ES2880444T3 - Combinación de metotrexato y simvastatina para su uso en el tratamiento del osteosarcoma - Google Patents

Combinación de metotrexato y simvastatina para su uso en el tratamiento del osteosarcoma Download PDF

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Abstract

La invención proporciona el uso de un inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa seleccionado del grupo que consiste en metotrexato, trimetrexato y pemetrexed; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o para la prevención de recidivas de una enfermedad seleccionada entre el grupo que consiste en cáncer, psoriasis, artritis psoriásica, artritis juvenil poliarticular, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, polimiositis, dermatomiositis y sarcoidosis, donde dicho tratamiento o prevención comprende administrar a un sujeto de manera simultánea, separada o secuencial una estatina lipofílica y el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende el inhibidor de la enzima dihidrofolato reductasa y la estatina lipofílica junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de metotrexato y simvastatina para su uso en el tratamiento del osteosarcoma
La presente invención se refiere a una terapia mejorada para el tratamiento del osteosarcoma mediante la combinación de metotrexato y simvastatina.
Estado de la técnica
El metotrexato (ácido (2S)-2-[(4-{[(2,4-diaminopteridin-6-il)metil](metil)amino}benzoil)amino]pentanodioico, número CAS 59-05-2, fórmula I, abreviado como MTX) es un antimetabolito que tiene actividad antiproliferativa y antiinflamatoria mediante la inhibición competitiva de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima que regula el folato intracelular disponible para la síntesis de ácidos nucleicos en la fase S del ciclo celular y que impide la conversión de la homocisteína en metionina durante la síntesis de proteínas.
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El MTX se usa como primera opción de quimioterapia para determinadas enfermedades neoplásicas, tales como el osteosarcoma. Se administra para diversos trastornos neoplásicos a dosis muy elevadas (de 3 a 12 g/m2 de área superficial del paciente), en pacientes con función renal normal y se administra con hiperhidratación (3 l/m2 de área superficial del paciente) y alcalinización. También se usa para el tratamiento de algunas enfermedades inflamatorias, incluida la artritis psoriásica y la artritis reumatoide.
Algunos documentos de la técnica anterior divulgan el uso de MTX en diferentes tratamientos, por ejemplo:
• DATABASE BIOSIS PREV201000353490 04 Lupus 2013, 12, 607, que divulga el tratamiento de pacientes diagnosticados de linfoma primario del sistema nervioso central (LPSNC) con metotrexato (MTX) y una estatina, incluida la atorvastatina, la simvastatina y la fluvastatina;
• Eur. J Pharmacol. 2013, 713, 47, que divulga el tratamiento del carcinoma sólido de Ehrlich en ratones, usando una combinación de metotrexato (MTX) y atorvastatina;
• J. Rheumatol. 2011, 38, 229, que divulga el tratamiento de pacientes que tienen artritis reumatoide (AR) con combinaciones de metotrexato (MTX) y atorvastatina;
• Lupus 2013, 12(8), 607, que divulga el tratamiento de pacientes que tienen artritis reumatoide (AR) con tratamiento concurrente con metotrexato y atorvastatina o simvastatina;
• el documento US 2004/013643, que divulga el tratamiento de la esclerosis múltiple con combinaciones de una estatina y un agente para combatir la esclerosis múltiple.
Sin embargo, es un fármaco que, en ocasiones, produce efectos secundarios adversos significativos e intensos que determina una elevada morbimortalidad en pacientes que usan el fármaco. En algunos casos fuerza incluso a interrumpir la quimioterapia de manera anticipada en una tercera parte de los pacientes, a pesar de la inclusión de un rescate adecuado con ácido folínico.
Se ha descrito mielosupresión, mucositis y neurotoxicidad con encefalopatía aguda o crónica en pacientes tratados con MTX. La encefalopatía aguda se desarrolla generalmente en un 3-15 % de los pacientes en los 5 a 14 primeros días tras comenzar el tratamiento y puede incluir cefaleas, náuseas, vómitos, letargia, alteración del estado mental, visión borrosa, afasia, hemiparesia y convulsiones. En estos casos, la mayoría de pacientes vuelven a comenzar el tratamiento con MTX sin consecuencias neurológicas permanentes, aunque un 10-56 % puede experimentar recidivas tras la reexposición. También puede producirse encefalopatía crónica, que se desarrolla lentamente, puede progresar y puede dañar permanentemente la función neurológica.
La administración de altas dosis de MTX es de vital importancia en niños afectados por osteosarcomas. En estos casos, el retraso en la eliminación de MTX y la exposición prolongada a este fármaco pueden causar una toxicidad significativa, principalmente insuficiencia renal aguda causada por una obstrucción renal secundaria causada por el depósito de cristales de MTX y sus metabolitos (17-hidroximetotrexato) en los túbulos renales o incluso a causa de la toxicidad directa del agente farmacéutico a estos túbulos.
Por tanto, estos problemas requieren encontrar tratamientos que sean capaces de reducir los efectos secundarios dañinos del tratamiento con MTX, a la vez que se conserva o mejora su actividad.
Explicación de la invención
El inventor ha descubierto que el uso combinado de simvastatina y metotrexato (MTX), produce un efecto sinérgico en el tratamiento o la prevención del osteosarcoma. Como se demuestra en los ejemplos proporcionados más adelante, el uso de simvastatina en politerapia con MTX refuerza el efecto antitumoral del MTX, lo que permite reducir la dosis de MTX sin afectar a la eficacia del tratamiento. Este tratamiento combinado aporta grandes beneficios para los pacientes que padecen osteosarcoma ya que, como consecuencia de la exposición a menores dosis del inhibidor de DHFR, estos pacientes tienen menos efectos secundarios, sin que se vea afectada la eficacia del tratamiento.
Por lo tanto, un primer aspecto de la invención proporciona metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento del osteosarcoma, en donde dicho tratamiento comprende administrar de manera simultánea, por separado o secuencialmente a un sujeto metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y simvastatina.
Puede usarse cualquier sal farmacéuticamente aceptable para los fines de la invención. La expresión "sal farmacéutica aceptable" se refiere a sales preparadas a partir de bases farmacéuticamente aceptables no tóxicas. No hay limitaciones con respecto a estas sales, salvo que cuando se utilicen con fines terapéuticos deben ser farmacéuticamente aceptables.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos para el tratamiento combinado de la invención pueden prepararse utilizando métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse a partir del compuesto precursor, que contiene una porción ácida o básica, utilizando métodos convencionales en la práctica de la química. Por lo general, estas sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar el ácido o la base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométricamente adecuada del ácido o la sal farmacéuticamente aceptable en presencia de agua o un disolvente orgánico o una mezcla de ambos. Cuando las sales se preparan a partir de los compuestos básicos precursores, estas sales se preparan a partir de los ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluidos ácidos orgánicos o inorgánicos. Estos ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, benzosulfónico, benzoico, canforsulfónico, cítrico, etanosulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bromhídrico, clorhídrico, láctico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico y ptoluenosulfónico.
La invención también incorpora aquellos compuestos para su uso en terapia combinada que pueden estar en su forma cristalina, ya sean compuestos en solvatación libre o como soluciones (por ejemplo, hidratos). Los métodos de solvatación son bien conocidos en la técnica.
La combinación de la presente invención proporciona una ventaja adicional que consiste en la posibilidad de utilizar el tratamiento combinado no solo con fines terapéuticos sino también con fines preventivos, específicamente, con el objetivo de prevenir las recidivas (o recaídas) en los pacientes que han respondido satisfactoriamente a un tratamiento previo para el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria.
Los efectos secundarios del uso y la administración de inhibidores de DHFR, como el MTX, según la práctica clínica actual son considerables, hasta el punto de que no se contempla su uso en pacientes en los que la patología está en remisión o ha desaparecido gracias a un tratamiento previo. Al tener la capacidad de utilizar concentraciones más bajas de, por ejemplo, MTX con una mayor eficacia terapéutica, el tratamiento combinado de la invención puede utilizarse para evitar una recidiva en el paciente que ha experimentado remisión con una terapia anterior para el tratamiento de una enfermedad que se beneficia de la administración de MTX, tal como, por ejemplo, un cáncer. En este sentido, cabe destacar que el inventor ha descubierto que el refuerzo del efecto del inhibidor de DHFR por la estatina lipófila es particularmente relevante a bajas dosis, especialmente a dosis de MTX que comprenden de 1 a 3 mg/m2 de superficie corporal del paciente.
Como resultará evidente para un experto en la materia, la presente terapia combinada de la invención es eficaz no solo cuando los ingredientes activos, el metotrexato y la simvastatina, se utilizan en una única composición, pero también cuando se utilizan dos composiciones diferentes, independientemente de que se administren simultáneamente o por separado en cualquier orden y con un intervalo terapéuticamente eficaz. Además, un experto en la materia entenderá que el metotrexato puede prescribirlo por un médico especialista para su uso junto con la simvastatina en una terapia combinada con el propósito de tratar o prevenir las recidivas del osteosarcoma.
La presente invención prevé que en el tratamiento combinado se administren simultáneamente el inhibidor de DHFR y la estatina lipófila. La invención también prevé que el inhibidor de DHFR y la estatina lipófila se administren por separado, en cualquier orden y con un intervalo terapéuticamente eficaz. El intervalo terapéuticamente eficaz dependerá en gran medida de la enfermedad considerada y de si el objetivo es el tratamiento o la prevención de las recidivas, pero siempre teniendo en cuenta que gracias a la combinación con la estatina lipófila, la cantidad de inhibidor de DHFR administrada al paciente es mucho menor que en el tratamiento convencional.
La dosis de MTX puede estar comprendida entre 0,5 mg/m2 de superficie corporal del paciente y 20 g/m2 de superficie corporal del paciente y la dosis de simvastatina puede estar comprendida entre 10 y 100 mg. La dosis aproximada dependerá de la enfermedad del paciente y de si el objetivo de la terapia es el tratamiento o la prevención de las recidivas. Para el tratamiento del osteosarcoma, se puede administrar una dosis de MTX que comprenda de 12 a 15 mg/m2 de superficie corporal del paciente, es posible administrar una dosis inicial alta de la estatina lipófila que comprende de 40 a 80 mg y una dosis de mantenimiento que comprende de 10 a 30 mg, por ejemplo, 20 mg. Para la prevención de las recidivas del osteosarcoma, es posible administrar una dosis de MTX que contenga de 3 a 20 mg/m2 de superficie corporal del paciente y 20 mg de simvastatina.
De manera similar, la pauta posológica dependerá de la enfermedad en cuestión y de si el objetivo es el tratamiento o la prevención de las recidivas de esta enfermedad. En general, en el tratamiento combinado de la presente invención, el MTX puede administrarse con una frecuencia que comprende de 1 a 5 semanas y la simvastatina puede administrarse con una frecuencia que comprende de 1 a 7 días. Por ejemplo, cuando el objetivo del tratamiento combinado es el tratamiento del osteosarcoma, es posible administrar una dosis de MTX que comprenda de 12 a 15 mg/m2 de superficie corporal del paciente cada 14 días. En ambos casos, es posible una dosis inicial alta de simvastatina que comprende de 40 a 80 mg y una dosis de mantenimiento que comprende de 10 a 30 mg, por ejemplo, 20 mg. Por ejemplo, cuando el objetivo de la terapia de la invención es la prevención de las recidivas del osteosarcoma, es posible administrar una dosis de MTX que contenga de 3 a 20 mg/m2 de superficie corporal del paciente y 20 mg de simvastatina cada semana.
Como se ha mencionado anteriormente, el MTX y la simvastatina en el sentido del tratamiento combinado de la invención pueden administrarse de manera simultánea, secuencial o por separado. En el caso de que la administración pueda ser simultánea, los fármacos pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o cada fármaco puede formar parte de una composición farmacéutica diferente.
Un aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del osteosarcoma que comprende metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y simvastatina junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, en donde la composición se administra en una unidad de dosificación que comprende de 1 a 15 mg de metotrexato y de 20 a 80 mg de simvastatina.
La expresión "excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables" se refiere a materiales, composiciones o vehículos farmacéuticamente aceptables. Cada componente debe ser farmacéuticamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes en la composición farmacéutica. También deben ser adecuados para su uso en contacto con los tejidos y órganos de los seres humanos y animales sin producir excesiva toxicidad, irritación, reacciones alérgicas, inmunogenicidad u otros problemas o complicaciones en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable.
La composición de la invención puede formularse en una unidad de dosificación para administración oral. En una realización específica, la unidad de dosificación para administración oral es un comprimido, píldora, polvo compacto, pastilla para chupar, cápsula, solución, suspensión, gel o gelatina. En otra realización, la composición de la invención se formula en una unidad de dosificación para administración por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, rectal, por vía intracavitaria o por inhalación.
A la hora de establecer el régimen de administración de la composición de la invención, deben tenerse en cuenta las recomendaciones de dosificación antes mencionadas para el tratamiento combinado.
Cuando la administración de metotrexato y simvastatina es secuencial o por separado, cada fármaco se formulará en una composición diferente y pueden presentarse en un kit, junto con instrucciones adecuadas para su administración en el tratamiento o la prevención de las recidivas del osteosarcoma.
Cada principio activo en el kit de la invención, el inhibidor de DHFR y la estatina lipófila, pueden formularse en una unidad de dosificación para administración oral. En una realización específica, la unidad de dosificación para administración oral es un comprimido, píldora, polvo compacto, pastilla para chupar, cápsula, solución, suspensión, gel o gelatina. En otra realización, cada principio activo en el kit de la invención se formula en una unidad de dosificación para administración por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, rectal, por vía intracavitaria o por inhalación.
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo únicamente ilustrativo. Además, la presente invención incluye todas las posibles combinaciones de realizaciones específicas y preferidas descritas en el presente documento.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Representación gráfica del efecto citotóxico sobre las células HOS del tratamiento combinado que contiene MTX y simvastatina. Se evaluó mediante la prueba de la sulforrodamina B, usando una dosis fija subóptima de simvastatina de 0,5 j M, combinada con el MTX (barras negras, gráfica A; y círculos negros, gráfica B) o utilizando solo dosis crecientes de MTX, a una concentración máxima de 100 nM durante 48 horas (barras blancas, gráfica A; y círculos blancos, gráfica B) sin simvastatina. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar. El eje Y representa la supervivencia expresada en porcentaje y el eje X la concentración de MTX.
Figura 2: Representación de la tabla que resume el porcentaje de supervivencia para el tratamiento sin simvastatina (columna A) y con ella (columna B) y la diferencia entre ambas (columna C) para las células HOS tratadas con una concentración de simvastatina de 0,5 j M. La columna de la izquierda representa la dosis de MTX utilizada. Figura 3: Representación gráfica del efecto citotóxico sobre las células HOS del tratamiento combinado que contiene MTX y simvastatina. Se evaluó mediante la prueba de la sulforrodamina B, usando una dosis fija subóptima de simvastatina de 1 j M, combinada con el m Tx (barras negras, gráfica A; y círculos negros, gráfica B) o utilizando solo dosis crecientes de MTX, a una concentración máxima de 100 nM durante 48 horas (barras blancas, gráfica A; y círculos blancos, gráfica B) sin simvastatina. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar. El eje Y representa la supervivencia expresada en porcentaje y el eje X la concentración de MTX.
Figura 4: Representación gráfica (A) y tabla (B) que resumen el porcentaje de supervivencia de las células HOS entre el tratamiento sin simvastatina (1) y con simvastatina (2) y la diferencia entre ambos (3) a una concentración de simvastatina de 1 j M de simvastatina. La columna de la izquierda representa la dosis de MTX utilizada.
Figura 5: Representación gráfica (A) y tabla (B) que resumen la diferencia entre (3) el porcentaje de supervivencia de las células HOS entre los tratamientos con simvastatina a una concentración de 0,5 j M (1) y una concentración de 1 j M (2). La columna de la izquierda representa la dosis de MTX utilizada.
Figura 6: Representación gráfica que evalúa la capacidad proliferativa de las células de osteosarcoma (HOS) sometidas a tratamiento con simvastatina 0,5 j M (2), con metotrexato 50 nM (3) o con ambos (4) en relación con las células de control (1) durante 72 horas (eje X). El efecto se evaluó contando el número total de células (viables y no viables) en la cámara de Neubauer (eje Y) mediante la técnica de tinción con azul tripano. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar.
Figura 7: Representación gráfica que evalúa la inducción de la muerte celular de las células de osteosarcoma (HOS) sometidas al tratamiento con simvastatina 0,5 j M (2), con metotrexato 50 nM (3) o con ambos (4) en relación con las células de control (1) durante 72 horas (eje X). El efecto se evaluó contando el número total de células no viables en la cámara de Neubauer (eje Y) mediante la técnica de tinción con azul tripano. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar.
Figura 8: Representación gráfica de los cambios morfológicos en las células de osteosarcoma (HOS) sometidas a tratamiento con simvastatina 0,5 j M (2), con metotrexato 50 nM (3) o con ambos (4) en relación con las células de control (1) durante 48 horas (panel A) y 72 horas (panel B). Se puede observar que el MTX (3) produce células agrandadas e incluso con dos núcleos (flecha sólida); la SV (2) produce células redondeadas (flecha rota); y ambos fármacos (4) produjeron ambos efectos.
Figura 9: Representación gráfica del cambio en el número total de células de osteosarcoma (HOS) (A) o del número de células muertas (B) sometidas al tratamiento con simvastatina 1 j M (2), con metotrexato 100 nM (3) o con ambos (4) en relación con las células de control (1) durante 48 horas (eje X). El efecto se evaluó contando el número total de células (eje Y en la gráfica A) y las células positivas al Azul de tripano (eje Y en la gráfica B) en la cámara de Neubauer mediante la técnica de tinción con azul tripano. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar.
Figura 10: Representación gráfica del cambio en el número total de células de osteosarcoma (HOS) (A) o del número de células muertas (B) sometidas al tratamiento con simvastatina 0,5 j M (2), con metotrexato 50 nM (3) o con ambos (4) en relación con las células de control (1) durante 72 horas (eje X). El efecto se evaluó contando el número total de células (eje Y en la gráfica A) y las células positivas al Azul de tripano (eje Y en la gráfica B) en la cámara de Neubauer mediante la técnica de tinción con azul tripano. Las mediciones se realizaron por triplicado y los datos se representan utilizando la media ± la desviación estándar.
Figura 11: Representación gráfica de los cambios en el ciclo celular de las células HOS tratadas con dosis crecientes de MTX durante 24 horas. G1.1 = control (en todas las figuras el control implica 0 nM); 2 = 10 nM; 3 = 50 nM; 4 = 100 nM; 5 = 200 nM. Obsérvese la disminución en la fase S y del número de células en fase G2/M, con la consiguiente acumulación en la fase G1.
Figura 12: (A) Representación gráfica de los cambios en el ciclo celular de las células HOS tratadas con dosis crecientes de MTX durante 24 horas. El eje X muestra las concentraciones de MTX: 1 = control; 2 = 10 nM; 3 = 50 nM; 4 = 100 nM; 5 = 200 nM. (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones de MTX mencionadas. (C) Diferencias porcentuales para los valores obtenidos en cada fase del ciclo en comparación con el control. a = 10 nM frente al control; b = 50 nM frente al control; c = 100 nM frente al control; d = 200 nM frente al control. La disminución en la fase S varía entre el 9,38 % y el 35,46 % en comparación con el control. La fase G2/M disminuye entre un 6,30 % y un 55,46 % en comparación con el control, mientras que las células en la fase G1 aumentan su número entre un 1,89 % y un 42,00 % en comparación con el control.
Figura 13: Representación gráfica de los cambios en el ciclo celular de las células HOS tratadas con dosis crecientes de Sv durante 24 horas. 1 = control; 2 = 0,2 j M; 3 = 0,5 j M; 4 = 1 j M; 5 = 2 j M; 6 = 5 j M; y 7 = 10 j M. Es notable la disminución en la fase S y del número de células en fase G1, con la consiguiente acumulación en la fase G2/M.
Figura 14: (A) Representación gráfica de los cambios en el ciclo celular de las células HOS tratadas con dosis crecientes de SV durante 24 horas. El eje X muestra las concentraciones de SV: 1 = control; 2 = 0,2 pM; 3 = 0,5 pM; 4 = 1 pM; 5 = 2 pM; 6 = 5 pM; y 7 = 10 pM. (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones de SV mencionadas. (C) Diferencias porcentuales para los valores obtenidos en cada fase del ciclo en comparación con el control. a = 0,2 pM frente al control; b = 0,5 pM frente al control; c = 1 pM frente al control; d = 2 pM frente al control; e = 5 pM frente al control; y f = 10 pM frente al control. La disminución en la fase S varía entre el 0,41 % y el 22,53 % en comparación con el control. Las disminuciones en la fase G1 oscilan entre el 7,85 % y el 48,28 % en comparación con el control. Las células en la fase G2/M aumentan su número entre un 9,32 % y un 97,65 % en comparación con el control.
Figura 15: (A) Representación gráfica de los cambios en el ciclo celular de las células HOS tratadas con una combinación de SV y MTX durante 24 horas. El eje X muestra las concentraciones de los fármacos: 1 = control; 2 = SV 1 pM; 3 = MTX 50 nM; 4 = SV 1 pM MTX 50 nM; (B) Valores absolutos en cada una de las fases del ciclo a las concentraciones mencionadas. (C) Diferencias porcentuales para los valores obtenidos en cada fase del ciclo en comparación con el control. a = SV 1 pM frente al control; b = MTX 50 nM frente al control; c = ambos frente al control. La disminución en la fase S varía entre el 4,10 % y el 12,10 % en comparación con el control. La fase G1 disminuye en un 19,60 % con la SV, pero aumenta un 15,11 % en comparación con el control cuando se combina con MTX. Las células en la fase G2/M aumentan su número en un 40,92 % cuando se tratan solo con SV, pero disminuye en un 33,90 % en comparación con el control cuando se combina con MTX.
Figura 16: Representación gráfica del pico SubG0 para las células HOS tratadas con MTX durante 48 horas.
1 = control; 2 = MTX 10 nM; 3 = MTX 20 nM; 4 = MTX 50 nM; 5 = MTX 100 nM; 6 = MTX 200 nM. Hay un cambio notablemente significativo en el perfil de la región G1-G2/M y la aparición incipiente del pico SubG0 a una concentración de MTX de 20 nM (3), indicativo de la muerte celular por apoptosis.
Figura 17: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubG0 en la región G1-G2/M de las células HOS tratadas con dosis crecientes de MTX durante 48 horas. El eje X muestra las concentraciones de MTX: 1 = control; 2 = 10 nM; 3 = 20 nM; 4 = 50 nM; 5 = 100 nM; 6 = 200 nM. (B) Valores absolutos en cada una de las regiones estudiadas a las concentraciones de MTX mencionadas. (C) Aumentos o disminuciones de los valores obtenidos para cada una de las regiones estudiadas en comparación con el control. a = 10 nM frente al control; b = 20 nM frente al control; c = 50 nM frente al control; d = 100 nM frente al control; y e = 200 nM frente al control. El resultado más notable es el aumento significativo del número de células cuantificadas en la fase SubG0 a dosis de MTX superiores a 50 nM.
Figura 18: Representación gráfica de los cambios en el pico SubG0 de las células HOS tratadas con SV durante 48 horas. 1 = control; 2 = SV 0,2 pM; 3 = SV 0,5 pM; 4 = SV 1,0 pM; 5 = SV 2,0 pM; 6 = SV 5,0 pM; y 7 = SV 10 pM. El cambio significativo en el perfil de la región G1-G2/M y la aparición del pico SubG0 a una concentración de SV inferior a 0,2 pM (2) con un máximo a una concentración de SV de 10 pM, indicativo de muerte celular por apoptosis.
Figura 19: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubG0 y en la región G1-G2/M de las células HOS tratadas con dosis crecientes de SV durante 48 horas. El eje X muestra las concentraciones de SV: 1 = control; 2 = 0,2 pM; 3 = 0,5 pM; 4 = 1,0 pM; 5 = 2,0 pM; 6 = 5,0 pM; y 7 = 10 pM. (B) Valores absolutos en cada una de las regiones estudiadas a las concentraciones de SV mencionadas. (C) Aumentos o disminuciones de los valores obtenidos para cada una de las regiones estudiadas en comparación con el control. a = 0,2 pM frente al control; b = 0,5 pM frente al control; c = 1,0 pM frente al control; d = 2,0 pM frente al control; e = 5,0 pM frente al control; y f = 10 pM frente al control. Hay un notable aumento del número de células cuantificadas en la fase SubG0 a dosis de SV superiores a 0,2 pM.
Figura 20: (A) Representación de los histogramas de los cambios en el pico SubG0 y en la región G1-G2/M de las células HOS tratadas con una combinación de SV y MTX durante 48 horas. 1 = control; 2 = MTX 30 nM; 3 = SV 0,5 pM; 4 = MTX 30 nM SV 0,5 pM.
Figura 21: (A) Representación gráfica de los cambios en el pico SubG0 y en la región G1-G2/M de las células HOS tratadas con una combinación de SV y MTX durante 48 horas. El eje X muestra las concentraciones de los fármacos: 1 = control; 2 = MTX 30 nM; 3 = SV 0,5 pM; 4 = MTX 30 nM SV 0,5 pM; (B) Valores absolutos en el pico SubG0 y en la región G1-G2/M a las concentraciones mencionadas. (C) Aumentos o disminuciones de los valores obtenidos para cada una de las regiones estudiadas en comparación con el control. a = MTX 30 nM frente al control; b = SV 0,5 pM frente al control; c = ambos frente al control. Hay un notable aumento de hasta 6 veces en el número de células en el pico SubG0 (muerte celular) cuando se combinan ambos tratamientos.
Figura 22: Representación gráfica de los cambios en la apoptosis celular de las células HOS después de 24 horas (A) y 36 horas (B) mediante la técnica de escala de ADN. 1 = control; 2 = SV 0,5 pM; 3 = MTX 50 nM; 4 = MTX 50 nM SV 0,5 pM.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invención reivindicada.
Ejemplo 1. Cultivo de líneas celulares de osteosarcoma
La línea celular de osteosarcoma de rata UMR-106 y la línea celular de osteosarcoma humano HOS se cultivan en medio RPMI 1640. La línea celular de osteosarcoma humano MG-63 se cultiva en el medio DMEN. Todos los medios de cultivo se complementan con FBS al 10 %, glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina. Las condiciones de mantenimiento utilizadas para todas las líneas celulares son 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5 % de CO2. Las líneas tumorales se obtienen de la ATCC (American Type Culture Collection) y se cultivan según las condiciones recomendadas.
Ejemplo 2. Análisis de la supervivencia celular
La línea celular de osteosarcoma se cultiva con dosis de MTX a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80 y 100 nM y con simvastatina a 0,5 |jM y 1,0 jM . La supervivencia celular se cuantifica mediante el ensayo de sulforrodamina B (SRB), que es una prueba colorimétrica no radiactiva para la cuantificación espectrofotométrica basada en la unión electrostática de la SRB a aminoácidos básicos fijados con ácido tricloroacético (TCA).
Figure imgf000007_0001
Para esto, las líneas celulares tumorales UMR-106, HOS y MG-63 se cultivan a una densidad de 5 x 103 células/pocillo en 200 j l de medio de cultivo suplementado con FBS al 10 % en placas de noventa y seis pocillos y se cultivan durante 24, 48 o 72 horas. Una vez terminado el experimento, se retira el medio por decantación. Tras añadir 50 jl/pocillo de TCA al 10 % (100 ml de TCA al 100 % (p/v) 900 ml de Elix H2O, 2 - 5 °C) frío, las células se incuban durante 30 minutos a 4 °C para que se fijen completamente a la base del pocillo. A continuación, se elimina el TCA por decantación y el pocillo se lava cuidadosamente con agua fría corriente al menos 4 veces, asegurándose de que todos los pocillos se lavan por igual. A continuación se invierten las placas y se colocan boca abajo sobre varias capas de papel adsorbente hasta el día siguiente, garantizando la eliminación de casi toda el agua. A continuación, se añaden 40 j l de solución de sulforrodamina B (Sigma S-9012, 4 g de SRB 1 l de ácido acético (vol/vol), a temperatura ambiente) al 0,4 % (p/v) en ácido acético al 1 % (vol/vol), evitando hacerlo con luz directa (la SRB es fotosensible). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación se decanta el colorante y se lavan los pocillos al menos 4 veces con ácido acético al 1 % (vol/vol, 100 ml de ácido acético 10 l de Elix H2O), asegurándose de que se eliminan todos los restos de colorante que no están unidos a las células. A continuación, se elimina todo el ácido acético restante agitando firmemente las placas contra varias capas de papel absorbente durante la noche en la oscuridad. A continuación, se añaden 150 j l de TRIS:BASE 10 mM (pH 10,5, 100 ml de TRIS:BASE 100 mM 900 ml de Hellix H2O) y se deja durante 10 minutos a temperatura ambiente para asegurar la completa disolución del colorante. Finalmente, las medidas se toman usando el lector multiplaca dual a 492 nm (pico de absorbancia de SRB) y a 620 nm (para eliminar las posibles interferencias causadas por pequeñas variaciones del volumen, suciedad o imperfecciones en la placa). Antes de la medición es necesario agitar rápidamente las placas.
Los resultados de los análisis de supervivencia celular se proporcionan en las figuras 1 a 5. Los resultados muestran que la simvastatina reduce significativamente la dosis eficaz de MTX cuando se coadministran. Este efecto es especialmente relevante a bajas concentraciones de MTX, entre 0 nM y 30 nM de MTX.
Ejemplo 3. Ensayo de viabilidad celular
Las células HOS se cultivan en un medio de cultivo suplementado con 5 - 10 % de suero fetal bovino inactivado por calor y L-glutamina 2 mM, a 37 °C, 95 % de humedad y 5 % de CO2 atmosférico. Las células se tratan con simvastatina 0,5 jM y MTX 50 nM durante 24, 48 y 72 horas. Las células se recogen por tripsinización. Para ello, primero hay que aspirar el medio de cultivo; las células se lavan a continuación con 2 - 3 ml de PBS (estéril); se añaden 0,5 - 1 ml de solución de tripsina-EDTA (estéril); se incuban a 37 °C durante 5 minutos; las células se recogen con 5 ml de medio de cultivo fresco; y la suspensión se coloca en un tubo estéril de 15 ml. El colorante azul tripano se utiliza para determinar la viabilidad de las células. El azul tripano es un coloide que entra en las células a través de roturas de la membrana celular. Por lo tanto, las células que aparecen en la imagen, claramente teñidas de azul, se consideran no viables. Para la medición, mezclar 50 j l de la solución de azul tripano y 50 j l de la suspensión celular se colocan en un tubo de 1,5 jl. La mezcla se homogeneiza y se colocan 10 j l en una cámara de Neubauer. Se cuentan las células totales y las no viables (completamente teñidas de azul).
Los resultados de las pruebas de viabilidad celular pueden verse en las figuras 6, 7, 8, 9 y 10.
A partir de estos experimentos es posible concluir que la simvastatina tiene un efecto predominante en la inducción de la muerte celular; que el metotrexato actúa preferentemente para frenar la proliferación celular; y que cuando se aplican ambos tratamientos la proliferación se frena en mayor medida y la muerte celular aumenta más que cuando se administran ambos tratamientos por separado.
Ejemplo 4. Detección de la apoptosis
La detección y cuantificación de la apoptosis se lleva a cabo mediante el análisis de la fragmentación del ADN y mediante citometría de flujo con tinción de Anexina-V/PI.
4.1 Prueba de fragmentación del ADN (escala de ADN). La línea celular tumoral UMR-106 se cultiva a una densidad de 2 x105 células/pocillo en placas de 6 pocillos durante dos o tres días. A continuación, el cultivo celular se incuba con simvastatina 0,5 pM y MTX 50 nM durante 24 y 48 horas. Después de obtener las células en cada condición experimental en tubos de microcentrífuga, las células se lisan en 200 pl de un tampón que contiene Tris/HCl 10 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM, Tritón X-100 al 0,2 % y se centrifuga a 12.000 x g durante veinte minutos en una microcentrífuga Biofuge Stratos, Heraeus Instruments. Las muestras se incuban con RNasa (Sigma) para eliminar su contenido de ARN, a una concentración final de 5 mg/ml durante una hora a 37 °C y con proteinasa K (Sigma) (20 mg/ml) durante una hora a 37 °C. Tras varios lavados cuyo componente principal es el fenol, las muestras se precipitan con 2 volúmenes de etanol puro a -20 °C durante al menos 12 horas. A continuación, se centrifugan de nuevo las muestras a 12.000 x g y se lavan las condiciones experimentales con etanol al 70 % para añadir 50 pl de tampón TE que contiene Tris/HCl 10 mM a pH 8,0, EDTA 1 mM a pH 8,0. Las muestras se analizan en un gel de agarosa al 1 %. El contenido de ADN de 123 pb se tiñe con bromuro de etidio y se visualiza con un sistema de luz UV (Bio Imaging System-Syngene). El análisis densitométrico se realiza con el software de dominio público Scion Image Beta 4.02 para Windows.
Los resultados del ensayo de fragmentación de ADN se muestran en la figura 22. Obsérvese la potenciación de la respuesta apoptótica cuando las células son tratadas con SV y MTX.
4.2 Citometría de fluio con Anexina-V/PI. Se utiliza un kit de detección de apoptosis de Anexina-V-FITC (Ref: 556547, Becton Dickinson, Pharmingen, TM) para detectar y cuantificar las células en condiciones apoptóticas. Las células se siembran en placas de 6 pocillos durante tres días. A continuación se tratan con simvastatina 0,5 pM y MTX 50 nM durante 24 y 48 horas. A continuación, se incuban con 100 pl de tampón de unión que contiene 4 pl de Anexina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (Anexina-V-FITC) y 10 pl de yoduro de propidio durante quince minutos en la oscuridad y a temperatura ambiente. A continuación, las células se resuspenden en 400 pl del mismo tampón de unión y se mantienen en la oscuridad. La solución se analiza usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) y los histogramas se cuantificaron con el software Cell Quest (Becton Dickinson). En estas condiciones y para distinguir los procesos apoptóticos de los necróticos y descontar la viabilidad celular, cada uno de los resultados se calcula usando la siguiente fórmula:
% de células = Anexina V-FITC PI-/PI-
Donde PI- es la suma de las células que se consideran viables (Anexina V-FITC-PI-) y las células que se encuentran en estado apoptótico (Anexina V-FITC PI-).
Los resultados de las pruebas de apoptosis mediante citometría de flujo se muestran en las figuras 16 - 22. Los resultados indican que la combinación de los dos fármacos induce una mayor muerte celular que cuando se administran por separado.
5. Análisis del ciclo celular
Para analizar los cambios en la distribución del ciclo celular, las células se siembran y tratan en las mismas condiciones empleadas con el colorante Anexina-V. Las células tratadas y no tratadas se resuspenden en NP-40 al 1 % disuelto en PBS que contiene adicionalmente 50 pg/ml de PI a una densidad de 3 x 105 células/muestra. El análisis y la cuantificación de cada una de las condiciones experimentales se realiza después de 15 minutos de incubación en la oscuridad y a temperatura ambiente, siguiendo la misma metodología empleada en los experimentos de apoptosis con tinción de Anexina-V (citometría de flujo FACSCalibur y software Cell Quest).
Los resultados de los estudios sobre los cambios en la distribución del ciclo celular se presentan en las figuras 11 -15. Los resultados indican que el MTX provoca esencialmente una interrupción del ciclo en la fase G1; que el SV detiene el ciclo en la fase g 2/M; y que la combinación de ambos detiene el ciclo en ambas fases con una importante disminución de la síntesis de ADN, por lo tanto, la combinación impide que la célula escape al control del ciclo celular.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención del osteosarcoma, en donde dicho tratamiento o prevención comprende administrar de manera simultánea, por separado o secuencial a un sujeto simvastatina, y en donde la dosis administrada de metotrexato comprende de 0,5 mg/m2 a 20 g/m2 de superficie corporal del paciente, y una cantidad para la administración de simvastatina comprende de 10 a 100 mg.
2. El metotrexato para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el metotrexato se administra simultáneamente con la simvastatina, o el metotrexato y la simvastatina se administran por separado, en cualquier orden.
3. El metotrexato para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 2, en donde el metotrexato es para su administración con una frecuencia comprendida entre 1 y 5 semanas y la simvastatina es para su administración con una frecuencia comprendida entre 1 y 7 días.
4. El metotrexato para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3, en donde, una cantidad para la administración del metotrexato comprende de 12 a 15 g/m2 de superficie corporal y una cantidad para la administración de la simvastatina comprende de 20 a 80 mg.
5. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención del osteosarcoma que comprende metotrexato y simvastatina, junto con excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables, en donde la composición se administra en una unidad de dosificación que comprende de 1 mg a 15 mg de metotrexato y de 20 a 80 mg de simvastatina.
6. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición se administra por vía oral, preferentemente en forma de un comprimido.
7. Una composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la composición se administra por vía intravenosa, intramuscular, transdérmica, rectal, intracavitaria o por inhalación.
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