CN111084776A - 匹立尼酸及其衍生物用于治疗和/或预防神经退行性疾病的用途 - Google Patents

匹立尼酸及其衍生物用于治疗和/或预防神经退行性疾病的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。本发明还提供了一种治疗和/或预防神经退行性疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含前述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体；优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药用载体。本发明还提供了包含匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体的药物组合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。

Description

匹立尼酸及其衍生物用于治疗和/或预防神经退行性疾病的 用途
技术领域
本发明涉及药物新用途技术领域，特别是涉及匹立尼酸及其衍生物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。
背景技术
神经退行性疾病(NDD)，包括阿尔茨海默病(AD)，帕金森症(PD)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿症(HD)等，是危害甚大的脑部病变，已逐渐成为世界性的卫生保健难题。遗憾的是，对于这些疾病，治疗方案仍局限在病症的控制方面，并没有可以阻止疾病发生的修饰药物。尽管这些疾病有各自的特点，但很多情况下，它们会有一些相同的症状和神经病理条件。
例如，阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，简称AD)，俗称老年痴呆，是世界上最常见的神经退行性疾病。随着人口的迅速老龄化，其发病率也在不断上升。临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，伴有各种神经精神症状和行为障碍，常见的早期症状是轻度认知障碍，难以记住最近发生的事情，并伴随感情冷漠和情绪低落等。随着疾病的发展，症状可能会发展为长期记忆的丧失，无法正确认知和判断周围事物，甚至不能认出亲属。此外还会出现语言能力的丧失和行为障碍，无法完成行走、吞咽等简单动作，完全丧失交流能力和自理能力，身体机能的逐渐丧失最终导致死亡。在中国，大约1000万人被AD困扰，居世界之首，大约有550万美国人有AD，到本世纪中叶，这个数字将达到1380万。在发达国家，AD是耗费社会财政补助的主要疾病之一。
AD的特征是渐进性记忆丧失和其他认知功能障碍，如运动能力受损、推理和判断能力受损等。AD的主要病理特征包括神经元胞外由β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)聚集形成的老年斑，神经元胞内由于过度磷酸化的微管相关蛋白tau(microtubule-associatedprotein tau，MAPT)聚集形成的神经纤维缠结，以及突触功能障碍和神经元丢失等。
目前，AD的治疗方式主要是辅助性治疗，这些药物都只能在一定程度上改善病人的症状，还没有彻底治愈该疾病的药物。
现有的辅助治疗药物有以下几种：
盐酸多奈哌齐(英文名为Aricept)，1996年和1997年在美国和欧盟获批，治疗机制是抑制乙酰胆碱酯酶，从而增强胆碱能传递，而在AD病人体内这种传递是缺乏的。
卡巴拉汀(英文名为Exelon)分别于1998年和2000年在欧盟和美国获批，它的作用机理同样是抑制乙酰胆碱酯酶。
加兰他敏(英文名为Razadyne或galantamine)，分别于2000年和2001年在欧盟和美国获批，它的作用机理和Aricept非常类似。
美金刚(英文名为Namenda)，分别于2002年和2003年在欧盟和美国获批，它是第一个通过阻止N-甲基-D-天门冬氨酸受体从而减少过长的钙内流、抑制神经毒性和细胞凋亡的药。
甘露寡糖二酸(GV-971)是从海藻中提取的海洋寡糖类分子，它能够多位点、多片段、多状态地捕获Aβ，抑制Aβ纤丝形成，使已形成的纤丝解聚为无毒单体。GV-971还通过调节肠道菌群失衡、重塑机体免疫稳态，进而降低脑内神经炎症，阻止AD病程进展。这项重大研究成果进一步说明了Aβ清除对于改善AD症状发面起着积极的作用。
发明内容
本发明的发明人通过对匹立尼酸进行深入的研究，意外地发现，匹立尼酸能够有效改善和/或治疗神经退行性疾病，尤其是AD，并基于此，完成了本发明。具体技术方案如下：
本发明首先提供了匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。
在本发明的一些实施方式中，匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体通过激活星型胶质细胞和小胶质细胞向Aβ周围聚集对其清除，以治疗和/或预防神经退行性疾病。
在本发明的一些实施方式中，神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。
在本发明的一些实施方式中，所述药物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
本发明还提供了一种治疗和/或预防神经退行性疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含前述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包含一种或多种药用载体。
在本发明的一些实施方式中，基于所述药物组合物的总重量，匹立尼酸、其药学上可接受的盐、立体异构体的含量为1-99％，优选为20-80％，更优选为40-60％。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物还包括第二治疗活性剂。
在本发明的一些实施方式中，所述第二治疗活性剂选自盐酸多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚及甘露寡糖二酸中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
本发明还提供了包含匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体的药物组合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途；优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药用载体。
在本发明的一些实施方式中，其中所述药物组合物还包括第二治疗活性剂；优选地，所述第二治疗活性剂选自盐酸多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚及甘露寡糖二酸中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，其中所述药物组合物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
本发明还提供了前述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体、或前述的药物组合物在治疗和/或预防神经退行性疾病中的应用。
本发明还提供了一种治疗和/或预防神经退行性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者给药治疗有效量的前述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体、或者前述的药物组合物。
本发明所说的“匹立尼酸(Wy14643)”，化学名：[4-氯-6-(2,3-茬胺基)-2-嘧啶硫代]乙酸；[4-氯-6-(2,3-二甲代苯氨基)-2-嘧啶基]乙酸，结构式如下：
Figure BDA0001839546210000041
本发明所说的“药学上可接受的盐”是指可药用的酸和碱的加成盐或其溶剂化物。这样的可药用盐包括诸如以下的酸的盐：盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸、亚硫酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、硝酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、氢碘酸、链烷酸(诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH(其中n是0～4))等。碱的盐：钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等。本领域技术人员知晓多种无毒的可药用加成盐。
本发明所说的“酯”是指能够保留药学活性和母体化合物性质的酯，例如包括可药用的甲酯、乙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、叔丁酯、戊酯、己酯、环戊酯、环己酯等烷基酯类，或者苯酯、萘酯、苄酯、苯乙酯等芳香酯类等。
本发明所说的“立体异构体”是指当化合物存在不对称碳原子时，会产生对映异构体；当化合物存在碳碳双键或环状结构时，会产生顺反异构体；当化合物存在酮或肟时，会产生互变异构体，所有的对映异构体、非对映异构体、消旋异构体、顺反异构体、互变异构体、几何异构体、差向异构体及其混合物，均包括在本发明范围中。
本发明所说的“药物组合物”可以是将“治疗有效量”的前述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体，与一种或多种第二治疗活性剂采用联合给药的方式使用，例如先后给药，同时给药，或将治疗活性成分做成复方制剂给药。
在本发明中，所说的“药物”或“药物组合物”给药频率可以是每天一次或每周或每月一次、两次、三次或更多次，根据需要以有效地治疗症状。或者，给药的频率可以是每三个月至少一次，根据需要以有效地治疗症状。例如，给药可以是约每5周、约每6周、约每7周、约每8周、约每9周、约每10周、约每11周、或约每12周。给药频率也可以根据所用治疗活性成分和所治疗特定疾病而变。然而，对于大部分病症的治疗，优选每天4次或更低的给药方案。然而，可以理解，针对任何特定患者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所用的治疗活性成分的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径和排泄速率、药物组合物和进行治疗的特定疾病的严重性。
本发明所说的“神经退行性疾病”(NDD)，可以理解为神经细胞进行性变性坏死所引起的中枢神经功能减退导致的疾病，包括不限于阿尔茨海默病(AD)，帕金森症(PD)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)和亨廷顿症(HD)等。
本发明所说的“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患本发明所说的神经退行性疾病的哺乳动物个体(优选为人)采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患本发明所说的神经退行性疾病或者对本发明所说的神经退行性疾病具有罹患风险的哺乳动物个体采用本发明的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。
本发明所说的“药用载体”可以是一种或多种适合于人使用的固体或液体填料或凝胶物质。所述药用载体优选具有足够的纯度和足够低的毒性，并且与本发明的活性成分(匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体)具有相容性且不明显减低活性成分的药效。例如，药用载体可以填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、水性溶剂或非水性溶剂等。
本发明所说的药物组合物，可以制成药学上可接受的任意剂型，以任何合适的给药方式，例如通过口服、肠胃外、直肠或经肺给药等方式施用于需要这种治疗的患者或受试者。用于口服给药时，可以制成片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等。用于肠胃外给药时，可以制成注射液、注射用无菌粉末等。
本发明所述的“治疗有效量”是指当给药到患者时至少能够减轻患者病症的症状的前述匹立尼酸、其它们药学上可接受的盐、酯、或立体异构体、以及前述的药物组合物的量。包含“治疗有效量”的实际量会根据多种情况而变化，多种情况包括但不限于所治疗的特定病症、病症的严重程度、患者的体格和健康状况以及给药途径。熟练的医疗从业者可容易地使用医疗领域中已知的方法确定合适的量。
本发明通过实验意外地发现匹立尼酸能够有效改善和/或治疗AD，因此，匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体可以用于制备预防和/或治疗神经退行性疾病的药物。进一步地，本发明提供的包含匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体的药物组合物，也能够预防和/或治疗神经退行性疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1表示匹立尼酸改善APP/PS1ΔE9小鼠的认知功能障碍。。
图2表示匹立尼酸能缓解APP/PS1ΔE9小鼠的焦虑症状。
图3表示匹立尼酸改善APP/PS1ΔE9小鼠的神经可塑性。
图4表示匹立尼酸降低AD小鼠的可溶性和不可溶性Aβ病理学特征。
图5表示匹立尼酸给药后APP/PS1ΔE9小鼠脑组织中Aβ斑块沉积度显著降低。
图6表示匹立尼酸给药诱导APP/PS1ΔE9小鼠脑中小胶质细胞和星型胶质细胞向Aβ斑块周围聚集。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
首先，对本发明所涉及的实验材料以及实验方法等进行说明。
实验材料来源：
匹立尼酸：购于Abcam公司。
实验用过表达人APP突变(Swedish mutation)以及删除第9个外显子的PSEN1(PS1)的AD小鼠(APP/PS1ΔE9小鼠)：购自南京大学-南京生物医药研究院，饲养于中科院昆明动物研究所实验动物中心。APP/PS1ΔE9小鼠的制作方式在Jankowsky et al.(2004)Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42residue beta-amyloid peptide in vivo:evidence for augmentation of a 42-specific gammasecretase.Hum Mol Genet.13(2):159-70.一文中有详细描述。
所有实验动物来源于中国科学院昆明动物研究所实验动物中心。小鼠的处理和实验方法均符合中国科学院昆明动物研究所伦理委员会的要求。所有的动物饲养在12小时光/暗周期的23℃-25℃环境中，并且在实验开展前提供标准的食物和水。所有实验过程中尽可能减少小鼠所受到的伤害和痛苦。
所用实验仪器包括：激光共聚焦显微镜(Olympus，Melville，NY，USA)，水迷宫(Panlab HARVARD,MA,USA)，开放场(Panlab HARVARD,MA,USA)，小型垂直电泳仪(BioRadLaboratories,Hercules,CA,USA)，Bio-Rad的荧光图像分析仪(BioRad Laboratories，Hercules，CA，USA)，冰冻切片机(Leica，Germany)，石蜡切片机(Leica，Germany)。
各种抗体购自于Millipore公司、Abcam公司、或Cell Signaling公司。
AβELISA检测试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
实验方法：
1.小鼠给药处理
使用8月龄的APP/PS1ΔE9小鼠(雄雌各半)进行匹立尼酸给药。匹立尼酸先以50mg/mL的浓度溶于二甲基亚砜(DMSO)里面，然后再用小鼠饮用水稀释为终浓度50μg/mL，得到药水。给药组小鼠让其自由饮用溶有匹立尼酸的药水，其中药水中DMSO的终浓度为0.1％；对照组让其自由饮用含有0.1％DMSO的水。所有装有匹立尼酸的饮水装置均铝箔包裹，以防止曝光使其分解。在给药期间，每2天更换一次药水。每天对小鼠的饮水量进行测量。待给药2个月后，对所有小鼠进行行为学检测。每天行为学开始前对提前1小时将小鼠放到要做行为学实验的实验室进行实验，所有的行为学实验均在9点到17点之间完成。所有涉及动物的实验均按照中国科学院昆明动物研究所动物伦理委员会的批准。
2.水迷宫实验检测小鼠的空间学习与记忆能力
本发明采用水迷宫实验对AD小鼠在匹立尼酸给药2个月后的学习记忆能力进行评估。所用水迷宫参数指标为：圆形水池，直径为120cm，高50cm，水的深度大约为30cm，圆柱形塑料救生平台直径为10cm，高度为29cm，淹没在水面下1cm处。水温保持在20±1℃；测试的时候，为了防止小鼠看见平台，在水中加入白色塑料泡沫，使其均匀的铺满水面直到看不到救生平台为止，每两天换一次水。圆形水池分为四个象限，救生平台放置于第三个象限的中心位置。在水迷宫的正上方安装好摄像头，用来记录小鼠的运动轨迹。每天实验开始前，将小鼠从饲养房放到进行水迷宫实验的房间实验1小时。连续7天对小鼠进行训练，起始位置在四个象限之间随机变化，让其自由探索1分钟，测定小鼠找到救生平台所需要的时间(又称潜伏期，Latency)。如果小鼠在1分钟内能找到平台，让其在平台上停留20秒，使其根据周围的标志物能记住救生平台所在的位置。如果小鼠在1分钟不能找到救生平台，则将小心诱导小鼠到达平台并让其停留20秒。每只小鼠每天训练的时间间隔为90分钟，每天随机在三个不同的象限把小鼠放入水迷宫，让其寻找救生平台。第7天最后一次训练结束4小时后，撤去水迷宫的救生平台，将小鼠放入水中，测定小鼠在1分钟内在救生平台周围所走的时间、路程、速度，以及在救生平台位置穿梭的次数，进而评估小鼠的短时程记忆能力。待第7天最后一次训练结束72小时后，再次撤去水迷宫的救生平台，将小鼠放入水中，测定小鼠在1分钟内在救生平台周围所走的时间、路程、速度，以及在救生平台位置穿梭的次数，进而评估小鼠的长时程记忆能力。实验过程中要保持水迷宫的周围环境保持一致，以规避环境因素改变带来的影响。整个实验过程使用SMART 3.0软件(Panlab HARVARD，MA，USA)对小鼠的行为进行跟踪并录像。行为参数(速度、路程、达到救生平台所需时间、每个象限中的时间百分比、每个象限中的路程百分比)由SMART 3.0软件根据小鼠的行为自动计算。
3.开放场实验检测小鼠的焦虑症状
我们采用开放场实验对APP/PS1ΔE9小鼠在匹立尼酸给药2个月后的焦虑症状行为进行评估。选择匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠为研究对象，将小鼠放入陌生的开放场(40×40×40英寸)中1小时，使用SMART 3.0软件记录和跟踪开放场中小鼠的自发运动活动和焦虑症状。小鼠在开放场中心区域停留时间的长短是用来衡量其焦虑症状的重要指标，小鼠在中心区域停留时间越少，表明该小鼠的焦虑症状越明显。
4.Western blot检测相关蛋白的表达
具体步骤如下：
1)对蛋白进行提取：使用碧云天(Beyotime Biotechnology)的western以及IP裂解液对小鼠脑组织中的蛋白进行提取。
2)对蛋白浓度进行测定：我们采用BCA蛋白定量试剂盒对HM和U251-APP细胞以及小鼠脑组织蛋白进行测量，并将提取好的蛋白用于后续检测。
3)加样前处理：根据蛋白浓度，每个样品按照20μg进行上样。首先加入蛋白变性剂无水巯基乙醇并在95℃条件下变性6分钟，变性结束后将其放在冰上静置5分钟。
4)上样并进行电泳：经变性的蛋白样品加到相应的胶孔中，并开始电泳。
5)转膜处理：按照1L转膜液所需试剂的比例(10×转膜液：无水甲醇：水＝1:2:7)配置转膜液的量，并将海绵以及滤纸浸入转膜液中，PVDF膜预先浸入无水甲醇中30秒使其激活。按照海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的次序制作转膜板(蛋白带负电，将向正极进行转移转到PVDF膜上)，并将转膜板放入转膜装置，加入转膜液开始转膜。转膜过程需要在冰浴条件下进行。
6)封闭处理：将转上蛋白的PVDF膜放入含有5％脱脂牛奶的TBST中，并置于摇床上缓慢摇动2小时。
7)一抗孵育：封闭结束后，用TBST对PVDF膜进行轻轻漂洗，目的是洗去PVDF膜上残余的脱脂牛奶。根据目标蛋白分子量对PVDF进行裁剪，并加入相应的抗体，在摇床上在4℃孵育过夜。
8)二抗孵育：第二天，回收一抗，用TBST对PVDF膜进行漂洗，5分钟/次，漂洗3次，确保PVDF膜上残余的一抗被洗去。随后根据一抗的种属来源标记上相应的二抗(二抗用5％脱脂牛奶配制)。在摇床上室温孵育1小时。
9)清洗二抗：弃去二抗，用TBST对PVDF膜进行漂洗，5分钟/次，漂洗3次，确保PVDF膜上残余的二抗被完全洗去。
10)显影：使用Bio-Rad荧光图像分析仪进行显影，获取所需要蛋白目的条带。
5.小鼠脑组织免疫荧光染色
主要实验步骤如下：
1)对小鼠进行麻醉：对匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠腹腔注射戊巴比妥(60mg/kg)进行全身麻醉。
2)心脏灌注：待小鼠完全麻醉后，将其腹腔用手术刀切开，暴露出心脏组织，使用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛按先后顺序进行心脏灌注。
3)组织固定：小心取出小鼠脑组织，放入装有4％多聚甲醛的15mL离心管中，4℃环境下进行固定，24小时后跟换一次4％多聚甲醛，共固定48小时。随后分别用含蔗糖量为15％和30％的PBS溶液将脑组织进行脱水处理。
4)组织包埋并切片：脱水后的小鼠脑组织用OCT包埋剂进行包埋，并利用冰冻切片机将海马以及皮层组织以10μm/张的厚度切出，收集在用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，保存于-80℃冰箱备用。
5)对组织切片进行抗原修复。具体步骤如下：
a.将冰冻切片从冰箱中取出恢复至室温，用PBS对切片进行清洗，5分钟/次，清洗3次，去除OCT包埋剂。
b.用PBS对柠檬酸抗原修复液进行稀释，并对脑组织进行抗原修复。
c.用PBS清洗切片，5分钟/次，清洗3次。甩干脑组织切片，用组化笔在组织的周围画圈。
6)透化处理：在切片上滴加0.2％的TritonX-100，室温静置15分钟，使其透化，以确保后续孵育的抗体能浸入细胞内。
7)封闭：5％BSA室温封闭1小时。
8)第一个一抗孵育：滴加用2％BSA稀释的目标蛋白一抗，4℃过夜。
9)第一个二抗孵育：第二天，回收第一个一抗。用PBS清洗，5分钟/次，清洗3分钟，将用2％BSA稀释好了的第一个一抗所对应的第一个二抗滴加到切片上面，室温孵育1小时。
10)第二个一抗孵育：对切片用PBS进行清洗，5分钟/次，清洗3次。滴加用2％BSA稀释好了的第二个一抗，4℃过夜。
11)第二个二抗孵育：第三天，回收第二个一抗。用PBS清洗，5分钟/次，清洗3分钟，将用2％BSA稀释好了的第二个一抗所对应的第二个二抗滴加到切片上面，室温孵育1小时。
12)染细胞核：弃去第二个二抗，用PBS清洗3次，每次5分钟。滴加DAPI进行染核，室温孵育10分钟。
13)封片：弃去DAPI，用用PBS清洗3次，每次5分钟，用抗淬灭剂封片剂进行封片。
14)观察结果：激光共聚焦显微镜对染色结果进行观测并获取。
6.小鼠脑组织免疫组化染色
主要实验步骤如下：
1)对小鼠进行麻醉：对匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠腹腔注射戊巴比妥(60mg/kg)进行全身麻醉。
2)心脏灌注：使用0.9％生理盐水和4％多聚甲醛按先后顺序进行心脏灌注。
3)组织固定：取出小鼠脑组织，放入装有4％多聚甲醛的15mL离心管中，4℃环境下进行固定，24小时后跟换一次4％多聚甲醛，共固定48小时。
4)组织脱水：固定好地脑组织使用梯度乙醇脱水，浓度从50％开始，然后依次75％、80％、95％、100％，即由低浓度逐级至高浓度，逐渐置换出脑组织内的水份。
5)组织透明：采用二甲苯对脑组织透明，组织脱水后转入二甲苯，依组织类型、厚薄透明约30～90分钟，直至组织呈透明状。
6)组织浸蜡：浸蜡采用纯净而熔点稍低的石蜡，采取三级浸蜡，以逐步清除组织中的二甲苯。
7)组织包埋：包埋时，取预热的包埋盒，浅浅地铺上一层石蜡，室温待石蜡稍稍凝结时放入组织块，倒入石蜡至组织全部浸入石蜡中即可。
8)石蜡切片，主要步骤如下：
a.切片：切片首先要注意的是切片刀要锋利平整，这个是影响切片质量的关键。
b.切片的蜡片先于常温水中进行初步展片，然后放于45-48℃的水中使蜡片完全展开，然后捞在玻璃片上。切片置于37℃烘箱内烘干。
9)石蜡切片脱蜡：将切片放入二甲苯中脱蜡15分钟，更换二甲苯重复两次；将切片放入无水乙醇中脱蜡5分钟，更换无水乙醇重复一次；85％乙醇5分钟；75％乙醇5分钟；蒸馏水洗。
10)抗原修复：组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8分钟至沸，停火8分钟保温再转中低火7分钟。自然冷却后将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。
11)阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％双氧水溶液，室温避光孵育25分钟，将玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。
12)血清封闭：在组化圈内滴加5％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30分钟。
13)加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。
14)二抗孵育：第二天，回收一抗，玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗(HRP标记)覆盖组织，室温孵育1小时。
15)DAB显色：玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5分钟。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
17)脱水封片：将切片依次放入75％乙醇5分钟；85％乙醇5分钟；无水乙醇5分钟；更换无水乙醇，重复一次；二甲苯5分钟中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
18)显微镜(Pannoramic250/MIDI，3DHISTECH)镜检，图像采集分析。
7.高尔基染色检测小鼠脑组织神经元树突棘密度
使用FD Rapid GolgiStainTMKit试剂盒进行染色，具体的实验步骤如下：
1)将A液与B液混合：至少要提前将A液和B液等体积混合，轻轻混匀，室温置于避光处，所需混合液至少是小鼠脑组织的5倍，每只小鼠用量为5mL。
2)将A-B混合液分装：提前将A-B混合液分装到15mL离心管里，避光。
3)小鼠脑组织取材：先用戊巴比妥(给药量为60mg/kg)将小鼠深度麻醉，取脑，用纯净水将脑组织清洗3次，洗去脑上的血迹，放入A-B混合液中。
4)换液：24小时后，弃去旧的A-B混合液，换成新的A-B混合液，室温避光放置两周左右。
5)在A-B混合液中染色两周后，将脑组织转入5mL的C溶液中，4℃保存。24小时后再换为新的C溶液，4℃放置一周左右。
6)C溶液浸泡结束后，将小鼠脑组织从C溶液中取出，用滤纸把液体吸干，立刻放到液氮中使其冷冻，并用冰冻切片机进行切片，厚度100-150μm。
7)将切片在室温条件下晾干(注意避光)，晾3天即可将组织晾干，并进行后续染色。
a.采用蒸馏水将切片清洗3次，每次3分钟。
b.把切片放进D与E的混合液中10分钟(混合液中各成分的比例为：Solution D：SolutionE：蒸馏水＝1:1:2)。
c.用蒸馏水对片子进行清洗，5分钟/次，清洗3次。
d.将切片依次放入75％乙醇5分钟；85％乙醇5分钟；无水乙醇5分钟；更换无水乙醇，重复一次；二甲苯5分钟中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
e.镜检。用明场显微观察染色结果。
8.ELISA实验检测小鼠脑组织中的不可溶性Aβ的含量
使用ELISA试剂盒(Elabscience)检测脑组织中不可溶性Aβ的含量，具体实验操作按ELISA试剂盒说明书实施。
实施例
实施例1匹立尼酸缓解AD认知障碍症状的研究
为了研究匹立尼酸是否能够缓解AD认知障碍症状，选用8月龄的APP/PS1ΔE9小鼠进行匹立尼酸给药后进行水迷宫实验检测。简言之，将匹立尼酸用DMSO溶解至50mg/mL，然后用小鼠的饮用水稀释为终浓度50μg/mL的药水，其中药水中DMSO的终浓度为0.1％。让小鼠自由饮用药水。对照组小鼠自由饮用含有0.1％DMSO的饮用水。持续给药两2个月后，对匹立尼酸给药组以及对照组的APP/PS1ΔE9小鼠进行水迷宫实验，检测不同组别小鼠之间的学习记忆能力。结果显示，经过7天的训练，所有的APP/PS1ΔE9小鼠都能找到救生平台。但可以看出，与对照组相比，匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠的学习能力显著提升，表现为到达救生平台所需要的逃生时间(图1中A，潜伏期)和路程(图1中B)较对照组少。值得注意的是，各个组别小鼠之间游泳速度并没有差异(图1中C)，说明各组小鼠的运动能力没有差异。
分别在最后一次训练结束的4小时(图1中D-F)以及72小时(图1中G-I)后分别对小鼠的短时记忆能力和长时记忆能力进行检测。与对照组相比，APP/PS1ΔE9小鼠经匹立尼酸给药后其短时记忆能力显著提升；表现为APP/PS1ΔE9小鼠经匹立尼酸给药后在目标象限停留的时间(图1中D)和路程(图1中E)增多，以及在救生平台位置穿梭的次数增多(图1中F)。与此结果相一致，与对照组相比，APP/PS1ΔE9小鼠经匹立尼酸给药后其长时记忆能力显著提升；表现为APP/PS1ΔE9小鼠经匹立尼酸给药后在目标象限停留的时间(图1中G)和路程(图1中H)增多，以及在救生平台位置穿梭的次数增多(图1I)。
由这些结果可见，匹立尼酸能真正改善APP/PS1ΔE9小鼠的认知障碍。
实施例2匹立尼酸缓解APP/PS1ΔE9小鼠的焦虑症状的研究
进展性认知衰退和焦虑增加是AD患者的两个重要临床特征。为了研究匹立尼酸是否能缓解APP/PS1ΔE9小鼠的焦虑症状，使用开放场实验进一步检测。研究结果显示，匹立尼酸给药或不给药对APP/PS1ΔE9小鼠的运动能力没有显著差异(图2中A和2中B)。然而，匹立尼酸给药后，APP/PS1ΔE9小鼠的焦虑症状明显得到改善；主要体现在与对照组相比，匹立尼酸给药过后的APP/PS1ΔE9小鼠在开放场中心区域停留的时间显著增加(图2中A和2中C)。
可见匹立尼酸真正的能缓解AD小鼠的焦虑症状。
实施例3匹立尼酸改善APP/PS1ΔE9小鼠的神经可塑性的研究
基于匹立尼酸能改善AD小鼠的认知功能障碍和缓解焦虑行为，为了研究匹立尼酸是否能改善APP/PS1ΔE9小鼠的神经可塑性，将匹立尼酸给药2个月的AD小鼠进行脑组织取材，随后进行免疫组化和高尔基染色实验。免疫组化实验结果显示，经匹立尼酸给药后，APP/PS1ΔE9小鼠海马组织中PSD-95蛋白免疫源性显著上调(图3中A-B)，提示匹立尼酸能改善AD小鼠的突触后完整性。高尔基染色结果也显示，匹立尼酸给药后，APP/PS1ΔE9小鼠海马神经元的树突棘密度显著上调(图3中C-D)。
综上所述，匹立尼酸能在APP/PS1ΔE9小鼠中缓解突触功能紊乱、焦虑症状和改善认知障碍。
实施例4匹立尼酸缓解AD的病理学特征的研究
为了进一步探究匹立尼酸是否能缓解AD的病理特征，对匹立尼酸给药或不给药的APP/PS1ΔE9小鼠的脑组织中的Aβ进行检测。Western blot结果显示，与对照组相比，匹立尼酸给药后，APP/PS1ΔE9小鼠海马和皮层中的可溶性Aβ显著降低(图4中A-B)。值得注意的是，起着重要神经毒性作用的Aβ42和Aβ40在匹立尼酸给药后，其水平显著降低，尽管不同组间两者的比值没有发生明显改变(图4中A-B)。进一步运用ELISA检测发现，与对照组相比，匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠中海马和皮层组织中的不可溶性Aβ42和Aβ40的比例虽然没有发现明显改变，但两者的量都显著降低(图4中C)。免疫组织化学染色结果进一步显示，与对照组相比，匹立尼酸给药后的APP/PS1ΔE9小鼠脑组织中由Aβ(4G8)抗体标记上的β-淀粉样斑沉积情况显著降低(图5中A-C)。
可见匹立尼酸能改善APP/PS1ΔE9小鼠的Aβ病理学特征。
实施例5匹立尼酸激活星型胶质细胞和小胶质细胞从而缓解Aβ病理学特征的研究
基于先前科学研究发现，在AD病人的脑组织中，星形胶质细胞围在Aβ斑块周围、包裹细胞内的Aβ并对其进行降解。另外，在AD病人脑组织中，激活的小胶质细胞也聚集在Aβ斑块周围，通过吞噬Aβ从而限制Aβ斑块的形成。AD早起的病理进程表现为胶质细胞的功能紊乱，进而导致Aβ的清除不足从而导致突触功能紊乱。
为了研究匹立尼酸是否能激活星型胶质细胞和小胶质细胞从而缓解Aβ病理学特征，对匹立尼酸给药或不给药的APP/PS1ΔE9小鼠的脑组织进行了免疫荧光试验。与对照组APP/PS1ΔE9小鼠相比，匹立尼酸给药的APP/PS1ΔE9小鼠脑组织中小胶质细胞的标记物Iba1与Aβ斑块的共定位程度(图6中A-B)以及星型胶质细胞GFAP与Aβ斑块的共定位程度(图6中C-D)显著增加。这提示了，匹立尼酸激活星型胶质细胞和小胶质细胞向Aβ斑块进行聚集从而对其清除。由此可见，匹立尼酸通过激活星型胶质细胞和小胶质细胞从而缓解AD病理特征，进而改善神经可塑性，最终达到缓解和治疗AD的效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病或肌萎缩侧索硬化症。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述药物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
4.一种治疗和/或预防神经退行性疾病的药物组合物，其中所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体；优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药用载体。
5.根据权利要求4述的药物组合物，其中基于所述药物组合物的总重量，匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体的含量为1-99％，优选为20-80％，更优选为40-60％。
6.根据权利要求4或5所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括第二治疗活性剂；优选地，所述第二治疗活性剂选自盐酸多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚及甘露寡糖二酸中的一种或多种。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
8.包含匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体的药物组合物在制备治疗和/或预防神经退行性疾病的药物中的用途；优选地，所述药物组合物还包含一种或多种药用载体。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述药物组合物还包括第二治疗活性剂；优选地，所述第二治疗活性剂选自盐酸多奈哌齐、卡巴拉汀、加兰他敏、美金刚及甘露寡糖二酸中的一种或多种。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述药物组合物给予有需要的对象的每日剂量以匹立尼酸、其药学上可接受的盐、酯、或立体异构体计为：0.1-100mg/kg体重、优选为0.5-20mg/kg体重。
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