente aceptable del mismo y de una estatina lipofílica para su uso en la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis ysarcoidosis. Este aspecto se puede reformular como el uso de un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y de una estatina lipofílica para la preparación de un medicamento para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y

sarcoidosis. La invención también proporciona un método para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis en un paciente que lo necesite, donde dicho método comprende administrar a un sujeto un inhibidor de la DHFR seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable

del mismo yuna estatina IipofíllC8.

La presente invención contempla que en la terapia combinada el inhibidor de DHFR y la estatina lipofílica se administren simultáneamente. La invención también contempla que el inhibidor de DHFR y la estatina lipofnica se administren de forma separada, en cualquier orden y con un intervalo terapéuticamente efectivo. El intervalo terapéuticamente efectivo dependerá en gran medida de la enfermedad considerada y de si el fin es el tratamiento o la prevención de recaídas , pero siempre tendrá en cuenta que gracias a la ccmbinación con la estatina lipofílica la cantidad de inhibidor de DHFR administrada al paciente es mucho menor que en el tratamiento convencional.

Cuando el inhibidor de DHFR que se utiliza en la terapia de combinación de la invención es MfX, la dosis a administrar de este fármaco puede estar ccmprendida de 0,5 mg/m2 de superficie del paciente a 20 gl m2 de superficie del paciente y la dosis de estatina lipafUica puede estar comprendida de 10 a 100 mg. La dosis aproximada dependerá de la enfermedad del paciente y de si el objetivo de la terapia es el tratamiento de la enfermedad

: o la prevención de recidivas . Así, para el tratamiento de leucemia linfocítica aguda se puede administrar una dosis de MTX comprendida de 1 a 3 mglm 2 de superficie del paciente. Para el tratamiento de osteosarcoma, se puede administrar una dosis de MfX comprendida de 12 a 15 g/m2 de superficie del paciente. En ambos casos, se puede administrar una dosis de choque inicial de estatina lipafUica comprendida de 40 a 80 mg y una dosis de mantenimiento comprendida de 10 a 30 mg, por ejemplo 20 mg. Para la prevención de recidivas de osteosarccma se puede administrar una dosis que contiene 3-20 mg/m2 de superficie de paciente de MfX y 20 mg de estatina lipofUica. Del mismo modo, el régimen de administración dependerá de la enfermedad en cuestión y de si el objetivo es el tratamiento

: o la prevención de recaídas para esta enfermedad. En general, en la terapia de combinación de la presente invención el MTX se puede administrar con una frecuencia comprendida de 1 a 5 semanas y la estatina lipofUica se puede administrar con una frecuencia comprendida de 1 a 7 días. Por ejemplo, cuando el objetivo de la terapia combinada es el tratamiento de

leucemia linfocítica aguda, se puede administrar una dosis de MfX comprendida de 1 a 3 mg/m' de superficie del paciente diaria durante 4-6 semanas. Por ejemplo, cuando el objetivo de la terapia combinada es el tratamiento de osteosarcoma, se puede administrar

una dosis de MTX comprendida de 12 a 15 91m2 de superficie del paciente cada 14 días. En ambos casos , se puede administrar una dosis de choque inicial de estatina lipof~ica comprendida de 40 a 80 mg y una dosis de mantenimiento comprendida de 10 a 30 mg, por ejemplo 20 mg. Por ejemplo cuando el objetivo de la terapia de la invención es para la prevención de recidivas de la osteosarcoma, se puede administrar una dosis que contiene 320 mg/m2 de superficie de paciente de MTX y 20 (mg) de estatina lipofílica cada semana.

Como se ha cementado anteriormente, el MfX y la estatina lipofílica en el sentido de la terapia combinada de la invención pueden administrarse de manera simultánea, secuencial

o separada. En el caso de que la administración sea siTIultánea, los fármacos pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o bien cada fármaco puede formar parte de una composición farmacéutica diferente.

Un aspecto de la invención proporciona una composición farmocéutica que ccmprende un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y una estatina lipofílica junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables. Esta composción es útil para su L50 en la terapia combinada de la invención para el tratamiento o prevención de recidivas de las enfermedades arriba mencionadas.

La expresión "excipientes y/o vehículos farmacéuticamente" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticanente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la composción farmacéutica. También debe ser apto para su uso en contacto con tejidos u órganos de seres humanos y aniTIales sin producir excesiva toxicidad, irritación, reacciones alérgicas, inmunogenicidad u otros problemas o ccmplicaciones en consonancia con una razonable relación beneficio/riesgo.

En una realización particular, la estatina lipofnica en la composción de la invención se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, simvastatina, fluvastatina y lovastatina, o sales farmacéuticaTIente aceptables de las mismas. En otra realización particular, el inhibidor de DHFR es MTX. En otra realización, la composición ccmprende MTX y

simvastatina.

La composición de la invención puede estar formulada en una unidad de dosificación para administración por vía oral. En una realización particular, la unidad de dosificación para administración oral es un comprimido, püdora, pastilla, tableta, cápsula, solución, suspensión, gel o gelatina. En otra realización, la ccmposc ión de la invención está formulada en una unidad de dosificación para administración por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, rectal, intracavitaria o inhalada.

En una realización particular, el régimen de administración de la composición de la invención para el tratamiento de las enfermedades arriba mencionadas dependerá del contenido en inhibidor de DHFR y estatina lipofílica en la unidad de dosificación, así como de su indicación. Para establecer el régimen de administración de la composición de la invención se pueden tener en cuenta las recomendaciones de dosis descritas más arriba para el tratamiento combinado.

En el caso de que la administración de inhibidor de DHFR y estatina lipofílica según la terapia combinada de la invención sea secuencial o separada, cada fármaco estará formulado en una composición diferente, pudiendo suministrarse todo ello en un kit junto con instrucciones adecuadas para su administración en el tratamiento o en la prevención de recidivas de las enfermedades arriba indicadas.

Así, otro aspecto de la invención proporciona un kit que comprende una primera composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; una segunda ccmposición farmacéutica que comprende una estatina lipof~ica; e instrucciones para el uso de ambas composiciones farmacéuticas en la terapia ccmbinada para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis , artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis ysarcoidosis.

En una realización, la estatina IlpofHica en el kit de la invención se selecciona del grupo que consiste en atorvastatina, srnvastatina, fluvastatina, lovastatina y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. En una realización particular, la estatina es simvastatina. En otra

realización el inhibidor de DHFR es MfX.

Cada principio activo en el kit de la invención, inhibidor de DHFR y estatina lipofílica, puede estar formulado en una unidad de dosificación para administración por vía oral. En una realización particular, la unidad de dosificación para administración oral es un comprimido, p~dora, pastilla, tablela, cápsula, solución, suspensión, gel o gelatina. En otra realización, cada principio activo en el kit de la invención está formulado en una unidad de dosificación para administración por vía intravenosa, intramuscular, transdérmca, rectal, intracavitaria o inhalada.

Una realización particular proporciona un kit que comprende MfX en una composición formulada en una unidad de dosificación que contiene 0,5 mg a 20 9 de MfX junto con excipientes y veh ículos farmacéuticamente aceptables, una estatina lipof~ica en una composición formulada en una unidad de dosificación que contiene de 10 a 100 mg de estatina liponica junto con excipientes y vehículos farmacéuticaTIente aceptables, y las instrucciones necesarias para la administración de ambas composiciones en terapia combinada para el tratamiento o prevención de recidivas de una de las enfermedades arriba mencionadas. En una realización, la unidad de dosificación de MTX contiene de 1 a 3 mg de MTX. En otra realización, la unidad de dosificación de MTX contiene de 12 a 15 9 de MTX. En ambos casos la unidad de dosificación de estatina lipof~ica puede contener una dosis de choque inicial comprendida de 40 a 80 mg o una dosis de mantenimiento comprendida de 10 a 30 mg, por ejemplo 20 mg. Dichas instrl.Cciones para la administración de las composiciones en terapia combinada pueden indicar, entre otras cosas, que las composiciones de MTX yestatina liponica se administren de manera simultánea, o bien que se administren de forma separada según un intervalo terapéuticamente efectivo. Las instrucciones pueden indicar también el régimen de administración para la terapia combinada, especificando las unidades de dosificación a administrar y los intervalos de tiempo en los que se debe administrar cada una de ellas. Las dosis e intervalos de tiempo dependerán de si el kit es para el tralamiento de la enfermedad o para prevenir la recaída del paciente. Para establecer el régimen de acrninistración de la composición de la invención se pueden tener en cuenta las recomendaciones de dosis descritas más arriba para el tratamiento combinado de la invención.

Las instru:::ciones también pueden indicar la enfermedad objeto de la terapia combinada. En una realización el kit es para el tratamiento del cáncer. En otra realización el kit es para prevenir las recidivas en pacientes que han sido tratados de cáncer. En una realización particular, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en osteosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica aguda, leucemia no linfacílica aguda, linfoma de células grandes, linfoma de alto grado, linfoma no Hodking, linfosarcoma, linfoma de Burkitt, carcinoma de mama, tumor epidermoide de cabeza, tumor epidermoide de cuello, mesotelioma pleural, carcinoma pulmonar de células pequeñas, y cáncer de la vejiga urinaria. En una realización particular el cáncer es osteosarccma. En una realización el kit es para el tratamiento de una enfermedad

autoinmune. En otra realización el kit es para la prevención de recidivas de una enfermedad autoinmune. En una realización particular, la enfermedad autoinmune es psoriasis , artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende" incluye el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctca de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1: Representación gráfica del efecto citotóxico en las células HOS del tratc:rniento combinado de MTX y simvastatina. Fue evaluado mediante el ensayo de la sulforrodamina B, usando una dosis fija de simvastatina subóptima de 0,5 ¡..1M, combinado con el MTX (barras negras, gráfico A:, y círculos negros, gráfico B) o usando sólo dosis crecientes de MTX, hasta una concentración máxima de 100 nM durante 48 horas (barras blancas, gráfico '" y circulas blancos , gráfico B) sin la simvastatina. Se tomaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media ~ la desviación estándar. En ordenadas se representa la supervivencia expresado en tanto por ciento yen abscisas la concentración de MfX.

Figura 2: Representación de la tabla en las que se resumen los porcentajes de supervivencia entre el tratamiento sin (columna A) y con simvastatina (columna B) y la diferencia entre ambos (columna C) de células HOS a una corcentración de 0,5 !-1M de simvastatina. La columna de la izquierda representa las dosis empleadas de MfX.

Figura 3: Representación gráfica del efecto citotóxico sobre células HOS del tratamiento combinado de MTX y simvastatina. Fue evaluado mediante el ensayo de la sulforrodamina B, usando una dosis fija de si11vastatina subóptima de 1 IJM, combinado con el metotrexato (barras negras , gráfico A, y círculos negros, gráfico B) o usando sólo dosis crecientes de metotrexato, hasta una concentración máxima de 100 nM durante 48 horas (barras blancas , gráfico A:, y círculos blancos, gráfico B) sin la si'nvastatina. Se tomaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media ~ la desviación estándar. En ordenadas se representa la supervivencia expresado en tanto por ciento y en abscisas la concentración de MfX.

Figura 4: Representación gráfica (A) y de la tabla (8) en las que se resumen los porcentajes de supervivencia de células HOS entre el tratamiento sin (1) y con simvastatina (2) y la diferencia entre ambos (3) a una concentración de 1 ¡..1M simvastatina. La columna de la izquierda representa las dosis empleadas de MfX

Figura 5: Representación gráfica (A) y de la tabla (B) en las que se resumen las diferencias

(3) en los porcentajes de supervivencia de células HOS entre los tratamientos con simvastatina a dosis de 0,5 ~M (1) Y de 1 ~M (2). La columna de la izquierda representa las dosis empleadas de MTX.

Figura 6: Representación gráfica en la que se evalúa la capacidad proliferativa de las células de osteosarcoma HOS sometidas a tratamiento con 0,5 ¡..1M simvastatina (2), con 50 nM metotrexato (3) o con ambos (4) respecto a las células control (1) durante 72 horas (eje de abscisas). El efecto fue evaluado mediante el contaje del número total de células (viables y no viables) en la cámara de Neubauer (eje de ordenadas) mediante la técnica del marcaje con el Tripan Blue. Se tcmaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media + la desviación estándar.

Figura 7: Representación gráfica en la que se evalúa la inducción de muerte celular en las células de osteosarcoma HOS sometidas a tratamiento con 0,5 ¡..1M simvastatlna (2), con 50 nM metotrexato (3) o con ambos (2) durante 72 horas (eje de abscisas) en relación a los controles (1). El efecto fue evaluado mediante el contaje del número células no viables en la

cámara de Neubauer (eje de ordenadas) mediante la técnica del marcaje con el Tripan Blue. Se tomaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media .:t la desviación estándar.

Figura 8: Representación gráfica de los cambios morfológicos de las células de osteosarcoma HOS sometidas a trat<miento con 0,5 ~M simvastatina (2), con 50 nM metotrexato (3) o con ambos (4) durante 48 (panel A) y 72 horas (panel B), respecto a los controles (1). Obsérvese como el MTX (3) produce células agrandadas e incluso con dos núcleos (flecha continua); la SV (2) produce células redondeadas (flecha discontinua); y ambas drogas (4) producen ambcs efectos .

Figura 9: Representación gráfica de la evolución del número total de las células de osteosarcoma HOS (A) o del número de células muertas (B) sometidas a tratamiento con 1 I-lMde simvastatina (2), con 100 nM de metotrexato (3) o con ambos (4) durante 48 horas en relación al control (1). El efecto fue evaluado mediante el contaje del número total de células (eje de ordenadas de la gráfica A) y de las Tripán Blue positivas (eje de ordenadas de la gráfica B) en la cámara de Neubauer mediante la técnica del marcaje con el Tripan Blue. Se tomaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media .:!:. la desviación estándar.

Figura 10: Representación gráfica de la evolución del número total de las células de osteosarcoma HOS (A) o del número de células muertas (B) sometidas a tratamiento con 0,5 ¡..1M de simvastatina (2), con 50 nM de metotrexato (3) o con ambos (4) durante 72 horas en relación al control (1). El efecto fue evaluado mediante el contaje del número total de células (eje de ordenadas de la gráfica A) y de las Tripán Blue positivas (eje de ordenadas de la gráfica B) en la cámara de Neubauer mediante la técnica del marcaje con el Tripan Blue . Se tomaron medidas por triplicados y los datos se representaron mediante la media .:!: la desviación estándar.

Figura 11: Representación gráfica de los cambios en el ce lo celular de las células HOS tratadas a dosis crecientes de MTX durante 24 horas . G1 . 1 = control (en todos los dibujos control implica OnM); 2 = 10 nM; 3 = 50 nM; 4 = 100 nM; 5 = 200 nM Destaca la caída en la fase S y en el número de células en fase G2JM, con acúmulo subsiguiente en la fase G1.

Figura 12: (A) Representación gráfica de los cambios en el celo celular de las células HOS tratadas a dosis crecientes de MfX durante 24 horas. En abscisas se representan las concentraciones de MfX 1 = control; 2 = 10 nM; 3 = 50 nM; 4 = 100 nM; y 5 = 200 nM; (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones de MTX

anteriormente referidas. (C) Diferencias porcentuales de los valores obtenidos en cada fase del ciclo respecto al control. a = 10 nM vs control; b = 50 nM vs control; e = 100 nM vs control; y d = 200 nM vs control. La caída en la fase S osciló entre un 9,38% y un 35,46% respecto al control. La fase G2JM descendió entre un 6,30% y un 55, 46% respecto al control, mientras que las células en fase G1 se incrementó su número entre un 1,89% Y un 42,00% respecto al control.

Figura 13: Representación gráfica de los cambios en el celo celular de las células HOS tratadas a dosis crecientes de SV durante 24 horas. 1 = control; 2 = 0,2 !-1M; 3 = 0,5 IJM; 4 = 1 ~M; 5 = 2 ~M; 6 = 5 ~M; Y 7 = 1O ~M. Destaca la caída en la fase S yen el número de

células en fase G1 , con acúmulo subsiguiente en la fase G2IM.

Figura 14: Representación gráfica de los cambios en el celo celular de las células HOS tratadas a dosis crecientes de SV durante 24 horas. En abscisas se representan las concentraciones de SV: 1 = control; 2 = 0,2 ~M ; 3 = 0,5 ~M ; 4 = 1 ~M; 5 = 2 ~M; 6 = 5 ~M; Y 7 = 10 IJM. (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones de SV anteriormente referidas . (C) Diferencias porcentuales de los valores obtenidos en cada fase del ciclo respecto al control. a = 0,2 IJM vs control; b = 0,5 IJM vs control; c = 1 IJ M vs control; d = 2 IJ M vs control; e = 5 IJ M vs control; y f = 1°IJ M vs control. La caída en la fase S osciló entre un 0,41 % y un 22,53% respecto al control. La caída en la fase G1 osciló entre un 7,85% y un 48,28% respecto al control. La fase G2IM ascendió entre un 9,32% y un 97, 65% respecto al control.

Figura 15: Representación gráfica de los cambios en el cClo celular de las células HOS tratadas una combinación de SV y de MTX durante 24 horas. En abscisas se representan las concentraciones de los tarmocos: 1 = control; 2 = SV 11M ; 3 = MfX 50nM ; 4 = SV 1 IJM + MTX 50 nM. (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones anteriormente referidas. (C) Diferencias porcentuales de los valores

obtenidos en cada fase del ciclo respecto al control. a = SV 1 IJM vs control; b = MTX 50 nM vs control ; c crnbos 'vS control. La caída en la fase S osciló entre un 4,10% y un 12,10% respecto al control. La fase G1 descendió un 19,60 con la SV, pero aumento un 15,11 % respecto al control cuando se combinó con el MTX. En la fase G2IM se acumuló un 40,92%

cuando se trató sólo con SV, pero descendió un 33 ,90% respecto al control cuando se combinó con el MTX.

Figura 16: Representación gráfica de los cambios en el pico SubGO de las células HOS tratadas con MTX durante 48 horas. 1 =control; 2 =MTX 10 nM; 3 =MTX 20 nM ; 4 =MTX 50 nM; 5 = MTX 100 nM; 6 = MTX 200 nM; Destaca el importante cambio en el perfil de la región G1-G2IM y la aparición incipiente del pico SubGo a una concentración de MTX 20 nM (3), indicativo de muerte celular por apoptosis.

Figura 17: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubGO y en la región G1G2IM de las células HOS tratadas a dosis crecientes de MTX durante 48 horas. En abscisas se representan las concentraciones de MTX: 1 = control; 2 = 10 nM; 3 = 20 nM; 4 = 50 nM; 5 = 100 nM; y 6 = 200 nM. (B) Valores absolutos en cada una de las regiones estudiadas a las concentraciones de MTX anteriormente referidas. (C) Incrementos o disminuciones de los valores obtenidos en cada una de las regiones estudiadas respecto al control. a = 10 nM vs control; b = 20 nM vs control; c = 50 nM vs control; d = 100 nM vs control; ye = 200 nM vs control. Destaca el importante incremento en el número de células cuantificadas en la fase SubGO a dosis superiores a los 50 nM de MfX.

Figura 18: Representación gráfica de los cambios en el pico SubGO de las células HOS tratadas con SV durante 48 horas. 1 =control; 2 =SV 0,2 ~M ; 3 =SV 0,5 ~M ; 4 =SV 1,0 ~M ; 5 =SV 2,0 ~M ; 6 =SV 5,0 ~M ; 7 =SV 10 ~M. Destaca el importante cambio en el perfil de la reglón G1-G2IM y la aparición del pico SubGo a una concentración tan baja de SV 0,2 IJM (2), siendo máxima a 10 IJM de SV, indicativo de muerte celular por apoptosis.

Figura 19: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubGO y en la región G1G2IM de las células HOS tratadas a dosis crecientes de SV durante 48 horas. En abscisas se representan las concentraciones de SV: 1 = control; 2 = 0,2 IJM; 3 = 0,5IJM; 4 = 1,0 IJM; 5 =2,0 ~M; 6 =5,0 ~M; Y 7 =10 ~M. (B) Valores absolutos en cada una de las regiones estudiadas a las concentraciones de SV anteriormente referidas. (C) Incrementos o disminuciones de los valores obtenidos en cada una de las reglones estudiadas respecto al control. a = 0,2 IJM vs control; b = 0,5 IJM vs control; c = 1,0 IJM vs control; d = 2,0 IJM vs control; e = 5,0 IJM vs control; y F = 10 IJM vs control. Destaca el inportante incremento en el número de células cuantificadas en la fase SubGO a dosis superiores a los 0,21JM de Sv.

Figura 20: (A) Representación de los histogramas de los cambios en el pico SubGO y la región G1-G2IM de las células HOS tratadas una combinación de SV y de MTX durante 48 horas. 1 = control; 2 = MTX 30 nM ; 3 = SV 0,5 ~M; 4 = MTX 30 nM + SV 0,5 ~M

Figura 21: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubGO y la región G1-G2IM en las células tratadas con una combinación de SV y de MTX durante 48 horas. En abscisas se representan las concentraciones de los fármacos: 1 = control; 2 = MfX 30nM; 3 = SV 0,5 ~f,,\ 4 = MTX 30 nM + SV 0,5 ~M. (B) Valores absolutos en el pico SubGO y la región G1G2JM a las concentraciones de los fánnacos: 1 = control; 2 = MfX 30nM ; 3 = SV 0,5 tJM; 4 = MfX 30 nM + SV 0,5 !-1M. (C) Incrementos o disminuciones de los valores obtenidos en cada una de las regiones estudiadas respecto al control. a = MTX 30 nM vs control ; b = SV

0,5 IJM vs control; e ambos vs control. Destaca un incremento de hasta 6 veces el número de células en el pico SubGO (muerte celular) cuando se combinan ambos tratamientos.

Figura 22: Representación gráfica de los cambios en la apotosis celular de las células HOS a las 24 horas (A) ya las 36 horas (B) con la técnica de DNA ladder. 1 = control; 2 = SV 0,5 ~f,,\ 3 = MTX 50nM; 4 = MTX 50 nM + SVO,5 ~M.

EJEtvPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada y no han de ser interpretados como limitativos del alcance de la invención. En la medida en que se mencionan materiales específicos , es meramente para fines de ilustración y no se pretende limitar la invención. Un experto en la técnica puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invención.

Ejemplo 1. Cultivo de líneas celulares de osteosarcoma

La línea celular de osteosarcoma de rata UfvR-106 y humana HOS se cultivaron en medio RPMI 1640. La línea celular de osteosarcoma hlfTlana rvG-63 se cultivó en medio DfvEN. Todos los medios de cultivo se suplementaron con el FBS al 10%, 2 mM glutamina, 100 unidades/mi de penicilina y 100 ~g/ml de estreptomicina. Las condiciones de mantenimiento de todas las líneas celulares empleadas fueron 37° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2• Las líneas tumorales se obtuvieron desde AlCC (American Type Culture Collection) y se cultivaron acorde las condiciones recomendadas .

Ejemplo 2. Ensayo de supervivencia celular.

5 Las líneas celulares de osteosarccma se cultivaron con dosis de MfX de 10, 20, 30, 40, 50 60, 80 Y 100 nM y la simvastatina a dosis de 0,5 ~M Y 1 ~M. La supervivencia celular se cuantificó mediante la técnica de la sulforrodamina B (SRB), que es un ensayo calorimétrico, no radiactivo, de cuantificación espectrofotométrica basado en la unión electrostática de la SRB a los aminoácidos básicos fijados con ácido tricloroacético (TeA).

S03

Estructura de la SRB.

Para ello, las lineas celulares tumorales UWR-106, HOS, MG-63 se cultivaron a una

15 densidad de 5 x 103 células/pocillo en 200 !JI de medio de cultivo suplementado con 10% FBS en placas noventa y seis pocillos y crecidas durante 24, 48 o 72 horas. Una vez terminado el experimento se retiró el medio por decantación. Tras añadir 50 ¡JI /pocillo de TeA (100 mL TeA 100% (p/v) + 900 mL H,O Elix, 2_5' e) al10 % frío, se incubó durante 30 minutos a 4° C para fijar ccmpletamente las células al fondo del pocillo. Luego se elim inó el

20 TCA por decantación y se lavó suavemente con agua fría corriente al menos 4 veces , garantizando que todos los pocillos se lavaban por igual. A continuación se invirtieron las placas y se pusieron boca abajo contra varias capas de papel secante de manos , garantizando la eliminación de casi toda el agua hasta el día siguiente. A continuación se añadió 40 ~I de una solución de Sulforrodamina B (Sigma S-9012, 4 gr SRB + 1 L de

25 Acético a11% (vol/vol), a temperatura ambiente) al 0,4 % (peso/vol) en 1% (vol/vol) de Ácido acético, evitando hacerlo con luz directa (la SRB es fotosensible). Se dejó incubando a temperatura ambiente 30 minutos. Seguidamente se decantó el colorante y se lavaron los pocillos al menos 4 veces con Ácido Acético a11% (vol/vol, 100 mL Acético + 10L H20 Elix.), asegurándonos de eliminar cualquier traza de colorante que no esté unido a las células.

30 Luego se eliminaron los restos de Acético sacudiendo con firmeza contra varias capas de papel secante hasta el día siguiente en oscuridad. Se añadieron 150 ¡JI de TRIS:BASE 10 mM (pH 10,5, 100 mL TRlS.Base 100mM + 900 mL de H,O Hellix) y se dejó 10 minutos a temperatura ambiente para garantizar que se disolvía completamente el colorante. Por

último, se realizó la medición en el Dual Lector multiplaca a 492 nm (pico absorción de la SRB) y a 620 nm (para eliminar posibles interferencias provocadas por pequeñas variaciones de volumen, suciedad o imperfecciones de la placa). Antes de la medición es necesario realizar una agitación rápida de la placa.

Los resultados de los ensayos de supervivencia celular pueden observarse en las figuras 1

5. Los resultados reflejan que la simvastatina permite disminuir significativamente la dosis efectiva del MfX cuando se co-administran. Este efecto es especialmente relevante a concentraciones bajas de MfX, entre Oy 30 nM de MfX.

Ejemplo 3. Ensayo de viabilidad celular.

Las células HOS se cultivaron en medio de cultivo suplementado con 5-10 % de suero fetal bovino ¡nactivado por calor y 2 mM en L-glutamina, a 37 oC, 95% de humedad y 5% de atmósfera de CO2. Las células fueron tratadas con 0,51JM de simvastatina y con 50 nM de MfX durante 24 , 48 Y 72 horas. Las células se recogieron por tripsinización. Para ello, primero se aspiró el medio de cultivo; se lavaron las células con 2-3 mL de PBS (estéril); se añadió 0,5--1 mL de disolución de tripsina-EDTA (estéril); se incubó a 37° e durante 5

minutos; se recogieron las células con 5 mL de medio de cultivo fresco; y se colocó la suspensión en un tubo de 15 mL estéril. Para determinar la viabilidad celular se empleó la tinción con azul tripán. El azul tripán es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana . .Así pues las células que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Para ello, se mezcla en un tubo de 1,5 mL, 50 IJL de disoluóh de azul tripán y 5{}L de suspenson de células. Se homogeneiza la mezcla y se colocan 10 IJL en ámara de Neubauer. Se cuentan las células totales y las células no viables (teñidas completamente de azul).

Los resultados de los ensayos de viabilidad celular pueden observarse en las figuras 6, 7, 8, 9 Y 10.

De estos experimentos se concluye que la simvastatina tiene un efecto predominante sobre la inducción de muerte celular; que el metotrexato afecta preferentemente al freno de la proliferación celular; y que cuando se aplican ambos tratamientos, se produce más freno de la proliferación y más muerte celular que cuando aTIbas tratamientos se administran por separado.

Ejemplo 4. Detección de apoptosis.

La detección y cuantificación de apoptosis se llevó a cabo mediante el ensayo de la fragmentación del AON y mediante citometría de flujo con Anexina-V/ IP.

4.1. Ensayo de la fragmentación del ADN (Ladder DNA). La línea celular tumoral UfvR-106 se cultivó a una densidad de 2 x 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos durante dos y tres días. Seguidamente, el cultivo celular se incubó con simvastatina a 0,5 IJM Y MTX 50 nM durante 24 y 48 horas . Después de la obtención de las células en cada condición experimental en tubos de microcentrífuga, las células se lisaron en 200 1-11 de tampón conteniendo Tris/HcI 10 mM pH 8,0, EDTA 1mM, Tritón X-100 0,2% Y se centrifugaron a

12.000 x 9 durante veinte minutos en la microcentrífuga Biofuge Stratos, Heraeus Instruments. Las muestras se incubaron con RNasa (Sigma) para eliminar su contenido en RNA, a la concentración final de 5 mg/ml durante una hora a 37° C y con proteinasa K (Sigma) (20mglml) durante una hora a 37° C. Después de varios lavados cuyo componente principal era el fenol, las muestras se precipitaron con 2 volúmenes de etanol absoluto a-20° C durante 12 horas como mínimo. Nuevamente se centrifugó a 12.000 x 9 y se lavaron las condiciones experimentales con etanol 70% para añadir 50 1-11 de Buffer TE conteniendo Tris/Hcl 10 mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0. Se analizaron en un gel de agarosa 1%. El contenido de DNA de 123 bp fue teñido con bromuro de etidio y visualizado mediante un sistana con luz UV (Bio Imaging System-Syngene). Los análisis densitométrcos se llevaron a cabo usando un software de dominio público Scion Image Beta 4.02 para Windows.

Los resultados del ensayo de fragmentación del ADN pueden observarse en la figura 22. Obsérvese la potenciocién de la respuesta apoptética cuando las células se tratan con SV y MfX.

4.2. Citometría de flujo con Anexina-V/IP. Para detectar y cuantificar las células bajo condiciones de apoptosis se empleó el kit AnnexinV-FfTC Apoptosls Detection Kit (Ref: 556547, Becton Dickinson Pharmingen TM). Las células se sembraron en placas de 6 pocillos durante tres días. Se trataron con simvastatina a 0,5 I-IM Y MfX 50 nM durante 24 y 48 horas. Después se incubaron con 100 1-11 del tampón de unión que contiene 4 1-11 de anexina conjugada con isotiocianato de fluoroceina (anexinaV-FITC) y 10 ~I de ioduro de propidio durante quince minutos en la oscuridad y a temperatura anbiente. Se

resuspendieron en 400 1-11 del mismo tampón de unión y conservadas en la oscuridad. Se analizaron mediante citómetro de flujo FACSCalibur (Bectan Dickinson, San Jose, CA) y los histogramas se cuantificaron mediante el software Cell Quest (Becton Dickinson). Bajo estas condiciones y con el fin de distinguir los procesos apoptéticos de los procesos necráticos y de descartar la viabilidad celular, cada uno de los resultados se ha representado bajo la siguiente formulación:

% células = Anexina V-FITC+ IP-J IP-

Siendo IP-la suma de las células consideradas como viables (Anexina V-FrfC-IP-) y las células que se encuentran en estadías de apoptosis temprana (Anexina V-FrrC+ IP-).

Los resultados de los ensayos de apoptosis mediante citometría de flujo pueden observarse en las figuras 16-22. Los resultados indican que la combinación de los dos fármacos induce mayor muerte celular que cuando se administran por separado.

5. Análisis del ciclo celular.

Para analizar los cambios en la distribución del ciclo celular, las células se sembraron y se trataron bajo las mismas condiciones que las empleadas con la tinción anexina-V. Las células tratadas y no tratadas se resLSpendieron en NP-40 al 1% disuelto en PBS conteniendo, además, 50 ¡Jg/ml de IP a la densidad de 3 x 105 células/muestra. Después de 15 minutos de incubación en oscuridad y a temperatura anbiente, se llevaron a cabo el análisis y la cuantificación de cada una de las condiciones experimentales siguiendo la misma metodología que la empleada en los experimentos de apoptosis por tinción con anexina-V (citómetro de flujo F ACSCalibur y software Cell Quest).

Los resultados de los estudios de cambios en la distribución del ciclo celular pueden observarse en las figuras 11-15. Los resultados indican que el MfX provoca esencialmente una parada del ciclo en fase G1 ; que la SV para el ciclo en fase G2JM; y que la combinación de ambos para el ciclo en ambas fases con una caída importante en la síntesis de ADN, evitando con la combinación que la célula pueda escapar del control sobre el ciclo celular.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásK::8, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatcmiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento o prevención comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofílica y el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa.
2.

Uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis , donde dicho medicamento es para uso en terapia combinada con una estatina lipofílica.
3.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el cual el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa se administra simultáneamente con la estatina lipofílica.
4.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el cual el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa y la estatina I¡pof~ica se administran de forma separada, en cualquier orden ycon un intervalo terapéuticamente efectivo.
5.

Uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y de una estatina lipofílica para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis , dermatomiositis y sarcoidosis.
6.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el cual el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa es metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el cual el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa se administra con una frecuencia comprendida de 1 y 5 semanas y la estatina liponica se administra con una frecuencia comprendida de 1 y 7 días.
8.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el cual la estatina lipof~ica se selecciona del grupo que consiste en simvastatina, f1uvastatina, atorvastatina, lovastatina y sales farmacéuticamente aceptables de las mismas.
9.

Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el cual el cáncer se selecciona del grupo que consiste en osteosarccma, corioadenoma destruens, coriocarcinoma, mola hidatidiforme, leucemia linfacítica aguda, leucemia no linfocítica aguda, linfoma de células grandes, linfoma de alto grado, linfoma de alto grado, linfoma no Hodking, linfosarcoma, linfoma de Burkitt, linfoma de células T cutáneo, cáncer de mama, cáncer de ovario, tumor epidermoide de cabeza, tumor epidermoide de cuello, mesotelioma pleural, carcinoma pulmonar de células pequeñas y cáncer de la vejiga urinaria.
10.

Uso según la reivindicación 9, en el cual cuando el cáncer es leucemia linfocítica aguda se administra una cantidad del inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa comprendida de 1 a 3 mg/m2 de superficie corporal y una cantidad de estatina lipofnica comprendida de 20 a 80 mgl m2 de superficie corporal.
11.

Uso según la reivindicación 9, donde cuando el cáncer es osteosarcoma se administra una cantidad del inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa comprendida de 12 a 15 g/m2 de superficie corporal y una cantidad de estatina lipofílica comprendida de 20 a 80 mg/ m2 de superficie corporal.
12.

Composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed;

o una sal farmacéuticanente aceptable del mismo; y una estatina lipofílica junto con excipientes y/o veh ículos farmacéuticanente aceptables.
13.

Composición según la reivindicación 12, en la cual el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa es metotrexato o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14.

Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12-13 que es para administra:ión por vía oral.
15.

Composición según la reivindicación 14, la cual está formulada en forma de comprimido.
16.

Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12-13 que es para administroción por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, rectal, intracavitaria, o inhalada.
17.

Composición según cualquiera de las reivindicaciones 12-16, la cual está formulada en

10 una unidad de dosificación que comprende de 1 mg a 15 9 del inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa y de 20 a 80 mg de estatina lipofHica.
18. Composción según cualquiera de las reivindicaciones 12-17, en la cual la estatina

lipataiea se selecciona del grupo que consiste en simvastatina, fluvastatina, atorvastatina, 15 lovastatina y sales farmacéuticaTIente aceptables de las mismas.
19. Un kit que comprende una primera composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; una segunda composición farmacéutica que comprende una estatina lipofílica; e instrucciones para el uso de ambas composciones farmacéuticas en la terapia combinada para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis.