CN115667503A - 促进髓鞘化的组合物和方法 - Google Patents

促进髓鞘化的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115667503A
CN115667503A CN202180032522.8A CN202180032522A CN115667503A CN 115667503 A CN115667503 A CN 115667503A CN 202180032522 A CN202180032522 A CN 202180032522A CN 115667503 A CN115667503 A CN 115667503A
Authority
CN
China
Prior art keywords
agent
gpr17
inhibits
differentiation
injury
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180032522.8A
Other languages
English (en)
Inventor
Z·何
J·王
X·何
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Childrens Medical Center Corp
Original Assignee
Childrens Medical Center Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Childrens Medical Center Corp filed Critical Childrens Medical Center Corp
Publication of CN115667503A publication Critical patent/CN115667503A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4722—G-proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/25—Tumour necrosing factors [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/081—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neurons

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提出可用于治疗以髓鞘化不足为特征的疾病、疾患、病症或损伤的方法和组合物。所述方法包括给药GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂。

Description

促进髓鞘化的组合物和方法
技术领域
联邦资助研究下的发明权利声明
本发明在政府支持下完成，由美国国立卫生研究院资助(项目编号：5R01EY026939)。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请为国际PCT申请，主张2020年5月1日提交的美国临时申请序列号63/018,939的优先权和权益，该临时申请的整体内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
与中枢神经系统损伤(诸如创伤性脑损伤和脊髓损伤)相关的功能缺陷在很大程度上归因于长投射轴突的切断以及后续相关回路的中断。然而，尽管在促进轴突再生的策略开发方面取得了巨大进展，但即使在实验性损伤模型中，这些方法所取得的行为改善仍然有限。例如，通过增强视网膜神经节细胞(RGC)的内在再生能力的操作来诱导再生轴突，能够在其适当的靶点诸如上丘形成功能性突触，但仍保持无髓鞘。鉴于髓鞘在促进轴突传导方面的既定作用，这些观察结果表明再生轴突的髓鞘化失败是对于功能恢复的一个被低估的障碍，并表明需要了解成年体的再生轴突的髓鞘化的调节机制。
众所周知，髓鞘化在神经发育完全后并不会停止，而是在成年体CNS中继续发生。这是通过广泛分布在CNS的全部部分中的少突胶质细胞前体细胞(OPC)实现的。对于成功的髓鞘化，驻留的OPC经常经历增殖，随后是鲜为人知的多步骤分化过程，最终成为具有髓鞘化能力的少突胶质细胞。CNS分化和髓鞘化的启动和时机由内在因素和外在因素严格调控。另一方面，髓鞘化失败是许多神经疾病的基础，诸如多发性硬化(MS)、脑白质营养不良和神经退行性阿尔茨海默症。例如，在称为进行性MS的MS晚期，一些增殖性OPC保留在病灶核心但不能分化为成熟的少突胶质细胞。因此，已经做出了许多努力来开发促进OPC增殖和分化的策略。然而，在最常使用的脱髓鞘化模型诸如实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)中，可能自发地发生某种程度的再髓鞘化，对于判断任何促髓鞘化治疗是否通过加快该自发进程和/或启动从头髓鞘化来发挥作用提出了挑战。此外，OPC成为成熟少突胶质细胞所需的多步骤分化的属性可能需要处理超过一个步骤的操作。
目前，对于与髓鞘化失败相关的疾病诸如多发性硬化(MS)、脑白质营养不良和神经退行性阿尔茨海默症或者对于与髓鞘化失败相关的中枢神经系统损伤(例如，创伤性脑损伤、脊髓损伤)尚无有效的治疗措施。
发明内容
如下所述，本发明提出可用于治疗以髓鞘化不足为特征的疾病、疾患、病症和损伤的方法和组合物。
一方面，本发明提供一种用于增加轴突的髓鞘化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与抑制GPR17的药剂和/或消融和/或抑制激活的小胶质细胞的药剂接触，从而增加轴突的髓鞘化。在一些实施方案中，轴突是受损的或脱髓鞘的。
另一方面，本发明提供一种增加轴突的髓鞘化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与抑制GPR17的药剂和/或抑制TNFα受体2或TNFα的药剂接触，从而增加轴突的髓鞘化。在一些实施方案中，抑制TNFα受体2或TNFα的药剂是沙利度胺(thalidomide)。
又一方面，本发明提供一种用于增加OPC数量和/或分化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化。在上述任何方面的一些实施方案中，抑制GPR17的药剂是孟鲁司特(Montelukast)或普鲁司特(Pranlukast)。
又一方面，本发明提供一种用于增加OPC数量和/或分化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与抑制GPR17的药剂和/或抑制TNFα受体2或TNFα的药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化。在上述任何方面的一些实施方案中，消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂是PLX3397。在一些实施方案中，抑制TNFα受体2或TNFα的药剂是沙利度胺。
另一方面，本发明提供一种增加轴突的髓鞘化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与选自由甲磺酸苯扎托品(benztropine mesylate)、氯马斯汀(clemastine)、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺组成的组的药剂接触，从而增加轴突的髓鞘化。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂是孟鲁司特。
另一方面，本发明提供一种增加OPC数量和/或分化的方法，该方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化，该药剂是甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺中的任何一种或多种。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂是孟鲁司特。
在上述任何方面的一些实施方案中，该方法增加CC1和/或Oligo1阳性OPC的数量。在一些实施方案中，该药剂同时或依次给药。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂与消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂同步给药。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂在消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂之前至少一周给药。在一些实施方案中，该药剂在损伤之前、同时或之后给药。在一些实施方案中，该药剂在损伤之后数天或数周给药。在一些实施方案中，该药剂在损伤之后1至2周给药。在一些实施方案中，给药该药剂至少14天至28天之间。在一些实施方案中，该方法在体内或体外进行。
另一方面，本发明提供一种增加受试者的轴突的髓鞘化的方法，该方法包括向所述受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂，从而增加轴突的髓鞘化。
另一方面，本发明提供一种增加受试者的OPC数量和/或分化的方法，该方法包括向所述受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂，从而增加OPC数量和/或分化。在前述两个方面的一些实施方案中，抑制GPR17的药剂是孟鲁司特或普鲁司特。在一些实施方案中，消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂是PLX3397。
另一方面，本发明提供一种用于增加有此需要的受试者的轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括向所述受试者给药药剂，从而增加所述轴突的髓鞘化，该药剂是甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺中的任何一种或多种。
另一方面，本发明提供一种增加有此需要的受试者的OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括向所述受试者给药药剂，从而增加OPC数量和/或分化，该药剂是甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺中的任何一种或多种。
另一方面，本发明提供一种治疗患有与髓鞘化失败相关的疾病或损伤的受试者的方法，该方法包括向受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂。在上述任何方面或本文中本发明的任何其他方面的一些实施方案中，该方法增加CC1和/或Oligo1阳性OPC的数量。在上述任何方面或本文中本发明的任何其他方面的一些实施方案中，受试者患有与髓鞘化失败相关的疾病，例如，多发性硬化(MS)、脑白质营养不良、神经退行性阿尔茨海默症、创伤性脑损伤、脊髓损伤或视神经损伤。在一些实施方案中，脑白质营养不良是肾上腺脑白质营养不良(ALD)、Aicardi-Goutieres综合征、亚历山大症、卡纳万病、脑腱黄瘤病(CTX)、球细胞性白质营养不良(Krabbe病)、异染性脑白质营养不良(MLD)、Pelizaeus Merzbacher病(X连锁痉挛性截瘫)或儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘低下(CACH)。
在上述任何方面或本文中本发明的任何其他方面的一些实施方案中，该药剂同时或依次给药。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂与消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂同步给药。在一些实施方案中，抑制GPR17的药剂在消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂之前至少一周给药。在一些实施方案中，药剂在损伤之前、同时或之后给药。在一些实施方案中，药剂在损伤之后数天或数周给药。在一些实施方案中，药剂在损伤之后1至2周给药。在一些实施方案中，创伤性脑损伤是脑震荡。在一些实施方案中，少突胶质细胞前体细胞是CC1-且具有位于细胞核中的Oligo1。在一些实施方案中，OPC是早期分化的少突胶质细胞细胞，其是CC1+且具有位于细胞核中的Oligo1.
在前述任何方面的一些实施方案中，OPC是分化的少突胶质细胞，其是CC1+且具有位于细胞质中的Oligo1。
又一方面，本发明提供一种组合物，其具有GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂、TNFα受体2抑制剂或TNFα抑制剂。在一些实施方案中，GPR17拮抗剂是孟鲁司特。在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂是PLX3397。在一些实施方案中，TNFα抑制剂是沙利度胺。
又一方面，本发明提供一种鉴定引起少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物的方法，该方法包括损伤小鼠的视神经；使该视神经与再生轴突的药剂接触；向小鼠给药候选化合物以引起少突胶质细胞前体细胞的分化；给药已知的小胶质细胞抑制剂或消融剂；以及确定少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化状态，其中CCl+少突胶质细胞相对于未治疗的对照有所增加指示该候选化合物引起了少突胶质细胞前体细胞的分化。
又一方面，本发明提供一种用于鉴定引起少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物的方法，该方法包括损伤小鼠的视神经；使该视神经与再生轴突的药剂接触；向小鼠给药已知引起少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物；给药疑似的小胶质细胞抑制剂或消融剂；以及确定少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化状态，其中具有细胞质Oligo1的CCl+少突胶质细胞相对于未治疗的对照有所增加指示该疑似的小胶质细胞抑制剂或消融剂有效地抑制或消融了小胶质细胞。
本发明定义的组合物和物品是关于下文所提供的实施例而分离或另外制造的。本发明的其他特征和优点从具体实施方式和权利要求书为显而易见的。
定义
除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有本发明所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献对技术人员提供本发明中使用的多个术语的一般性定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nded.1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988)；The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger等人(eds.),Springer Verlag(1991)；以及Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文中所用，除非明确排除，否则下述术语具有归于其下方的意义。
“药剂”意为任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。在一种实施方案中，该药剂是GPR17拮抗剂或小胶质细胞抑制剂或消融剂。在另一实施方案中，该药剂是使受损的视神经中的分化的OPC的数量增加(例如，增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、85％、90％、95％或100％)的药剂。在另一实施方案中，该药剂是甲磺酸苯扎托品(Bzp)，一种M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂(Deshmukh等人，Nature 502,327–332(2013))；氯马斯汀(Clem)，一种抗组胺和抗胆碱能药剂、M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂(Mei等人，Nat.Med.20,954–960(2014))；索利那新(Solifenacin(Sli))，一种M3毒蕈碱型受体拮抗剂(Abiraman等人，J.Neurosci.35,3676–3688(2015))；贝沙罗汀(Bexarotene(Bex))，一种维甲酸X受体激动剂(Natrajan等人，Brain 138,3581–3597(2015))；咪唑(Imi)，一抗胆固醇合成化合物(Hubler等人，Nature 560,372–376(2018))；异丁司特(Ibudilast(Ibud))，一种临床批准的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂(Fox等人，N.Engl.J.Med.379,846–855(2018))；孟鲁司特(Mon)和普鲁司特(Pra)，两种不同的GPR17拮抗剂(Fumagalli等人，J.Biol.Chem.286,10593–10604(2011),Marschallinger等人，Nat.Commun.6.(2015)；Ou等人，J.Neurosci.36,10560–10573(2016))；雷帕霉素(rapamycin(Rap))，一种mTOR抑制剂；或沙利度胺(TNFα抑制剂)。
“改变”意为髓鞘化或与髓鞘化相关的标志物(例如，多核苷酸、多肽)的的变化(增加或减少)，如通过该领域已知的方法如本文所述的那些方法所检测。如本文中所用，改变包括表达水平变化至少10％，优选变化25％，更优选变化40％，且最优选表达水平变化50％或更高。
“缓解”意为减少、阻抑、衰减、缩减、迟滞或稳定化疾病(例如，与髓鞘化失败相关的疾病)的发展或进展。
“类似物”意为不相同但具有类似的功能或结构特征的分子。例如，多肽类似物保留相对应的天然多肽的生物学活性，但具有某些令该类似物功能相对于天然多肽增强的生化修饰。此类生化修饰将会增加类似物的蛋白酶抗性、膜渗透性或半衰期，而不改变例如配体结合。类似物可以包括非天然氨基酸。
本公开中，“包含”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且可意为“包括”等；“主要由……组成”等具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且该术语是开放性的，允许超过其所引述者的存在，只要其所引述的基本或新颖特征没有被超过其所引述者的存在改变即可，但不包括先前技术实施方案。
“检测”指的是鉴定待检测的被分析物的存在、不存在或量。
“可检测的标记”意为一种组合物，当链接至感兴趣的分子时，该组合物使得后者可经由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁性微珠、金属微珠、胶体离子、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原。
“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症、损伤或疾患。疾病的示例包括与髓鞘化的失败、丧失或不希望的降低相关的疾病，包括但不限于多发性硬化(MS)、脑白质营养不良、神经退行性疾病，阿尔茨海默症、ALS、创伤性脑损伤和脊髓损伤。脑白质营养不良的示例包括但不限于，18q综合征伴髓鞘碱性蛋白缺乏、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、肾上腺脊髓神经病(AMN)、成年发病的常染色体线性脑白质营养不良(ADLD)、成人多糖体病(Adult Polyglucosan Body Disease)、Aicardi-Goutieres综合征、亚历山大症(Alexander Disease)、常染色体显性弥漫性脑白质病伴球状神经轴突(HDLS)、AARS、AARS2、卡纳万病(Canavan Disease)、组织蛋白酶A相关动脉病伴卒中和脑白质病(CARASAL)、脑常染色体线性动脉病伴皮层下梗死和脑白质病(CADASIL)、脑常染色体隐性动脉病伴皮层下梗死和脑白质病(CARASIL)、具有钙化和囊肿的脑视网膜微血管造影、脑腱黄瘤病(CTX)、儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘化低下(CACH)、ClC2相关脑白质病、Coates plus、Cockayne综合征、超长链脂肪酸-4的延伸(ELOVL4；Pseudo-Sjogren-Larsson)、脂肪酸2-羟化酶缺乏、岩藻糖苷贮积病、先天性肌营养不良、球形细胞样脑白质营养不良(Krabbe病)、GM1神经节苷脂贮积病、GM2神经节苷脂贮积病(Tay-Sachs病)、髓鞘化低下伴基底神经节和小脑萎缩(H-ABC)、髓鞘化低下-促性腺激素分泌不足-性腺机能减退-牙发育不全(4H综合征)、髓鞘化低下伴脑干和脊髓受累及腿痉挛(HBSL)、髓鞘化低下伴先天性白内障(HCC)、脑白质病伴脑干和脊髓受累及乳酸升高(LBSL)、脑白质病伴钙化和囊肿(LCC)、脑白质病伴丘脑和脑干受累及高乳酸(LTBL)、脂膜样骨发育不良伴脑白质病(Nasu病)、异染性脑白质营养不良(MLD)、巨脑性脑白质营养不良伴皮层下囊肿(MLC)、线粒体脑白质营养不良、多发性硫酸脂酶缺乏、神经轴突脑白质病伴球状轴突(遗传性弥漫性脑白质病伴球状轴突(HDLS))、新生儿肾上腺脑白质营养不良(NALD)、眼齿指发育不良伴脑白质异常、正色性脑白质营养不良伴色素胶质细胞、卵巢脑白质营养不良综合征、佩梅病(Pelizaeus Merzbacher disease)(X连锁痉挛性瘫痪)、佩梅样病(PMLD)、RARS2相关髓鞘化低下、Refsum病、RNAse T2缺乏性脑白质病、唾液酸贮积症(Salla病，婴儿唾液酸贮积症及其中间形式)、Sjogren-Larsson综合征、SOX10相关PCWH：周围脱髓鞘神经病、中枢脱髓鞘脑白质营养不良、Waardenburg综合征、和Hirschsprung病、消失性白质病(VanishingWhite Matter Disease(VWM))或儿童共济失调伴弥漫性中枢神经系统髓鞘化低下(CACH)、X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)和Zellweger谱系(Zellweger综合征、新生儿肾上腺脑白质营养不良和婴儿Refsum病)。
“有效量”意为相对于未治疗患者缓解疾病、疾患、病症或损伤的症状所需的治疗性组合物的量。用来实践本发明的用于治疗性处理疾病、疾患、病症或损伤的活性化合物的有效量可变，取决于给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康情况。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和用药方案。这一量被称为“有效”量。在一种实施方案中，有效量是增加神经元的髓鞘化、增加OPC增殖、在损伤后增加OPC数量、或促进OPC分化为CC1和Oligo1阳性细胞的分化的量。
本发明的方法提供一种简单的手段来鉴定安全用于受试者的疗法。此外，本发明的方法提供一种用于以高体积通量、高灵敏度和低复杂性分析几乎任何数量的化合物对于本文所述疾病的效应。
“髓鞘化不足”意为相对于在相应的对照神经元中观察到的髓鞘化水平，靶神经元的髓鞘化水平降低。
“标志物”意为任意蛋白质或多核苷酸，其在表达水平或活性上有与疾病或疾患相关的改变。
如本文中所用，如“获得药剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方法取得该剂。
“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。
“参考”意为标准或对照条件。
“受试者”意为哺乳动物，包括但不限于人类和非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。
本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任意数字、数字组合或子范围。
如本文中所用，“治疗”等指的是减轻或缓解与其相关的疾病、疾患、病症、损伤和/或症状。应知晓，尽管未排除，但治疗疾病、疾患、病症或损伤并不需要完全消除与其相关的疾病、疾患、病症、损伤或症状。
除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“一”和“该”理解为单数或复数。
除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。
本文中，对任何变量定义中一系列化学基团的描述包括该变量作为任何单一基团或作为所列基团的组合的定义。对本文中变量或方面的实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一输送方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。
本文中提供的任何组合物或方法可与本文中提供的一种或多种任何其他组合物和方法组合。
附图说明
图1A至1P示例性说明，在受损视神经中的OPC的增殖和失败的分化。
图1A包括完整视神经和具有再生轴突的受损视神经中轴突的髓鞘化百分比的代表性电子显微镜图像和量化。在成年小鼠中，大多数轴突在完整视神经中是髓鞘化的，且极少的再生轴突在视神经挤压损伤后具有自发的髓鞘化。n＝6只小鼠每组。比例尺：600nm。
图1B至1D呈现实验方案以在PDGFRα-H2B-GFP报告小鼠中评估受损(同侧)视神经和完整(对侧)视神经中的OPC增殖。
图1B是对于受损的同侧视神经和完整的对侧视神经的示例性说明。箭头指示挤压损伤部位，且灰色区域指示所分析的目标区域。
图1C包括在损伤后不同时间点的受损视神经中的免疫荧光染色图像。n＝3至8只小鼠。比例尺：100μm。
图1D是显示对损伤后不同时间点的受损视神经中的OPC数量的量化的图。n＝3至8只小鼠。
图1E包括来自PDGFRα-H2B-GPP报告小鼠的以Oligo2和/或GFP染色的视神经(受损的或其对照)的代表性图像，显示在损伤后不同时间点的总OPC数量的变化。比例尺：100μm。
图1F包括受损视神经中BrdU/Oligo2双阳性细胞的代表性图像。
图1G是显示对受损视神经中BrdU/Oligo2双阳性细胞的量化的图。
图1H是不同分化阶段的OPC及其对应标志物的示例性说明。比例尺：50μm。
图1I是用于使用如图1J至1O中所示的PDGFRα-CreER/iRTM小鼠来追踪OPC的后裔的实验设计示意图。
图1J包括受损的和完整的视神经中的CC1+细胞和RTM+细胞的代表性图像。
图1K是受损的和完整的视神经中的CC1+细胞和RTM+细胞数量的图。
图1L是显示受损的和完整的视神经中的CC1+细胞和RTM+细胞的比例的图。与完整的(对侧的)相比，受损神经中的RTM+CC1+的比例显著较少。n＝6只小鼠每组。
图1M包括受损的和完整的视神经中三个不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的代表性图像。对侧中的箭头指示RTM+/CC1+/Oligo1-C，但同侧中的那些指示RTM+/CC1-/Oligo1-N(未分化的细胞)。n＝6只小鼠每组。比例尺：100μm 10μm。
图1N是显示受损的和完整的视神经中三个不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N(细胞核Oligo1)；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的细胞数量的图。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图1O是显示受损的和完整的视神经中三个不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例的图。
分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图1P包括来自PDGFRα-CreER/RTM小鼠的受损视神经的代表性图像，显示在RTM与GFAP之间没有重叠。比例尺：50μm。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图2A至2Z示例性说明，受损视神经中的OPC的早期少突胶质细胞分化的内在内在阻断剂。
图2A是在野生型C57小鼠中的体内化合物筛选的示意图。进行dpi4-10的每天BrdU注射以标记增殖性OPC。用所示抗体分析接受4周的个体化合物治疗的来自小鼠的受损视神经。
图2B包括以抗CC1和BrdU染色的受损视神经的代表性图像。n＝4至13只小鼠每组。
图2C是将以抗CC1和BrdU染色的受损视神经量化的图。n＝4至13只小鼠每组。
图2D是图2E至2G中所示的使用孟鲁司特在PDGFRα-CreER:RTM小鼠中进行研究的实验设计的示意图。n＝6只小鼠每组。
图2E包括用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU(对不同群体染色，对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；且对于成熟的髓鞘化少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)染色的受损的或完整的视神经中的RTM+细胞的代表性图像。
图2F是显示用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU染色的受损的和完整的视神经中，RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度的图。
图2G是显示RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例的图。
图2H包括受损视神经的代表性原位杂交图像，显示损伤诱导的Gpr17表达。比例尺：100μm。
图2I是图2H中显示损伤诱导的Gpr17表达的视神经量化的图。n＝6只小鼠每组。
图2J至2L显示，Gpr17敲除不影响OPC增殖。
图2J包括用GFP(GPR17)、BrdU和/或Oligo2染色的GPR17敲除小鼠及其对照的受损视神经的代表性图像，这些小鼠接受4至10dpi之间的每天BrdU注射。比例尺：200μm。
图2K是将图2J中以GFP(GPR17)、BrdU和Oligo2染色的受损视神经量化的图。
图2L是将图2J中以BrdU和Oligo2染色的受损视神经量化的图。
图2M至2O示例性说明使用针对GFP(GPR17)或CC1的抗体在GPR17敲除小鼠的受损视神经中进行的OPC分化分析。
图2M包括在损伤后28天取自GPR17敲除小鼠或其对照的受损视神经的代表性图像。
图2N是将来自视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照的GFP+CC1+细胞的密度量化的图。
图2O是将来自视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照的GFP+细胞中的CC1+比例量化的图。
图2P包括用GFP(GPR17)和CC1染色的来自GPR17敲除小鼠及其对照的受损视神经的代表性图像。n＝6只小鼠每组。比例尺：200μm。
图2Q是将视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照中的GFP+细胞中的CC1+细胞比例量化的图。
图2R是将来自视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照的GFP+CC1+细胞的密度量化的图。图2Q和2R显示，GPR17敲除显著增加了受损视神经中的CC1+细胞，但在完整视神经中则不然。
图2S至2U示例性说明使用针对GFP(GPR17)、CC1、Oligo1、DAPI的抗体在GPR17敲除小鼠的受损视神经中(在损伤后28天)进行的OPC分化分析。
图2S包括用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU染色的来自GPR17敲除小鼠及其对照的受损视神经的代表性图像。n＝6只小鼠每组。比例尺：50μm。
图2T是将视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照中的GFP+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度量化的图。n＝6只小鼠每组。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图2U是将视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照中的GFP+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例量化的图。n＝6只小鼠每组。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图2V至2X示例性说明使用针对GFP(GPR17)、CC1、Oligo1、DAPI的抗体在GPR17敲除小鼠的受损视神经中(在损伤后7天)进行的OPC分化分析。
图2V包括用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU染色的来自GPR17敲除小鼠及其对照的受损视神经的代表性图像，以及对于GFP+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；且对于成熟的髓鞘化少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度(J)或比例(K)的量化结果。比例尺：100μm。
图2W是将来自视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照的GFP+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度量化的图。n＝6只小鼠每组。
图2X是将来自视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照的GFP+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例量化的图。n＝6只小鼠每组。
图2Y包括用GFP(GPR17)和CC1(L)染色的来自GPR17敲除小鼠及其对照的受损视神经的代表性图像，这些小鼠接受4至10dpi之间的每天BrdU注射。
图2Z是将视神经受损的GPR17敲除小鼠及其对照中的BrdU+细胞中的CC1+细胞比例量化的图。n＝6只小鼠每组。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图3A至3G示例性说明，通过PLX3397治疗，耗尽了受损视神经中的激活的小胶质细胞。
图3A包括以针对GFAP、CD68或P2Y12的抗体染色的来自在单侧视神经挤压损伤后4周的成年小鼠的视神经的代表性图像。比例尺：50μm。
图3B是显示GFAP免疫反应性信号的量化的图。n＝10只小鼠每组。
图3C是显示P2Y12免疫反应性信号的量化的图。n＝10只小鼠每组。
图3D是显示CD68免疫反应性信号的量化的图。n＝10只小鼠每组。
图3E包括图像，其显示在损伤后6周取自成年小鼠的位于病灶远端的完整视神经中的经染色的激活的小胶质细胞。比例尺：500μm。
图3F是将CD68免疫反应性信号量化的图。n＝10只小鼠每组。
图3G包括以针对CD68的抗体染色的经或未经PLX3397治疗的来自在单侧视神经挤压损伤后2周的成年小鼠的视神经的代表性图像。比例尺：40μM。
图3H至3O示例性说明，小胶质细胞为OPC增殖所需但不利于其成熟。
图3H是将CD68免疫反应性信号量化的图。6至10只小鼠每组。比例尺：40μm。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图3I是实验示意图，用来评估经PLX3397(PLX)或其媒介物对照(Vec)治疗的PDGFRα-H2B-GFP小鼠中的OPC增殖。PLX治疗施加14天(损伤前后各7天)，并在终止前48小时注射BrdU。
图3J包括以GFP、Oligo2或BrdU染色的受损视神经的代表性图像。比例尺：100μm。
图3K是将GFP+Oligo2+BrdU+细胞量化的图。n＝6只小鼠每组。
图3L是实验设计的示意图，该实验设计用于在PDGFRα-CreER:RTM小鼠中分析延迟的PLX3397治疗对于受损视神经中OPC分化的效应，结果显示在图3M至3O中。
图3M包括用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU染色的受损的或完整的视神经的代表性图像。比例尺：100μm。
图3N是将RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度量化的图。n＝6只小鼠每组。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图3O是将RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例量化的图。n＝6只小鼠每组。分别地，*、**、***p<0.05、0.01、0.001。
图4A至4I示例性说明，孟鲁司特与PLX3397的组合治疗在成年小鼠的受损视神经中导致稳健的再生轴突髓鞘化。
图4A包括用针对Oligo1、CC1、RTM和DAPI的抗体、抗CC1和BrdU染色的来自接受孟鲁司特和PLX3397治疗的PDGFRα-CreER:RTM小鼠的受损视神经的代表性图像。在损伤后第4周结束时采集样品。比例尺：20μm(A)。
图4B是将RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的密度量化的图。n＝6只小鼠每组。
图4C是将RTM+细胞的不同群体(对于未分化的OPC，CC1-/Oligo1-N；对于髓鞘化前的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-N；和对于髓鞘化的少突胶质细胞，CC1+/Oligo1-C)的比例量化的图。n＝6只小鼠每组。
图4D至4H示例性说明来自用孟鲁司特和/或PLX3397治疗的小鼠的受损视神经(在损伤后4周)的再生轴突的鞘髓生成的透射电子显微镜成像结果。
图4D是来自每个治疗组的经挤压视神经的冠状切面的低倍数图像。比例尺：2μm。
图4E是来自组合治疗组的再生轴突上正在进行的髓鞘化的放大图像。薄层的髓鞘和较大的内舌表明正在进行的新髓鞘化。比例尺：500nm。
图4F是来自经组合治疗的经挤压视神经的纵向切面的蒙太奇图像。完全的内点以“x”指示。箭头指示与郎飞氏结(Nodes of Ranvier)相邻的位置。比例尺：1400nm。
图4G是图G(H)量化图D中显示的再生轴突上的半个郎飞氏结的放大图像。比例尺：200nm。
图4H是将图4D中观察到的髓鞘化轴突的百分比量化的图。
图4I包括以郎飞氏结标志物、Caspr、AnkG和钠通道NaV1.6染色的组合治疗的受损视神经的代表性图像。比例尺：3.5μm。
图4J至4L示例性说明，在进行孟鲁司特和PLX3397组合治疗的小鼠中更好保持的再生轴突。
图4J包括来自野生型小鼠的受损视神经(42dpi)中经CTB标记的再生轴突的代表性图像，这些小鼠接受AAV2/2-CNTF/IGF/OPN的玻璃体内注射，然后进行视神经挤压并且进行或不进行孟鲁司特和PLX3397治疗。比例尺：750μm。
图4K是将再生轴突的面积相对于损伤时间进行量化的图。n＝4只小鼠每组。
图4L是将与再生轴突相关的信号强度相对于到挤压部位的距离进行量化的图。n＝4只小鼠每组。
图5A至5E示例性说明对于视神经挤压后的细胞群上的TNFα的抑制。
图5A包括文氏图和热图，显示TNFα在视神经挤压后上调。
图5B包括荧光图像，显示在挤压后用探针探测TNFα的成年视神经。
图5C包括荧光图像和图，显示TNFR1 KO小鼠中位于接近挤压部位的远端区域的CC1+少突胶质细胞的稳健增加。
图5D包括荧光图像，其显示在经沙利度胺(一种TNFα抑制剂)治疗的小鼠中位于轴突远端区域的BrdU+/CC1+/Olig2+细胞的稳健增加。TNFi表示沙利度胺。
图5E包括示意图和图像，显示单独用媒介物治疗的小鼠与用沙利度胺治疗的小鼠的比较。
具体实施方式
本发明提出可用于促进或增加髓鞘化的组合物和方法，尤其是在神经损伤或脱髓鞘导致疾病的情况下。
本发明至少部分地基于以下发现：抑制GPR17并消融激活的小胶质细胞导致在成轴突的稳健髓鞘化。
髓鞘化促进轴突传导，使得能够进行神经系统不同部分之间的有效通讯。提高神经元内在再生能力的操作会导致视神经损伤后的轴突再生，但这些再生轴突不会自发髓鞘化。此类髓鞘化失败的潜在机制尚不清楚。
如本文所示，在成年小鼠的视神经损伤模型中，视神经中的少突胶质细胞前体细胞(OPC)进行短暂的增殖但未能成功分化为成熟的能够髓鞘化的少突胶质细胞，这让人联想到进行性多发性硬化。在机制上，OPC内在的GPR17和慢性激活的小胶质细胞抑制不同阶段的OPC分化。重要的是，抑制GPR17和小胶质细胞两者导致再生轴突的稳健髓鞘化。除了揭示阶段依赖性OPC分化的调节性机制之外，所呈现的结果还指示，本文所述的药剂即使在存在慢性炎性病症的情况下，也在成年CNS中提供从头髓鞘化。
神经元的髓鞘化
通过成熟的髓鞘化少突胶质细胞进行再生的或脱髓鞘的轴突的髓鞘化需要具有功能正常的神经。由于少突胶质细胞负责髓鞘化，引起少突胶质细胞前体细胞(OPC)的扩增和成熟代表在治疗由疾病引起的神经损伤或脱髓鞘中的一个显著改善。未分化的、早期分化的和成熟的髓鞘化少突胶质细胞可以基于细胞CC1和Oligo1表达谱来区分。例如，未分化的少突胶质细胞被表征为具有位于细胞核的Oligo1的CC1阴性细胞。早期分化的少突胶质细胞被表征为具有位于细胞核的Oligo1的CC1阳性细胞。成熟的髓鞘化少突胶质细胞被表征为具有细胞质Oligo1的CC1阳性细胞。响应于神经损伤，OPC得以扩张。在一些实施方案中，可以通过使该细胞与GPR17拮抗剂或抑制剂接触来促进未分化的OPC成熟为早期分化的OPC。在一些实施方案，GPR17拮抗剂或抑制剂可以是甲磺酸苯扎托品，一种M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂；氯马斯汀，一种抗组胺和抗胆碱能药剂及M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂；索利那新，一种M3毒蕈碱型受体拮抗剂；贝沙罗汀，一种维甲酸X受体激动剂；咪唑，一种抗胆固醇合成化合物；异丁司特，一种临床批准的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂；孟鲁司特或普鲁司特或沙利度胺。
早期分化的OPC可以通过去除周边环境中的小胶质细胞而进一步分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞。在本领域中已知消融剂有效地去除脱落的小胶质细胞。在本发明的一些实施方案中，小胶质细胞与抑制剂或消融剂接触提供一种环境，该环境有助于使早期分化的少突胶质细胞分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞。
本发明的药剂
本文所述的药剂，包括小化合物在内，可用于增加髓鞘化、增加OPC增殖或分化或增加OPC数量。在一种实施方案中，本发明的药剂是培西达替尼(Pexidartinib)，也称为PLX3397，它是具有多激酶抑制活性的小分子。培西达替尼(CAS登记号1029044-16-3；C 20-H15-Cl-F3-N5)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000191
在另一实施方案中，本发明的药剂是贝沙罗汀(例如，100mg/kg，p.o.)，它是具有维甲酸X受体结合和激活活性的小分子。贝沙罗汀(CAS登记号153559-49-0；C24H28O2)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000192
在另一实施方案中，本发明的药剂是甲磺酸苯扎托品(例如，10mg/kg，i.p.)，它是具有多巴胺摄入抑制活性的小分子中枢毒蕈碱型拮抗剂。甲磺酸苯扎托品(CAS登记号132-17-2；C22H29NO4S)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000193
在另一实施方案中，本发明的药剂是氯马斯汀(例如，10mg/kg，p.o.)，它是具有抗胆碱能、镇静和组胺H1拮抗性质的小分子。富马酸氯马斯汀(CAS登记号14976-57-9；C25H30ClNO5)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000194
在另一实施方案中，本发明的药剂是异丁司特(例如，10mg/kg，i.p.)，它是具有环状核苷酸磷酸二酯酶抑制活性的小分子。异丁司特(CAS登记号50847-11-5；C14H18N2O)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000201
在另一实施方案中，本发明的药剂是咪唑(例如，10mg/kg，i.p.)，它是碱且极具亲核性。咪唑(CAS登记号288-32-4，C3H4N2)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000202
在另一实施方案中，本发明的药剂是孟鲁司特(例如，25mg/kg，p.o.)，它是白三烯受体(例如，GRP17)拮抗剂。孟鲁司特(CAS登记号158966-92-8；C35H36ClNO3S)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000203
在另一实施方案中，本发明的药剂是普鲁司特(例如，0.5mg/kg，i.p.)，它是白三烯受体(例如，GRP17)拮抗剂。普鲁司特(CAS登记号103177-37-3；C27H23N5O4)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000204
在另一实施方案中，本发明的药剂是雷帕霉素(例如，6mg/kg，i.p.)，它具有mTOR抑制活性。雷帕霉素(CAS登记号53123-88-9；C51H79NO13)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000211
在另一实施方案中，本发明的药剂是琥珀酸索利那新(例如，20mg/kg，i.p.)，它是具有抗胆碱能和痉挛抗活性的小分子。琥珀酸索利那新(CAS登记号242478-38-2；C27H32N2O6)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000212
在另一实施方案中，本发明的药剂是沙利度胺(例如，50mg/kg，i.p.)，它是抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生的小分子。沙利度胺(CAS登记号50-35-1；C13H10N2O4)具有以下结构：
Figure BDA0003920828040000213
治疗方法
本发明提供治疗以未经髓鞘化或脱髓鞘的神经元为特征的疾病、疾患或损伤或其症状的方法，该方法包括给药治疗有效量的包含本文所述药剂(例如，G蛋白偶联受体17(GPR17)拮抗剂、小胶质细胞抑制剂或消融剂)的药物组合物。在一些实施方案中，该疾病以神经的脱髓鞘为特征。在一些实施方案中，该疾病是神经退行性疾病，诸如多发性硬化或阿尔茨海默症。在一些实施方案中，待治疗的损伤是创伤性脑损伤。
在一些实施方案中，该药剂是甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、索利那新、贝沙罗汀、咪唑、异丁司特、孟鲁司特、普鲁司特或沙利度胺。在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂是PLX3397。因此，一个实施方案是治疗苦于或易患疾病或病变或其症状的受试者的方法。该方法包括对该哺乳动物给药治疗量的本文所公开的药剂的步骤，给药量足以在使得该疾病或病变被治疗的条件下治疗该疾病或病变或其症状。
鉴定受试者需要此治疗可为专业医护人员对受试者的判断，且可以是主观的(例如，观点)或客观的(例如，通过测试或诊断方法可测)。此治疗将被适当地给予苦于、患有、易患疾病、病变或其症状或处于该疾病、病变或其症状风险下的受试者，尤其是人类。可通过由诊断性测试做出的客观决定或受试者或保健提供者的观点(例如，基因测试、酶或蛋白标记物、标记物家族病史等)做出那些受试者“处于风险下”的决定。本文的化合物也可用于治疗可能涉及髓鞘化缺乏或丧失的任何其他疾患。
组合物
当GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂作为组合给药时，它们可用于治疗以神经元的髓鞘化不足为特征的疾病、疾患或损伤。在一些实施方案中，GPR17拮抗剂是孟鲁司特或普鲁司特。在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂是PLX3397。在某些实施方案中，GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂组合疗法可将靶神经元的髓鞘化增加至少10％、25％、50％、75％或甚至100％。
本文预期GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂或两者的药学上可接受的盐用于增加靶神经元的髓鞘化。术语“药学上可接受的盐”也指从GPR17拮抗剂或小胶质细胞抑制剂或消融剂(其中该GPR17拮抗剂或该小胶质细胞抑制剂或消融剂具有酸性官能团诸如羧酸官能团)与药学上可接受的无机或有机碱制备的盐。合适的碱包括但不限于，碱金属诸如钠、钾和锂的氢氧化物；碱土金属诸如钙和镁的氢氧化物；其他金属诸如铝和锌的氢氧化物；氨和有机胺，诸如未取代的或羟基取代的单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺；二环己基胺；三丁胺；吡啶；N-甲基,N-乙基胺；二乙胺；三乙胺；单-、双-或叁-(2-羟基-低级烷基胺)，诸如单-、双-或叁-(2-羟基乙基)-胺、2-羟基叔丁基胺或叁-(羟甲基)甲基胺、N,N,-二-低级烷基-N-(羟基低级烷基)-胺，诸如N,N-二甲基-N-(2-羟基乙基)-胺或三-(2-羟基乙基)胺；N-甲基-D-氨基葡萄糖；和氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸等。术语“药学上可接受的盐”也指从具有碱性官能团诸如氨基官能团的GPR17拮抗剂和/或小胶质细胞抑制剂或消融剂与药学上可接受的无机或有机酸制备的盐。合适的酸包括但不限于，硫酸氢盐、柠檬酸、醋酸、草酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、磷酸、异烟酸、乳酸、水杨酸、酒石酸、抗坏血酸、琥珀酸、马来酸、苯磺酸、富马酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、葡糖二酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸和对甲苯磺酸。
药物疗法
对于治疗性用途，包含本文所述药剂的组合物可全身性给药。优选的给药途径包括，例如，口服给药或皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或皮内注射，这向患者体内提供连续、持续的药物水平。将使用处于生理学可接收载剂内的治疗有效量的本文中鉴别的治疗剂进行对人类患者或其他动物的治疗。在一种实施方案中，GPR17拮抗剂、小胶质细胞抑制剂或消融剂或两者可配制在药学上可接受的缓冲液诸如生理盐水中。合适的载体即其配方在例如E.W.Martin Remington's Pharmaceutical Sciences中有所描述。待给药的治疗剂的量依据给药方式、患者的年龄和体重、以及以髓鞘化不足为特征的疾病或疾患或损伤的临床症状而变。通常，量将在用于治疗以髓鞘化不足为特征的其他病症或疾病或损伤的其他药剂所使用的那些范围内。在一些实施方案中，包含本文所述药剂(例如，GPR17拮抗剂和/或小胶质细胞抑制剂或消融剂)的组合物以有效增加靶神经元的髓鞘化的剂量给药。在其他实施方案中，包含GPR17拮抗剂的组合物和包含小胶质细胞抑制剂或消融剂的组合物以有效增加靶神经元的髓鞘化的剂量给药。给药的有效性可通过本领域技术人员已知的方法确定，或使用测量神经元的髓鞘化的测定法确定。
药物组合物的配方
可通过任何合适的手段给药包含本文所述的药剂(例如，GPR17拮抗剂、小胶质细胞抑制剂或消融剂、或两者)的组合物以用于治疗以靶神经元的髓鞘化不足为特征的疾病或疾患或损伤，这些手段导致治疗剂(与其他组分组合)的剂量有效增加或稳定化靶神经元的髓鞘化。该组合物可以任何适宜的量包含在任何适当的载体物质中，且通常以该组合物总重量的1重量％至95重量％的量存在。该组合物可提供为适用于口服给药途径的剂型。在一些实施方案中，该组合物可提供为适用于肠胃外(如，皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内)给药途径的剂型。可根据传统药学实践来配制药物组合物(见，如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams&Wilkins,2000以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick andJ.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
由于熟练技术人员知道与动物模型比较而修正人用剂量是该领域的常识，可通过从小鼠体内使用的该药剂的量外推而确定最初的人用剂量。可基于有效治疗本领域中已知的以靶神经元的髓鞘化不足为特征的病症或损伤的剂量来确定剂量。在某些实施方案中，据设想，本文所述药剂的剂量在每天约0.1mg至约200mg之间、每天约0.1mg至约190mg之间、每天约0.1mg至约180mg之间、每天约0.1mg至约170mg之间、每天约0.1mg至约160mg之间、每天约0.1mg至约150mg之间、每天约0.1mg至约140mg之间、每天约0.1mg至约130mg之间、每天约0.1mg至约120mg之间、每天约0.1mg至约110mg之间、每天约0.1mg至约100mg之间、每天约0.1mg至约90mg之间、每天约0.1mg至约80mg之间、每天约0.1mg至约70mg之间、每天约0.1mg至约60mg之间、每天约0.1mg至约50mg之间、每天约0.1mg至约40mg之间、每天约0.1mg至约30mg之间、每天约0.1mg至约20mg之间、每天约0.1mg至约10mg之间、每天约0.1mg至约5mg之间、每天约0.1mg至约1mg每天之间。在一些实施方案中，GPR17拮抗剂的剂量为每天约0.5mg至约200mg之间、每天约1mg至约200mg之间、每天约10mg至约200mg之间、每天约20mg至约200mg之间、每天约30mg至约200mg之间、每天约40mg至约200mg之间、每天约50mg至约200mg之间、每天约60mg至约200mg之间、每天约70mg至约200mg之间、每天约80mg至约200mg之间、每天约90mg至约200mg之间、每天约100mg至约200mg之间、每天约110mg至约200mg之间、每天约120mg至约200mg之间、每天约130mg至约200mg之间、每天约140mg至约200mg之间、每天约150mg至约200mg之间、每天约160mg至约200mg之间、每天约170mg至约200mg之间、每天约180mg至约200mg之间或每天约190mg至约200mg之间。
在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂的剂量为每天约250至约350mg之间。在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂的剂量为每天约250mg至约325mg之间、每天约250mg至约300mg之间或每天约250mg至约275mg之间。在一些实施方案中，小胶质细胞抑制剂或消融剂的剂量为每天约275mg至约350mg之间、每天约300mg至约350mg之间或每天约325mg至约350mg之间。
在一些实施方案中，该药剂是贝沙罗汀且具有约50至约150mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是甲磺酸苯扎托品且具有约5至约15mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是富马酸氯马斯汀且具有约5至约15mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是异丁司特且具有约5至约15mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是咪唑且具有约5至约15mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是孟鲁司特且具有约10至约40mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是普鲁司特且具有约0.1至约1.0mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是雷帕霉素且具有约3至约9mg/kg的剂量。在一些实施方案中，药剂是琥珀酸索利那新且具有约10至约30mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是沙利度胺且具有约25至约75mg/kg的剂量。在一些实施方案中，该药剂是培西达替尼(PLX 3397)且具有每天约225至约350mg/kg的剂量。当然，该剂量可如此类治疗方案常规进行的那样上调或下调，取决于初始临床试验的结果和特定患者的需求。
根据本公开实施方案的药物组合物可以经配制以在给药后立即持续地或在给药后的任何预定时间或时间段释放活性化合物(例如，GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂)。后者类型的组合物通常称为控释制剂，其包括(i)，在身体内建立历经延长的一段时间的基本上恒定的药物浓度的制剂；(ii)在预定的滞后时间后，在身体内建立历经延长的一段时间的基本上恒定的药物浓度的制剂；(iii)通过在身体内维持相对恒定、有效水平，同时伴有最低限度的与活性物质的血浆水平波动相关的不良副作用，从而在预定时间段内持续作用的制剂(锯齿动力学模式)；(iv)通过例如控释组合物在空间上放置为接近预期靶向细胞(例如，脑细胞)而定位作用的制剂；(v)允许方便地给药，使得例如每天一次或两次口服给药剂量的制剂；和(vi)通过使用载体或化学衍生物将治疗剂递送至特定细胞类型(例如，脑细胞)而靶向钙通道和血管紧张肽受体的制剂。对于一些应用，控释制剂避免了对于每天频繁投药以将血浆水平保持在治疗水平的需求。
为了获得其中释放速率大于所述化合物的代谢速率的控释，可以采用多种策略中的任何一种。在一个示例中，通过适当地选自各种制剂参数和成分(包括，例如，各种类型的控释组合物和包衣)来获得控释。因此，使用适宜的赋形剂将药物组合物配制治疗剂，该药物组合物在给药时以受控的方式释放治疗剂。示例包括单个或多个单位片剂或胶囊组合物、油溶液、悬浮液、乳液、微胶囊、微球、分子复合物、纳米颗粒、贴剂和脂质体。
胃肠外组合物
可通过以含有传统的、无毒的药学可接受的载剂和佐剂的剂型、制剂或经由合适的递送装置或移植物注射、滴注或移植来(皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内)给药该药物组合物。此类组合物的制剂和制备是药物制剂领域技术人员所熟知的。制剂可见于前述《雷明顿：制药科学与实践》中。
用于肠胃外用途的组合物可提供为单位剂型(例如，在单剂量安瓿中)或在含有几个剂量的小瓶中，且该小瓶中可添加合适的防腐剂(见下文)。组合物的形式可以是溶液、悬浮液、乳液、输注装置、或用于移植的递送装置，或者它可以作为待使用水或另一合适的媒介物在使用前重建的干粉而存在。除了增加靶神经元的髓鞘化的活性剂之外，该组合物还可包括合适的肠胃外可接受的载体和/或赋形剂。活性治疗剂可并入微球、微胶囊、纳米颗粒、脂质体等中以备受控的释放。此外，组合物可包括悬浮剂、增溶剂、稳定剂、pH调节剂、张度调节剂和/或分散剂。
如上所示，根据本公开实施方案的药物组合物可以是适用于无菌注射的形式。为了制备此类组合物，将GPR17拮抗剂和/或小胶质细胞消融剂溶解或悬浮在肠胃外可接受的液体媒介物中。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水；通过加入适宜量的盐酸、氢氧化钠或合适的缓冲剂调节至合适pH的水；1,3-丁二醇；林格溶液；以及等渗氯化钠溶液和葡萄糖溶液。水性制剂也可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、乙酯或正丙酯)。在化合物之一只能少量地或微溶于水中的情况下，可加入溶解增强剂或增溶剂，或者溶剂可包括10％至60％w/w的丙二醇等。
控释肠胃外组合物
控释肠胃外组合物可以是水性悬浮液、微球、微胶囊、磁性微球、油溶液、油悬浮液或乳液的形式。或者，可以将活性药物并入生物相容的载体、脂质体、纳米颗粒、植入物或输液装置中。
用于制备微球和/或微胶囊的材料是，例如，生物可降解/生物可溶蚀的绝毫无，诸如polygalactin、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(2-羟乙基-L-谷氨酰胺)和聚乳酸。当配制控释肠胃外制剂时可使用的生物相容的载体是碳水化合物(例如，葡聚糖)、蛋白质(例如，白蛋白)、脂蛋白或抗体。用于植入物中的材料可以是生物不可降解的(例如，聚二甲基硅氧烷)或生无可降解的(例如，聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚原酸酯)或其组合。
用于口服用途的固体剂型
用于口服用途的制剂包括含有活性成分(例如，GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂)与无毒的药学上可接受的赋形剂的混合物的片剂。此类制剂时技术人员已知的。赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填料(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙和磷酸钠)；成颗粒剂和崩解剂(例如，纤维素衍生物，包括微晶纤维素；淀粉，包括马铃薯淀粉；交联羧甲基纤维素钠；藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇)；和润滑剂、助流剂和抗粘着剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、风味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。
在一些实施方案中，片剂是未包衣的；而在其他实施方案中，片剂是包衣的。片剂可以通过已知技术包衣，以任选地延迟崩解和在胃肠道中的吸收，并因此在更长期间内提供持续作用。可调整包衣，从而以预设的模式释放一种或多种活性药物(例如，为了实现控制释放制剂)；或经调整以使其直到通过胃以后才释放活性药物(肠溶衣)。在一些实施方案中，包衣是糖衣、膜衣(例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇和/或聚乙烯基吡咯烷酮)、或肠溶衣(例如，基于甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸醋酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、琥珀酸醋酸羟丙基甲基纤维素、聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、虫胶和/或乙基纤维素)。再者，可采用延时材料，例如，甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。
在一些实施方案中，固体片剂组合物包括包衣，该包衣被调整为保护该组合物免于不希望的化学改变(例如，在释放药剂之前的化学降解)。在一些实施方案中，使用类似于前述《制药技术百科全书》(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology)中所述的方式施加到固体剂型上。
在一些实施方案中，GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂可在片剂中混合在一起或分开。在一个实施例中，GPR17拮抗剂包含在片剂内部，而小胶质细胞消融剂在外部，使得该小胶质细胞消融剂的主要部分在该GPR17拮抗剂释放之前释放。在一些实施方案中，小胶质细胞消融剂包含在片剂内部，而GPR17拮抗剂在外部。
用于口服用途的制剂包括咀嚼片或硬明胶胶囊，其中活性成分(即，GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂)与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合在一起；或作为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合在一起。在一些实施方案中，使用在片剂和胶囊剂下提及的成分，使用例如混合器、流体床仪器或喷雾干燥设备以传统方式制备粉末剂和颗粒剂。
控释口服剂型
例如，可构造用于口服用途的药剂的控释组合物，以通过控制活性物质的溶解和/或扩散来释放药剂。溶解或扩散控释可通过对化合物的片剂、胶囊、丸剂或颗粒制剂的适当包衣来实现，或通过将包含该药剂的组合物并入适当的基质中来实现。在一些实施方案中，控释包衣包括上述包衣物质中的一种或多种和/或，例如，虫胶、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈酸硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、醋酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯和/或聚乙二醇。在控制基质制剂中，基质材料也可包括，例如，水合甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波姆(carbopol)934、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代氟碳。
在一些实施方案中，含有药剂的控释组合物是胃漂浮片或胶囊(即，当口服给药时，片剂或胶囊剂在胃内容物顶上漂浮一定时间)的形式。通过将GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂与赋形剂和20％至75％w/w的水胶体如羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素的混合物颗粒化，可制备该组合物的胃漂浮片制剂。然后，所得颗粒可压制为片剂。该片剂一旦与胃液接触，就环绕表面形成基本上不透水的凝胶屏障。这一凝胶屏障参与维持小于一的密度，从而令片剂在胃液中保持漂浮。
本公开实施方案提供治疗以髓鞘化不足为特征的疾病、疾患或损伤的方法，该方法包括向受试者(例如，哺乳动物诸如人)给药治疗有效量的包含GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂的药物组合物。该方法包括向受试者给药治疗量的GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂的方法，在一定条件下，该量足以治疗该疾病、疾患、病症、损伤或其症状，使得该疾病、疾患或损伤或其症状得以治疗。治疗方法包括预防性治疗。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，特别是罹患、患有、易患以靶神经元髓鞘化不足为特征的疾病或疾患或处于风险下的受试者。
组合疗法
任选地，GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂可以与然和其他用于以髓鞘化不足为特征的疾病、疾患、病症或损伤为特征的标准治疗组合给药；此类方法是技术人员已知的并且在E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences中有所描述。
试剂盒或药物系统
本发明的组合物可以组装在试剂盒或药物系统中，用于增加靶神经元的髓鞘化。试剂盒或药物系统包含载剂单元，例如盒、纸板箱、管等，其内部密封有一个或多个容器单元，例如小瓶、管、安瓿、瓶等。试剂盒或药物系统也可包含用于使用本公开实施方案的药剂的相关使用说明。在一些实施方案中，试剂盒包括GPR17拮抗剂和小胶质细胞消融剂。在一些实施方案中，GPR17拮抗剂是孟鲁司特或普鲁司特。在一些实施方案中，小胶质细胞消融剂是PLX3397。
化合物和组合物的鉴定
本发明提供用于鉴定化合物和组合物的方法，该化合物和组合物可用来使少突胶质细胞前体细胞(OPC)分化为早期分化的少突胶质细胞，或可用来使早期分化的少突胶质细胞分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞。以髓鞘化不足为特征的神经元损伤和疾病(例如，多发性硬化)可使用视神经挤压小鼠模型进行研究。该模型涉及损害视神经，如下文所述或如本领域中已知的。将候选化合物给药至该动物。在一些实施方案中，观察到刷涂胶质细胞分化作为化合物或组合物用于分化OPC或早期分化的少突胶质细胞的有效性的测量结果。在一些实施方案中，监测再生神经元的髓鞘化以确定候选化合物的有效性。
该鉴定方法尤其适用于鉴定针对多发性硬化的候选治疗。相对于向小鼠注射雄激素以触发脱髓鞘的传统方法，视神经损伤或视神经挤压是多发性硬化的一种优越模型。尽管接受雄激素注射的动物在停止雄激素给药后仍进行自发的髓鞘化，但在具有视神经挤压的情况下不然。接受视神经挤压损伤的小鼠表现出增加的炎症且没有自发的再髓鞘化，两者是与髓鞘化失败相关的多发性硬化、脑白质营养不良、神经退行性阿尔茨海默症和中枢神经系统损伤(例如，创伤性脑损伤、脊髓损伤)中所共有的。
除非另外指定，否则本公开的实施方案采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术，这些技术完全在该领域技术人员的权限之内。此类技术在文献中有完整阐述，例如，“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“AnimalCell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of ExperimentalImmunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller andCalos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987)；“PCR:ThePolymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。这些技术科用于生产本发明的多核苷酸和多肽，并因此可视为作出并实践本发明。尤其可用于具体实施方案的技术将在以下章节中讨论。
详述以下实施例以向该领域技术人员提供对如何制备和使用本发明的检验、筛选和治疗性方法的完全公开和说明，并且以下实施例不试图限制发明人所认为的本发明的范畴。
实施例
实施例1：损伤诱导的OPC增殖
已知不同的操作可以提高视网膜神经节细胞(RGC)的内在再生能力，并在视神经损伤后实现稳健的轴突再生，但这些再生轴突无一与髓鞘相关糖蛋白(MAG)抗体共同染色。为了进一步评估由PTEN删除诱导的此类再生轴突的髓鞘化状态，在视神经损伤后4周对受损神经(其中全部RGC神经元被切断)进行电子显微镜分析(Park等人，Science322,963–966(2008))。正如预期，很多具有与天然轴突不可区分的形态的再生轴突可见于病灶远端的视神经中(图1A)。然而，在所分析的数千个轴突中，仅一个再生轴突具有薄层髓鞘(图1A)。因此，与视神经束损伤模型类似，在受损的视神经中，大多数再生轴突并未表现出自发的髓鞘化。
由于OPC负责成年体中的髓鞘化，检查了OPC如何响应损伤。首先，评估PDGFRα-H2B-GFP小鼠的受损(对于挤压为同侧的)和对照(对侧的)视神经中的OPC增殖，在该小鼠中，全部OPC均表达核H2B-GFP。因为这一报告系中的GFP也在<5％的血管和柔脑膜细胞中表达，将视神经切片用少突胶质细胞谱系标志物Olig2进行共染色，并将GFP+和Olig2+双阳性细胞定义为OPC(图1B至E)。如图1C和1D中所示，受挤压的神经中的总OPC数在损伤后1周和2周显著增加，但在4周时恢复为基础水平。相比之下，在全部时间点均在完整神经中观察到了类似数量的GFP+/Olig2+OPC(图1D)。为了进一步评估此类损伤诱导的OPC增殖的动力学，在损伤后的不同时间点向这些小鼠注射BrdU但在损伤后3小时终止，期望在每个时间点标记分裂中的OPC(图1F、1G)。结果表明，损伤诱导的OPC增殖在损伤后约3至5天的增加最为显著，但在后来的时间点变为降低，指示由视神经损伤触发的迅速且可逆的OPC增殖(图1G)。总之，这些结果表明，在受损的视神经中，挤压损伤触发迅速且可逆的OPC增殖。
实施例2：在受损视神经中，经增殖的OPC的分化失败
接下来检查这些增殖的OPC是否能进行分化。为了跟踪OPC的后裔，利用了不同的报告基因小鼠品系，即与Rosa26-STOP-Tomato小鼠杂交的PDGFRα-CreER(Kang等人，Neuron68,668–681,2010)、或PDGFRα-CreER/iRTM小鼠(Arenkiel等人，,2011)。当给药他莫昔芬时，在PDGFRα+OPC中诱导了Cre表达，不仅在这些OPC中而且在其分化的后裔中导致了RTM表达。为了监测其分化，使用了两种证据充分的标志物，即CC1和Oligo1。CC1是用于来自OPC的全部分化细胞的标志物。Oligo1从细胞核至细胞质的易位已经被认为是晚期分化为髓鞘化少突胶质细胞的标志。因此，使用这些免疫组织化学评估，这些细胞可以分为三类：未分化的OPC(CC1-和细胞核Oligo1)、早期分化的OPC(CC1+和细胞核Oligo1)和成熟的少突胶质细胞(CC1+和细胞质Oligo1)(图1H)。
为了标记预先存在的OPC，向PDGFRα-CreER/iRTM小鼠注射他莫昔芬，然后立即进行视神经挤压(Young等人，Neuron 77,873–885,2013)。然后，在损伤后4周，通过免疫组织化学用抗CC1和抗Oligo1检查经标记的OPC的命运(图1I)。在他莫昔芬诱导后4周，在完整的对侧视神经中，尽管总RTM+数较低，但67％的RTM+细胞变为CC1+少突胶质细胞且它们中大约一半表现为细胞质Oligo1+(图1J至1L)。这与成年体中的连续髓鞘化的概念相一致。然而，在相同小鼠的受损视神经中，仅17％的RTM+细胞是CC1+，且这些CC1+细胞中大多具有细胞核Oligo1而没有细胞质Oligo1(图1J至1O)，表明未分化的OPC。这些结果表明，在受损的视神经中，对于OPC分化为成熟的少突胶质细胞而言，存在至少两个阻断，即早期分化(变为CC1+)和晚期成熟化(具有细胞质Oligo1)。此外，尽管已经证明OPC具有在发育期间分化为星形胶质细胞的潜力(Levison and Goldman,Neuron 10,201–212,1993)，但没有观察到表达星形胶质细胞标志物GFAP的RTM+细胞(图1P)。因此，这些数据表明，与完整的视神经相反，在受损的视神经中，增殖的OPC表现出分化阻断，这让人联想到在进行性多发性硬化患者的病灶中观察到的情况(Kuhlmann等人，Brain 132,1118,2008)。
实施例3：损伤诱导的GPR17上调有贡献于OPC的早期分化失败
基于体外模型和EAE模型，先前研究鉴定了多种可促进OPC增殖和/或分化的化合物。然而，不清楚是否这些药剂中的任一种都将会促进再生轴突的髓鞘化。作为研究此类增殖的OPC的分化阻断的第一步，筛选了一组小分子以鉴定将会增加受损视神经中的分化的OPC的化合物(图2A至2C)。候选化合物包括：甲磺酸苯扎托品(Bzp)，一种M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂；氯马斯汀(Clem)，一种抗组胺药和抗胆碱能药，M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂；索利那新(Sli)，一种M3毒蕈碱型受体拮抗剂；贝沙罗汀(Bex)，一种维甲酸X受体激动剂；咪唑(Imi)，一种抗胆固醇合成化合物；异丁司特(Ibud)，一种临床批准的磷酸二酯酶(PDE)抑制剂；和孟鲁司特(Mon)和普鲁司特(Pra)，两种不同的GPR17拮抗剂。由于雷帕霉素(Rap)，一种mTOR抑制剂)，已被证明在TSC1敲除小鼠中改善髓鞘化(Meikle等人，2008)，也包括在我们的筛选中。
由于这些化合物全部会跨越血脑屏障，在视神经损伤后4周，向野生型C57BL/6小鼠进行个体化合物的全身性给药。为了跟踪增殖OPC的分化，当OPC表现出高增殖率时，在损伤后第4至10天每天向小鼠注BrdU(图1G)。在另外3周内(由于分化可能耗时2至3周)，通过少突胶质细胞标志物CC1在受损视神经中BrdU+OPC上的表达来评定每种化合物的促分化效应。如图2B和2C中所示，三种化合物(包括孟鲁司特、甲磺酸苯扎托品和索利那新)显著增加了BrdU+和CC1+双阳性细胞的数量。由于孟鲁司特具有最强的效应，进一步的研究专注于该化合物及其推定的靶标GPR17。
作为验证这一观察结果的第一步，向PDGFRα-CreER/iRTM小鼠给药孟鲁司特治疗以将视神经损伤后的OPC及其后裔选择性地可视化(图2D)，与图1H至1M中的类似。在进行4周的孟鲁司特治疗后，64％的RFP+细胞变为CC1+，相比之下，经媒介物治疗的小鼠中的这一数值为12％(图2E至2G)。令人惊奇的是，77％的这些CC1+RTM+细胞具有细胞核(而非细胞质)Oligo1免疫反应性(图2E至2G)。此外，在孟鲁司特治疗后，总RTM+细胞数增加(图2F)。由于细胞死亡与OPC分红失败相关，此类增加的RTM+细胞可能是改善的分化和降低的细胞死亡所导致的。总之，这些结果表明，孟鲁司特治疗可促进OPC的早期分化，但这些细胞仍未能进展为成熟的少突胶质细胞。
孟鲁司特是临床批准的用于治疗哮喘和季节性过敏的治疗措施。在机制上，它作为白三烯受体(包括G蛋白偶联受体GPR17)的拮抗剂发挥作用。除了孟鲁司特之外，另一种GPR17拮抗剂普鲁司特(Pra)也增加OPC分化，但并未达到统计学显著(图2C)。这可能与其不同的药学性质诸如血脑屏障渗透性质有关(Marschallinger等人，2015)。尽管如此，这些结果强化了关于GPR17在启动OPC增殖中的作用的概念。有趣的是，先前的研究表明，GPR17的表达在成年CNS中下调，且成年GPR17敲除小鼠的髓鞘化似乎是正常的，尽管它被认为是发育过程中OPC分化的内在计时器Chen等人，2009)。因此，使用原位杂交来评估GPR17在不同情况的视神经中的表达模式。与先前的报告(Chen等人，2009)相一致，在成年小鼠的完整视神经中极少检测到GPR17表达(图2H、2I)。然而，视神经挤压损伤触发受损神经中GPR17的显著上调，如在损伤后1周或2周两个时间点所检测(图2H、2I)。
由于孟鲁司特可抑制除了GPR17外的其他白三烯受体，利用GPR17敲除小鼠品系来评估GPR17的基因缺失对于受损视神经中OPC分化的效应(Chen等人，Nat.Neurosci.12,1398–1406,2009)。在该品系中，GPR17编码区被替换为组蛋白2b融合的GFP(H2b-GFP)的序列。因此，这些小鼠可用于监测GPR17表达(通过杂合子和纯合子中的GFP信号)并用于功能丧失研究(纯合子)。正如预期，从损伤后7天开始，GPR17+/-小鼠和GPR17-/-小鼠两者中的GFP+(GPR17+)细胞显著增加(图2J至2L)。这些GFP+中的大多数也使用抗Oligo2共染色，与它们在OPC谱系中的受限表达相一致(图2J)。到损伤后30天，在GPR17+/-小鼠中，仅2.3％的GFP+细胞是CC1+少突胶质细胞，而在GPR17-/-小鼠中，61％的GFP+细胞是CC1+(图2M至2R)。与孟鲁司特治疗相一致，大部分GPR17-/-GFP+细胞在其细胞核中而非细胞质中显示Oligo1免疫反应信号(对于dpi28，图2S至2U；而对于dpi7，图2V至2X)。此外，与GPR17+/-小鼠相比，GPR17-/-小鼠中的GFP+细胞数量明显更高(图2P至2R)。通过BrdU标记，在两个组中发现了类似数量的经标记细胞(图2J、2L)，表明此类GFP+细胞的不同数量可能是由于在GPR17缺失时增加的分化以及因此降低的细胞死亡。一致地，在损伤后4周，相比于GPR17+/-小鼠，在GPR17-/-小鼠中观察到了BrdU+CC1+增加约十倍(图2Y和2Z)。因此，类似于孟鲁司特治疗，GPR17敲除促进了受损视神经中增殖的OPC的初始分化，但不促进其晚期成熟化。
实施例4：实际或持续激活的小胶质细胞对于OPC增殖和成熟化的差异效应
鉴于所观察到的GPR17抑制对于OPC分化的部分效应，考虑了OPC分化的晚期成熟化步骤的额外阻断剂。一个重要提示是受损的(同侧)和其对照未受损的(对侧)神经中具有细胞质Oligo1的CC1+细胞数量不同(图1M至1O)，这表明环境因素可能有贡献于这种晚期分化阻断。与受损的而非未受损的视神经中的经充分表征的炎症和慢性Wallerian退化相一致，在受损视神经中，小胶质细胞被迅速且可持续地激活，如通过用抗CD68抗体进行正染色以及缺乏与抗P2Y12(一种稳态小胶质细胞的标志物)的免疫反应性所表明(图3A至3E)。由于已经证明炎症调节OPC增殖和分化，进一步检查了受损视神经中的小胶质细胞对于OPC增殖和分化的作用。
利用关于进行PLX3397(一种集落刺激因子1受体(CSF1R)抑制剂)的全身性施用能够特异性地在体内耗尽小胶质细胞的观察结果的优点(图3G、3H)，将PDGFRα-H2B-GFP小鼠用PLX3397或其对照预治疗7天，然后进行视神经挤压，并在损伤后14天通过BrdU/GFP/Olig2标记来检查OPC增殖(图3I)。如图3J和3K中所示，PLX3397治疗明显降低了OPC的总数，留下少数细胞以分析其分化。因此，小胶质细胞激活似乎是损伤诱导的OPC增殖所需要的。
由于大部分的OPC增殖在损伤后第一周内发生(图1)，假设在损伤后2至4周进行的滞后PLX3397治疗可能绕过其对增殖的抑制，允许评估其对于OPC增殖的效应。为了做到这一点，进行独立的实验，其中在损伤后2至4周，对PDGFRα-CreER:iRTM小鼠进行PLX3397给药，如图1G至1M、3L中所用。如图3M至3O中所示，PLX治疗增加了CC1+细胞。重要的是，在这些CC1+RTM+细胞中，78％表达细胞质Oligo1，表明小胶质细胞的滞后消融促进早期分化的OPC成熟为髓鞘化少突胶质细胞。
实施例5：孟鲁司特和PLX3397的组合治疗导致再生轴突的稳健髓鞘化
关于GPR17抑制和滞后的小胶质细胞消融对于OPC分化的差异效应的观察结果促使检查组合治疗对于再生轴突的髓鞘化的效应。为了做到这一点，将表达骨桥蛋白/IGF1/CNTF的AAV注射到PDGFRα-CreER:iRTM小鼠的玻璃体内以激活RGC的内在再生能力，并在2周内进行视神经损伤。然后，用孟鲁司特(从dpi1至dpi28，持续4周)和/或PLX3397(在dpi 15至28期间，持续两周)治疗这些小鼠。如图4A至4C中所示，组合疗法急剧增加了CC1+RTM+双阳性细胞的数量，并且大多数的这些CC1+细胞具有细胞质Oligo1，支持这一组合治疗促进OPC的早期分化和晚期分化两者的概念。
在每组中，对一些小鼠进行电子显微镜分析(图4D至4H)和额外的免疫组织化学分析(图4I)。如图4D和4H中所示，在进行孟鲁司特或PLX3397治疗的小鼠中，一些(约20％)再生轴突变为髓鞘化的。然而，使用孟鲁司特治疗后的髓鞘结构比使用PLX治疗后的那些薄得多，这与孟鲁司特或PLX3397分布促进早期分化的OPC(具有使轴突桥鞘化的能力)和成熟的少突胶质细胞(具有形成成熟髓鞘的能力)的结果相一致。相比之下，在使用组合治疗的小鼠中，大多数(60％)的再生轴突被髓鞘化(图4D和4H)。这些髓鞘结构很多相对薄且具有大的内舌，表明正在进行新的髓鞘化(图4E)。然而，可清晰地观察到郎飞氏结(图4F和4G)。一致地，通过免疫组织化学使用已确立的标志物观察到郎飞氏结，且有时观察到半结，这些标志物包括Caspr(副结轴突胶质连接(paranodal axoglial junction)的组成部分)以及Nav和锚蛋白G(郎飞氏结的两个组成部分)(图4I)。最有趣的是，注意到这些再生轴突中的大部分没有穿过视神经交叉，表明此类髓鞘化在这些再生轴突与其功能性靶标形成功能性突出之前发生。有趣的是，在使用促进髓鞘化的治疗的情况下，观察到明显更多更长的再生轴突(图4J至4L)，这可能与髓鞘化对于轴突的保护效应有关。总之，这些研究确立了组合疗法，其能够在具有持续炎症的受损视神经中实现再生轴突的稳健髓鞘化。
实施例6：TNFα表达通过视神经损伤得以上调
在损伤后1周和3周时间点的测序数据表明，TNF表达在视神经损伤后得以上调(图5A、5B)。TNFR1 KO小鼠数据表明，与同一窝的杂合小鼠相比，在接近挤压部位的远端区域处的(图5C)。使用BrdU脉冲追踪方案，在这些小鼠中观察到了明显更多的BrdU+Olig2+细胞。这表明，源自OPC祖细胞的细胞的存活和/或分化增加。这一效应并非由于增加的OPC增殖，因为3小时的BrdU标记显示了较少的BrdU+Olig2+细胞(图5C)。
从损伤后2周至4周，给药沙利度胺(一种TNF抑制剂)，并且在远离损伤处观察到BrdU+/CC1+/Olig2+细胞的稳健增加。使用PDGFRα-CreER/iRTM谱系报告小鼠发现，响应于该治疗，OPC分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞(图5D)。该形态非常不同于其他治疗，诸如GPR17拮抗剂治疗(图5E)。
在分析视神经损伤模型后再生轴突髓鞘化失败的潜在机制时，发现OPC表现出迅速增殖，但无法分化为成熟的髓鞘化少突胶质细胞。机制研究揭示了由明显不同的机制介导的两种不同的分化阻断：损伤诱导的GPR17阻止OPC早期分化为CC1+细胞，而损伤激活的小胶质细胞阻断朝向髓鞘化少突胶质细胞(具有细胞质Oligo1)的成熟化步骤。个体操纵在一定程度上增加了髓鞘化，但组合操纵导致再生轴突的稳健髓鞘化，突出了同时处理内在和外在机制的重要性。加上最近在促进成年CNS轴突再生方面的进展，这些结果为解决重建有功能意义的神经回路的另一个主要障碍提供了重要的见解。有趣的是，在受损的视神经/束中观察到的OPC动力学与在进展性多发性硬化患者的病灶中报道的非常相似，两者都伴有增殖的OPC未能分化为成熟的少突胶质细胞。由于激活的小胶质细胞在受损的视神经和多发性硬化病灶中占主导地位，因此本文报道的结果可能与为进展性MS患者设计促进髓鞘化的干预措施高度相关。
大量分子已经被认为是OPC分化的关键调节剂。令人惊奇的是，孟鲁司特似乎最能促进初始阶段的OPC分化。尽管孟鲁司特可能靶向GPR17和其他半胱氨酰白三烯受体，但在GPR17敲除和孟鲁司特治疗研究中观察到的类似结果指出GPR17是最相关的靶标。就此而言，研究表明GPR17在受损的视神经中显著上调，大多数在早期OPC谱系细胞中，但在极少数CC1+细胞中，这与先前的报导相一致(Chen等人，2009；Fumagalli等人，2011)。然而，GPR17抑制促进这些细胞(转基因小鼠中的GFP+)中的大多数分化为CC1+细胞。有趣的是，来自该谱系的细胞数在GPR17抑制后也显著增加。由于没有在敲除小鼠的发育过程中观察到这一点，这可能与损伤相关因素有关。GPR17由半胱氨酰白三烯激活，因此，促炎因子也可以激活GPR17，阻止表达GPR17的OPC分化且甚至阻止其增殖。值得注意的是，其他一些分子也可能在这一过程中发挥作用，因为其他两种M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂，苯扎托品和索利那新，也显著增加了OPC的分化。此外，另一种M1/M3毒蕈碱型受体拮抗剂氯马斯汀和维甲酸X受体激动剂贝沙罗汀也增加CC1+细胞，尽管该增加没有达到统计学差异。
本文呈现的结果也指示小胶质细胞在OPC动力学中的二元作用：急性激活的小胶质细胞刺激OPC增殖；而慢性激活的小胶质细胞反而抑制OPC分化，尤其是朝向髓鞘化少突胶质细胞的成熟化步骤。事实上，已经提出了小胶质细胞与髓鞘化之间的关联。据报道，炎症能够通过移植的OPC刺激髓鞘化，许多研究指出小胶质细胞是髓鞘化的重要调节物。最近，有研究表明，甲氨蝶呤等化疗导致小胶质细胞的持续活化，从而导致OPC分化受损。
总之，目前公开的研究表明，只有内在(GPR17)和外在(小胶质细胞)因子的共同操纵才能实现再生轴突的稳健髓鞘化。未来的研究将检查此类治疗是否在不同的损伤模型中增强行为改善。重要的是，缺陷性髓鞘化也与神经退行性疾病诸如多发性硬化、脑白质营养不良、神经退行性阿尔茨海默症和与髓鞘化失败相关的中枢神经系统损伤(例如，创伤性脑损伤、脊髓损伤)相关。由于神经炎症可能在这些情况下存在，因此研究小胶质细胞的激活状态并测试我们的操纵对这些情况的影响将是很有趣的。
使用下述材料和方法获得上文报告的结果。
小鼠品系
全部实验程序都遵守由机构动物保护与使用委员会批准的动物协议在波士顿儿童医院进行。Gpr17转基因小鼠来自Richard Lu博士(Chen等人，2009)。其他小鼠品系获自杰克逊实验室(表1)。当小鼠达到6至8周龄时开始实验。雄性和雌性小鼠均在损伤前随机分组并分配至不同治疗组，并且对于动物研究，不使用其他特定的随机分组。量化以盲法检查。
抗体
所使用的一抗是：兔抗Oligo1(1:50，来自Charles D Stiles博士的礼物)、兔抗Olig2(1:300，Novus biologicals，NBP1-28667)、大鼠抗PDGFRα(CD140a)(1:100，BDBioscience，558774)、小鼠抗CC1(APC)(1:100，Millipore，OP80)、大鼠抗BrdU(1:300，Abcam，ab6326)、小鼠抗Nav1.6(1:50，Antibodies incorporated，75-026)、小鼠抗Ankyrin-G(AnkG)(1:50，Antibodies incorporated，75-146)、兔抗Caspr(1:1000，Abcam，ab34151)、大鼠抗MBP(1:300，Abcam，ab7349)、小鼠抗MAG(1:100，Millipore，MAB1567)、大鼠抗CD68(1:300，Bio-Rad，MCA1957)、兔抗Iba1(1:500，WAKO Pure Chemicals，019-19741)、兔抗P2Y12(1:500，AnaSpec，AS-55043A)、大鼠抗GFAP(1:1000，ThermoFisher，13-0300)、兔抗RFP(1:500，Abcam，ab34771)。二抗(Invitrogen)，在任山何羊针对一抗的宿主物种中产生，高度交叉吸附并偶联至Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alex Fluor647的荧光团，并且以1:500稀释度使用。
方法详情
病毒生产
全部AAV病毒载体均由波士顿儿童医院病毒中心制作。在研究中使用如下AAV血清型2：AAV2-Cre；AAV2-CNTF；AAV2-IGF1；AAV2-OPN。全部病毒制剂的滴度为至少1.0X1013GC/mL。
手术程序
对于全部手术程序，小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉并接受丁丙诺啡作为术后镇痛药。
AAV病毒注射
如前所述，在视神经挤压损伤前两周进行玻璃体内病毒注射，以使得能够进行轴突再生。简而言，将一个牵引式玻璃微吸管插入锯齿缘后面的周边视网膜附近，并谨慎地倾斜以避免损坏晶状体。对于Pten f/f小鼠，注射2μl的AAV2/2-CAG-Cre病毒(Park等人，2008)。对于其他小鼠品系，注射2μl的AAV2/2-CAG-CNTF、AAV2/2-CAG-IGF和AAV2/2-CAG-OPN的组合(1:1:1混合物)(Bei等人，2016)。
视神经损伤
如前所述，将视神经暴露于眶内，并用精细镊(Dumont#5FST)挤压5秒，距离视神经盘大约500μm。事后，在术后使用眼膏保护角膜。通过Alexa偶联的霍乱毒素亚单位B标记，可以在挤压后2周观察到稳健的轴突再生。
化合物给药
对于PDGFRα-CreER小鼠，在视神经挤压之前，给药它莫西芬(Tamoxifen)(100mg/kg,p.o.)，持续5天。对于OPC增殖测定，在样品采集前3小时，注射BrdU(100mg/kg，i.p.)。对于药物筛选测定，在视神经挤压后第4天至第10天，每天注射BrdU。从视神经挤压后第1天开始，各化合物或相应媒介物每天给药一次(表2)。如前所述，被测试化合物的剂量和途径为：贝沙罗汀(100mg/kg，p.o.)、甲磺酸苯扎托品(10mg/kg，i.p.)、富马酸氯马斯汀(10mg/kg，p.o.)、异丁司特(10mg/kg，i.p.)、咪唑(10mg/kg，i.p.)、孟鲁司特(25mg/kg，p.o.)、普鲁司特(0.5mg/kg，i.p.)、雷帕霉素(6mg/kg，i.p.)、琥珀酸索利那新(20mg/kg，i.p.)。培西达替尼(PLX 3397)按照LabDiet实验室动物营养方案以290mg/kg混合在食物中。
灌注和组织处理
对于免疫染色，给予动物过量的麻醉并先后经心脏灌注冰冷的PBS和4％多聚甲醛(PFA，sigma)。灌注后，解剖视神经并在4％PFA中在4℃进行后固定过夜。通过将组织在30％蔗糖在PBS中的溶液中浸泡48小时来进行低温保护。使用干冰将样品冻结在OptimalCutting Temperature化合物(Tissue Tek)中，然后在12mm处对视神经进行切片。
免疫染色和成像分析
将冷冻切片(12-μm厚)透化并且封闭缓冲液(0.5％Triton X-100和5％正常山羊血清在PBS)中在室温封闭1小时，并在4℃用一抗覆盖过夜(表1)。对于BrdU染色，将细胞或组织切片在37℃用2N HCl变性30分钟，然后用0.1M硼酸钠缓冲液中和10分钟，在进行正常阻断程序。次日，施加相对应的Alexa Fluor 488-、594-或647-偶联的二抗(全部二抗均购自Invitrogen)。经染色的切片全部用含DAPI的封固溶液封固并用盖玻片密封。免疫荧光标记的图像全部用Zeiss700或Zeiss 710共焦显微镜获取。对于每个生物样品，在10x或20x物镜下对每个视神经的3至5个切片成像以用于量化。然后，使用ImageJ软件的Plugins/Analyze/Cell Counter功能将阳性细胞数量手动量化。对于荧光强度分析，首先在ImageJ软件中将图像转化为8-bit深度，然后通过内在功能：Analyze/Measure来计算平均强度值。
视神经再生的组织清除、成像和量化
对使用经荧光团标记的霍乱毒素B(CTB)注射的小鼠进行4％多聚甲醛灌注然后，对解剖的视神经进行先前公布的iDISCO组织清除方法的改良程序，该方法使得视神经透明以进行直接荧光成像(Renier等人，2014)。已经对该程序进行了针对更好保持CTB荧光以及在组织清除期间的视神经形状变化极小的测试。对于脱水，将视神经样品在黑暗中在80％四氢呋喃(THF，Sigma-Aldrich 360589-500ML)/H2O中温育0.5小时，然后切换至100％THF温育1小时。然后，将样品在二氯甲烷(DCM，Sigma-Aldrich 270997-1L)中温育20分钟(神经应沉没在底部)。将样品最终切换至二苄基醚(DBE，Sigma-Aldrich 33630-250ML)中，直至完全透明(至少3小时，但建议过夜)。透明的神经可以储存在DBE中，在至少1年内没有明显的CTB荧光衰减。对于成像，可将经处理的神经封固在DBE中，并在Zeiss 710共焦显微镜下成像。为了获取全部的再生轴突，使用Z-stask扫描和最大投影的Z-stack图像。对于图像分析，通过ImageJ的内在功能：Analyze/Plot Profile来生成沿着神经的荧光强度谱。为了计算跨整个神经长度的荧光强度积分，开发了Matlab算法以将“曲线下面积”从通过ImageJ生成的图谱数据中量化。
电子显微镜和形态分析
对小鼠灌注4％多聚甲醛和2.5％戊二醛在0.1M二甲胂酸钠缓冲液中的溶液pH7.2。解剖视神经并在相同的固定溶液中固定过夜。然后，由Harvard EM中心基于以下程序来处理样品：将神经在PBS中浸洗，在1％OsO4在PBS中的溶液中进行后固定1小时，在分级乙醇系列物中脱水，用环氧丙烷浸润，并包埋在Epon中。半薄切片用甲苯胺蓝染色，而超薄切片用柠檬酸铅染色。超薄切片在JEOL 1200EX-80kV电子显微镜下取得。以3,000x至20,000x的放大倍数，分析超薄切片中每个神经的髓鞘化轴突的数量。
原位杂交
为了评估Gpr17的表达模式，通过杂交链反应(HCR)(Choi等人，2018)用来自Molecular Instruments的含有DNA探针组、DNA HCR扩增仪和不同缓冲液的商用试剂盒进行原位杂交。为了制备用于原位杂交的切片，先后用DEPC-PBS和4％多聚甲醛(PFA)灌注经麻醉的小鼠。将解剖的视神经在4％PFA中固定过夜，在30％蔗糖/DEPC-PBS中在4℃脱水，包埋在OCT中，并冷冻切片为14μm。将组织在5％SDS中在室温(RT)透化20分钟，然后在杂交缓冲液中在37℃预杂交3小时。然后，将载玻片在包括探针(各自为2.5nM)的预热杂交缓冲液中在37℃温育过夜。杂交后，将切片在37℃用洗涤缓冲液洗涤1小时，然后用2xSSC在RT洗涤15分钟。使用B3 HCR扩增仪在RT进行扩增步骤过夜。
量化和统计分析
在我们应用因数检验之前，通过STATA(版本12，College station,TX,USA)测量正态性和方差相似性。使用双尾学生t检验进行两个组间的单一比较。依据适宜的设计，使用单因素或双因素ANOVA来分析剩余的数据。仅当主要测量显示统计学显著性时才进行事后比较。使用Bonferroni校正来调节多个比较的P值。所有图中的误差条都代表均值±S.E.M。将来自不同窝的不同体重和性别的小鼠随机分配到不同的治疗组，并且动物研究中不使用其他特异性随机化。
其他实施方案
从前述说明书可知，可对本文所述的发明作出改变和修改以令其适应各种用途和条件。此类实施方案也处于所附权利要求书的范畴内。
本文中，对任何变量定义中一系列元件的描述包括该变量作为任何单一元件或作为所列元件的组合(或亚组合)的定义。对本文中实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一实施方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用并入本文，其并入程度与各独立的专利和出版物具体且独立地指明以待通过引用并入相同。

Claims (46)

1.一种增加轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与抑制GPR17的药剂和/或消融和/或抑制激活的小胶质细胞的药剂接触，从而增加所述轴突的髓鞘化。
2.一种增加轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与抑制GPR17的药剂和/或抑制TNFα受体2或TNFα的药剂接触，从而增加所述轴突的髓鞘化。
3.一种增加OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化。
4.一种增加OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与抑制GPR17的药剂和/或抑制TNFα受体2或TNFα的药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂是孟鲁司特或普鲁司特。
6.根据权利要求1、3或5中任一项所述的方法，其中，所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂是PLX3397。
7.根据权利要求2、4或5中任一项所述的方法，其中，所述抑制TNFα受体2或TNFα的药剂是沙利度胺。
8.一种增加轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)在轴突的存在下与选自由甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺组成的组的药剂接触，从而增加所述轴突的髓鞘化。
9.一种增加OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括使少突胶质细胞祖细胞(OPC)与选自由甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺组成的组的药剂接触，从而增加OPC数量和/或分化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述方法增加CC1和/或Oligo1阳性OPC的数量。
11.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述药剂是孟鲁司特、甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、沙利度胺或普鲁司特。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述药剂是孟鲁司特。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述药剂同时或依次给药。
14.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂与所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂同步给药。
15.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂在所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂之前至少一周给药。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中，所述药剂在损伤之前、同时或之后给药。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述药剂在损伤之后数天或数周给药。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述药剂在损伤之后1至2周给药。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中，给药所述药剂至少14天至28天之间。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述轴突是受损的和/或脱髓鞘的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中，所述方法在体外或体内进行。
22.一种增加受试者的轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括向所述受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂，从而增加所述轴突的髓鞘化。
23.一种增加受试者的OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括向所述受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂，从而增加OPC数量和/或分化。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂是孟鲁司特或普鲁司特。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，其中，所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂是PLX3397。
26.一种增加有此需要的受试者的轴突的髓鞘化的方法，所述方法包括向所述受试者给药选自由甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺组成的组的药剂，从而增加所述轴突的髓鞘化。
27.一种增加有此需要的受试者的OPC数量和/或分化的方法，所述方法包括向所述受试者给药选自由甲磺酸苯扎托品、氯马斯汀、孟鲁司特、普鲁司特和沙利度胺组成的组的药剂，从而增加OPC数量和/或分化。
28.一种治疗患有与髓鞘化失败相关的疾病或损伤的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药抑制GPR17的药剂和/或消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂。
29.根据权利要求27或28所述的方法，其中，所述方法增加CC1和/或Oligo1阳性OPC的数量。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有多发性硬化(MS)、脑白质营养不良、神经退行性阿尔茨海默症、创伤性脑损伤、脊髓损伤或视神经损伤。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述脑白质营养不良是肾上腺脑白质营养不良(ALD)、Aicardi-Goutieres综合征、亚历山大症、卡纳万病、脑腱黄瘤病(CTX)、球形细胞样脑白质营养不良(Krabbe病)、异染性脑白质营养不良(MLD)、Pelizaeus Merzbacher病(X连锁痉挛性截瘫)和儿童共济失调伴中枢神经系统髓鞘低下(CACH)。
32.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中，所述药剂同时或依次给药。
33.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂与所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂同步给药。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中，所述抑制GPR17的药剂在所述消融或抑制激活的小胶质细胞的药剂之前至少一周给药。
35.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中，所述药剂在损伤之前、同时或之后给药。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述药剂在损伤之后数天或数周给药。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述药剂在损伤之后1至2周给药。
38.根据权利要求30所述的方法，其中，所述创伤性脑损伤是脑震荡。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中，少突胶质细胞前体细胞是CC1-且具有位于细胞核中的Oligo1。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，所述OPC是早期分化的少突胶质细胞，其是CC1+且具有位于细胞核中的Oligo1。
41.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中，所述OPC是分化的少突胶质细胞，其是CC1+且具有位于细胞质中的Oligo1。
42.一种组合物，其包含GPR17拮抗剂和小胶质细胞抑制剂或消融剂或TNFα抑制剂。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中，所述GPR17拮抗剂是孟鲁司特。
44.根据权利要求42所述的组合物，其中所述小胶质细胞抑制剂或消融剂是PLX3397。
45.一种鉴定引起少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物的方法，所述方法包括：
损伤小鼠的视神经；
使所述视神经与再生轴突的药剂接触；
向所述小鼠给药候选化合物以引起少突胶质细胞前体细胞的分化；
给药已知的小胶质细胞抑制剂或消融剂；以及
确定少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化状态，其中CC1+少突胶质细胞相对于未经治疗的对照有所增加表示所述候选化合物引起所述少突胶质细胞前体细胞的分化。
46.一种鉴定引起少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物的方法，所述方法包括：
损伤小鼠的视神经；
使所述视神经与再生轴突的药剂接触；
向所述小鼠给药已知引起少突胶质细胞前体细胞的分化的化合物；
给药疑似的小胶质细胞抑制剂或消融剂；以及
确定少突胶质细胞或少突胶质细胞前体细胞的分化状态，其中具有细胞质Oligo1的CC1+少突胶质细胞相对于未经治疗的对照有所增加表示所述疑似的小胶质细胞抑制剂或消融剂有效地抑制或消融小胶质细胞。
CN202180032522.8A 2020-05-01 2021-04-29 促进髓鞘化的组合物和方法 Pending CN115667503A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063018939P 2020-05-01 2020-05-01
US63/018,939 2020-05-01
PCT/US2021/029806 WO2021222507A1 (en) 2020-05-01 2021-04-29 Compositions and methods of promoting myelination

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115667503A true CN115667503A (zh) 2023-01-31

Family

ID=78332272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180032522.8A Pending CN115667503A (zh) 2020-05-01 2021-04-29 促进髓鞘化的组合物和方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230167406A1 (zh)
EP (1) EP4143303A1 (zh)
JP (1) JP2023531358A (zh)
CN (1) CN115667503A (zh)
CA (1) CA3181413A1 (zh)
WO (1) WO2021222507A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023102350A1 (en) * 2021-11-30 2023-06-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Neuroprotective agents for use in the treatment of optic neuropathies
CN115957311A (zh) * 2023-01-06 2023-04-14 南通大学附属医院 组蛋白甲基转移酶ezh2在促视神经髓鞘再生药物中的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5219837A (en) * 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
CA2773109A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Brian Popko Methods and systems for inducible ablation of neural cells

Also Published As

Publication number Publication date
JP2023531358A (ja) 2023-07-24
US20230167406A1 (en) 2023-06-01
CA3181413A1 (en) 2021-11-04
WO2021222507A1 (en) 2021-11-04
EP4143303A1 (en) 2023-03-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11406625B2 (en) Method of treating amyotrophic lateral sclerosis with pridopidine
Kim et al. Naringin treatment induces neuroprotective effects in a mouse model of Parkinson's disease in vivo, but not enough to restore the lesioned dopaminergic system
Cabañero et al. Protective role of neuronal and lymphoid cannabinoid CB2 receptors in neuropathic pain
JP6574769B2 (ja) 二環式化合物ならびに自閉症スペクトラム障害および神経発達障害の治療におけるそれらの使用方法
CN115667503A (zh) 促进髓鞘化的组合物和方法
KR102630042B1 (ko) 알츠하이머병의 치료를 위한 항-a베타 원시섬유 항체 및 베타-세크레타제 bace1 억제제를 포함하는 조성물
US20230181027A1 (en) Methods and materials for treating neuromyelitis optica spectrum diseases
US10132815B2 (en) Methods of diagnosing, treating and monitoring diabetic retinopathy
US20210030734A1 (en) Method of treating amyotrophic lateral sclerosis with pridopidine
TW201609640A (zh) 吲哚基及吲哚啉基異羥肟酸於治療神經退化病症或認知缺乏之用途
WO2021161319A1 (en) Combination therapy for treating amyotrophic lateral using pridopidine and another active agent
US20220142991A1 (en) Methods and compositions for treatment of l ysosomal storage disorder
CN110998321A (zh) 帕金森氏症患者脑脊液中par的检测方法
JP2023542516A (ja) アルツハイマー病の前駆フェーズにおける新規な神経保護治療ターゲットとしてのアストロサイトｔｒｐａ１チャネル抑制
Lu et al. Chronic alcohol exposure induces cerebral microbleeds by TGF-β1/Smad signaling pathway mediated remodeling of cerebral small vessels
JP2022531484A (ja) 加齢性黄斑変性症を治療するための物質および方法
CN116672341A (zh) 雷帕霉素在治疗渐冻症和额颞叶痴呆中的应用
JP2021504392A (ja) 新規ジストニア治療用薬学的組成物
CN115403553A (zh) 一种抗抑郁和抗焦虑的取代桂皮酰胺化合物
WO2019169113A1 (en) Compositions and methods for the treatment of endometriosis
Ahlers Microglial responses to ethanol exposure in a mouse model of fetal alcohol syndrome
Qing et al. Protective effects of tamoxifen on traumatic brain injury in rats
JP2017132742A (ja) Ａβオリゴマー特異的抗体の新規薬理用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40080299

Country of ref document: HK