CN116265016B - 癫痫疾病药物的组合物及其用于制备治疗癫痫疾病药物的用途 - Google Patents

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Abstract

癫痫疾病药物的组合物及其用于制备治疗癫痫疾病药物的用途，属于生物医药技术领域，为解决癫痫，特别是难治性癫痫有效治疗的问题，要点是超低用量的右美沙芬和治疗有效量的丙戊酸钠联合用药，本发明通过海人酸(KA)模型模拟难治性癫痫的病理改变的动物模型，注射KA后直到自发的癫痫发作后再给予右美沙芬及丙戊酸钠联合用药进行干预，表明本发明联合用药能够对癫痫，特别是难治性癫痫进行有效治疗，具有重要的理论意义和应用价值。

Description

癫痫疾病药物的组合物及其用于制备治疗癫痫疾病药物的 用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及超低剂量右美沙芬匀速持续给药配伍丙戊酸钠在减轻难治性癫痫的癫痫发作方面的应用。
背景技术
癫痫是由不同病因引起的，脑部神经元反复高度同步化异常放电为特征的一组慢性脑部疾患，是神经系统的第二大类疾病，其患病率约为7‰，也就是说全球约有6500万癫痫患者，我国约有近千万，且每年新增65-70万。癫痫治疗方案包括药物治疗、外科治疗、生酮饮食以及神经调控治疗等。抗癫痫药物(Anti-Epileptic Drugs)治疗是目前癫痫治疗中最主要的治疗方案，常作为首选方案。大部分癫痫患者经过抗癫痫药物治疗可以获得长期缓解，但仍有25-30％的癫痫患者经正规抗癫痫药物治疗仍不能得到有效控制，称为难治性癫痫(Refractory Epelepsy)。2010年国际抗癫痫联盟将难治性癫痫定义为应用正确选择且能耐受的2种抗癫痫药物(单药或者联合用药)，仍未能达到持续无发作的癫痫。难治性癫痫病因不明，机制不清，治疗困难，长期的病痛折磨给患者及其家庭、乃至整个国家和社会，带来了巨大的经济和社会负担，因此，目前急需寻找难治性癫痫的生物标志物和治疗靶点，并开发一种全新的抗癫痫药物或治疗策略。
研究发现难治性癫痫由于反复发作、神经元持续异常放电，能够引起脑内小胶质细胞及星形胶质细胞激活，炎症因子大量释放，过氧化物产生增多，氧化应激升高，这种神经炎症不仅局限于癫痫灶局部，还会蔓延到其他脑区，并可能持续很长时间，从而导致癫痫发作相关的神经环路和网络的功能异常进一步加重，癫痫发作程度加重以及共患病发生；提示神经炎症在难治性癫痫发病机制中的重要作用，精准找到神经炎症相关的抗痫治疗靶点，是目前提高难治性癫痫疗效的关键环节，也是当今癫痫治疗领域的研究热点。
发明内容
为解决癫痫有效治疗的问题，特别是难治性癫痫有效治疗的问题，在第一方面上，根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，包括右美沙芬和丙戊酸钠。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，所述组合物中包括每天约10ng/kg～2mg/kg含量的右美沙芬。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，其中所述组合物中包括每天约10ng/kg～1μg/kg含量的右美沙芬。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，其中所述组合物中包括每天约0.1mg/kg～2mg/kg含量的右美沙芬。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，所述药物组合物中包括每天约100mg/kg～200mg/kg含量的丙戊酸钠。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，所述药物组合物中包括每天约150mg/kg含量的丙戊酸钠。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，所述药物组合物中包括每天约2mg/kg～40mg/kg含量的丙戊酸钠。
根据本申请一些实施例中的癫痫疾病药物的组合物，所述药物组合物的剂型包括注射剂或片剂。
在第二方面上，根据本申请一些实施例中的右美沙芬和丙戊酸钠的药物组合用于制备治疗癫痫疾病药物的用途。
根据本申请一些实施例中的用途，所述药物组合包括任一项所述的组合物。
根据本申请一些实施例中的用途，所述药物组合用于制备难治性癫痫(Refractory Epilepsy)疾病药物的用途。
根据本申请一些实施例中的用途，所述右美沙芬的干预靶点是NOX-2分子通路的亚基gp91PHOX。
根据本申请一些实施例中的用途，所述药物组合中所述右美沙芬通过颈部皮下植入式渗透压泵给药，所述丙戊酸钠通过颈部皮下注射。
有益效果：本发明的药物组合物以及用途，能够对癫痫，特别是难治性癫痫进行有效防治，具有重要的理论意义和应用价值。具体能够表明本发明取得上述效果的实验数据由具体实施方式记载。
附图说明
图1是实验例中实验操作流程示意图。
图2是实验例中慢性癫痫模型第5、6、7、8周时，连续给药4周，观察并统计各个治疗组相关数据图。
图3是实验例中慢性癫痫模型第9周时，通过皮下注射2mg/kg KA(1mg/ml)，连续观察4h的结果图。
图4在实验例中慢性癫痫模型第13周时，通过皮下注射2mg/kg KA(1mg/ml)，诱导癫痫样异常脑电放电结果图。
图5是在模型第10-11周时旷场实验及新物体识别实验结果图。
图6是慢性癫痫模型大鼠海马区尼氏染色结果图。
图7是慢性癫痫模型大鼠海马区小胶质细胞Iba-1免疫组化染色结果图。
图8是慢性癫痫模型大鼠海马组织NOX-2分子亚基gp91PHOX蛋白表达结果图。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例：右美沙芬(DM)是吗啡类左吗喃甲基醚的右旋异构体，是一种传统的非麻醉性镇咳药，能够以高亲和力结合于sigma配体相关位点并且以较低亲和力结合于N﹣甲基﹣D﹣天冬氨酸(NMDA)受体发挥相应的拮抗作用。通过抑制延髓咳嗽中枢而发挥中枢性镇咳作用，常规剂量右美沙芬的应用范围，主要用于干咳，适用于感冒、急性或慢性支气管炎、支气管哮喘、咽喉炎、肺结核以及其他上呼吸道感染引起的咳嗽。
根据现有技术，特定剂量的右美沙芬可通过抑制小胶质细胞NOX2，作用于相关神经炎症信号通路，降低小胶质细胞的过度活化和超氧化物(Free radicals)的产生，减少特定促炎性因子的释放，在神经变性疾病中起到神经保护作用，包括治疗帕金森病、阿尔兹海默病、抑郁症、眼睑痉挛等。右美沙芬常规治疗剂量在抗癫痫中的应用也有少量报道，但是由于高剂量和长期应用右美沙芬可对中枢神经系统产生明显的毒性作用，患者可表现出恶心、头晕、严重者可出现幻视、过度兴奋、眼球震颤，甚至昏迷等中毒性症状，因此难以在抗痫治疗中加以应用。
丙戊酸钠是目前治疗癫痫的常用药物，通过抑制钠通道，进而能够减少或抑制神经元放电的过度兴奋，缓解癫痫发作，在治疗过程中，癫痫病人基本需要每天服用丙戊酸钠进行治疗。然而，在丙戊酸钠低用量、甚至常规用量用药的情况下，部分患者控制癫痫的效果不明显，特别是对于难治性癫痫，有效性较低。此外，在一些情况下，还有部分患者需明显提高丙戊酸钠用药量。在这种情况下，高剂量长期应用丙戊酸钠可能引发对中枢神经系统产生明显的毒性作用。为此，本发明通过丙戊酸钠配伍右美沙芬，特别是超低剂量右美沙芬，使得丙戊酸钠在低剂量、常规剂量下就能够具有较明显的癫痫控制效果。此外，对于难治性癫痫也能起到明显控制效果。配伍右美沙芬能够降低丙戊酸钠的用量，甚至可降低丙戊酸钠的常规用量，对需明显提高丙戊酸钠用药量控制癫痫疾病的患者，能够明显降低丙戊酸钠用量。在癫痫或难治性癫痫能效控制的基础上，降低丙戊酸钠对中枢神经系统产生的毒性作用。
本发明超低用量使用右美沙芬，在第一方面，超低用量已经可以达到抗神经炎症的作用，且不会导致高剂量长期应用右美沙芬会引起对中枢神经系统产生潜在的毒性作用。第二方面，超低用量的右美沙芬加入，可以降低丙戊酸钠的使用量，从而降低丙戊酸钠高剂量和长期应用对中枢神经系统产生明显的毒性作用。第三方面，超低剂量降低了药物之间的相互影响。由上述，本发明丙戊酸钠与右美沙芬联合用药，丙戊酸钠是抗癫痫用药，通过抑制钠通道，能够减少或抑制神经元放电的过度兴奋，缓解癫痫发作，是对症治疗，即治标；右美沙芬可降低小胶质细胞的过度活化，起到抗炎的作用，进而保护神经元，阻止炎症反应对神经元的损伤，是治本。联合用药可以治标和治本。
在一种实施方式中，本发明的所述药物组合物包括超低用量的右美沙芬，以及包括癫痫治疗有效量的丙戊酸钠。具体的，本发明癫痫疾病药物的组合物中包括每天约10ng/kg～2mg/kg含量的右美沙芬以及每天约100mg/kg～200mg/kg含量的丙戊酸钠，联合用药可以明显改善低剂量和常规用量丙戊酸钠的癫痫控制效果，通常还可降低丙戊酸钠用量，特别是对需明显提高丙戊酸钠用药量控制癫痫疾病的患者，能够极大降低丙戊酸钠用量。
在第一种实施方式中，本发明的所述药物组合物包括超低用量的右美沙芬，以及包括癫痫治疗有效量的丙戊酸钠。具体的，本发明癫痫疾病药物的组合物中包括每天约10ng/kg～2mg/kg含量的右美沙芬以及每天约100mg/kg～200mg/kg含量的丙戊酸钠，优选丙戊酸钠用量每天约150mg/kg。
在第二种实施方式中，本发明的所述药物组合物包括超低用量的右美沙芬，以及包括癫痫治疗有效量的丙戊酸钠。具体的，本发明癫痫疾病药物的组合物中包括每天约10ng/kg～2mg/kg含量的右美沙芬以及每天约2mg/kg～40mg/kg含量的丙戊酸钠，优选丙戊酸钠用量每天约0.1mg/kg～2mg/kg。
所述第一种和第二种实施方式中，联合用药可以明显改善低剂量和常规用量丙戊酸钠的癫痫控制效果，通常还可降低丙戊酸钠用量，特别是对需明显提高丙戊酸钠用药量控制癫痫疾病的患者，能够极大降低丙戊酸钠用量。
在一种实施方式中，作为第一种和第二种实施方式的进一步限定，所述组合物中包括每天约10ng/kg～1μg/kg含量的右美沙芬。
在一种实施方式中，作为第一种和第二种实施方式的进一步限定，所述组合物中包括每天约0.1mg/kg～2mg/kg含量的右美沙芬。
通常实验动物单独使用丙戊酸钠的用量是每天约100～200mg/kg，本发明丙戊酸钠与超低用量的右美沙芬组合使用，丙戊酸钠的用量是每天约130～150mg/kg，并且能够达到明显的癫痫控制效果。临床通常使用丙戊酸钠的用量口服每天约10～25mg/kg，但是一些患者在这个剂量下用于控制癫痫效果不明显，一些患者需要使用每天约60毫克/kg，或者增加其他抗癫痫药联合应用。本发明增加超低量右美沙芬，使得丙戊酸钠的用量在约每天10～25mg/kg时控制癫痫效果明显，最高用量基本可以降到每天40mg/kg，在具有明显控制效果的前提下，在一些情况下还能明显减少丙戊酸钠的用量，并且不需要增加其他类型抗癫痫药物。
在一种实施方式中，本发明将所述用量的丙戊酸钠通过颈部皮下注射，将超低剂量右美沙芬通过颈部皮下植入式渗透压泵匀速持续给药。因此，本发明能精准的作用于难治性癫痫的关键治疗靶点NOX-2通路，降低小胶质细胞的过度活化，保护在难治性癫痫中的易损神经元，能够有效降低难治性癫痫的癫痫发作程度，进而为制备难治性癫痫的新型抗痫药物提供依据。具体的，所述右美沙芬的干预靶点是NOX-2分子通路的亚基gp91PHOX。
在这种实施方式中，应用渗透原理确保右美沙芬持续不间断地均匀给药，增强特异性、降低毒性、减少药物相互反应，对半衰期短的药物具有保护作用，优选溶剂为生理盐水。在这种实施方式中，优选丙戊酸钠药物溶解的溶剂为0.9％生理盐水，丙戊酸钠浓度75mg/ml。可以理解的是，本发明剂型并不限于注射剂，还可以是片剂等其他剂型。
在一种实施方式中，每天施用所述药物组合物治疗癫痫以及难治性癫痫，能够降低癫痫患者丙戊酸钠用量，可以明显控制癫痫，还能够解决对中枢神经系统产生毒性的问题，从而可支持对癫痫患者长时间用药目的。此外，还能够给与难治性癫痫患者有效治疗。
在进一步的优选实施方式中，在癫痫疾病药物的组合物中，所述丙戊酸钠与所述右美沙芬的重量比约为(75～(15×106))：1，优选约为(15×106)：1，所述右美沙芬用量优选每日10ng/kg。由此，在优选例中，右美沙芬用量优选约每日10ng/kg，丙戊酸钠用量优选约每日150mg/kg，例如体重55～80Kg左右的癫痫患者，一份所述组合物包括右美沙芬约550～800ng，丙戊酸钠8.25～12g。
根据本发明的上述方案，本发明所述的应用在一种实例中被理解为超低剂量右美沙芬缓释试剂在制备治疗难治性癫痫药物方面的应用。在更进一步的实例中，被理解为超低剂量右美沙芬匀速持续给药配伍丙戊酸钠在减轻难治性癫痫的癫痫发作方面的应用。特别是涉及超低剂量右美沙芬缓释试剂配伍丙戊酸钠在难治性癫痫药物在配伍药物组分和组成比例方面的应用。
对于上文所述的技术方案而言，进一步的，所述的应用还包括揭示超低剂量右美沙芬的主要作用靶点，以NOX-2分子亚基gp91phox作为干预靶点在制备治疗难治性癫痫药物方面的应用。
由上述方案，本发明对揭示难治性癫痫的发病机制，发现针对该类疾病的药物靶点，进行有效防治，具有重要的理论意义和应用价值。其效果是：1.靶点更明确：对NOX2更有选择性，因此副作用更少；2.减少丙戊酸的用量；3.合剂的缺点是药物之间的影响，超低剂量降低了药物之间的相互影响。
实验例：本发明通过制备难治性癫痫大鼠模型，进一步分析模型大鼠癫痫发作程度、认知功能、焦虑样行为的变化，免疫组化和western blot检测实验大鼠脑内的海马区神经元受损程度和小胶质细胞的激活状态，同时检测NOX-2分子通路的相关分子蛋白表达的改变，对模型大鼠给予本发明超低剂量右美沙芬匀速持续给药配伍丙戊酸钠进行干预，以证明本发明的效果。
一.在本发明的实验例中，本发明所使用的实验动物和实验试剂如下：
1.实验动物：采用出生8周SPF级别SD雄性大鼠，体重160-200g(辽宁长生生物技术股份有限公司提供，NO.211002300069006)，动物到达饲养环境后，先经过1周左右的适应期。在此期间，对动物健康和是否有任何生理、行为异常进行监测，并将所有出现异常的动物从研究中移除。
本发明的实验试剂包括造模及给药试剂及耗材，并具体包括
海仁酸(Sigma，K0250，美国)
丙戊酸钠(Sigma，K4543，美国)
右美沙芬(Supelco，PHR1018)
Alzet植入式给药泵(Osmotic pumps，2004，0.25ul/h，4w，RWD)
免疫组化试剂：
水合氯醛(扬州市奥鑫助剂厂)
多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司)
蔗糖(Biosharp美国)
OCT冷冻切片包埋液(SAKURA美国)
PBS磷酸盐缓冲液(粉剂)(北京索莱宝科技有限公司)
免疫组化染色试剂盒SP-9000(北京中杉金桥生物技术有限公司)
浓缩型DAB显色试剂盒ZLI-9032(北京中杉金桥生物技术有限公司)
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
盐酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)
二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司)
中性树胶(北京索莱宝科技有限公司)
曲拉通Trition X-100(北京索莱宝科技有限公司)
30％H2O2溶液(北京索莱宝科技有限公司)
柠檬酸钠抗原修复液(50X)(上海碧云天生物技术有限公司)
Iba-1抗体(日本和光纯药工业株式会社)
尼氏染色试剂：
尼氏染色液(北京索莱宝科技有限公司)
二甲苯(天津市科密欧化学试剂有限公司)
中性树胶(北京索莱宝科技有限公司)
OCT冷冻切片包埋液(SAKURA美国)
Western blot试剂：
全蛋白提取试剂盒KGP250/KGP2100(江苏凯基生物技术股份有限公司)BCA蛋白含量检测试剂盒KGPBCA(江苏凯基生物技术股份有限公司)30％Acr-Bis(29:1)(上海碧云天生物技术有限公司)
下层胶缓冲液(4×)(上海碧云天生物技术有限公司)
上层胶缓冲液(4×)(上海碧云天生物技术有限公司)
过硫酸铵(上海碧云天生物技术有限公司)
TEMED(上海碧云天生物技术有限公司)
无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
PageRulerprest Protein Ladder(Thermo Scientific美国)
甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)
脱脂奶粉(P1622普利莱基因技术有限公司)
牛血清白蛋白(BSA)(D009 Sigma美国)
特超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)
重组Anti-NOX2/gp91 phox抗体(abcam英国)
GAPDH单克隆抗体(abcam英国)
Anti-rabbit IgG(Cell signaling美国)
Anti-mouse IgG(Cell signaling美国)
二.在本发明的实验例中，本发明下述实施所有统计数据最终以平均值±标准误(Mean±S.E.M.)表示，符合正态分布的数据采用单因素方差分析(模型组和对照组)和多因素方差分析(对照组、模型组、不同治疗组)，统计指标包括癫痫发作潜伏期、癫痫发作次数和癫痫发作持续时间，首先是比较各组间总的差异，如总差异有显著性，再进行组间的两两比较；等级资料的数据包括癫痫发作级别采用非参数秩和检验。P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有非常显著性差异，P<0.001表示有极显著性差异。
三.在本发明的实验例中，实验包括如下步骤(见图1)：
图2的A-C所示结果提示，在慢性难治性癫痫模型第29-56天(第5、6、7、8周)时，连续给药4周，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)，每周癫痫发作总次数逐渐减少(图2的A)，发作总时间逐渐缩短(图2的B)，发作级别逐渐降低(图2的C)。n＝12/组
图3A的D所示结果提示在慢性难治性癫痫模型第9周时，通过皮下注射2mg/kg KA(1mg/ml)；连续观察4小时，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)诱发的癫痫潜伏期延长(见图3的A)，发作总时间缩短(见图3的B)，发作次数明显减少(见图3的C)，发作严重程度减轻(见图3的D)。n＝12/组
图4所示在慢性难治性癫痫模型第13周时，通过皮下注射2mg/kg KA(1mg/ml)，诱导癫痫样异常脑电放电。注射KA前，记录5min基线期，注射之后连续记录100min脑电图。记录每只大鼠不同级别癫痫发作对应脑电图放电的次数以及不同级别癫痫发作对应脑电图棘慢波(SWD)的时程，同时统计每20min棘慢波和棘波的数量，结果提示超低剂量右美沙芬联合丙戊酸钠可以明显减少慢性癫痫大鼠小剂量KA诱发的癫痫发作次数(图4的B、C、D)以及明显缩短SWD时程(图4的E、F、G)，并且在不同时间段内，合剂组也可减少棘慢波数量。
图5旷场实验(open fieldtest)是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。如图5的A所示，模型组大鼠相比正常对照组大鼠的静止时间明显增长，可以反映癫痫大鼠的绝望程度较高。治疗后大鼠的静止时间延长，说明癫痫大鼠的绝望程度有所缓解，其中超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)改善效果最明显。中央区时间百分比指的是大鼠在中央格运动的总时间占整个旷场实验时间的百分比，比值低说明大鼠探索行为有所下降，是大鼠焦虑的表现。如图5的B所示，模型组中的大鼠相比正常对照组中大鼠在中央区时间百分比明显减少，说明癫痫大鼠焦虑程度较高，经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)焦虑症状有所改善。平均速度是指大鼠在旷场实验中运动总路程和时间的比值，如图5的C所示，模型组大鼠相比正常对照组大鼠在旷场内的总平均速度降低，表示癫痫大鼠的自主运动减少，而经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠的自主运动有明显恢复。n＝14/组。
新物体识别：该测试依据动物对环境中熟悉的旧物体和陌生的新物体的探索时间长短，计算其辨别指数来评价其非空间记忆功能，其中辨别指数越高，说明记忆功能越好。结果显示，图5的D，癫痫模型组大鼠对新物体的辨别能力较差，记忆保留差。经过治疗后，三个治疗组大鼠记忆功能均有所改善，其中超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)记忆功能改善最明显。
图6为慢性癫痫模型大鼠海马区尼氏染色结果。在慢性癫痫模型第14周，处死小鼠，取脑组织，经过灌流、固定、脱水处理后，在恒冷条件下，进行脑组织切片，厚度为10um。根据大鼠脑图谱(The Rat Brain脑图谱的名称)，选取定位于Interaural6.00-5.52mmBregma3-3.48mm坐标处，连续选取脑冠状切片2片贴在一张载玻片上，按照产品说明书推荐的实验步骤，使用尼氏染液(有效成分为Cresyl violet)染色后，选取海马CA1及CA3区，在边长为200μm×200μm的统计框内，选取具有明显神经元胞体形态的尼氏染色细胞进行计数。沿着CA1及CA3区的分布特征，顺序选取4个统计区域，取其平均值进行最后的统计分析，每只大鼠将两张脑片的统计值进行均数处理。结果提示相较于正常鼠，KA导致海马CA1及CA3区尼氏染色神经元数量下降。而经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠的尼氏染色神经元数量有明显恢复。具有代表性的尼氏染色原始图片如图6的A，CA1尼氏染色统计结果如图6的B，CA3尼氏染色统计结果如图6的C。n＝3/组。
图7为慢性癫痫模型大鼠海马区小胶质细胞Iba-1免疫组化染色结果。选取定位于Interaural6.00-5.52mm Bregma 3-3.48mm坐标处，连续选取脑冠状切片2片贴在一张载玻片上，统计区域为图6的B和图6的C所示范围，为两张脑片的平均光密度的平均值。在癫痫模型13周时，与对照组相比，KA导致海马CA1和CA3区所在脑区Iba-1阳性小胶质细胞的平均光密度明显增强，提示KA导致海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞的免疫反应活性明显增强，而与KA模型组相比，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞的平均光密度明显降低，提示超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗(合剂)可明显减轻大鼠海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞增加的免疫反应活性。具有代表性的小胶质细胞Iba-1免疫组化原始图片如图7的A，CA1统计结果如图7的B，CA3统计结果如图7的C。n＝3/组。
图8为慢性癫痫模型大鼠海马组织NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达结果。在癫痫模型13周时，与对照组相比，KA导致海马NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达明显增高，提示KA导致海马NOX通路处于激活状态，而与KA模型组相比，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠海马NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达明显降低，提示超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗(合剂)可明显减轻大鼠海马NOX通路的激活状态。具有代表性的大鼠海马组织NOX-2分子亚基gp91phox蛋白原始图片如图8的A，统计结果如图8的B。n＝3/组。
实施例1
1实验分组
实验前，对动物称取体重，并根据体重进行随机分组，每笼5-6只，具体如表：
表实验动物分组及其干预方式
2.自发性难治性癫痫模型制备
2.1第1周：诱导急性癫痫模型：实验大鼠给予KA(10mg/kg,ip.)，浓度为4mg/ml，观察给药后3h内其癫痫惊厥行为并进行Racine分级并且研判大鼠在KA诱导后的急性期内是否出现持续1h及以上的3级以上癫痫发作。
其中Racine分级评判标准如下：
0级：无任何惊厥行为，与正常状态无异；
1级：动物活动频繁，出现咀嚼、眨眼等面部肌肉抽搐动作；
2级：点头状态下伴随阵挛性的咀嚼等颈部肌肉抽搐；
3级：头部颤搐加前肢阵挛性抽搐；
4级：上身僵直，伴随阵挛，抽搐严重，身体出现立起；
5级：双侧后肢抽搐极为严重，身体背曲强直，全身性阵挛，出现跌倒等现象。
2.2第2周：阈下刺激，检测癫痫大鼠癫痫敏感性。
KA诱发急性癫痫发作后1周，给大鼠颈背部皮下注射阈下剂量(2mg/kg)的KA(浓度1mg/ml)检测癫痫动物癫痫发作的敏感性，同时视频记录3h，观察KA后3h内其癫痫惊厥行为并进行Racine分级，当大鼠出现2级或以上癫痫发作，认为已经形成了难治性癫痫。
2.3第4周：2mg/kg KA(浓度1mg/ml)阈下刺激，加速癫痫大鼠自发癫痫形成。
KA诱发急性癫痫发作第4周，再次给大鼠颈背部皮下注射阈下剂量(2mg/kg)的KA，加速癫痫大鼠自发癫痫形成。选取出现2级或以上癫痫发作的大鼠，随机分成4组(KA+NS，KA+DM超低剂量，KA+VPA，KA+合剂组)。
3药物干预
第5-8周，视频记录药物干预对KA大鼠癫痫发作的影响。
DM干预策略：采用“超低剂量”DM(10ng/kg)，颈部皮下植入式渗透压泵给药策略(Alzet Pumps 2004Model)，应用渗透原理确保持续不间断地均匀给药，增强特异性、降低毒性、减少药物相互反应；对半衰期短的药物具有保护作用；溶剂为生理盐水。同时为了减少给药方式的差异带来的影响，超低剂量组每天同时给予皮下注射2ml/kg生理盐水。
丙戊酸钠：VPA：150mg/kg，1日1次，sc。丙戊酸钠浓度75mg/ml，药物溶解的溶剂为0.9％生理盐水。
4行为学检测
4.1癫痫行为学检测：录制视频，对癫痫发作情况进行监测。治疗期间，同时视频记录癫痫发作次数、持续时间、级别。
4.2小剂量KA诱导，检测各组癫痫发作敏感性，在模型第9周时，给予小剂量KA2mg/kg(浓度1mg/ml)，sc；观察诱发的癫痫发作的潜伏期、次数、总时程(s)以及发作级别；潜伏期是指第1次出现Racine1级及以上发作的时间；发作次数及总时程只统计Racine3级及以上发作.
四.在本发明的实验例中，还包括旷场实验及新物体识别实验
在模型第10周，进行旷场实验(Open Field Test，OFT)，用来检测实验动物的抑郁样及焦虑样行为，评估其自发运动。测试工具为全黑的开口塑料箱，箱高30～40cm，底边长100cm，内壁涂黑，底面平均分为25个4cm×4cm小方格，正上方2m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部，放置在隔音的测试房间内，箱体用帘与周围环境隔开。连接电脑和摄像头装置后，将大鼠放于实验箱中央位置，立即开始使用设备进行大鼠的行为轨迹记录，每只实验大鼠记录5min。5min结束后，将大鼠放回原来饲养的鼠笼内，用干净纸巾对实验箱进行排泄物的清理，并且用75％酒精进行实验箱底部和侧壁上大鼠气味的清除。再等待5min酒精挥发完全后，将下一只实验大鼠放于实验箱中继续进行实验。记录大鼠休息时间，运动总距离、周围运动距离，中央运动距离、运动速度等。
在模型第11周，进行新物体识别实验(novel object recognition，NOR)来检测实验动物的非空间认知能力，该测试依据动物对环境中熟悉的旧物体和陌生的新物体的探索时间长短来评价其记忆功能。测试实验前1d，先将大鼠放到实验室，让其适应环境1d，然后进行正式实验。测试工具为透明的开口塑料箱(40cm×40cm×40cm)，箱体用帘与周围环境隔开，放置在隔音的测试房间内，保持光照强度约为40LX，避免产生阴影。识别的物体有A，B，C三个大小相同(5cm×5cm×5cm)的特制立方体，立方体的重量均不能被实验大鼠推动，其中A，B物体(白色)完全一样，C物体(黑白相间)与A，B物体完全不同。新物体识别实验包括两部分：样本实验和测试实验。在样本实验中，实验大鼠背朝两物体放入场地内，并且大鼠鼻尖距离两物的长度要一致。小鼠放入5min，放入后立即开启录像设备，实验者立即离开测试房间，记录大鼠与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的次数和距离物体2cm范围内探究的时间(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属探究物体，摆架势或爬到物体上不动不能算是对新物体的探究)。5min结束后，立即将大鼠放回原来饲养的鼠笼内，待其休息1小时后再进行测试(此期间大鼠仍待在测试房间内)。在测试实验中，将场地内的B物体换作C物体，仍将大鼠背向两物体放入实验场地，鼻尖据两物体距离相同，观察5min时间，同样用录像设备录像，观察者离开测试房间，观察指标同探索实验。实验中为了避免实验大鼠气味或排泄物相互干扰，每次探索实验或测试实验后都用75％的酒精擦拭消毒。待全部实验结束将大鼠送回原来的饲养房中。
实验采用辨别指数(discrimination index，DI)来评估实验动物的非空间认知能力，计算公式为DI＝(Tn-Tf)/(Tn+Tf)，Tn和Tf分别代表探索新的和熟悉的事物的探索时间。
五.在本发明的实验例中，还包括脑电监测
小剂量KA(2mg/kg，浓度1mg/ml)诱导，通过脑电图检测各组癫痫发作敏感性，在模型第12周时，开始进行脑电极植入，正负极分别置于两侧顶叶，地线接小脑。恢复7天后，在模型第13周时，开始进行脑电图监测，给予小剂量KA(2mg/kg，浓度1mg/ml)诱导，脑电监测100min，观察诱导的癫痫严重程度。包括癫痫发作的潜伏期、次数、总时程(s)以及发作级别。
六.在本发明的实验例中，还包括形态学检测
1灌流
(1)麻醉：4％的水合氯醛，0.01ml/g，腹腔注射。腹股沟附近进针，向腹中线方向走行。若麻醉效果不佳，可适当增加剂量；
(2)固定：用注射器针头将大鼠四肢固定在泡沫板上；将泡沫板置于托盘内，其中一边搭在托盘边缘，使泡沫板倾斜，方便灌流液流出；
(3)灌流液体准备：4％多聚甲醛(4摄氏度)，生理盐水备用；
(4)灌流：首先剪开腹腔，再剪开膈肌，少量剪开胸廓，暴露心脏。用皮钳或止血钳固定皮肤及胸廓等，剪开心包。由左心尖进输液针，连接生理盐水，打开输液开关，注意：进针不宜过深，否则会刺破心脏。进针后发现有血液回流至头皮针，通常表示位置准确，此时剪开右心耳，固定好输液针。缓慢推注射器，若心脏内有暗红色液体流出，则进针准确。待流出液体变成无色透明后(约60ml即可)更换4％多聚甲醛，先快后慢，快速灌注50ml后放慢速度，每只大鼠约需100ml。如果多聚甲醛灌注充分，则动物四肢和全身肌肉不停抽动。灌流完成后，将大鼠室温放置30min，使其脑组织充分固定；
(5)剥离脑组织：将大鼠头部用剪刀剪下，再用止血钳小心剥离脑组织，避免造成损伤；
(6)固定：将脑组织放置于含有4％多聚甲醛的50ml离心管中，固定3天；
(7)梯度脱水：将装有脑组织的离心管中的多聚甲醛弃去，将脑组织取出，用滤纸吸取上面多余液体，再在离心管内注入配制好的10％的蔗糖溶液，按照10％、20％和30％(2次)三个浓度进行梯度脱水。先在10％蔗糖溶液中脱水1天，待脑组织彻底沉底为脱水完全，即可更换至20％的蔗糖溶液中继续脱水2天，依次进行，直至脱水完全。
2脑组织冰冻切片
取脱水完全的大鼠脑组织，弃去蔗糖溶液，用滤纸吸取脑组织上面多余液体，再用刀修平脑组织底部。把脑组织置于样品托上并保证其呈竖直状态，在样品托槽内加入OTC包埋液，直至完全没过脑组织，放入-80℃冰箱中，待脑组织全部冰冻后(或液氮速冻)，就可以进行切片。切片前1小时调试冰冻切片机温度至-22℃提前预冷，再将冰冻的脑组织放到冰冻切片机里的速冻台放置20min，调整机器切片厚度为15μm。各组切片做好标记，-80℃保存备用。
3.尼氏染色
(1)从-80℃取出冰冻切片，将切片放置到37℃烘箱中干燥10min；
(2)置于摇床上，用PBS洗2次，第一遍1min，第二遍3min；
(3)取出切片放入湿盒内，用滤纸吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。在脑片位置滴加尼氏染液，保证脑片表面及周围被染液完全覆盖。将湿盒放置37℃烘箱中30min；
(4)将切片用二蒸水清洗，洗3次，每次2min；
(5)将切片按顺序置于75％无水乙醇、95％无水乙醇、100％无水乙醇三个梯度中进行脱水，置于摇床上，视程度决定每个梯度脱水时间，每个梯度30s左右；
(6)将切片置于二甲苯中静置1min；
(7)取出切片放入湿盒内，用滤纸吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。在脑片位置滴加尼氏染液，保证脑片表面及周围被染液完全覆盖。
(8)待切片晾干后滴加中性树胶，用盖玻片盖上。封片时注意不要有气泡，树胶使用适量。自然晾干，室温保存；
(9)使用正置光学电子显微镜观察染色情况并拍照。
4免疫组化实验
(1)从-80℃取出冰冻切片，将切片放置到37℃烘箱中干燥15min；
(2)将切片置于0.5％Trition X-100溶液中，摇床上慢摇20min。再用PBS洗3次，每次2min；
(3)取出切片放入湿盒内，用滤纸吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。用移液器滴加过氧化氢(0.3％H2O2去离子水)去除内源性过氧化物酶，盖上湿盒盖，避光，室温10min。置于摇床上，用PBS洗3次，每次2min；
(4)取出切片放入配置好的0.5％柠檬酸钠抗原修复液中，放入微波炉10min。室温放置冷却1h。再置于摇床上，用PBS洗3次，每次2min；
(5)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。用组化笔在玻片上距离脑片位置2mm处画圈。滴加试剂2(封闭用正常山羊血清工作液)，盖上湿盒盖，室温孵育1h，回收试剂2，勿洗；
(6)滴加稀释的一抗[Iba-1(1：1000)]，一定要保证组织表面及周边被一抗完全覆盖，4℃过夜；
(7)倾斜玻片，回收一抗。置于摇床上，用PBS洗3次，每次2min；
(8)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。滴加试剂3(生物素标记山羊抗兔IgG聚合物)，室温孵育1h，倾去。置于摇床上，用PBS洗3次，每次3min；
(9)取出切片放入湿盒内，吸干表面的液体(保持组织呈湿润状态)。滴加试剂4(辣根酶标记链霉素卵白工作液)，盖上湿盒盖，室温孵育1h。置于摇床上，用PBS洗3次，每次2min；
(11)进行DAB显色，DAB现配现用，30min内使用，避光保存。滴加DAB显色液，镜下观察，适时终止(滴加PBS缓冲液)，一般8min-15min内终止；
(12)将显色好的切片用PBS清洗3次，每次2min；
(13)封片，切片擦干后滴加中性树胶，用盖玻片盖上。封片时注意不要有气泡，树胶使用适量。自然晾干，室温保存；
(14)使用正置光学电子显微镜观察染色情况并拍照，用Image-J 6.0对免疫组化图片脑区进行光密度分析。
4.形态学实验主要溶液配制：
(1)生理盐水
配制浓度为0.9％氯化钠，1升水+9g氯化钠即可。
(2)4％水合氯醛
用电子天平称取水合氯醛结晶0.6g，加入三蒸水10ml溶解，在量筒中定容至15ml。室温避光保存备用。
(3)多聚甲醛
4％多聚甲醛：用电子天平称取40g多聚甲醛粉末置于烧杯(规格：1L)中，加入三蒸水，将烧杯置于磁力搅拌器上加热至55℃，注意通风，并持续搅拌至多聚甲醛完全溶解，在量筒中定容至1L。室温保存备用。
(4)蔗糖
30％蔗糖溶液：用电子天平称取150g蔗糖，置于烧杯(规格：500ml)中，加入300ml三蒸水充分溶解，随后在量筒中定容至500ml。4℃保存备用。
20％蔗糖溶液：用量筒量取100ml 30％蔗糖溶液，加入三蒸水定容至150ml。4℃保存备用。
10％蔗糖溶液：用量筒量取50ml 30％蔗糖溶液，加入三蒸水定容至150ml。4℃保存备用。七.在本发明的实验例中，还包括Western blot检测
1大鼠脑分区组织全蛋白的提取
(1)使用全蛋白提取试剂盒，每1ml冷Lysis Buffer中加入10μl磷酸酶抑制剂，1μl蛋白酶抑制剂和10μl 100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟备用；
(2)将取好的海马组织，置于预冷离心管中，按照每100mg固体组织加入0.5ml冷Lysis Buffer的标准，加入冷Lysis Buffer。用高速匀浆机手动上下匀浆30～50次，注意低温操作；
(3)打开离心机，调节温度至4℃预冷。将组织匀浆液转移到1.5ml预冷的离心管中，按照12000g离心，4℃离心5min；
(4)取上清转移至新的预冷的离心管中，即为全蛋白提取物；
(5)样品分装保存于-80℃冰箱中(注意标记蛋白样品的体积，便于后期加上样缓冲液)，避免反复冻融。
2蛋白浓度的测定
(1)配制BCA工作液：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配置适量的BCA试剂，充分混匀后置于冰盒内待用；
(2)将蛋白质标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μl的顺序依次加到96孔板的标准品孔中，加去离子水补足到20μl，再加200μl BCA工作液；
(3)取待测蛋白样品，稀释至合适的浓度；
(4)各孔加入20μl稀释好的蛋白样品，再加入配制好的BCA工作液200μl。把酶标版放在震荡仪器震动30sec，充分混匀，放置在37℃温箱中30min；
(5)在562nm波长下比色测定。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；
(6)根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可算得相应的蛋白含量(μg)，除以样品稀释液总体积(20μL)，乘以样品稀释倍数即为样品实际浓度(单位：μg/μL)。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(1)根据被检测蛋白分子量确定分离胶浓度为8％，浓缩胶浓度为5％；
(2)清洗玻璃板：玻璃板用自来水冲洗，再用三蒸水冲洗干净后，放在胶架上晾干；
(3)灌胶：首先用三蒸水灌入等待10min，确定是否漏水。按照配胶浓度先配制分离胶，灌入至插入梳子后至梳子底端1cm左右，缓慢加入无水乙醇直至玻璃板上方，赶走气泡。室温放置40min，待胶凝固后，将无水乙醇倒出。配制浓缩胶，混匀，注入玻璃板，至玻璃板顶端，迅速小心插入梳子，避免产生气泡，室温放置40min，使分离胶和浓缩胶充分聚合；
(4)准备蛋白样品：将已经测定浓度的蛋白取出，根据蛋白样品体积，加入6×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，放入水浴锅中，96℃～98℃加热5min使蛋白变性，注意防止爆管；
(5)电泳：将配制好的胶放置于电泳槽中，胶内部注入充足的电泳液至没过加样孔，外周也加入电泳液没过底部的导电线，保证通电。竖直拔出梳子，除去上样孔中的气泡并用钝针头扶正。用微量移液器贴壁加入蛋白样品，蛋白上样量为30μg。插入电泳仪电源，调制电压为恒定80V，15min后将电压调整为恒定120V，至溴酚蓝移至分离胶底部，关闭电源，取出凝胶；
(6)转膜：用切胶器将凝胶切下放入盛有转膜液的容器内，并且按照所切凝胶的大小剪出相应大小的PVDF膜，放置在无水甲醇中浸泡30sec活化，再放入转膜液中洗涤待用。在加有转膜液的盘中放入转膜夹、海绵、滤纸。将转膜夹黑色的部分朝下，依次放置海棉、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、海棉，每步都用切胶器在上面轻轻压过，赶走气泡。将转膜夹放入转膜槽中，使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。使用恒定电流300mA转膜90min。转膜时需将电泳槽置于放有充足冰水混合物的盆中，避免产热破坏转膜，使条带变形；
(7)封闭：待转膜结束后将PVDF膜迅速从夹子中取出，正面朝上放入装有TBST的容器内洗涤，然后转移至配制好的5％脱脂奶粉(或5％BSA)的孵育盒中，置于摇床上，室温封闭2h。注意脱脂奶粉现配现用，BSA可回收利用2-3次，-20℃保存；
(8)一抗孵育：倒掉脱脂奶粉，用TBST洗膜3次，每次10min。分别加入按比例配制好的一抗[ADAR1(1:1000)、GAPDH(1:5000)、NSF(1:1000)、Gp91phox1:5000、GSDMD(1:5000)、NLRP3(1:1000)]，4℃摇床过夜；
(9)二抗孵育：回收一抗。TBST洗膜3次，每次10min。孵育配制好的二抗[Anti-rabbit IgG(1:5000)、Anti-mouse IgG(1:5000)]，常温在摇床上孵育90min。
(10)化学发光与显影：回收二抗。TBST洗膜3次，每次10min。按照1:1的比例配制显影液，用移液器滴加到PVDF膜上进行显影(避光)，使用凝胶成像仪进行成像；
(11)用Image Lab 3.0进行灰度分析。
4.Westernblot实验主要溶液配制：
(1)10％过硫酸铵溶液(Ammonium Persulfate，APS)
取1g过硫酸铵，加三蒸水溶解并定容至10ml，装置15ml离心管中，-4℃保存备用。
(2)SDS-PAGE电泳凝胶的配制(2板)
5％的浓缩胶配制(4ml)：三蒸水2.33ml、30％Arc-Bis(29:1)0.67ml、上层胶缓冲液(4X)(pH6.8)1ml、10％APS 0.04ml、TEMED 0.004ml。
10％的分离胶配制(15ml)：三蒸水6.1ml、30％Arc-Bis(29:1)5ml、下层胶缓冲液(4X)(pH8.8)3.75ml、10％APS 0.15ml、TEMED 0.006ml。
(3)SDS-PAGE电泳液
SDS-PAGE电泳液5X:称取1515g Tris、72g甘氨酸(Gly)、10g SDS倒入到洁净的烧杯(规格1L)中，加入三蒸水到约900ml，充分溶解。在量筒中定容到1L，混匀后可室温保存。
SDS-PAGE电泳液(1X)：将SDS-PAGE电泳液(5X)取出100ml置洁净烧杯(规格1L)中，加入三蒸水到约900ml，充分溶解。在量筒中定容到1L，混匀后即可使用，可室温保存。
(4)Western转移缓冲液
Western转移缓冲液(5X):称取15.15g Tris、72g甘氨酸(Gly)、倒入到洁净的烧杯(规格1L)中，加入三蒸水到约900ml，充分溶解，混匀即可使用，4℃保存。
Western转移缓冲液(1X):在1L量筒中加入200ml甲醇，然后加入Western转移缓冲液(5X)定容至1L。混匀即可使用。4℃保存。
(5)Western洗涤液(TBST)
Western洗涤液(10X)：称取30g Tris、73g Nacl置于洁净烧杯中(规格1L)，加入三蒸水到约900ml，充分溶解。在量筒中定容到1L，混匀后即可使用。可室温保存。
Western洗涤液(1X)：将Western洗涤液(10X)取出100ml并加入吐温-20 1ml，倒入到洁净的烧杯(规格1L)中，加入三蒸水并定容到1L，混匀即为Western洗涤液(1X)，可以用于Western的洗涤。可室温保存。
(6)5％脱脂奶粉(封闭液)
称取2.5g奶粉置于50ml离心管中，用量筒量取30ml TBST加入其中，充分溶解，定容至50ml。现用现配。
在本发明的实验例中，根据上述实验例的各实验所得实验结果请参见各附图。
图2的A示出了在慢性癫痫模型第5、6、7、8周时，连续给药4周，观察并统计各个治疗组每周癫痫发作的总次数。结果显示，随着治疗周期的延长，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)每周癫痫发作总次数逐渐减少，相较于生理盐水组，在治疗第3周时，开始呈现出治疗效果，明显减少了每周癫痫发作的总次数。癫痫发作行为通过视频回放的形式进行记录，统计Racine3级及以上发作。*P<0.05。
图2的B示出了在慢性癫痫模型第5、6、7、8周时，连续给药4周，观察并统计各个治疗组每周癫痫发作的总时间。结果显示，随着治疗周期的延长，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)每周癫痫发作总时间逐渐减少，相较于生理盐水组，在治疗第3周时，明显减少了每周癫痫发作的总时间，在治疗第4周时，效果更显著。癫痫发作行为通过视频回放的形式进行记录，统计Racine3级及以上发作。*P<0.05。
图2的C示出了在慢性癫痫模型第5、6、7、8周时，连续给药4周，观察并统计各个治疗组每周癫痫发作的级别。结果显示，随着治疗周期的延长，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)癫痫发作级别逐渐减轻，相较于生理盐水组，在治疗第2周时，就明显减轻了癫痫发作的级别，随着治疗时间的延长，效果更显著。癫痫发作行为通过视频回放的形式进行记录，统计Racine 1-5级的发作。*P<0.05。
从图2的A-C所示结果提示，在慢性难治性癫痫模型第29～56天(第5、6、7、8周)时，连续给药4周，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)，每周癫痫发作总次数逐渐减少(图2的A)，发作总时间逐渐缩短(图2的B)，发作级别逐渐降低(图2的C)。n＝12/组。
图3的A示出了慢性癫痫模型第9周时，给予KA(2mg/kg，sc)，观察第1次出现Racine1级及以上发作的时间。结果显示，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)可延长小剂量KA诱发癫痫发作的潜伏期，n＝12/组，***P<0.001。
图3的B、图2的C示出了慢性癫痫模型第9周时，给予2mg/kg KA，sc，连续观察4h。结果显示，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)诱发的癫痫发作次数较模型组明显减少，发作总时间缩短。癫痫发作行为由2人现场分别记录，发作次数和总时间只统计Racine3级及以上发作，n＝12/组。*P<0.05。
图3的D示出了慢性癫痫模型第9周时，给予2mg/kg KA，sc，连续观察4h。结果显示，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)可以明显降低小剂量KA诱发的癫痫发作级别。癫痫发作行为由2人现场分别记录，发作级别只统计Racine1-5级发作，n＝12/组。*P<0.05。
超低剂量右美沙芬联合丙戊酸钠对慢性癫痫大鼠小剂量KA诱导后脑电异常放电的影响。通过腹腔注射2mg/kg KA诱导癫痫样异常脑电放电。注射KA前，记录5分钟基线期，注射之后连续记录100min脑电图。记录每只大鼠棘慢波(SWD)的数量和时程，同时统计每20min棘慢波和棘波的数量。
图3的A-D所示结果提示在慢性难治性癫痫模型第9周时，给予阈下剂量KA，2mg/kg，sc；连续观察4h，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)诱发的癫痫潜伏期延长(见图3的A)，发作总时间缩短(见图3的B)，发作次数明显减少(见图3的C)，发作严重程度减轻(见图2的D)。n＝12/组。
图4所示在慢性癫痫模型第13周时，给予2mg/kg KA，sc，诱导癫痫样异常脑电放电。注射KA前，记录5min基线期，注射之后连续记录100min脑电图。记录每只大鼠不同级别癫痫发作对应脑电图放电的次数以及不同级别癫痫发作对应脑电图棘慢波(SWD)的时程，同时统计每20min棘慢波和棘波的数量，结果提示超低剂量右美沙芬联合丙戊酸钠可以明显减少慢性癫痫大鼠小剂量KA诱发的癫痫发作次数(图4的B、C、D)以及明显缩短SWD时程(图4的E、F、G)，并且在不同时间段内，合剂组也可减少棘慢波数量。
图5表示的旷场实验(open fieldtest)是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。如图5的A所示，模型组大鼠相比正常对照组大鼠的静止时间明显增长，可以反映癫痫大鼠抑郁程度较高。治疗后大鼠的静止时间延长，说明癫痫大鼠的抑郁程度有所缓解，其中超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)改善效果最明显。中央区时间百分比指的是大鼠在中央格运动的总时间占整个旷场实验时间的百分比，比值低说明大鼠探索行为有所下降，是大鼠焦虑的表现。如图5的B所示，模型组中的大鼠相比正常对照组中大鼠在中央区时间百分比明显减少，说明癫痫大鼠焦虑程度较高，经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)焦虑症状有所改善。平均速度是指大鼠在旷场实验中运动总路程和时间的比值，如图5的C所示，模型组大鼠相比正常对照组大鼠在旷场内的总平均速度降低，表示癫痫大鼠的自主运动能力下降，而经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠的自主运动能力有明显恢复。n＝14/组。
新物体识别：该测试依据动物对环境中熟悉的旧物体和陌生的新物体的探索时间长短，计算其辨别指数来评价其非空间记忆功能，其中辨别指数越高，说明记忆功能越好。结果显示，图5的D，癫痫模型组大鼠对新物体的辨别能力较差，记忆保留差。经过治疗后，三个治疗组大鼠记忆功能均有所改善，其中超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)记忆功能改善最明显。
图6为慢性癫痫模型大鼠海马区尼氏染色结果。使用尼氏染液染色后，选取海马CA1及CA3区，在边长为200μm×200μm的统计框内，选取具有明显神经元胞体形态的尼氏染色细胞进行计数。沿着CA1及CA3区的分布特征，顺序选取4个统计区域，取其平均值进行最后的统计分析，每只大鼠将两张脑片的统计值进行均数处理。结果提示相较于正常鼠，KA导致海马CA1及CA3区尼氏染色神经元数量下降。而经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠的尼氏染色神经元数量有明显恢复。n＝3只大鼠/组。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。在慢性癫痫模型第13周，处死小鼠，取脑组织，经过灌流、固定、脱水处理后，在恒冷条件下，进行脑组织切片，厚度为10μm。根据大鼠脑图谱(TheRat Brain脑图谱的名称)，选取定位于Interaural6.00-5.52mm Bregma 3-3.48mm坐标处，连续选取脑冠状切片2片贴在一张载玻片上，按照产品说明书推荐的实验步骤，使用尼氏染液(有效成分为Cresyl violet)染色后，选取海马CA1及CA3区，在边长为200μm×200μm的统计框内，选取具有明显神经元胞体形态的尼氏染色细胞进行计数。沿着CA1及CA3区的分布特征，顺序选取4个统计区域，取其平均值进行最后的统计分析，每只大鼠将两张脑片的统计值进行均数处理。结果提示相较于正常鼠，KA导致海马CA1及CA3区尼氏染色神经元数量下降。而经过治疗后，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠的尼氏染色神经元数量有明显恢复。具有代表性的尼氏染色原始图片如图6的A，CA1尼氏染色统计结果如图6的B，CA3尼氏染色统计结果如图6的C。n＝3/组。
图7为慢性癫痫模型大鼠海马区小胶质细胞Iba-1免疫组化染色结果。在癫痫模型13周时，与对照组相比，KA导致海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞的平均光密度明显增强，提示KA导致海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞的免疫反应活性明显增强，而与KA模型组相比，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞的平均光密度明显降低，提示超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗(合剂)可明显减轻大鼠海马CA1和CA3区Iba-1阳性小胶质细胞增加的免疫反应活性。n＝3/组。*P<0.05，***P<0.001，****P<0.0001。选取定位于Interaural6.00-5.52mm Bregma 3-3.48mm坐标处，连续选取脑冠状切片2片贴在一张载玻片上，统计区域为图7的B和图7的C所示范围，为两张脑片的平均光密度的平均值。具有代表性的小胶质细胞Iba-1免疫组化原始图片如图7的A，CA1统计结果如图7的B，CA3统计结果如图7的C。n＝3/组。
图8为慢性癫痫模型大鼠海马组织NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达结果。在癫痫模型13周时，与对照组相比，KA导致海马NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达明显增高，提示KA导致海马NOX通路处于激活状态，而与KA模型组相比，超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗组(合剂组)大鼠海马NOX-2分子亚基gp91phox蛋白表达明显降低，提示超低剂量右美沙芬配伍丙戊酸钠治疗(合剂)可明显减轻大鼠海马NOX通路的激活状态。具有代表性的大鼠海马组织NOX-2分子亚基gp91蛋白原始图片如图8的A，统计结果如图8的B。n＝3/组。*P<0.05，**P<0.01。
本发明公开超低剂量右美沙芬匀速持续给药配伍丙戊酸钠在减轻难治性癫痫的癫痫发作方面的应用，包括超低剂量右美沙芬主要作用靶点NOX-2分子通路相关分子靶点在减轻难治性癫痫的癫痫发作方面的应用，具体是在制备治疗难治性癫痫药物方面的应用；所述的应用包括超低剂量右美沙芬匀速持续给药配伍丙戊酸钠在制备治疗难治性癫痫药物方面的应用。本发明对于揭示难公开治性癫痫疾病的发病机制，发现针对该类疾病的药物靶点，进行有效防治，具有重要的理论意义和应用价值。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分的量、性质(诸如量、百分比)等的所有数字在所有情况下都应理解为表示所示的精确值和由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则在说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，所述近似值可以根据寻求获得的所需性质而变化。最起码，并且并非试图将等同原则的应用限于权利要求的范围，每一数值参数应至少按照所报告的有效数以及应用普通舍入法来理解。
在描述实施方式的上下文中(尤其是在所附权利要求书上下文中)不使用数量词修饰时应理解为覆盖单数和复数，除非本文另有说明或者显然与上下文矛盾。除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明实施方式，并且不对任何权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何非权利要求元素对于实施权利要求是必要的。
本文公开的替代要素或实施方式的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独地或与该组中的其他成员或本文中找到的其他要素任意组合地被提及和要求保护。可预见，出于方便和/或加速审查程序的原因，可将组中的一个或多个成员包括进组中或者从中删除。当出现任何这种包括或删除时，说明书看作是包含经修改的组，因而完成对如果所附权利要求书中使用，则满足了对全部马库什组的撰写说明。
本文中描述了某些实施方式，包括本发明人已知的用于实施所要求保护的实施方式的最佳方式。当然，对于本领域普通技术人员来说，在阅读前面的描述后，这些描述的实施方式的变型将变得显而易见。本发明人预期技术人员会根据情况采用这些改动，并且本发明人打算所要求保护的实施方式以不同于本文具体描述的方式来实施。因此，权利要求包括适用法律所允许的权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则还考虑了上述要素的所有可能变型的任何组合。
最后，应理解，本文公开的实施方式是对权利要求的原理的说明。可以采用的其他修改在权利要求的范围内。因此，举例来说而非限制，可以根据本文的教导来采用替代实施方式。相应地，权利要求书并不限于所恰好显示和描述的实施方式。

Claims (4)

1.一种用于难治性癫痫疾病药物的组合物，其特征在于，包括右美沙芬和丙戊酸钠，所述右美沙芬的干预靶点是NOX-2分子通路的亚基gp91 PHOX ，所述组合物中包括每天10ng/kg含量的右美沙芬，所述药物组合物中包括每天150mg/kg含量的丙戊酸钠，所述丙戊酸钠与所述右美沙芬的重量比为（15×106）：1，不包括其他类型抗癫痫药物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括注射剂或片剂。
3.一种权利要求1-2中任一项所述的组合物用于制备治疗难治性癫痫疾病药物的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述右美沙芬的干预靶点是NOX-2分子通路的亚基gp91 PHOX 。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4906638A (en) * 1987-12-22 1990-03-06 Nova Pharmaceutical Corporation Dextromethorphan potentiator for anticonvulsant composition and method
CN106413708A (zh) * 2014-06-18 2017-02-15 上海翰森生物医药科技有限公司 Nmda受体拮抗剂的医药用途及其药物组合物
CN115025227A (zh) * 2017-05-09 2022-09-09 浙江大学 联合用药治疗抑郁症的方法和药物组合物

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4906638A (en) * 1987-12-22 1990-03-06 Nova Pharmaceutical Corporation Dextromethorphan potentiator for anticonvulsant composition and method
CN106413708A (zh) * 2014-06-18 2017-02-15 上海翰森生物医药科技有限公司 Nmda受体拮抗剂的医药用途及其药物组合物
CN115025227A (zh) * 2017-05-09 2022-09-09 浙江大学 联合用药治疗抑郁症的方法和药物组合物

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A phase I clinical trial of dextromethorphan in intractable partial epilepsy;Kimiskidis, VK等;METHODS AND FINDINGS IN EXPERIMENTAL AND CLINICAL PHARMACOLOGY;19991201;第21卷(第10期);673-678 *
抗癫痫新药的进展;孙道开;;国际儿科学杂志(03);全文 *
焦万田等主编.《新编简明药物手册 第7版》.河南科学技术出版社,2022,(第2022年7月第7版第1次印刷版),第263页第2段. *
王一帆主编.《神经内科学基础与实践》.河南大学出版社,2020,(第2020年1月第1版第1次印刷版),第135-137页. *
钟海军等主编.《药剂学》.华中科技大学出版社,2021,(第2021年7月第1版第1次印刷版),第363页第6段. *

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