CN110998321A - 帕金森氏症患者脑脊液中par的检测方法 - Google Patents
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Abstract
聚(ADP‑核糖)(PAR)是一种与多种神经退行性疾病状态有关的蛋白质，包括帕金森氏症(PD)。迄今为止，尚未开发出常规的实验室测试来诊断、评估或监测患PD的患者。本申请公开了一种评估一患者的脑脊液(CSF)中的PAR浓度以及使所述浓度与一PD患者的医疗状态相关连的新颖方法。本申请还公开了PAR作为一PD生物标志物的用途。
Description
本申请要求2017年6月2日提交的美国临时申请62/514,316以及2018年6月1日提交的美国临时申请62/679,161的优先权，出于所有目的，这两件申请通过引用将其全部内容并入本文中。
关于联邦资助的研究与开发的声明
本发明是在国家卫生研究院资助的计画编号NS38377以及U01NS082133的政府支持下进行的，政府拥有本发明的一定权利。
背景技术
聚(ADP-核糖)(poly(ADP-ribose)，“PAR”)聚合酶-1(“PARP-1”)是一种重要的核酶，其对DNA损害作出反应，且是DNA修复所必需的。激活后，PARP-1催化从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，“NAD+”)转移ADP-核糖，并将PAR结合至各种核蛋白上，例如，组蛋白、DNA聚合酶、拓扑异构酶(topoisomerase)以及转录因子，还有PARP-1自身的自动修饰，从而调节各种生理过程。PARP-1的过度激活导致一内在的细胞死亡程序，其已被命名为依赖性细胞死亡(parthanatos)(或可选择地，PARP-1依赖性细胞死亡(PARP-1-dependent cell death))，以区别于坏死(necrosis)以及凋亡(apoptosis)。已知依赖性细胞死亡发生在许多疾病以及状态中，例如，中风、帕金森氏症(Parkinson’sdisease)、心脏病发作、糖尿病以及局部缺血再灌注(ischemia reperfusion)损伤。PARP-1抑制或PARP-1基因缺失在许多细胞损伤范例的模型中有显着的保护作用，包含中风、创伤、缺血再灌注损伤、糖尿病以及神经退行性疾病，这表明依赖性细胞死亡在这些疾病中起着重要作用。
线粒体蛋白凋亡诱导因子(“AIF”)在依赖性细胞死亡中起着关键作用，在此过程中AIF是从线粒体释放并转移至细胞核。AIF是一种线粒体氧化还原酶，与细胞色素C(cytochrome C)一样，具有两个独立的功能。第一个是在线粒体内的(涉及细胞存活)，被认为是通过呼吸复合体I的组合或稳定性。第二个是作为依赖性细胞死亡的一启动子(promoter)。AIF在PARP-1激活后释放至细胞质中，最终进入细胞核以诱导细胞死亡。
帕金森氏症(PD)是一种与年龄有关的神经退行性疾病，其中α-syn在称为路易体(Lewy body)以及神经元轴突(neurite)结构中的胞浆内包含体(intracytoplasmicinclusion)中沉积为原纤维。重组α-syn可以在体外(in vitro)聚集以形成与在体内(invivo)发现的结构相似的原纤维，且这些α-syn预形成的原纤维(α-syn PFF)可以以一类朊病毒(prion-like)的方式扩散：两者在体外神经元的培养以及在体内当注射至小鼠脑中时，伴随着丝氨酸129(serine 129)上α-syn的磷酸化(病理性α-syn以及神经毒性的一标志物)。虽然很明显地，聚集的α-syn是造成PD的病理原因，但驱动α-syn的异常聚集以及由此聚集激活的细胞损伤以及死亡机制的原因尚不清楚。由于聚(ADP-核糖)(PAR)聚合酶-1(PARP-1)以及PAR在与神经系统疾病相关的细胞死亡中起着主要作用，因此在此评估PARP-1以及PAR在病理性α-syn诱导的神经退化中的作用。
另外，PD是一种缓慢进行的神经退行性CNS疾病，其特征在于缓慢且减少的运动、肌肉僵硬、静息性震颤(resting tremor)、姿势不稳、认知障碍以及痴呆(dementia)。PD的主要病理性特征是在黑质致密部(substantia nigra pars compacta，SNpc)中多巴胺能神经元的选择性退化以及在尾核(caudate)以及壳核(putamen)中其末稍的丢失。投射至尾状核以及壳核中的黑质神经元的丢失消耗了在这些区域中的多巴胺。有证据表明，多种因素(包含遗传以及环境因素)导致在此神经退行性疾病中的多巴胺能神经退化。
PD的药物治疗旨在阻止、减缓或减少在黑质纹状体神经元(nigrostriatalneuron)中神经退行性过程的程度、或使其最小化(神经保护疗法)、以及消除生化失衡(对症疗法(symptomatic therapy))。PD中对症疗法的主要方向是增加多巴胺合成、或刺激多巴胺受体活性以及多巴胺从突触前(presynaptic)空隙的释放，并抑制突触前受体对多巴胺的再摄取、以及抑制多巴胺的分解代谢。
由于目前还未有已知用于PD的治愈方法，且不同的患者对治疗方法的反应不同，因此对于医疗专业人员而言，仔细地监测患者的疾病进展是非常重要的。这使得医疗专业人员在当前治疗无效的情况下调整或改变患者接受的药物治疗。当前用于监测PD进展的方法是基于患者经历的残疾以及损伤水平的一主观量表(subjective scale)。
因此，仍然需要更具体地评估以及监测PD患者的治疗以及进展，以对药物治疗进行微调，还需要有一定量以及定性量表来消除或减少评估的主观成分。
发明内容
在一第一方面，本文中公开了一种用于测定脑脊液中的一聚(ADP-核糖)(PAR)浓度的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)样品；以及对所述CSF样品进行一PAR夹心的酶联免疫吸附法(PAR-sandwich ELISA)，从而测定所述CSF中的所述PAR浓度。
在一第二方面，本文中公开了一种用于测定一帕金森氏症药物治疗的治疗功效的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的一聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
在另一方面，本文中公开了一种用于监测一帕金森氏症患者的疾病进展的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的一聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较，其中所述患者正在接受至少一种帕金森氏症药物治疗。
在另一方面，本文中公开了一种诊断一帕金森氏症患者的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的一聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
在另一方面，本文中公开了一种用于帕金森氏症的治疗方法，所述方法包括：从接受至少一种帕金森氏症药物治疗的一患者收集一脑脊液样品，测量所述脑脊液样品中的一聚(ADP-核糖)浓度；以及将所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品中的一聚(ADP-核糖)浓度进行比较。
在另一方面，本文中公开了PAR在一患者的所述CSF中作为一PD生物标志物的用途。
附图说明
图1绘示了在依赖性细胞死亡(parthanatos)中PAR依赖性AIF释放模型于细胞中的过程的示意图。
图2是具有一抗PAR抗体的夹心的ELISA试验的示意图以及一浓度曲线图。
图3是一PD患者与多个健康对照组的CSF中的PAR浓度的条形图。
图4是多个PD正常患者与多个PD认知障碍患者中的PAR浓度的条形图。
图5示出α-syn PFF治疗的初级皮层神经元中PARP-1的激活。PAR积累水平的代表性西方墨点法(western blot)分析(上图)以及定量(下图)。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析(one-way ANOVA)，然后进行杜凯氏(Tukey)的事后测试(post hoc test)(n＝3至4)。
图6示出用ABT-888(10μM)、AG-014699(1μM)或BMN 673(10μM)预温育1小时、且进一步用α-syn PFF(5μg/ml)温育14天的初级皮层神经元的赫斯特(Hoechst)以及碘化丙啶(PI)染色的代表性图像。比例尺为20微米(μM)。
图7示出细胞死亡的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。
图8示出通过西方墨点法分析测定α-syn PFF诱导的PAR积聚的抑制。
图9示出用AAV-sgCon或AAV-sgPARP-1转导并进一步用α-syn PFF温育14天的初级皮层神经元的赫斯特以及碘化丙锭(PI)染色的代表性图像。
比例尺为20微米。
图10示出细胞死亡的定量。条形表示平均值±s.e.m.(n＝3)。
图11示出来自WT或PARP-1KO初级皮层神经元并进一步用α-syn PFF温育14天的赫斯特以及碘化丙锭(PI)染色的代表性图像。比例尺为20微米。
图12示出细胞死亡的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。
图13示出在α-syn PFF注射的小鼠的纹状体中PAR积累水平的代表性免疫印迹以及定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝4)。
图14示出在纹状体内α-syn PFF或PBS注射6个月后，α-syn PFF注射的WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的SNpc DA神经元的代表性TH以及尼氏(Nissl)染色。
图15示出立体计数。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至7只小鼠)。
图16示出通过HPLC测量在纹状体内α-syn PFF或PBS注射6个月后，WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的纹状体中的DA浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝6至30只小鼠)。
图17示出α-syn PFF注射后180天的爬杆测试结果。爬杆测试在WT、PARP-1KO或用ABT-888饲喂的WT小鼠中进行。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝7至9只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图18示出α-syn PFF注射后180天的握力测试结果。握力测试在WT、PARP-1KO或用ABT-888饲喂的WT小鼠中进行。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝7至9只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图19示出通过PAR加速α-syn原纤维化。将有或没有5nM纯化PAR的单体α-syn在37℃下温育指定的时间。通过使用α-syn抗体的免疫印迹检测α-syn的原纤维化(上图)。数据为平均值±s.e.m.(下图)。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。
图20示出通过硫黄素T(thioflavin T)荧光监测有或没有PAR的α-syn原纤维的形成速率(n＝3)。
图21示出α-syn原纤维的代表性透射电子显微镜(transmission electronmicroscopy，TEM)图像。比例尺为200奈米(nm)。
图22示出在PARP-1KO神经元中NMDA诱导的α-syn原纤维化的抑制。用AAV-α-syn转导来自WT或PARP-1KO胚胎的初级皮层神经元，然后进一步用500μM NMDA温育5分钟。在NMDA治疗后6小时通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图23示出通过PARP1抑制剂防止NMDA诱导的α-syn原纤维化。用10μM ABT-888或1μM AG-014699预治疗AAV-α-syn转导的初级皮层神经元1小时，用500μM NMDA进一步温育5分钟。在NMDA治疗后6小时通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图24示出α-syn PFF或PAR-α-syn PFF与递增浓度的PK(0至2.5μg/ml)温育、以及与α-syn抗体免疫印迹(上图)。定量表示裂解与未裂解的α-syn的比例(下图)。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。
图25示出用α-syn PFF或PAR-α-syn PFF治疗1、4以及7天的初级皮层神经元中p-α-syn(红色)的代表性免疫染色。用DAPI标准化的p-α-syn信号的定量(右图)。条形表示平均值±s.e.m.(下图)。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5)。
图26示出用1％TX-100(TX可溶)以及2％SDS(TX不可溶)依次提取用α-syn PFF或PAR-α-syn PFF治疗的初级皮层神经元。使用α-syn、p-α-syn以及GAPDH抗体对裂解液进行免疫印迹。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝3)。ND为未检测到。与1天的α-syn PFF相比，*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005。#P<0.05，##P<0.005，###P<0.0005。
图27示出在纹状体内PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射后1、3以及6个月，WT小鼠的SNpc DA神经元的代表性TH和尼氏染色。
图28示出立体计数。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至8只小鼠)。
图29示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的DA浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。
图30示出在纹状体内PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射后1、3以及6个月，WT小鼠的SNpc中的代表性p-α-syn免疫染色。比例尺为100微米。
图31示出p-α-syn水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至8只小鼠)。
图32示出通过爬杆测试测量在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的行为异常。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝9至14只小鼠)。
图33示出通过握力测试测量在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的行为异常。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝9至14只小鼠)。
图34示出PD患者的CSF中的PAR增加。通过PAR ELISA测定健康对照组(n＝31)以及PD患者(n＝80)的CSF中的PAR水平。条形表示平均值±s.e.m.。用韦尔奇的更正(Welch’scorrection)的学生t检验。
图35示出PD患者的CSF中的PAR增加。通过PAR ELISA测定健康对照组(n＝33)以及PD患者(n＝21)的CSF中的PAR水平。条形表示平均值±s.e.m.。用韦尔奇的更正的学生t检验。
图36示出PD患者的路易体(Lewy body)中的PAR增加以及共定位(co-localization)。PD患者的SNpc中的代表性α-syn(红色)以及PAR(绿色)免疫染色。
图37示出用ABT-888(10μM)、AG-014699(1μM)或BMN 673(10μM)预温育1小时、以及用α-syn PFF进一步温育7天的初级皮层神经元中的p-α-syn(红色)的代表性图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图38示出用DAPI标准化的p-α-syn信号的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝6)。
图39示出用PARP抑制剂预治疗1小时、然后用α-syn PFF温育7天的初级皮层神经元的去垢剂(detergent)可溶以及不可溶部分中的α-syn的代表性免疫印迹。
图40示出标准化为b-肌动蛋白(actin)的去垢剂不可溶部分中的α-syn水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。
图41示出用AAV-sgPARP1感染的初级皮层神经元中α-syn PFF诱导的PAR积累的抑制。
图42示出来自PARP1 KO胚胎的初级皮层神经元中α-syn PFF诱导的PAR积累的抑制。
图43示出用ABT-888(10μM)、AG-014699(1μM)或BMN 673(10μM)预温育1小时、以及用α-syn PFF进一步温育7天的初级皮层神经元中的p-α-syn(红色)的代表性图像。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图44示出用DAPI标准化的p-α-syn信号的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝6)。
图45示出用α-syn PFF温育7天的WT或PARP1 KO初级皮层神经元的去垢剂可溶以及不可溶部分中的α-syn的代表性免疫印迹。
图46示出标准化为b-肌动蛋白的去垢剂不可溶部分中的α-syn水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。
图47示出用ABT-888、Z-VAD、NEC-1或3-MA预治疗1小时，然后用α-syn PFF进一步温育14天的初级皮层神经元的赫斯特以及碘化丙锭(PI)染色的代表性图像。比例尺为20微米。
图48示出细胞死亡的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，***P<0.001。
图49示出α-syn PFF传输的代表性图像。将α-syn PFF添加至微流体装置的室1(C1)中。在第14天，当所有三个腔室中均存在WT神经元时，在室2(C2)以及室3(C3)中检测到p-α-syn，但在室2的PARP-1KO神经元中以及在室3的WT神经元中的p-α-syn强度非常有限。比例尺为100微米。
图50示出在高分辨率图像中的p-α-syn信号。比例尺为10微米。
图51示出在每个室中p-α-syn水平的定量。数值是平均值±s.e.m.。未配对的学生t检验(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005。
图52示出来自WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的中脑裂解液具有不正常折叠的(misfolded)α-syn、p-α-syn、TH、DAT、PAR以及PARP-1抗体的代表性免疫印迹。
图53示出TH水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图54示出DAT水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图55示出不可溶α-syn水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图56示出不可溶p-α-syn水平的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图57示出通过HPLC测量在纹状体内α-syn PFF或PBS注射6个月后，WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的纹状体中的DA代谢物DOPAC浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至10只小鼠)。
图58示出通过HPLC测量在纹状体内α-syn PFF或PBS注射6个月后，WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的纹状体中的DA代谢物3-MT浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至10只小鼠)。
图59示出通过HPLC测量在纹状体内α-syn PFF或PBS注射6个月后，WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的纹状体中的DA代谢物HVA浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至10只小鼠)。
图60示出来自WT、PARP-1KO以及用ABT-888饲喂的WT小鼠的p-α-syn免疫染色的代表性图像。
图61示出杏仁核(amygfala)区中p-α-syn强度的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至5只小鼠)。
图62示出皮层(cortex)区中p-α-syn强度的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至5只小鼠)。
图63示出SNpc区中p-α-syn强度的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至5只小鼠)。
图64示出α-syn PFF注射后180天的爬杆测试结果。爬杆测试在WT、PARP-1KO或用ABT-888饲喂的WT小鼠中进行。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝6至30只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图65示出α-syn PFF注射后180天的握力测试结果。握力测试在WT、PARP-1KO或用ABT-888饲喂的WT小鼠中进行。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝6至30只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图66示出温度对PAR介导的α-syn原纤维化加速的影响。将有或没有5nM PAR的单体α-syn在指定的温度下温育72小时。通过使用α-syn抗体的免疫印迹检测α-syn的原纤维化。
图67示出PAR介导的α-syn原纤维化的浓度依赖性。温育36小时后，通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图68示出α-syn原纤维化的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。
图69示出通过在37℃下添加5nM PAR、Poly(A)或ADPr 36小时而产生的α-syn原纤维化的代表性免疫印迹。
图70示出α-syn原纤维化的定量。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。
图71示出用AAV-α-syn转导5天、然后用BioPorter递送PAR聚合物6小时的WT或PARP1 KO胚胎的初级皮层神经元。通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图72示出用α-syn WT转染24小时、然后用50μM MNNG进一步温育15分钟的WT或PARP1 KO SH-SY5Y细胞。MNNG治疗6小时后，通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图73示出用α-syn A53T转染24小时、然后用50μM MNNG进一步温育15分钟的WT或PARP1 KO SH-SY5Y细胞。MNNG治疗6小时后，通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图74示出用α-syn WT转染24小时、然后用BioPorter递送PAR聚合物6小时的的WT或PARP1 KO SH-SY5Y细胞。通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。
图75示出用10μM ABT-888或1μM AG-014699预治疗1小时、然后用50μM MNNG进一步温育15分钟的用α-syn WT转染24小时的SH-SY5Y细胞。MNNG治疗6小时后，通过西方墨点法分析检测α-syn原纤维化。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图76示出α-syn PFF或PAR-α-syn PFF用0.5μg/ml PK温育，以及用对α-syn的表位特异性抗体的免疫印迹。
图77示出随着增加剂量的纯化PAR聚合物而产生PAR-α-syn PFF。用相同量的α-syn PFF或PAR-α-syn PFF治疗初级皮层神经元14天。细胞死亡通过赫斯特以及碘化丙锭(PI)染色测定。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3至4)。
图78示出用增加量的α-syn PFF或PAR-α-syn PFF治疗4天的初级皮层神经元中的p-α-syn(红色)的代表性免疫染色。细胞核用DAPI(蓝色)染色。
图79示出用DAPI标准化的p-α-syn信号的定量(n＝5)。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图80示出在纹状体内PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射后1、3以及6个月，WT小鼠的SNpc DA神经元的立体计数。(A)对同侧的(ipsilateral)尼氏神经元进行计数。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至8只小鼠)。*P<0.05，***P<0.001。
图81示出在纹状体内PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射后1、3以及6个月，WT小鼠的SNpc DA神经元的立体计数。对对侧的(contralateral)TH神经元进行计数。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至8只小鼠)。*P<0.05，***P<0.001。
图82示出在纹状体内PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射后1、3以及6个月，WT小鼠的SNpc DA神经元的立体计数。对尼氏阳性神经元进行计数。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝5至8只小鼠)。*P<0.05，***P<0.001。
图83示出多巴胺代谢的示意图。
图84示出通过HPLC测量的在1、3和6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的DA浓度没有显着差异。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。
图85示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的同侧DOPAC浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图86示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的对侧DOPAC浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图87示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的同侧3-MT浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图88示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的对侧3-MT浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图89示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的同侧HVA浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图90示出通过HPLC测量的在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中的对侧HVA浓度。条形表示平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(每组n＝4至6只小鼠)。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图91示出在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的纹状体中TH、DAT以及β-肌动蛋白的代表性免疫印迹。
图92示出标准化为β-肌动蛋白的纹状体中TH以及DAT水平的定量。误差条表示平均值±s.e.m。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝3至4)。
图93示出通过爬杆测试测量在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的行为异常。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图94示出通过握力测试测量在1、3以及6个月时PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR注射的小鼠的行为异常。数据为平均值±s.e.m.。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.001。
图95示出PAR ELISA的建立。ELISA检测到低至3pM的PAR，并在50nM时达到饱和。
图96示出在对照组以及PD患者的黑质中的PAR、TH以及β-肌动蛋白的代表性免疫印迹。
图97示出标准化为β-肌动蛋白的纹状体中PAR以及TH水平的定量。误差条表示平均值±s.e.m。单向方差分析，然后进行杜凯氏的事后测试(n＝5)。*P<0.05，***P<0.001。
具体实施方式
先前发现了一种新的且有用的机制，通过施用干扰PAR-AIF相互作用的试剂来防止PARP-1激活后的细胞死亡(参见US20120122765，通过引用将其全部内容并入本文中)。这种机制在治疗患帕金森氏症的患者是有用的。在这方面，AIF作为一PAR聚合物结合蛋白的辨认确立了抑制PAR聚合物与AIF相互作用的治疗化合物在单一疗法或联合疗法中作为对抗激活PARP-1的应激物(stressor)的保护化合物可能是有用的。
在继续这项工作中，本文中公开了一种用于监测以及评估多个患PD的患者的新颖方法。还公开了一种用于监测以及评估对一患PD的患者施行药物治疗的有效性的新颖方法。本文中公开的所述诊疗方法(theranostic method)使一医疗专业人员能够更好地为一患PD的患者制定一治疗计划，所述患者具有减缓或阻止疾病进展的最佳机会。
在一个方面，本文中公开了一种用于测定脑脊液中的所述聚(ADP-核糖)(PAR)浓度的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)样品；以及对所述CSF样品进行一PAR夹心的酶联免疫吸附法(PAR-sandwich ELISA)，从而测定所述CSF中的所述PAR浓度。
在一些实施例中，所述方法还包括将所述CSF样品中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的所述PAR浓度进行比较。所述对照样品可以是一先前从相同患者或从一不同患者收集的CSF样品。在一些方面，使用超过一个对照样品。每个对照样品可以来自相同患者，或来自一独立于其他对照样品选择的不同患者。
在一些方面，所述对照样品是具有一已知浓度PAR的一制备好的标准液，这样可以使测试样品与所述对照样品进行比较，从而允许测定在所述测试样品中的所述PAR浓度。可以使用例如图2中所示的多个制备好的对照标准液，从而可以使所述测试样品与一生成的控制曲线进行比较，由此能够定量在所述测试样品中的所述PAR浓度。
本文中其他地方提供了所述夹心的ELISA的描述。在一些方面，捕获抗体、检测抗体或两者为抗PAR抗体。它们可以是单克隆或多克隆，且它们可以是人源化(humanized)或不是人源化。在一些方面，所述抗体是从一人类组合抗体库制备的一抗PAR抗体。在一些方面，所述人类组合库是来自
的
技术。所述
技术的示例请参见Knappik，A.等人(2000)“基于模块共识框架以及三核苷酸随机化的多个CDR的全合成人类组合抗体库(Fully synthetic human combinatorial antibody libraries(HuCAL)based on modular consensus frameworks and CDRs randomizedwithtrinucleotides)”(分子生物学杂志(J Mol Biol.)，296：57-86)以及Prassler，J.等人(2011)“抗体库白金，一用于哺乳动物表达系统中序列多样性以及优异性能而优化的合成Fab库(HuCAL PLATINUM,a synthetic Fab library optimized for sequencediversity and superior performance in mammalian expression systems)”(分子生物学杂志，413：261-78)，两者通过引用将其教示内容并入本文中。
所述检测抗体与至少一种适合用于通过比色测定法或其他测定法检测的试剂结合。在一些方面，使用对第一检测抗体具有特异性的一第二检测抗体，且将所述第二检测抗体结合至适合用于通过比色测定法或其他测定法检测的所述试剂。在一些方面，适合用于通过比色测定法检测的所述试剂是生物素(biotin)。辣根过氧化酶(Horseradishperoxidase，HRP)强力地结合至生物素，且与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)反应以形成一有色产物。在一些方面，所述比色测定法使用HRP以及TMB以测量一患者的一CSF样品中的PAR浓度。
在另一方面，本文中公开了一种用于测定一帕金森氏症药物治疗的治疗功效的方法，所述方法包括：从一患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的所述聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
在一些方面，所述对照样品是一先前从相同患者收集的CSF样品。所述先前收集的CSF样品可能是在过去的任何时间收集。例如，所述样品可能是在当前收集的样品的1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月、或36个月前收集。在一些方面，所述样品是在所述患者的生命期期间的任何时间点收集。此种样品收集可以作为对一患者健康的常规监测的一部分，定期或重复地进行。在一些方面，所述对照样品取自一健康的患者。如本文中所使用，“健康的”是指所述患者没有表现任何可能影响所述测试结果的一医疗状态的症状。在一些方面，所述健康的患者没有表现任何PD的症状或相似的神经系统状态。
先前已证明PARP-1的激活以及PAR的积累与PD的神经病理学有关，因此在本文中公开的一些方面，一患者的所述CSF中的所述PAR浓度的增加表明所述患者患有PD或处于发生PD的风险。在一些方面，如果一患者中的所述PAR浓度高于先前从相同患者收集的所述对照样品，则表明所述PD在所述患者中正在恶化。在一些方面，与先前从相同患者收集的所述对照样品相比，所述患者中的所述PAR浓度增加，表明所述患者接受的所述药物治疗并未阻止所述疾病的进展。
在一先前诊断为PD的患者中，使用本文中公开的所述多个方法以及技术或通过另一种方法，且所述患者正在接受PD的药物治疗，与一先前从相同患者收集的样品相比，当所述患者中的所述PAR浓度增加时，表明所述药物治疗未阻止所述疾病。在这些情况下，一医疗专业人员将决定是否继续相同的治疗或改变所述患者接受的治疗。
在另一方面，本文中公开了一种用于监测一PD患者的疾病进展的方法，所述方法包括：从所述患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的所述聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
在一些方面，所述对照样品是一先前从相同患者收集的CSF样品。所述先前收集的CSF样品可能是在过去的任何时间收集。例如，所述样品可能是在当前收集的样品的1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月、15个月、18个月、21个月、24个月、27个月、30个月、33个月、或36个月前收集。在一些方面，所述样品是在所述患者的生命期期间的任何时间点收集。此种样品收集可以作为对一患者健康及/或治疗的常规监测的一部分，定期或重复地进行。
当将所述PAR浓度与在一较早的时间段取自相同患者的样品进行比较，所述CSF中的所述PAR浓度的增加表明所述患者的状态正在恶化。如果所述患者正在接受药物治疗，则一增加的PAR浓度表明所述治疗对所述患者无效。如果所述PAR浓度相同或更低，则表明所述患者正在接受的所述治疗在减缓或阻止所述疾病的进展是有效的。所述PAR浓度是使用如本文中其他地方公开的一夹心的ELISA来测量。
在又一方面，本文中公开了一种用于诊断、或测定一患者处于发生PD的风险的方法，所述方法包括：从所述患者收集一脑脊液(CSF)样品；测量所述CSF样品中的所述聚(ADP-核糖)(PAR)浓度；以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
根据此方法，在一些方面，如果一患者的所述CSF中的所述PAR浓度高于一预定的浓度，则将所述患者诊断为患有PD、或处于发生PD的风险。在一些方面，所述预定的浓度是一健康的患者的所述CSF中的所述PAR浓度。在一些方面，使用如本文中其他地方公开的一夹心的ELISA来测量所述患者的所述CSF中的所述PAR浓度。
根据此方法，如果一患者的一PAR浓度高于一来自一健康的患者的对照样品或一先前取自相同患者的对照样品，则所述患者诊断为患有PD或测定为处于发生PD的风险。如果所述患者的所述CSF中的所述PAR浓度低于或等于一阴性对照样品中或一健康患者的一对照样品中的所述PAR浓度，则所述患者当前没有患有PD、或在此时发生PD的风险低。由于PD的最终原因尚不清楚，因此不可能断定一患者永远不会发生PD。
如本文中所使用的术语“诊疗(theranostics)”，是指针对一特定患者制定一个体化(individualized)的治疗计划或疗法的过程。这个词定义了正在进行的临床努力，以开发对各种疾病更具体、个体化的治疗，并将诊断以及治疗能力结合成一单一试剂。基本原理起因于以下实际情况：许多疾病(例如，PD以及癌症)为极大地异质性(heterogeneous)，且当前的治疗仅对有限的患者族群或亚族群、及/或仅在疾病进展的特定阶段有效。希望诊断以及治疗的一紧密结合可以提供对个体更具特异性的治疗方案，从而更有可能提供改善的预后。
PD没有标准的治疗。根据每个患者的症状以及整体健康状况，制定一个体化的治疗计划。多个治疗选项包含药物、手术以及生活方式改变。用于治疗PD的药物的多个实例包含但不限于，左旋多巴(levodopa)、多巴胺激动剂(dopamine agonist)、金刚烷胺(amantadine)、抗胆碱能药(anticholinergics)、COMT抑制剂、以及MAO-B抑制剂。手术治疗包含但不限于，深部脑刺激、丘脑切开术(thalamotomy)、苍白球切开术(pallidotomy)以及丘脑下切开术(subthalamotomy)。生活方式治疗包含但不限于，运动以及饮食。许多患者经常探索所谓的“替代药物”，其中可能包含草药以及维生素补充剂。在临床试验中一直在研究其他的治疗。在一些方面，一患者正在接受至少一种特别针对PD的类型的药物治疗。为了测定对一患者的最佳组合，所述患者接受多种不同类型的药物治疗并不少见。无论对所述患者施用多少种不同类型的药物治疗，本文中公开的所述多个方法以及技术皆适合用于评估在所述患者中的所述PAR浓度，以及测定所述药物治疗或这些治疗的组合的治疗功效。
本文中还公开了一种诊疗方法，其将帮助医疗专业人员为一患PD的患者制定一个体化的治疗计划。所述方法包括从正在接受至少一种PD药物治疗的一患者收集一脑脊液(CSF)样品，测量所述CSF样品中的所述聚(ADP-核糖)(PAR)浓度，以及将所述患者中的所述PAR浓度与至少一个对照样品中的一PAR浓度进行比较。
所述药物治疗可以是本文中其他地方公开的任何治疗，或其可以是由一医疗专业人员施用或在一医疗专业人员的监督下的任何其他治疗。在一些方面，如果已经在预期一药物会产生作用的至少一时间段内向一患者施用所述药物，且在所述患者中的所述PAR浓度已经增加，则所述方法进一步包括改变向所述患者施用所述药物的方式。改变施用所述药物的方式可以包括增加或减少所述药物的剂量；其可以包括增加或减少所述患者服用或向所述患者施用所述药物的频率；其可以包含改变或取消正在向所述患者施用一特定药物。
在另一方面，与一先前从相同患者收集的CSF样品相比，如果所述患者的所述CSF中的所述PAR浓度已经增加，则所述医疗专业人员可以改变所述患者接受的药学治疗以增加一另外形式的治疗。例如，如果所述患者仅接受一种或多种药物作为治疗，则所述医疗专业人员可以建议一手术替代治疗。或者，如果所述患者已接受一种药物(例如，左旋多巴)，则所述医疗专业人员可以建议添加一第二药物(例如，一多巴胺激动剂)。所述医疗专业人员改变所述患者的所述药物治疗的确切性质将根据所述患者的医疗需求以及所述医疗专业人员的专业判断而个体化。
如本文中所使用，术语“生物标志物”是指由国家卫生研究院生物标志物定义工作小组制定的定义。其是“一客观测量以及评估的特征，作为正常生物学过程、致病过程或对一治疗性介入(therapeutic intervention)的药理学反应的一指标”。本文中还公开了一患者的所述CSF中的PAR作为一PD生物标志物的用途。本文中其他地方公开的所述多个方法适合用于诊断一患有PD的患者或测定一患者是否处于PD的风险。一患者的所述CSF中的PAR浓度升高表明为PD、或表明一患者处于发生PD的风险。如果一患者已经表现PD的症状，则所述患者的所述CSF中的PAR浓度升高意味所述患者患有PD。PD的症状包含但不限于，震颤或颤抖、书写或言语模式改变、嗅觉丧失、难以入睡、行走或移动困难、动作缓慢、便秘、面具脸(masked face)、头晕或昏厥、或过度弯腰或驼背。这些PD的早期预警征兆，加上一患者的所述CSF中的PAR浓度升高，意味所述患者患有PD。可能需要进一步测试以确认此诊断。本文中还公开了PAR作为一PD生物标志物的用途。在一患者的所述CSF中检测到PD浓度升高表明所述患者患有PD或处于发生PD的风险。
如本文中所使用，如图2中所示，“夹心的ELISA”是一传统ELISA的变体，其对样品抗原检测以及定量有高度特异性。所述夹心的ELISA定量两层的多个抗体之间的多个抗原(即，一捕获抗体以及一检测抗体)。由于至少两种抗体在所述夹心中起作用，因此待测的所述抗原必须包含至少两种能够与所述抗体结合的多个抗原表位(epitope)。单克隆或多克隆抗体都可以用作一夹心的ELISA系统中的所述捕获以及检测抗体。多个单克隆抗体识别一单个表位，其允许对多个抗原之间的微小差异进行精细检测以及定量，而多个多克隆抗体通常用作所述捕获抗体，以捕获尽可能多的所述抗原。夹心的ELISA的优势之一在于样品制备简便，这意味着所述样品无需在分析前纯化。夹心的ELISA的另一个优势是检测以及定量多个特定抗原的技术的灵敏度。
在本文中公开的所述夹心的ELISA的一些方面，所述捕获抗体固定在一板、芯片或其他物理结构上。在第二步骤中，将所述固定的捕获抗体暴露于包含靶蛋白的所述样品。如本文中所述，所述靶蛋白是PAR。在一预定时间段之后，添加一第一检测抗体以结合至与所述固定的捕获抗体结合的所述抗原。在一些实施例中，添加一第二检测抗体以结合至所述第一检测抗体。在所有实施例中，至少一种的所述多种检测抗体将包括一可检测的底物(substrate)。所述可检测的底物可以是一酶，其与一外加的试剂反应以形成一可检测且可定量的产物，或所述可检测的底物可以无需进一步反应即为可检测的。在一些实施例中，所述可检测的底物是生物素。在所有实施例中，所述可检测的底物将是可检测以及可定量的。在一些实施例中，所述底物的所述检测将是比色的(colorimetric)。
适合用于本文中公开的所述夹心的ELISA的人类抗体是本领域已知的。例如，本领域已描述了人类骨髓瘤以及小鼠-人类异种骨髓瘤细胞系用于人类单克隆抗体的生产(Kozbor J.，Immunol.，133：3001，1984；Brodeur等人，“单克隆抗体生产技术以及应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)”，纽约马塞尔德克尔公司(Marcel Dekker，Inc.)，1987，通过引用将其全部内容并入本文中)。在一些方面，所述抗体是从一人类组合抗体库制备的一抗PAR抗体(例如，来自
的
技术)。
为了测定α-syn PFF是否诱导PARP的激活，在将α-syn PFF施用于初级小鼠皮层神经元后，使用一高灵敏度且特异性PAR的单克隆抗体测量PAR水平(图5至图12)。α-syn PFF(1微克/毫升(μg/ml))在3至7天之间诱导PARP激活峰(activation peak)，且保持升高状态长达14天(图5)。伴随PAR升高的是神经元的死亡(通过碘化丙锭(propidium iodide，PI)染色评估)(图6以及7)。用所述PARP抑制剂、ABT-888(维利帕尼(veliparib))(10微摩尔每升(μM))、或AG-014699(鲁卡帕尼(Rucaparib))(1μM)、或BMN 673(他拉唑帕尼(Talazoparib))(10μM)对皮层神经元的治疗防止了所述α-syn PFF介导的PARP激活以及细胞死亡(图6、7以及8)。这些PARP抑制剂还降低了α-syn PFF介导的丝氨酸129(serine 129)上α-syn的磷酸化(p-α-syn)(通过免疫染色评估)(图37以及38)、以及α-syn聚集(通过免疫印迹(immunoblot)分析所示)(图39以及40)，两者均与α-共核蛋白病(α-synucleinopathies)的病理学相关。由于PARP-1在依赖性细胞死亡中起主要作用，因此通过腺相关病毒(adeno associated virus，AAV)转导(携带一反PARP-1导向RNA(guide RNAagainst PARP-1))，使用CRISPR/Cas9从多个皮层神经元删除了PARP-1(图9、10和41)，或使用来自PARP-1基因敲除(knockout)的皮层培养(图11、12、以及42至46)。PARP-1的缺失或基因敲除防止了α-syn PFF介导的PARP激活以及细胞死亡(图9至12、41以及42)。PARP-1的基因敲除还减少了p-α-syn免疫染色以及α-syn聚集(如免疫印迹分析所示)(图43至46)。用广谱(broad spectrum)胱天蛋白酶(caspase)抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)对皮层神经元的治疗部分地降低了α-syn PFF毒性。坏死性凋亡(necroptosis)抑制剂坏死稳定素1(Necrostatin-1，Nec-1)以及细胞自噬(autophagy)抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)没有作用，而所述PARP抑制剂ABT-888防止了α-syn PFF毒性(图47以及48)。由于PARP抑制以及PARP-1的基因敲除减少了病理性α-syn的积累(如p-α-syn免疫染色减少所示)，因此如前所述评估α-syn的细胞间传递。PARP-1的基因敲除减少了所述病理性α-syn的细胞间传递(图49至51)。这些结果一起意味着α-syn PFF主要通过依赖性细胞死亡杀死多个神经元，且PARP-1有助于病理性α-syn的生成。
由于合成的α-syn PFF通过依赖性细胞死亡杀死初级皮层神经元，因此进行多个实验以在所述纹状体内注射α-syn PFF后使用一标准且经验证的方案测定依赖性细胞死亡是否在DA神经元的损失中起作用(图13至18)。一单次纹状体内注射α-syn PFF(5μg)诱导了PARP激活(如通过评估PAR水平来测定)(图13)。纹状体内注射α-syn PFF至PARP-1基因敲除的小鼠无法增加PAR水平(图13)。一单次纹状体内注射α-syn PFF导致WT小鼠注射后6个月DA神经元损失约50％(图14以及15)。相反地，一单次纹状体内注射α-syn PFF至PARP-1基因敲除的小鼠无法诱导DA细胞损失(图14以及15)。还给WT小鼠饲喂一含有所述PARP抑制剂ABT-888(125mg/kg)的饮食，且与给予一对照饮食的小鼠进行比较(图14以及15)。与在所述对照饮食中的小鼠相比，经一纹状体内注射α-syn PFF后且用ABT-888治疗的小鼠的DA神经元损失显著地减少(图14以及15)。ABT-888还减少了α-syn PFF诱导的PAR水平升高的形成(图52)。对α-syn PFF反应的WT小鼠中的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)以及多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)水平也降低(如通过西方墨点法(western blot)分析来测定)，而防止了在PARP-1基因敲除更多或ABT-888治疗的ST小鼠中TH以及DAT水平的降低(图52至54)。伴随DA神经元损失的是纹状体DA及其代谢物的减少，如通过高效液相色谱法(HPLC)在WT小鼠中测定，而不是在PARP-1基因敲除的小鼠或ABT-888治疗的小鼠中(图16、57、58以及59)。一纹状体内α-syn PFF注射导致α-syn病变，如通过西方墨点法(图52、55以及56)以及对WT小鼠DA神经元中的p-α-syn进行免疫染色(图60至63)来评估。α-syn病变在PARP-1基因敲除的小鼠以及ABT-888治疗的WT小鼠中明显地减少，其分别与神经退行性的缺乏以及减少一致。纹状体内注射α-syn PFF引起爬杆测试(pole test)缺陷，爬杆测试是在WT小鼠中多巴胺能功能的一灵敏行为测量，但在PARP-1基因敲除的小鼠或ABT-888治疗的WT小鼠中则没有缺陷(图17以及64)。α-syn PFF注射后，在WT小鼠的前肢加上后肢、以及前肢握力(grip strength)皆降低，但在PARP-1基因敲除或ABT-888治疗的WT小鼠中却没有降低(图18以及65)。综上所述，这些结果表明所述纹状体α-syn PFF诱导的DA神经元损失取决于PARP-1。
由于PAR引起内在无序蛋白的液相分离(liquid demixing)导致其聚集，因此进行了实验以测定PAR是否可以播种(seed)并加速α-syn聚集。重组α-syn在37℃下温育，且在5nM PAR存在以及不存在的情况下搅拌(在脑组织中观察到的浓度)。早在温育4小时时就观察到PAR不存在的情况下的高分子量形式的α-syn，且α-syn随时间继续原纤维化(fibrillize)(图19)。在72小时观察到不同分子量形式的α-syn。在PAR存在的情况下，α-syn的原纤维化明显地加速早在温育24小时时观察到不同分子量形式的α-syn(图19)。硫黄素T荧光(thioflavin T fluorescence)也表明了PAR加速α-syn的原纤维化，而单独的PAR对硫黄素T荧光没有影响(图20)。还评估了温度对PAR介导的α-syn原纤维化加速的影响(图66)。PAR在多个温度下引起α-syn原纤维化，而不许可α-syn原纤维化在PAR不存在的情况下(图66)。使用透射电子显微镜(transmission electron microscopy，TEM)以监测α-syn原纤维的形成。在PAR不存在的情况下，α-syn原纤维在12小时开始形成，且在37℃下搅拌以及温育72小时后完全地形成以及扩展(图3C)。相反地，在PAR存在的情况下，α-syn在12小时大量地原纤维化，且在24以及72小时更大量地原纤维化(图21)。监测在PAR存在的情况下，α-syn原纤维化在36小时的浓度依赖性。1nM PAR能够增强α-syn原纤维化，且在5nM PAR处出现峰聚集，而20nM PAR则没有明显地增加α-syn原纤维化(图67以及68)。由于PAR是一带高负电荷的分子，因此测试了另一带高电荷的聚合物(PolyA)的作用，其对α-syn原纤维化没有影响(图69以及70)。ADP核糖单体也对α-syn原纤维化没有影响(图69以及70)。为了测定内源PAR形成是否能加速α-syn原纤维化，用一有毒剂量的N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)治疗在AAV-α-syn转导后超表达WT人类α-syn的初级小鼠皮层神经元。在WT培养中，NMDA治疗导致PARP激活(如通过PAR免疫印迹评估)以及一伴随的α-syn聚集，而α-syn在用NMDA治疗的PARP-1KO培养中并未聚集(图22)。通过Bioporter外源施用PAR增加了在WT以及PARP-1KO培养(用AAV-α-syn转导)中α-syn的聚集(图71)，表明PAR(而非PARP-1)可以直接地增加α-syn聚集。两种不同的PARP抑制剂(ABT888以及AG014699)防止了对NMDA施用产生反应的α-syn聚集以及PARP激活(图23)。在SH-SY5Y细胞中，有效的PARP激活剂N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine，MNNG)增强了在SH-SY5Y细胞中超表达的WT或A53Tα-syn的聚集，而MNNG在PARP-1KO SH-SY5Y细胞中没有影响(图72以及73)。PAR外源施用增加了在SH-SY5Y WT以及SH-SY5Y PARP-1KO培养中α-syn的聚集(图74)。两种不同的PARP抑制剂(ABT888以及AG014699)防止了对在SH-SY5Y细胞中MNNG施用产生反应的α-syn聚集以及PARP激活(图75)。
为了测定PAR是否改变α-syn PFF的生物物理特性，使用α-syn PFF以及在PAR存在的情况下使用α-syn PFF(PAR-α-syn PFF)进行一系列生化分析。首先，进行α-syn PFF的蛋白酶K(PK)消化，并通过α-syn免疫印迹进行监测。α-syn PFF以及PAR-α-syn PFF在PK消化后显示出非常不同的带型(banding pattern)，其中PAR-α-syn PFF对增加的PK浓度的抵抗力更强(图24)。PAR-α-syn PFF主要示出一α-syn的未消化条带(第一条带)，仅在较高的PK浓度下具有可比较的消化条带，而在较低的PK浓度下(0.5以及1μg/ml)，α-syn PFF降解为多个较小的片段(第二至第五条带)，且这些条带在较高的PK浓度下(1.5至2.5μg/ml)变为主要的(图24)。使用对α-syn的表位特异性抗体，发现PAR使大多数α-syn区对PK消化有抵抗力(图76)。对PAR-α-syn PFF的PK消化的抵抗力意味着PAR诱导形成独特的α-syn PFF类型，比α-syn PFF具有更多的错误折叠以及紧密结构。然后在培养的神经元中比较α-syn PFF以及PAR-α-syn PFF诱导的神经元细胞死亡。治疗14天后，与用α-syn PFF治疗的培养相比，用PAR-α-syn PFF治疗的培养中，细胞死亡增加(图77)。PAR本身即使在较高浓度(20nM)下也不会引起显着的细胞死亡(图77)。为了进一步证实神经病理学的潜能，在不同浓度α-synPFF或PAR-α-syn PFF的治疗后，监测p-α-syn免疫反应性。在20ng PAR-α-syn PFF与在500ngα-syn PFF相当的水平下观察到P-α-syn免疫反应性，意味着α-syn PFF的PAR修饰使毒性增加了25倍(图78以及79)。PAR-α-syn PFF在较高浓度下显着地增加了p-α-syn免疫反应性(图78以及79)。在暴露于α-syn PFF或PAR-α-syn PFF的培养神经元中，还监测了在不同时间点的磷酸-α-syn免疫反应性。在PAR不存在的情况下，α-syn PFF治疗导致治疗后1天几乎无法检测到p-α-syn免疫反应性，而PAR-α-syn PFF治疗则早在治疗后1天导致可检测的p-α-syn免疫反应性水平，且在7天时显着地增强免疫反应性(图25)。α-syn的免疫印迹分析表明，在4天时聚集以及磷酸化的α-syn是可检测的，而在PAR不存在的情况下，这些α-syn种类仅在治疗7天后为可检测的。在PAR存在的情况下，α-syn的聚集形式增加(图26)。
为了测定PAR-α-syn PFF类型在体内是否表现出增强的神经毒性，将一单次纹状体内注射PAR-α-syn PFF(5μg)与α-syn PFF(5μg)进行比较。PAR-α-syn PFF注射后，1个月后SNpc注射侧同侧会有DA神经元损失的趋势，以及在3个月后会有DA神经元的显着损失，而α-syn PFF注射在这些时间点没有影响(图27、28以及80)。PAR-α-syn PFF或α-syn PFF注射后6个月，DA神经元的损失没有显着的差异(图27、28以及80)。在任何时间点，注射侧对侧的DA神经元没有显着的损失(图81以及82)。PAR注射本身对DA神经元数量没有影响(图27、28以及80)。PAR-α-syn PFF也加速了纹状体DA及其代谢物的损失(如通过HPLC测定)，与α-synPFF相比，所述PAR-α-syn PFF注射1个月后观察到DA及其代谢物显着的降低(图29以及83至90)。PAR-α-syn PFF或α-syn PFF注射后3个月以及6个月，DA及其代谢物的损失没有显着的差异(图29以及83至90)。注射后3个月，与α-syn PFF相比，注射PAR-α-syn PFF后的TH以及DAT水平也降低(通过西方墨点法分析测定)，而在6个月时的损失程度没有差异(图91至94)。在注射后3个月以及6个月时，与α-syn PFF相比，α-syn病理学通过注射PAR-α-syn PFF增加了(通过在DA神经元中对p-α-syn的免疫染色评估)(图30以及31)。PAR-α-syn PFF在3个月时引起在所述爬杆测试的缺陷，与在3个月时DA神经元的损失以及DA缺陷一致，而在α-syn PFF或PAR注射的小鼠中没有显着的缺陷(图32以及93)。在3个月时，在PAR-α-syn PFF注射小鼠中的前肢加上后肢、以及前肢握力皆降低，但在α-syn PFF或PAR注射小鼠中却没有降低(图33以及94)。在6个月时，通过PAR-α-syn PFF或α-syn PFF诱导的所述行为缺陷没有显着的差异(图32、33、92以及94)。综上所述，这些结果表明PAR-α-syn PFF在体内比α-syn PFF更具神经毒性。
为了测定PAR是否在多个患有PD的患者中起作用，使用对PAR灵敏的ELISA(图95)监测在多个患有PD的患者与多个对照组的所述CSF中的PAR水平(表1)。与两个独立患者群中的多个对照组相比，在多个PD患者中的PAR水平升高(图34以及35)。如先前报道的，与多个对照组相比，多个患有PD的患者的所述黑质中的PAR水平升高(图96以及97、以及表2)。PAR免疫反应性与在多个PD患者的多个路易体中的α-syn共定位(图36)。
所述结果表明，在指定为依赖性细胞死亡的一细胞死亡过程中，α-syn PFF通过PARP-1激活而在体外以及体内杀死神经元。PARP-1的基因敲除以及PARP的抑制防止了通过纹状体内α-syn PFF注射引发的所述神经退行性以及行为缺陷。依赖性细胞死亡的激活似乎是α-syn PFF神经退行性的主要驱动力，因为坏死性凋亡以及细胞自噬抑制剂对α-synPFF神经毒性没有影响，且胱天蛋白酶抑制作用仅有适度的保护作用。众所周知，α-syn PFF诱导炎症介质激活，其可能在一定程度上导致细胞死亡，并说明了广谱胱天蛋白酶抑制剂(ZVAD)的适度神经保护作用。
最近的研究已经鉴定了表现不同神经毒性、播种能力以及增殖的α-syn类型的构象(conformational)变体，其导致α-共核蛋白病的不同性质。考虑到α-syn PFF诱导PARP激活以及PAR积累，PAR接着加速α-syn PFF的原纤维化以及改变α-syn PFF的生化特性，使其转化为一毒性更高的类型。与此观点一致的是，与亲本(parental)α-syn PFF相比，观察到PAR-α-syn PFF显示α-syn聚集以及神经毒性增加约25倍。此外，与α-syn PFF注射的小鼠相比，PAR-α-syn PFF注射的小鼠显示一加速的疾病进展以及表型。除了在培养的神经元以及小鼠脑中正在增加的PAR水平外，还观察到PD中的PAR水平不只在所述黑质中升高，也在所述CSF中升高。PD患者的所述CSF以及脑中的PAR升高以及PD患者的所述黑质中的PARP激活的证据意味着，PARP激活通过依赖性细胞死亡以将α-syn转化为一毒性更高的类型而导致PD的发病。
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实例
动物
C57BL/6小鼠获自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(缅因州巴港(BarHarbor，ME))。PARP-1KO小鼠获自杰克逊实验室(美国缅因州巴港)。WT以及PARP1 KO小鼠的多个同窝出生仔畜(littermate)用于实验中。所有的饲养、繁殖以及程序均根据美国国家卫生研究院的实验动物的管理和使用指南(NIH Guide for the Care and Use ofExperimental Animals)进行，且经约翰霍普金斯大学动物管理和使用委员会(JohnHopkins University Animal Care and Use Committee)批准。
α-syn PFF以及PAR-α-syn PFF的制备
纯化重组小鼠α-syn蛋白。用一热混合器(在37℃下1,000每分钟转速(rpm))通过不断搅拌α-syn，在PBS中制备α-syn PFF(离心管(Eppendorf))。温育7天后，将α-syn聚集体(aggregate)用PBS稀释至0.1mg/ml，并以10％振幅超声处理30秒(0.5秒脉冲开/关)(布兰森数位超声波仪(Branson Digital Sonifier)，美国康涅狄格州丹伯里(Danbury，CT，USA))。将所述α-syn PFF在使用前保持在-80℃。如其他地方所述进行PAR聚合物的合成以及纯化。通过在α-syn原纤维化反应中加入5nM或指示剂量的PAR来制备PAR-α-syn PFF。
立体定位(stereotaxic)注射α-syn PFF
用氯胺酮(ketamine)(100mg/kg)以及甲苯噻嗪(xylazine)(10mg/kg)的一混合物深度麻醉2至3个月大的WT以及PARP1 KO小鼠。将PBS、α-syn PFF、PAR-α-syn PFF或PAR单侧注射至纹状体中(每半球2μl，0.4μl/min)，坐标如下：前后位(anteroposterior，AP)＝+2.0毫米(mm)，中间外侧(mediolateral，ML)＝±2.0mm，背腹侧(dorsoventral，DV)＝+2.8mm(距前囟(bregma))。注射后，将针头再保持5分钟以完全吸收溶液。手术后，对动物进行监测并提供术后管理。注射后1、3以及6个月进行行为测试，并对小鼠实施安乐死以进行生化以及组织学分析。为了进行生化研究，立即解剖组织并将其冷冻在-80℃下。为了进行组织学研究，给小鼠灌注PBS以及4％PFA，并取出大脑，然后在4％PFA中固定过夜，然后转移至30％蔗糖中进行冷冻保护。
硫黄素T(thioflavin T，ThT)结合试验
用ThT荧光监测有或没有PAR的α-syn原纤维化。在不同时间点从温育混合物中提取5μL等分试样(aliquot)，用25μM ThT(PBS中)稀释至100μL，并在室温下温育10分钟。使用SpectraMax盘式分析仪(加利福尼亚州森尼维尔分子仪器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA))在450nm激发以及510nm发射下记录荧光。实验以三重复(triplicate)进行。
透射电子显微镜(TEM)测量
将α-syn PFF或PAR-α-syn PFF吸附至辉光放电400目碳涂覆的铜栅格(glowdischarged 400meshed carbon coated copper grid)(电子显微镜科学(ElectronMicroscopy Sciences))2分钟，用Tris-HCl(50mM，pH 7.4)快速洗涤两次，以及漂浮在两滴0.75％甲酸铀酰(uranyl formate)上(每次30秒)。使格栅干燥，然后在以80kV操作的一菲利普斯(Phillips)CM 120TEM上成像。捕获图像，并通过先进的显微镜技术用一ER-80CCD(8百万像素)数字化。
PAR的细胞内递送
根据制造商的操作指南，使用BioPORTER(根兰蒂斯(Genelnatis)，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego，CA))在细胞内递送纯化的PAR。用PBS将PAR聚合物稀释至所需浓度。将稀释的溶液添加至干燥的BioPORTER试剂中并温和地混合，然后在室温下温育5分钟。在无血清培养基中洗涤后，将所述BioPORTER-PAR复合物添加至细胞培养中，并在37℃下温育3至4小时。随后将培养物用于实验。
组织裂解液制备以及西方墨点法分析
将人类死后的脑(表1)或小鼠脑组织均质化并在裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、1％Triton x-100、0.5％SDS、0.5％脱氧胆酸钠(sodium-deoxycholate)、磷酸酶抑制剂混合物I和II(西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯)、以及完整的蛋白酶抑制剂混合物(罗氏(Roche)，美国印第安纳州印第安纳波利斯))中使用一Diax 900均质器(西格玛奥瑞奇)制备。匀质后，将样品在4℃下旋转30分钟以完全裂解，将匀浆以15,000g离心20分钟，并将上清液用于进一步分析。使用BCA试验(皮尔斯(Pierce)，美国伊利诺伊州罗克福德)对蛋白水平进行定量，使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离样品并将其转移至硝化纤维素膜上。将膜用5％脱脂牛奶(在TBS-T中(含0.1％Tween-20的Tris缓冲盐水))阻断(block)1小时，使用初级抗体(表3)进行探测(probe)，并与适当的HRP结合的二级抗体温育。通过ECL底物使条带可视化。
表1图34中使用的对照组以及PD CSF的临床信息
细胞培养、转染、初级神经元培养以及治疗
SH-SY5Y细胞(ATCC)在含有10％胎牛血清以及青霉素/链霉素的DMEM中于37℃在5％CO2下培养。根据制造商的操作指南，使用PolyFect试剂(凯杰(Qiagen))转染细胞。从WT或PARP1 KO胚胎制备初级皮层神经元。简言之，在胚胎第16天，在补充有B-27、0.5mM L-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素(英杰(Invitrogen)，纽约州格兰德岛)的神经基础培养基中培养所述初级皮层神经元。每3至4天将所述神经元更换至新鲜培养基。ABT-888(10μM)、AG-014699(1μM)、BMN 673(10μM)、Z-VAD(20μM)、Nec-1(20μM)或3-MA(500μM)在α-syn PFF治疗前1小时预处理为神经元。在体外(DIV)第7天时添加α-syn PFF，并进一步温育指示的时间，然后进行细胞死亡试验或生化实验。初级神经元在DIV 4-5感染了AAV2-对照sgRNA或AAV2-PARP1 sgRNA(维根生物科学(ViGene Bioscineces)，美国马里兰州洛克维尔)、以及AAV-α-syn WT或AAV-α-syn A53T
细胞死亡评估
用α-syn PFF或PAR-α-syn PFF治疗初级培养的皮层神经元14天。通过用7μMHoechst 33342以及2μM碘化丙锭(PI)(英杰(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴斯)染色来测定细胞死亡的百分比。用配备有自动计算机辅助软件的蔡司显微镜(Axiovision 4.6，卡尔蔡司(Carl Zeiss)，美国加利福尼亚州都柏林)拍摄图像以及计数。
微流体室
三隔室微流体装置(TCND1000)获自克索纳微流体公司(Xona Microfluidic，LLC)(美国加利福尼亚州特曼库拉)。在将玻璃盖玻片固定至所述微流体装置之前，对其进行制备以及涂覆。每个室分别接种约100,000个WT或PARP1 KO神经元。在7DIV时，将0.5mgα-synPFF添加至室1中。为了控制流动方向，在室1与室2以及室2与室3之间保持50μl的培养基体积差异。在α-syn PFF治疗后第14天，使用4％多聚甲醛(paraformaldehyde)(PBS中)固定神经元。然后处理多个室以用p-α-syn抗体进行免疫荧光染色。
行为测试
在α-syn PFF注射的WT或PARP-1KO小鼠、α-syn PFF注射的小鼠饲喂ABT-888、以及α-syn PFF或PAR-α-syn PFF注射的小鼠中通过爬杆测试(pole test)以及握力(gripstrength)测试评估处死前1周的行为缺陷。所有实验均以盲模式进行。
爬杆测试。一金属棒(长75厘米(cm)，直径9mm)用绷带纱布包裹用作所述杆。在实际测试之前，对小鼠进行连续两天的训练，且每次训练包括三个测试试验。将小鼠放在距所述杆的顶部7.5cm处，并记录转身时间以及到达所述杆的底座的总时间。测试结束是定义为将所有4个爪子放在底座上。停止所述测试以及记录的最大截止时间为60秒。每次试验后，用70％乙醇清洁迷宫。
握力测试。通过使用一设备(拜尔赛伯(Bioseb)，美国)测定所述小鼠产生的最大峰值力来测量神经肌肉功能。将小鼠放在一金属栅格上，用前肢或双肢抓住，分别记录为“前肢”以及“前肢和后肢”。温和地拉住尾巴，并在所述小鼠失去抓力之前将施加在所述栅格上的力记录为以克(g)表示的峰值张力。
使用HPLC的多巴胺以及衍生物测量
通过有电化学检测的高效液相色谱法(HPLC-ECD)测量生物胺(biogenic amine)浓度。将纹状体迅速地从脑中取出，称重并在冰冷的0.01mM高氯酸(含0.01％EDTA)中超声处理。60ng 3,4-二羟基苄胺(3,4-dihydroxybenzylamine，DHBA)用作一内标。在4℃下以15,000g离心30分钟后，使用一0.2μm过滤器清洁上清液，以及20μl上清液通过一双通道coulochem III电化学检测器(型号5300，美国麻萨诸塞州切姆斯福德ESA公司)的HPLC柱(3mm×150mm，C-18反相柱，AcclaimTM Polar Advantage II，赛默飞世尔(ThermoScientific)，美国)分析。使用BCA蛋白试验试剂盒(皮尔斯，美国伊利诺伊州罗克福德)测量组织匀浆的蛋白浓度。将数据标准化为蛋白浓度并以ng/mg蛋白表示。
免疫组织化学以及免疫荧光
给小鼠灌注PBS以及4％PFA，并取出脑，然后在4％PFA中固定过夜，并转移至30％蔗糖进行冷冻保护。在40μm厚的连续脑切片上进行免疫组织化学(IHC)以及免疫荧光(IF)。初级抗体以及工作稀释度详见表2。为进行组织学研究，用10％山羊血清(PBS中)含0.2％Triton X-100阻断自由漂浮的切片，并分别与TH或p-α-syn抗体温育，然后与生物素结合的抗兔或小鼠抗体温育。洗涤3次后，添加ABC试剂(飞克特实验室(Vector Laboratories)，美国加利福尼亚州)，并使用SigmaFast DAB过氧化物酶底物(西格玛奥瑞奇(Sigma-Aldrich))对切片进行显影。将切片用尼氏(Nissl)(0.09％硫蛋白)复染。为了进行定量，来自SNpc区的TH阳性以及尼氏阳性的DA神经元通过光学分馏器(无偏(unbiased)细胞计数方法)，使用一计算机辅助图像分析系统(由一Axiophot显微镜(卡尔蔡司(Carl Zeiss))组成，配备有一计算机控制的电动载物台(路德电子(Ludl Electronics)，美国纽约州霍桑市)、一日立HV C20相机、以及立体声调查器软件(Stereo Investigator software)(微明亮领域(MicroBright-Field)，美国佛蒙特州威利斯顿)进行计数。分析TH染色的神经元以及尼氏计数的总数。为了进行免疫荧光研究，将有TH以及和p-α-syn抗体的双标记切片与Alexa-fluor 488以及594结合的二次抗体(英杰(Invitrogen)，美国加利福尼亚州卡尔斯巴斯)的一混合物温育。通过共聚焦扫描显微镜(LSM710，卡尔蔡司(Carl Zeiss))获得荧光图像。所有图像均通过Zen软件(卡尔蔡司(Carl Zeiss))处理。使用ImageJ软件测量阈值信号强度范围内的选定区域。
表2图35使用的对照组以及PD CSF的临床信息
α-syn PFF的PK消化
进行PK消化。将10微克的α-syn PFF或PAR-α-syn PFF与0.5至2.5μg/ml的PK(PBS中)混合，并在37℃下温育30分钟。通过添加1mM PMSF终止反应，将其与SDS样品缓冲液一起煮沸5分钟。使用表位特异性的α-syn抗体(表3)通过免疫印迹检测PK消化产物的条带。
表3本研究中测试的一些抗体列表
人类临床试验
人脑CSF样品以及PAR ELISA
在约翰霍普金斯大学站点的NINDS帕金森氏症生物标记物计划(Parkinson’sDisease Biomarker Program，PDBP)的多个参与者每年接受大量的临床与认知测试以及一腰椎穿刺。将所述CSF离心、等分、并在采集后1小时内保存在-80℃下。单克隆抗PAR抗体的两个不同克隆(#19以及#25)用于PAR ELISA。将抗PAR抗体(捕获抗体，克隆#19)(5μg/ml)涂覆在一96孔微量滴定板(NUNC，Cat#46051)上，各种浓度的纯化PAR(0至200nM，阳性对照组)以及将来自正常或PD患者的多个CSF样品添加至每个孔中，并在室温(RT)下温育1小时。用PBST(0.05％Tween20在PBS缓冲液中)洗涤所述板5次后，将生物素化PAR抗体(检测抗体，克隆#25)在室温下温育1小时。通过HRP结合的链霉亲和素抗体(Thermo Scientific)检测颜色变化。所述试验可以检测到低至3pM的PAR，并在50nM时达到饱和。
临床痴呆评分(clinical dementia rating)
临床痴呆评分(CDR)量表是一五点量表，用于评估适用于患有神经退行性以及痴呆的患者的六个不同方面的认知与功能表现。参见Hughes CP、Berg L、Danziger WL、CobenLA、Martin RL的“痴呆分期的新临床量表(A New Clinical Scale for the Staging ofDementia)”(英國精神病學雜誌(Br J Psychiatry)，1982，140：566-72)，通过引用将其教示内容并入本文中。所述六个方面是记忆、方向、判断和解决问题、社区事务、家庭和爱好、以及个人护理。所有患者使用所述CDR量表以及一个人访谈进行评估，以测定他们是否具有正常的认知、轻度的认知障碍、或痴呆。
使用学生t检验(student’s t-test)比较对照组与患有PD个体之间、以及具有正常的认知与认知障碍者之间PAR的浓度。然后，一广义线性模型评估PAR浓度变化的决定因素以及PAR浓度是否与认知变化有关。
人类组合抗体库
所述
抗体的产生过程始于使用一共价偶联至磁珠的抗原(PAR)的固定化。随后将它们与所述
库一起温育，其中非特异性抗体被洗掉(wash out)，而特异性抗体噬菌体被洗脱(elute)。大肠杆菌(E.coli)培养物受到特异性抗体-噬菌体的感染，以生成一丰富的抗体库，用于下一轮噬菌体筛选。回收这些富集的抗体相的DNA，并将其亚克隆至多个Fab表达载体中，然后接种至E.coli菌落中以产生多个Fab片段。此后进行菌落挑选、初步筛选，其中所述多个菌落在一384微孔板中生长。裂解所述培养物后诱导并收集抗体表达。用所述末端标记的PAR抗原通过ELISA筛选这些培养物。然后对来自所述初次筛选的阳性结果进行测序，以鉴定独特的抗体，将其存储以备将来合成的可重复性。进行二次筛选以选择PAR单体结合抗体。最后，通过亲和层析进行表达以及纯化以获得抗体克隆。
夹心ELISA
将抗PAR抗体(捕获抗体，克隆#19)(5μg/ml)涂覆在一96孔微量滴定板(NUNC，Cat#46051)上。将来自正常或PD患者的不同浓度的纯化PAR(0至200nM，阳性对照组)以及多个CSF样品添加至每个孔中，并在室温(RT)下温育1小时。用PBST(0.05％Tween20在PBS缓冲液中)洗涤所述板5次后，将生物素化PAR抗体(检测抗体，克隆#25)在RT下温育1小时。通过HRP结合的链霉亲和素抗体检测颜色变化。所述试验检测到低至3pM的PAR浓度，并在50nM时达到饱和。
结果
110个个体在起点时捐赠CSF(80个PD，30个对照组)，94个个体在第一次随访时捐赠CSF(68个PD，26个对照组)，71个个体在第二次随访时捐赠CSF(51个PD，20个对照组)，以及36个个体在第三次随访时捐赠CSF(28个PD，8个对照组)。在基线时，PD和对照组的平均年龄约为66岁(p＝0.71)，且PD患者中67％为男性，而对照组中37％为男性(p<0.01)。PD的平均持续时间为6.7年。在前三次访视中，患有PD的个体与对照组之间的PAR平均浓度存在差异，在第四次访视中有一差异趋势(访视1：PD平均值112.13，对照组平均值87.99，p＝0.04；访视2：PD平均值145.49，对照组平均值110.63，p＝0.04；访视3：PD平均值132.29，对照组平均值86.06，p＝0.01；访视4：PD平均值151.88，对照组平均值111.07，p＝0.08)。
即使在控制年龄、性别、MDS-UPDRS运动评分、左旋多巴等效剂量、以及认知障碍后，疾病状态仍是PAR浓度的一重要预测指标(p<0.01)(见图3以及4)。在访视2以及访视4的PAR浓度与在访视1的PAR浓度有显着差异(p<0.01，p＝0.01)。仅在PD参与者中，PAR浓度(p＝0.03)以及MDS-UPDRS运动评分(p<0.01)是认知下降的重要预测指标。
统计分析
所有数据均以至少进行3次独立实验的平均值±s.e.m.表示。使用GraphPadPrism进行统计分析。分别通过不配对的两尾(unpaired two-tailed)学生t检验以及ANOVA、然后杜凯氏的事后检验(Tukey’s post hoc test)来评估2个平均值以及多个平均值之间的差异。显着性是评估为*P<0.05、**P<0.005、以及***P<0.001。
总的来说，PD患者与对照组患者之间的PAR浓度存在一显着差异。在随后的样本收集访视中，患者之间的PAR浓度也存在一显着差异。
Claims (28)
1.一种用于测定脑脊液中的一聚(ADP-核糖)浓度的方法，其特征在于：所述方法包括：
从一患者收集一脑脊液样品；以及
对所述脑脊液样品进行一聚(ADP-核糖)夹心的酶联免疫吸附法，从而测定所述脑脊液中的所述聚(ADP-核糖)浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括：将所述脑脊液样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品进行比较。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述夹心的酶联免疫吸附法包括至少一捕获抗体以及一检测抗体，且所述捕获抗体、所述检测抗体或两者为一抗聚(ADP-核糖)单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述捕获抗体附着至一固体支持物。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述抗聚(ADP-核糖)单克隆抗体是真正完全人类的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：将所述脑脊液样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品进行比较是通过比色测定法来完成。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测抗体与生物素结合。
8.一种用于测定一帕金森氏症药物治疗的治疗功效的方法，其特征在于：所述方法包括：
从接受至少一种帕金森氏症药物治疗的一患者收集一脑脊液样品；
测量所述脑脊液样品中的一聚(ADP-核糖)浓度；以及
将所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品中的一聚(ADP-核糖)浓度进行比较。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述对照样品是在一较早的时间段从所述患者收集的一脑脊液样品。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述对照样品是从一健康供体收集的一脑脊液样品。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于：
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度高于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述药物治疗对所述患者无效；以及
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度等于或低于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述药物治疗对所述患者有效。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述药物治疗是向所述患者施用一种或多种药物、对所述患者进行手术，或其组合。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于：通过所述夹心的酶联免疫吸附法测量所述脑脊液样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度。
14.一种用于监测一帕金森氏症患者的疾病进展的方法，其特征在于：所述方法包括：
从接受至少一种帕金森氏症药物治疗的一患者收集一脑脊液样品；
测量所述脑脊液样品中的一聚(ADP-核糖)浓度；以及
将所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品中的一聚(ADP-核糖)浓度进行比较。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述对照样品是在一较早的时间段从所述患者收集的一脑脊液样品。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述对照样品是从一健康供体收集的一脑脊液样品。
17.如权利要求15或16所述的方法，其特征在于：
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度高于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述药物治疗对所述患者无效；以及
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度等于或低于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述药物治疗对所述患者有效。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述药物治疗是向所述患者施用一种或多种药品、对所述患者进行手术，或其组合。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于：通过所述夹心的酶联免疫吸附法测量所述脑脊液样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度。
20.一种诊断一帕金森氏症患者的方法，其特征在于：所述方法包括：
从一患者收集一脑脊液样品，
测量所述脑脊液样品中的一聚(ADP-核糖)浓度；以及
将所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品中的一聚(ADP-核糖)浓度进行比较。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述对照样品是在一较早的时间段从所述患者收集的一脑脊液样品。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于：所述对照样品是从一健康供体收集的一脑脊液样品。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于：
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度高于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述患者处于发生帕金森氏症的高风险或患有帕金森氏症；以及
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度等于或低于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述患者未处于发生帕金森氏症的风险或未患有帕金森氏症。
24.一种用于帕金森氏症的治疗方法，其特征在于：所述方法包括：
从接受至少一种帕金森氏症药物治疗的一患者收集一脑脊液样品，
测量所述脑脊液样品中的一聚(ADP-核糖)浓度；以及
将所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度与至少一个对照样品中的一聚(ADP-核糖)浓度进行比较。
25.如权利要求24所述的治疗方法，其特征在于：所述对照样品是在一较早的时间段从所述患者收集的一脑脊液样品。
26.如权利要求24所述的治疗方法，其特征在于：所述对照样品是从一健康供体收集的一脑脊液样品。
27.如权利要求25或26所述的治疗方法，其特征在于：
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度高于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述方法还包括：改变所述患者接受的至少一种药物治疗；以及
如果所述患者中的所述聚(ADP-核糖)浓度等于或低于所述对照样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度，则所述方法还包括：未改变所述患者接受的所述药物治疗。
28.如权利要求24所述的方法，其特征在于：通过所述夹心的酶联免疫吸附法测量所述脑脊液样品中的所述聚(ADP-核糖)浓度。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113533725A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-22 | 上海市肺科医院 | 一种肺动脉高压的发病风险和预后标记物及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070292883A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-20 | Ossovskaya Valeria S | Method of treating diseases with PARP inhibitors |
| WO2009152607A1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-12-23 | Ottawa Hospital Research Institute | Methods and kits for diagnosing neurodegenerative disease |
| CN101661032A (zh) * | 2008-08-29 | 2010-03-03 | 生物远景技术有限公司 | 帕金森病的生物标志物 |
| US20130022982A1 (en) * | 2009-09-14 | 2013-01-24 | Kevin Ka-Wang Wang | Micro-rna, autoantibody and protein markers for diagnosis of neuronal injury |
| US20170000836A1 (en) * | 2013-05-22 | 2017-01-05 | Sirbal Ltd. | Prognostic and Diagnostic Methods and Herbal Therapies for Treating Skin Conditions, Autoimmune Diseases, Inflammatory Ailments and Cancer |
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2018
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070292883A1 (en) * | 2006-06-12 | 2007-12-20 | Ossovskaya Valeria S | Method of treating diseases with PARP inhibitors |
| WO2009152607A1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-12-23 | Ottawa Hospital Research Institute | Methods and kits for diagnosing neurodegenerative disease |
| CN101661032A (zh) * | 2008-08-29 | 2010-03-03 | 生物远景技术有限公司 | 帕金森病的生物标志物 |
| US20130022982A1 (en) * | 2009-09-14 | 2013-01-24 | Kevin Ka-Wang Wang | Micro-rna, autoantibody and protein markers for diagnosis of neuronal injury |
| US20170000836A1 (en) * | 2013-05-22 | 2017-01-05 | Sirbal Ltd. | Prognostic and Diagnostic Methods and Herbal Therapies for Treating Skin Conditions, Autoimmune Diseases, Inflammatory Ailments and Cancer |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| AJIT A. SARNAIK ET.AL: "Influence of PARP-1 Polymorphisms in Patients after Traumatic Brain Injury" * |
| CHIERI IDA ET.AL: "An enzyme-linked immunosorbent assay-based system for determining the physiological level of poly(ADP-ribose) in cultured cells" * |
| ERICKA L FINK ET.AL: "Quantification of poly(ADP-ribose)-modified proteins in cerebrospinal fluid from infants and children after traumatic brain injury" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113533725A (zh) * | 2021-06-23 | 2021-10-22 | 上海市肺科医院 | 一种肺动脉高压的发病风险和预后标记物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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