CN115403553A - 一种抗抑郁和抗焦虑的取代桂皮酰胺化合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种抗抑郁和抗焦虑的取代桂皮酰胺化合物，即化合物M2，本申请还提供了含有化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐的药物组合物，以及抗抑郁、抗焦虑或抗抑郁和抗焦虑的应用。
Figure DDA0003659551740000011

Description

一种抗抑郁和抗焦虑的取代桂皮酰胺化合物
技术领域
本申请涉及但不限于一种药物化合物，特别涉及一种抗抑郁和抗焦虑的取代桂皮酰胺类新化合物。
背景技术
抑郁症和焦虑症是危害人类精神健康的主要疾病，随着现代生活节奏的加快，发病人群逐年扩大。最近，据统计，在我国各型抑郁症的发病人群达到2600万，其中青少年占了较大的比例。因此，研发抗抑郁、抗焦虑药物具有重要的经济和社会效益。
大量的研究提示，中枢单胺类神经递质、多巴胺、胆碱能的变化和相应受体功能的改变及神经内分泌功能失调可能对本病的发生发展起重要作用。至此，治疗原则应该侧重于调整下丘脑单胺类神经递质含量及其受体功能和恢复正常的神经内分泌。
当前，抑郁症和焦虑症的主要治疗手段仍为服用药物。目前，临床上抗抑郁和抗焦虑药物主要有三环类、苯二氮
Figure BDA0003659551720000011
类、5-羟色胺再摄取抑制剂、单胺氧化酶抑制剂等化学药物，虽然对抑郁症和焦虑症具有一定的治疗作用，但是也存在着毒副作用较大的弊端：单胺氧化酶抑制剂由于选择性以及对酶的不可逆性抑制导致中毒性肝损害，存在一定毒副作用。三环类常用药物有多塞平、阿米替平、氯米帕明等，尽管此类药物对内因性抑郁效果较好，尤其是情绪低落、兴趣减退、悲观厌世可获80％以上的疗效，但由于对心脏的毒性大，不良反应也较多。选择性5-HT再摄取抑制剂(SSRI)是20世纪80年代末出现的新型抗抑郁、抗焦虑药物，由于在保持经典抗抑郁抗焦虑的同时显著减少其他受体所出现的不良反应，目前已成为欧美国家常用的一线药物。常用药物有氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、氟伏沙明等。由于经胃肠吸收，肝脏代谢，仍存在胃肠功能紊乱，部分也有性功能障碍，在一定程度上影响了治疗的长期应用。且传统抗抑郁、抗焦虑药物起效缓慢(6～8周以上)，并且只在30％左右的病人中起效。因此，在重度抑郁症治疗领域，对起效更快的药物(特别是在有自杀倾向的患者中)，能具有较好的疗效和较小的毒副作用、具有新作用机制的药物有着迫切的医疗需求。
中国专利CN102850317A(申请号201210123842.7，以下简称专利A)和CN103687850A(申请号201280020049.2，以下简称专利B)公开了一种取代桂皮酰胺衍生物、制备方法及其治疗和预防抑郁型精神疾病药物中的应用。并公开了13个具体化合物I-1～I-13。在该专利中，通过小鼠悬尾法“获得性绝望”抑郁模型实验、抗利血平眼睑下垂抑郁模型实验、小鼠强迫游泳实验，证实了该系列化合物中I-5、I-9、I-10、I-11、I-12和I-13以10mg/kg剂量给药7天均能明显缩短小鼠悬尾不动时间；化合物I-4、I-5、I-10、I-11、I-12和I-13以10mg/kg剂量连续给药7天后具有显著拮抗利血平所致的小鼠体温下降、运动不能和改善闭眼程度的作用，表明对5-HT、NE和DA的重摄取均有一定调节作用；化合物I-5、I-10和I-13均能明显缩短小鼠强迫游泳不动时间，I-5对小鼠强迫游泳不动时间的影响呈现一定的剂量依赖性。其中效果最好的I-5目前已处于临床研究阶段。
中国专利CN107011313A(申请号201710038281.3，以下简称专利C)公开了一种取代桂皮酰胺衍生物在抗焦虑方面的应用。其中一共公开了17个具体化合物：II-3(专利A、B中的化合物I-3)、II-4(专利A、B中的化合物I-4)、II-5(专利A、B中的化合物I-5)、II-10(专利A、B中的化合物I-10)、II-11(专利A、B中的化合物I-11)、II-12(专利A、B中的化合物I-12)、II-13、II-14、II-15、II-16，III-2、III-4、III-7、III-9、III-10、III-11、III-13。在该专利中，通过小鼠高架十字迷宫实验证明，以10mg/kg的剂量，17种化合物给药7天，能在不同程度上增加高架十字迷宫试验中小鼠进入开臂的次数，并延长小鼠在开臂停留的时间；通过大鼠饮水冲突实验证明，以5mg/kg的剂量，17种化合物给药10天均能在不同程度上增加大鼠惩罚期的饮水次数。
发明概述
本申请对上述专利中的许多化合物进行了研究，发现虽然多数化合物疗效优良，但生物利用度偏低，起效较慢。
第一方面，本申请提供了一种起效更快、生物利用度更高的抗抑郁及抗焦虑的取代桂皮酰胺化合物，或其溶剂化物、或药学上接受的盐，所述取代桂皮酰胺化合物的结构式如下式所示：
Figure BDA0003659551720000031
第二方面，本申请提供了一种含有上述取代桂皮酰胺化合物或其溶剂化物、或其药学上接受的盐的药物组合物。
第三方面，本申请提供了一种上述取代桂皮酰胺化合物的制备方法。
第四方面，本申请提供了上述取代桂皮酰胺化合物在制备抗抑郁、抗焦虑、或抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用。
第五方面，本申请提供了上述化合物与一种或多种另外的抗抑郁药或抗焦虑药相组合在制备抗抑郁、抗焦虑、或抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用。
附图概述
图1表示的是化合物M2具有抗抑郁样作用：给药24h后，化合物M2显著降低小鼠的不动时间，呈明显的剂量效应，并在给药剂量为30mg/kg时，有显著性作用。
图2表示的是化合物M2对前额叶的兴奋性突触传递的影响：图示化合物M2浓度为10nM，10μM，150μM时对前额叶PrL脑区的锥体神经元的sEPSC的影响，上图示sEPSC波形示意图，下图为数据统计后的柱状图。
图3表示的是化合物M2增强前额叶的兴奋性突触传递：在多种浓度下，化合物M2增加前额叶PrL脑区的sEPSC发放频率，且呈明显的浓度依赖性；但是对sEPSC发放幅度影响不明显，其中150μM化合物M2可显著增强sEPSC的发放频率。
图4表示的是多巴胺D2R受体拮抗剂Sulpride阻断化合物M2对前额叶sEPSC的增强效应：D2R拮抗剂sulpride在10μM工作浓度下可以阻断D2R受体，结果显示阻断D2R可以阻断150μM化合物M2对sEPSC发放频率的增强作用。
图5表示的是多巴胺D1R受体拮抗剂SCH23390阻断化合物M2对前额叶sEPSC的增强效应：D1R受体拮抗剂SCH23390在10μM工作浓度下可以阻断D1R受体，结果显示阻断D1R可以阻断150μM化合物M2对sEPSC发放频率的增强作用。
图6表示的是化合物M2激活mTOR相关信号通路：a图示单次给药后30min的前额叶相关信号蛋白的变化；b图示单次给药后24h的前额叶相关信号蛋白的变化。
图7表示的是化合物I-5及M2对大鼠脑突触体摄取DA、5-HT、NA的抑制作用(IC50)。
图8表示的是大鼠灌胃及静脉化合物M2后平均药时曲线图。
图9表示的是大鼠灌胃及静脉化合物I-5后平均药时曲线图。
详述
在第一方面的实施方案中，本申请提供一种取代桂皮酰胺化合物，所述取代桂皮酰胺化合物的结构式如下式所示：
Figure BDA0003659551720000041
Figure BDA0003659551720000051
进一步地，本申请的取代桂皮酰胺化合物还可以溶剂化物的形式存在。
进一步地，本申请的取代桂皮酰胺化合物还可以药学上可接受的盐形式存在。
在第二方面的实施方案中，本申请提供了一种含有本申请取代桂皮酰胺化合物或其溶剂化物、或药学上接受的盐的药物组合物。
本申请的药物组合物，可以是任何可服用的药物形式：如：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂。
本申请的药物组合物，优选地是单位剂量的药物制剂形式。
本申请的药物组合物，在制成药剂时，单位剂量的药剂可含有本申请的药物活性物质0.1-1000mg，其余为药学上可接受的载体。药学上可接受的载体以重量计可以是制剂总重量的0.01-99.99％。
本申请的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，如一日1-3次。一次1-10片等。
优选地，本申请的药物组合物为口服制剂或注射剂。
其中，所述口服制剂选自胶囊剂、片剂、滴丸、颗粒剂、浓缩丸、口服液和合剂中的一种。
其中，所述注射剂选自注射液、冻干粉针剂和水针剂中的一种。
本申请的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂或湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖或其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或淀粉衍生物，优选羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂为硬脂酸镁。适宜的湿润剂为十二烷基硫酸钠。
本申请的药物组合物可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的组合物中。
口服液体制剂的形式可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，也可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本申请的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本申请的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自如下的一种或几种：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β－环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本申请所述的药物组合物，除含有本申请取代桂皮酰胺化合物外，还可以包括以下预防和治疗精神疾病药物中的一种或几种：如萘法唑酮、舒必利、阿普唑仑、罗拉、丁螺环酮、坦度螺酮、哌甲酯、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、来士普、氟伏沙明、瑞波西汀、文拉法辛、三氟噻吨、四甲蒽丙胺和路忧泰等。
在第三方面的实施方案中，本申请提供了一种本申请取代桂皮酰胺化合物的制备方法，所述取代桂皮酰胺化合物也称为化合物M2，所述的制备方法为：
Figure BDA0003659551720000071
(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(即中间体A)与NH3反应，得到化合物M2。
在第三方面的一些实施方案中，本申请提供的制备方法，其中，NH3可以是氨水(NH3-H2O)。
在第三方面的一些实施方案中，本申请提供的制备方法，其中，所述的反应是在有机溶剂中进行的，所述的有机溶剂包括二氯甲烷(DCM)。
在第三方面的一些实施方案中，本申请提供的制备方法，其中，(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(即中间体A)可以与酰氯化试剂例如草酰氯或二氯亚砜进行活化，然后再与NH3反应，得到化合物M2。
在第三方面的一些实施方案中，本申请提供的制备方法，可通过如下反应路线进行制备：
Figure BDA0003659551720000072
其中的反应原料为(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸，该原料可以从市场上购买得到，也可以根据现有技术文献中的方法制备得到。
本申请取代桂皮酰胺化合物可以通过以下方法制备：
将(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(中间体A)溶于二氯甲烷中，加入催化量N,N-二甲基甲酰胺，冰浴下滴加草酰氯，室温搅拌至原料反应完全；反应液浓缩干燥后，加入二氯甲烷溶解，冰浴下滴加氨水，室温反应至反应结束；减压蒸除溶剂后，加入稀盐酸调节至酸性，析出固体经过滤水洗后得粗品，后经硅胶柱色谱纯化，得化合物M2。
在第四方面的实施方案中，本申请提供了化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐，或者含有化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐的药物组合物在制备抗抑郁、抗焦虑、或者抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用。
在第四方面的一些实施方案中，本申请提供了化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐，或者含有化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐的药物组合物，用于药物的使用。
在第五方面的实施方案中，本申请提供了化合物M2或其溶剂化物或其药学上接受的盐可以和其他抗抑郁药或抗焦虑药联合应用，或者，化合物M2与一种或多种另外的抗抑郁药或抗焦虑药相组合在制备抗抑郁、抗焦虑、或抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用；这里，所述其他抗抑郁药或抗焦虑药，或者另外的抗抑郁药或抗焦虑药，可以选自以下预防和治疗精神疾病药物中的一种或几种：如萘法唑酮、舒必利、阿普唑仑、罗拉、丁螺环酮、坦度螺酮、哌甲酯、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、来士普、氟伏沙明、瑞波西汀、文拉法辛、三氟噻吨、四甲蒽丙胺和路忧泰等。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1
将(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(15g,0.058mol)溶于200mL二氯甲烷中，加入催化剂N,N-二甲基甲酰胺0.1mL，冰浴搅拌，将草酰氯(18.3g,0.144mol)溶于50mL二氯甲烷中，缓慢滴加体系中，滴加完毕后撤去冰浴，室温搅拌至原料反应完全；反应液浓缩干燥后得粗品16.5g；取粗品(10g,36mmol)加入50mL二氯甲烷溶解，冰浴搅拌下缓慢滴加氨水(12.6g,360mmol)，滴加完毕后撤去冰浴，室温反应至反应结束。
向体系中加入浓盐酸，调节pH至酸性，减压旋去二氯甲烷，抽滤至干燥得白色粗品8.67g，经乙醇-水(体积比1:2)重结晶得化合物M2 6.4g。
实验例1：化合物M2药效和对脑区功能的研究
本实验研究目标是通过如下两个实验来阐明化合物M2抗抑郁的效应和脑区功能机制：
1)强迫游泳实验：也被称为绝望实验，通常被用来测试老鼠抑郁类行为的实验
动物：C57 BL/6J雄性小鼠(18-20g)
Figure BDA0003659551720000091
腹腔注射(i.p)
2)脑片电生理实验：用于检测化合物M2对mPFC兴奋性突触传递的影响
·动物：新生窝鼠C57 BL/6J(20-30天).
·仪器：震动切片机(Leica)、脑片电生理系统(Axon).
·脑片电生理实验方法
·sEPSC实验方法：新生C57窝鼠麻醉后，采用人工脑脊液(ACSF)灌流。断头后快速取脑组织，使用震动切片机切片，脑片厚度为300μm.脑片28℃孵育1h后，通过脑片电生理系统，采用电压钳(-70mV)对mPFC锥体神经元进行全细胞记录。基线记录时间为6min，之后通过灌流系统，加入待测药物(药物采用ACSF溶解)，加药后记录时间为6-10min。采用Minianalysis软件对所记录的数据进行分析，并比较待测药物对C57小鼠内侧前额叶锥体神经元sEPSC频率和幅度的影响。
·数据统计
所有数据分析采用spss数据处理软件完成，数据用Mean±s.e.m.表示。用单因素方差分析(One-way ANOVA)分析化合物M2及多巴胺受体拮抗剂作用下化合物M2对sEPSC电流的影响；使用配对t检验分析sEPSC实验结果。p<0.05时标记为*。
3)Western blot：用于检测化合物M2对mPFC蛋白含量变化的影响
·动物：C57 BL/6J雄性小鼠(18-20g)，分为四组，即对照组，氟西汀(fluoxetine)组，化合物M2(30mg/kg)组，艾司氯胺酮组。
·实验应用的一抗抗体
一抗抗体 品牌 货号
p-mTOR Cst 2971s
mTOR Cst 2983s
p-TrkB Cst 4621s
TrkB Cst 4603s
PSD95 Cst 3450s
Synapsin 1 Cst 5297s
β-tubulin Cst 2128s
·Western blot实验方法：
C57小鼠给药0.5h/24h后，脑组织取样前额叶脑区，裂解匀浆组织样品后，使用BCA法进行定量蛋白，通过SDS-PAGE凝胶配制、上样与电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、蛋白检测(显影定影)等步骤，完成检测化合物M2腹腔给药半小时/24小时作用下前额叶脑区蛋白含量的变化情况。
3)实验结果
1.化合物M2有抗抑郁样作用
在给药24h后，化合物M2显著降低小鼠的不动时间，呈明显的剂量效应，并在给药剂量为30mg/kg时，有显著性作用，如图1。化合物M2抗抑郁作用起效较快：实验采用两种阳性化合物作为对照，其中临床一线药物氟西汀起效较慢，而艾司氯胺酮起效快。本实验结果显示，单次给药后24h氟西汀无抗抑郁样作用，而化合物M2和艾司氯胺酮都有抗抑郁样作用，提示化合物M2有快速抗抑郁作用的潜力。
2.化合物M2显著增强内侧前额叶(mPFC)兴奋性突触传递
实验过程中，溶液加入10μM Bicuculine以阻断GABA受体，以此记录椎体神经元的sEPSC。实验考察不同浓度的化合物M2对前额叶PrL脑区的锥体神经元的自发兴奋性突触后电位的影响(sEPSC)，如图2。结果显示，M2增加前额叶PrL脑区的sEPSC发放频率，且呈明显的浓度依赖性；但是对sEPSC发放幅度影响不明显，如图3。
sEPSC发放频率的增加提示化合物M2可以增强前额叶突触的兴奋性谷氨酸神经递质释放，根据化合物M2的靶点作用特征，这种增加可能是由于化合物M2增强中脑投射到前额叶的单胺类神经递质的突触传递，也可能是直接作用于前额叶单胺类受体而引起的。前额叶兴奋性突触传递与抗抑郁作用有密切联系，像氯胺酮新型的抗抑郁药物均可增强前额叶兴奋性突触传递。
3.化合物M2通过多巴胺D2R受体增加前额叶的兴奋性突触传递
1)多巴胺D2R受体阻断化合物M2对前额叶sEPSC的增强效应
本实验考察前额叶多巴胺受体是否影响化合物M2对前额叶的作用。实验用多巴胺受体D2R的拮抗剂Sulpride阻断D2R受体，结果显示，阻断多巴胺D2R受体，可以显著阻断化合物M2对sEPSC发放频率的增强作用，提示前额叶的D2R受体可能介导M2引起的兴奋性突触传递(如图4)。
2)多巴胺D1R受体不影响化合物M2对前额叶兴奋性突触传递的增强作用
应用多巴胺D1R受体拮抗剂SCH23390，结果显示阻断多巴胺D1R受体，不能阻断化合物M2对sEPSC发放频率的增强作用，提示前额叶的D1R受体可能不参与化合物M2引起的兴奋性突触传递(如图5)。
4.化合物M2快速激活前额叶突触生成相关信号通路
本实验研究化合物M2发挥抗抑郁作用可能的胞内信号通路，由于mTOR信号通路的激活在快速抗抑郁中发挥重要的作用，因此本研究考察mTOR信号通路上下游相关蛋白的变化。结果显示化合物M2给药半小时后(图6.a)，可以增加内侧前额叶p-mTOR和p-TrkB的含量，而总的含量未发生变化。文献表明mTOR信号通路与快速抑郁疾病机制相关，氯胺酮的快速抗抑郁作用可能与增加磷酸化mTOR含量和激活TrkB蛋白(BDNF受体)有关。本结果提示化合物M2抗抑郁作用可能也与激活mTOR和TrkB蛋白相关。
mTOR信号通路被激活后进一步增加突触相关蛋白表达水平的增加，图6.b显示单次给药24h后，化合物M2显著增加内侧前额叶突触形成相关蛋白PSD95的含量，该结果与电生理实验发现化合物M2增强前额叶突触传递功能吻合。PSD95是突触后密度蛋白，与神经可塑性相关，有文献研究(Shinohara R,Aghajanian G K,Abdallah C G.Neurobiology ofthe RapidActing Antidepressant Effects of Ketamine:Impact and Opportunities[J].Biological Psychiatry,2020.)表明，氯胺酮发挥抗抑郁、抗焦虑作用与增加PSD95蛋白的表达水平相关。
已有研究表明(Pizzagalli D A,Roberts A C.Correction:Prefrontalcortexand depression[J].Neuropsychopharmacology,2021:1-1.)，临床上抑郁患者可能会出现前额叶萎缩的形态学特征，且基础实验研究中，在慢性社交压力下的造模小鼠，表现出前额叶第五层神经元棘密度降低，神经元兴奋性突触后电流EPSC频率降低，EPSC频率降低，降低了前额叶兴奋性神经递质的突触传递。前额叶兴奋性突触传递与抗抑郁、抗焦虑作用有密切联系，像氯胺酮、氟西汀这些均可增强前额叶兴奋性突触传递。因此，本实验结合化合物M2的药理作用特点，着重考察化合物M2的抗抑郁、抗焦虑效果，以及研究化合物对脑内兴奋性神经递质谷氨酸能系统的影响。利用更接近生理状况下的前额叶脑片实验，结果发现化合物M2均能促进谷氨酸神经递质的释放以及增强谷氨酸受体的功能，提示化合物M2增强前额叶的兴奋性，呈浓度效应。
综合以上结果，表明化合物M2主要通过作用于谷氨酸能神经递质系统，通过增强兴奋谷氨酸能突触传递，提高前额叶兴奋性，从而发挥快速抗抑郁的药效作用。此外，化合物M2快速激活前额叶mTOR信号通路。结果提示化合物M2具有快速抗抑郁作用和增强突触传递和大脑兴奋性的新型抗抑郁机制，显示了优于临床单胺类药物的抗抑郁潜力。
实验例2化合物I-5及化合物M2对大鼠脑突触体单胺再摄取的抑制作用
目前认为，中枢单胺类神经递质5-羟色胺(5-HT)，去甲肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)绝对或相对不足，与抑郁症和焦虑症密切相关。本实验拟通过体外单胺再摄取方法，评价受试化合物I-5、化合物M2两个样品对大鼠脑突触体再摄取5-HT、NA和DA的抑制作用。采用离体SD大鼠脑突触体的制备、同位素示踪标记方法，分别对两个受试样品抑制单胺再摄取DA、5-HT和NA的IC50进行研究，以探索化合物I-5、化合物M2可能的抗抑郁及抗焦虑作用机制。
一、实验材料
1、实验用动物：SD大鼠，雄性，体重：200-220g
2、实验样品：
根据专利A、B说明书中实验部分记载可知，所有化合物中，化合物I-5在各项实验中结果均较好，故选择化合物I-5作为对照，来比较化合物M2对大鼠脑突触体单胺再摄取的抑制作用。
供试品1
名称：化合物I-5
批号：PS01068-6-C-S
结构如下：
Figure BDA0003659551720000141
供试品2
名称：化合物M2
批号：20171208
阳性对照品1
名称：6-羟基多巴胺/6-Hydroxydopamine hydrobromide
批号：0000051379
阳性对照：100μM能100％抑制突触体对3H-DA的再摄取
阳性对照品2
名称：氟西汀盐酸盐/Fluoxetine hydrochloride
批号：WXBC7489V
阳性对照：100μM能100％抑制突触体对3H-5-HT的再摄取
阳性对照品3
名称：地昔帕明盐酸盐/Desipramine hydrochloride
批号：MKCH5352
阳性对照：100μM能100％抑制突触体对3H-NA的再摄取
3供试品和阳性对照品等配制
3.1供试品的配制
称取供试品(允许称量误差±1％)，溶于DMSO，配置成10mM的储存液，存放于-20℃保存。
Figure BDA0003659551720000142
Figure BDA0003659551720000151
在实验之前，采用倍比稀释法，用Kreb’s溶液将其稀释至所检测浓度(1nM-100μM)时所需100倍的工作液。
换算公式：
Figure BDA0003659551720000152
配制如下：
检测浓度(100μM)—储存液10mM:10μl*
检测浓度(10μM)—工作液浓度1mM:100μl*Kreb’s→终体积至1000μl①
检测浓度(1μM)—工作液浓度100μM:100μl①Kreb’s→终体积至1000μl②
检测浓度(100nM)—工作液浓度10μM:100μl②Kreb’→s终体积至1000μl③
检测浓度(10nM)—工作液浓度1nM:100μl③Kreb’s→终体积至1000ul④
检测浓度(1nM)—工作液浓度100nM:100μl④Kreb’s→终体积至1000μl⑤
注：每步配制时均需涡旋混匀，避光。每次实验前现配现用工作液
3.2阳性对照品配制
称取对照品(允许称量误差±1％)，溶于双蒸水，配置成10mM的储存液，存放于-20℃保存。
Figure BDA0003659551720000153
Figure BDA0003659551720000161
二、实验方法
1.脑突触体的制备
采用文献的方法分离突触体制备脑突触体。使用小动物断头器快速断头SD大鼠，断头后迅速取出大脑，置于冰水混合物中预冷，去除软脑膜及血管组织。取出脑组织。加入10倍体积(ml/g)10mM Tris HCl缓冲液(含0.32M蔗糖，pH 7.4)，用超声波细胞粉碎器匀浆(保持低温)，将脑组织匀浆离心10分钟(4℃，1,000g)。4℃平衡离心(1500g,10min)，弃沉淀，随后取上清再离心(20000g)30min。弃取上清液，留用沉淀，即突触小体的粗提物。此沉淀部分再用0.32M的冷蔗糖溶液悬浮后小心铺在已由管底依次铺上1.2M和0.8M(各10ml)的冷蔗糖梯度溶液上,4℃平衡离心(38000g)60min。用穿刺针小心收集0.8–1.2M蔗糖界面处的悬浮带，置于10ml 0.32M的冷蔗糖溶液中混匀，4℃平衡离心(20000g)30min，沉淀物即为精制的脑突触体。将沉淀物悬浮于少量Kreb’s缓冲液(NaCl 118mM、KCl 4.7mM、CaCl22.5mM、MgSO4 1.2mM、KH2PO4 1.2mM、NaHCO3 25mM和Glucose 11.1mM,pH 7.2-7.4)中，采用BCA法进行蛋白定量，操作步骤按说明书进行。
2.单胺的再摄取
参考文献中相关方法，经本发明人实验室自行优化，简述实验方法如下：应管中加入950μl预冷的Kreb’s缓冲液，随后加入30μl突触小体悬液，再加入待测化合物10μl(冰上操作)，涡旋混匀，水浴37℃，5min。取出反应管放置冰上再加入10μl底物(3H-DA或3H-5HT或3H-NA；终反应浓度：10nM)，涡旋混匀，水浴37℃，5min。随后取出反应管迅速置冰上加入3ml预冷的Kreb’s缓冲液终止反应，使用Millipore细胞样品收集器收集，经过GF/C玻璃纤维滤膜快速抽滤，并用洗脱液(50mM Tris-HCl,PH 7.4)3ml×3次，取下滤膜，用微波炉5～6min烘干，将滤膜移入1.5ml离心管中，加入500μl脂溶性闪烁液。避光静置30min以上，计数测定放射性强度(cpm值)。
按以下公式计算各化合物对同位素配基结合的抑制率百分率：
抑制率(I％)＝(总结合管cpm—化合物cpm)/(总结合管cpm—非特异结合管cpm)×100％
化合物每次实验做三复管，进行三次单独重复实验。
三、实验结果
1.IC50的计算
1)以检测化合物浓度为X，抑制率为Y。
2)对X取对数，X’＝Log(X)，形成新的数据。
3)对新的数据做非线性的曲线拟合，拟合后代入以下方程，计算得出IC50值。以上步骤使用软件GraphpadPrism拟合。
4)
Figure BDA0003659551720000171
Figure BDA0003659551720000172
2.实验小结
单胺再摄取抑制是抗抑郁、抗焦虑药物作用的主要靶点之一。供试品化合物I-5、化合物M2对大鼠脑突触体再摄取DA、5-HT和NA均有不同程度的抑制作用，且化合物I-5与化合物M2的抑制作用相当，提示化合物I-5及化合物M2通过抑制DA、5-HT和NA再摄而发挥抗抑郁、抗焦虑作用。
化合物I-5对大鼠脑突触体再摄取DA、5-HT和NA的IC50值分别为：26.02±1.33nM、18.52±2.47nM、17.21±1.59nM。
化合物M2对大鼠脑突触体再摄取DA、5-HT和NA的IC50值分别为：37.28±1.97nM、98.87±2.42nM、23.54±3.56nM。
实验例3：化合物I-5及化合物M2抗抑郁作用研究
“行为绝望”模型是1977年由Porsolt等发展而来，包括大鼠、小鼠强迫游泳模型和小鼠尾悬挂模型，属于急性应激模型。小鼠尾悬挂实验是Stern等于1985年介绍的一种评价抗抑郁药的简单易行的实验方法，其原理与强迫游泳“不动”实验相同。被倒挂状的小鼠为克服不正常的体位而挣扎活动，但在活动一定时间后，动物因“失望”而呈现间歇性不动状态。
本实验观察待测样品化合物I-5和化合物M2对“行为绝望”实验中的小鼠尾悬挂行为有否影响，是否具有缩短小鼠停止不动的时间，并对化合物I-5和化合物M2的快速起效作用进行对比研究。
一、实验材料
1.受试样品1
名称或代码：化合物I-5
供试品编号：YLS-2021-CMI1203-002
批号：C16101006-C17001M
配制方法：溶媒为吐温80+水，以终体积1.5％的吐温80充分乳化，加水至终体积，配制后暂存条件：4℃冰箱。
2.受试样品2
名称或代码：化合物M2
供试品编号：YLS-2021-CMI1203-01-001
批号：20201029
配制方法：溶媒为吐温80+水，以终体积1.5％的吐温80充分乳化，加水至终体积，配制后暂存条件：4℃冰箱。
二、实验动物
C57 BL/6小鼠，40只，SPF级，雄性，4-5周。
三、实验方法
1.动物分组及剂量设计依据
40只小鼠按照Excel完全随机分组法分为4组，每组10只动物。前期预实验结果提示，在给药24h后，化合物M2能够剂量依赖地降低强迫游泳实验中小鼠的不动时间，并在给药剂量为30mg/kg时有显著作用。故本实验研究以30mg/kg作为化合物M2的低剂量，同时设60mg/kg作为化合物M2给药的高剂量，与60mg/kg的化合物I-5进行对比研究。分组及给药详见表1。
表1动物分组及给药
Figure BDA0003659551720000191
2.给药途径及给药时间
各试验组按应给予药液经口灌胃(i.g.)给药，0.2ml/10g体重。
3.指标检测
单次口服给药30min后进行小鼠尾悬挂试验，尾悬挂持续时间为6min。记录小鼠6min内静止不动的时间。
4.统计方法
数据以平均值±标准(mean±SD)差表示，数据差异统计采用单因素方差分析(ANOVA)或非参数检验，组间差异以P<0.05判断。
四、实验结果
小鼠单次给药测试结果表明，60mg/kg的化合物M2单次给药30min后，可明显缩短小鼠悬尾的静止不动时间，与空白组比较p<0.05；30mg/kg的化合物M2单次给药30min后虽有一定降低小鼠悬尾不动时间的趋势，但统计学上未出现显著性差异。60mg/kg的化合物I-5单次给药30min后，对小鼠悬尾静止不动时间无明显影响(详见表2)。以上结果提示，化合物M2抗抑郁作用起效较快，化合物M2具有显著的抗抑郁作用，且抗抑郁作用起效较快，在快速起效方面明显优于化合物I-5。
表2.化合物I-5及化合物M2单次给药对C57小鼠悬尾实验的影响(n＝10,
Figure BDA0003659551720000201
)
Figure BDA0003659551720000202
注：与空白对照组比较**P<0.05；与化合物I-5组比较###P<0.01
实验例4：化合物I-5及化合物M2大鼠绝对生物利用度研究
1.实验目的
通过实验建立测定大鼠血浆中化合物I-5及化合物M2的LC-MS/MS方法，考察化合物的大鼠药代动力学特征及绝对生物利用度。
2.实验材料
2.1实验动物
SPF级SD雄性大鼠20只(体重220±20g)，购于北京维通利华公司。
2.2供试品
化合物I-5原料药，批号C16101006-C(20170814)M，含量：99.6％，由天士力医药集团股份有限公司提供。
化合物M2原料药，批号：20201029，含量：99.8％，由天士力医药集团股份有限公司提供。
3.实验方法
3.1供试品配制及给药剂量
Figure BDA0003659551720000211
3.2测定方法
3.2.1化合物M2液质条件(正谱)
3.2.1.1液相条件
色谱柱：waters BEH C18 1.7μm；2.1×100mm Column
内标：D-I-5(氘代化合物I-5，结构式如下所示)
Figure BDA0003659551720000212
流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，乙腈(B)；等度洗脱(A/B:58:42v/v)
流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：4μL
3.2.1.2质谱条件
离子检测方式：选择反应监测(MRM)
离子化方式：电喷雾离子化(ESI)
离子极性：正离子
质谱参数
Figure BDA0003659551720000221
3.3药动学实验
SD大鼠20只，随机为4组，每组5只。给药前禁食10h，自由饮水，于给药前(0h)和给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24h从眼眶静脉取血0.3mL，置于EDTA-K2抗凝试管中，轻摇使其与抗凝剂充分混匀，置于湿冰上，于0.5h之内完成离心。
离心：8000rpm离心5min后，分离血浆。
保存：-20℃下冷冻储存。
3.4血浆样品处理方法
取50μL血浆，加入50μL D-I-5(20ng/mL乙腈溶解),涡旋30s，再加100μL乙腈；充分涡旋2min，4℃12000r/min离心3min，取上清50μL，加入50uL水溶液稀释，涡旋1min，进样4μL即可。
4.药动学结果分析
大鼠分别口服灌胃和静脉给药后平均血药浓度-时间曲线见图8和9，采用DAS3.0药动学软件(中国数学药理专业委员会，中国上海)进行数据处理，并计算非房室模型统计矩参数，Cmax和Tmax为实测值。血药浓度数据和药动学参数详见下表。
表3大鼠单次灌服化合物M2(12.5mg/kg)后血药浓度(ng/mL)
Figure BDA0003659551720000222
Figure BDA0003659551720000231
BLOQ：低于检测限
表4大鼠单次静脉推注化合物M2(2.5mg/kg后血药浓度(ng/mL)
Figure BDA0003659551720000232
表5大鼠单次灌胃12.5mg/kg化合物I-5后的血浆浓度(ng/mL)
Figure BDA0003659551720000233
BLOQ：低于检测限
表6大鼠单次静脉推注2.5mg/kg化合物I-5后血药浓度(ng/mL)
Figure BDA0003659551720000241
表7.大鼠灌胃及静脉给于化合物M2后药动学参数(Mean±SD)(n＝5)
Figure BDA0003659551720000242
表8.大鼠灌胃及静脉给于化合物I-5后药动学参数(Mean±SD)(n＝5)
Figure BDA0003659551720000243
Figure BDA0003659551720000251
5.讨论
大鼠灌胃及静脉给予化合物M2及化合物I-5后，药动学研究结果表明，灌胃给药后化合物M2及化合物I-5吸收达峰时间较快，达峰时间tmax为0.35h,化合物M2 Cmax为425.4±136.9ng/mL，化合物I-5Cmax为361.1±258.2ng/mL，化合物M2具有较高的血药浓度；化合物M2 AUC0-t为1080.1±373.4ng.h/mL，化合物I-5AUC0-t为523.3±433.3ng.h/mL，在相同灌胃给药剂量下化合物M2比化合物I-5在大鼠体内呈现更高的暴露量，同时具有更高的绝对生物利用度，分别为40.8％和24.05％。
实验例5：M2及其结构类似物抗焦虑作用研究
一、实验材料
1、受试样品
根据专利C说明书中两个实验(小鼠高架十字迷宫实验、大鼠饮水冲突实验)结果可知，两组实验效果均较好的化合物为II-3、II-4、II-5、II-10，因此选择这4个化合物作为对照，来评价本申请化合物M2的抗焦虑作用。
①名称或代码：化合物M2
Figure BDA0003659551720000252
批号：20201029
供试品编号：YLS-2021-CMI1203-01-001
来源：天士力研究院化学药品开发中心
②名称或代码：化合物II-3(即专利A、B中的化合物I-3)
Figure BDA0003659551720000261
供试品编号：YSL-2021-CMI1203-01-023
来源：天士力研究院化学药品开发中心
③名称或代码：化合物II-4(即专利A、B中的化合物I-4)
Figure BDA0003659551720000262
供试品编号：YSL-2022-CMI1203-01-001
来源：天士力研究院化学药品开发中心
④名称或代码：化合物II-5(即专利A、B中的化合物I-5)
Figure BDA0003659551720000263
供试品编号：YSL-2021-CMI1203-01-002
来源：天士力研究院化学药品开发中心
⑤名称或代码：化合物II-10(即专利A、B中的化合物I-10)
Figure BDA0003659551720000271
批号：20170601
供试品编号：YSL-2021-CMI1203-01-023
来源：天士力研究院化学药品开发中心
2阳性对照品
名称或代码：艾司唑仑片
批号：211007
供试品编号：YSL-2021-CMI1203-01-022
来源：山东信谊制药有限公司
3主要仪器
Figure BDA0003659551720000272
二、实验动物
2.1实验动物
①种属：ICR小鼠(用于高架十字迷宫实验)
数量：120只
等级：SPF级
性别：雄性
体重：18-20g
动物合格证编号：110011211113772653、110011221101333628
来源：北京维通利华实验动物技术有限公司
生产许可证号：SCXK(京)2021-0006
②种属：SD大鼠(用于饮水冲突实验)
数量：75只
等级：SPF级
性别：雄性
体重：180-200g
动物合格证编号：110011221102490324
来源：北京维通利华实验动物技术有限公司
生产许可证号：SCXK(京)2021-0011
2.2动物设施
饲养设施：天津天士力控股集团有限公司动物设施屏障环境内
设施地址：天津市北辰科技园淮河道与汀江西路交口厂区内
实验动物使用许可证：SYXK(津)2017－0007
签发单位：天津市科学技术委员会
2.3动物饲养与管理
饲养环境：屏障环境，本设施的环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》(GB14925-2001)对屏障动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《天津市实验动物管理条例》等法规的要求，温度：20～26℃，湿度：40％～70％，光照：12小时明、12小时暗，通风：≥15次/小时全新风，动物饮用1T/h型多重微孔滤膜过滤系统制备的无菌水(四级过滤紫外灭菌)。
动物管理由动物保障部负责，除禁食外，每天为动物提供足够的饲料和饮用水。饮水瓶每天更换一次。动物饲养垫料每周更换二次，特殊情况随时更换。饲养笼具每周更换一次；动物饲料：购于北京科澳协力饲料有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0003。
2.4动物接收与检疫
实验动物到来后，实验人员、兽医和动物保障部门一同接收。接收时首先查看运输工具是否符合要求，再查看动物供应单位提供的动物合格证明，并确认合格证内容与申请购买的动物种属、级别、数量和性别一致。然后检查外包装是否符合要求及动物外包装是否有破损。动物外包装经第一传递柜传入检疫室。试验用具和实验记录经第二传递柜传入。
在检疫室打开动物外包装，核对动物性别及数量与动物合格证明所载事项是否一致。逐一对动物进行外表检查(包括性别、体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神、活动等)，并填写《实验动物接收记录》和《实验动物检疫记录》。动物检验后放入动物饲养笼中，在笼具上悬挂检疫期标签，然后放在检疫室中进行适应期饲养。
动物适应饲养期限为2-3天。定期对动物进行观察，包括体重、头部、躯干、尾部、四肢、皮毛、精神、活动等。
三、实验方法
3.1化合物M2单次给药剂量探索研究(高架十字迷宫实验)
(1)动物分组及给药
50只ICR小鼠，雄性，随机分为5组(溶剂对照组、艾司唑仑组、M2高剂量组、M2中剂量组、M2低剂量组)，每组10只。其中化合物M2高、中、低剂量组分别按照20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg灌胃给药；阳性药艾司唑仑按照2.5mg/kg灌胃给药；溶剂对照组灌服等容积的溶剂。各组均于单次给药30min后进行行为测试。实验要求于上午8:00—14:00之间进行，所有动物均于前日进入测试实验室。
剂量设计依据：前期抗焦虑实验结果(专利C)显示化合物M2的结构类似物化合物II-3、II-4、II-5等在小鼠高架十字迷宫实验中，其抗焦虑的有效剂量为10mg/kg，本次实验拟以10mg/kg为化合物M2的中剂量，分别下探一个剂量5mg/kg，上探一个剂量20mg/kg。阳性药艾司唑仑抗焦虑临床用量为6mg/人/天，换算成小鼠临床等效剂量为6mg/60kg*12.3＝1.23mg/kg，2倍临床剂量为2.5mg/kg；换算成大鼠临床等效剂量为6mg/60kg*6.2＝0.62mg/kg，2倍临床剂量为1.24mg/kg。
表9.化合物M2单次给药剂量探索—组别及给药剂量
Figure BDA0003659551720000301
(2)行为测试
实验室内光线昏暗(以1.5m距离处能区分小鼠细微活动的最低亮度为准)并保持恒亮，室温20℃左右，保持安静。迷宫测试前将每只小鼠放入一个35cm*10cm*5cm塑料盒中，任其自由探究5min后迅速置于高架十字迷宫的中央平台处，使其头部正对其中一个开放臂，释放后即开始记录下述指标。每只小鼠测试5min。观测人员在距离1.5m处分别观察记录动物的活动。中间用湿布擦拭迷宫，清除粪便，继用干布擦净后再进行下一只小鼠的测试。
(3)行为学观察指标
①进入开放臂的次数(open armentry,OE)：进入到任一开放臂的次数，以小鼠四个爪子均进入到臂内为准，中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成；
②进入开放臂时间(open arm time,OT)：进入开放臂的时间，单位：秒；
③进入封闭臂次数(close arm entry,CE)：进入到任一封闭臂的次数，以小鼠四个爪子均进入到臂内为准；
④进入封闭臂时间(close arm time,CT)：进入封闭臂的时间，单位：秒；
⑤开臂时间百分率：OT％＝OT/(OT+CT)*100％
⑥开臂次数百分率：OE％＝OE/(OE+CE)*100％
3.2化合物M2及结构类似物单次给药药效对比研究(高架十字迷宫实验)
(1)动物分组及给药
70只ICR小鼠，雄性，随机分为7组(溶剂对照组、艾司唑仑组、化合物M2组、化合物II-3组、化合物II-4组、化合物II-5组、化合物II-10组)，每组10只。其中M2及其4个结构类似化合物的剂量根据3.1的实验结果定为20mg/kg；阳性药艾司唑仑按照2.5mg/kg灌胃给药；溶剂对照组灌服等容积的溶剂。各组均于单次给药30min后进行行为测试。实验要求于上午8:00—14:00之间进行，所有动物均于前日进入测试实验室。
表10.化合物M2及结构类似物单次给药高架十字迷宫—组别及给药剂量
Figure BDA0003659551720000311
行为测试方法及行为学观察指标同3.1。
3.3化合物M2及结构类似物单次给药药效对比研究(饮水冲突实验)
(1)动物分组及给药
75只SD大鼠，雄性，体重180-220g，适应性喂养1周后，禁水24h进行训练期测试，将筛选合格的动物按体重随机分为7组(溶剂对照组、艾司唑仑组、化合物M2组、化合物II-3组、化合物II-4组、化合物II-5组、化合物II-10组)，每组8只，其中化合物M2及其4个结构类似化合物的剂量根据3.1的实验结果定为10mg/kg；阳性药艾司唑仑按照1.24mg/kg灌胃给药；溶剂对照组灌服等容积的溶剂。将分组后的动物继续禁水24h进行单次给药，并于单次给药30min后进行惩罚实验测试。
表11.化合物M2及结构类似物单次给药饮水冲突—组别及给药剂量
Figure BDA0003659551720000312
Figure BDA0003659551720000321
实验分两阶段进行。第一阶段为训练期，动物禁水24h后被单独置于操作箱，让其充分探究，直到发现瓶嘴并开始舔水(电击强度0mA)，计数器自动记录其在3min内的舔水次数，对舔水少于300次的动物予以淘汰；第二阶段为惩罚期，将未被淘汰的动物继续禁水24h后给药，再次单独置于操作箱，动物舔水20次起仪器自动开始计时并给予一次电击(舔水与电击次数之比为20:1)，电击强度一般为0.3mA，持续2s，但动物可通过脱离瓶嘴来解除电击。记录3min动物的舔水次数和电击次数。
观察指标：惩罚期内大鼠的舔水次数。
3.4统计方法
数据以平均值±标准(mean±SD)差表示，数据差异统计采用单因素方差分析(ANOVA)或非参数检验，组间差异以P<0.05判断。
四、实验结果
4.1化合物M2单次给药剂量探索研究(高架十字迷宫实验)
化合物M2单次给药剂量探索研究结果表明，化合物M2高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低剂量(5mg/kg)单次灌胃给药均能在不同程度上增加高架十字迷宫实验中小鼠进入开臂的次数，并延长小鼠在开臂停留的时间，其中化合物M2高剂量组与溶剂对照组相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。
以上结果表明，化合物M2单次给药具有显著抗焦虑活性，其单次给药的有效剂量为20mg/kg。
表12.不同剂量化合物M2对小鼠进入开臂次数及在开臂停留时间的影响
Figure BDA0003659551720000322
Figure BDA0003659551720000331
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01
4.2化合物M2及结构类似物单次给药药效对比研究(高架十字迷宫实验)
高架十字迷宫实验研究结果表明，化合物M2及其结构类似物化合物II-3、II-4、II-5、II-10以20mg/kg单次灌胃给药均能在不同程度上增加高架十字迷宫实验中小鼠进入开臂的次数，并延长小鼠在开臂停留的时间，其中化合物M2、化合物II-4、化合物II-5、化合物II-10组与溶剂对照组相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01)，表明化合物M2及其结构类似物II-4、II-5、II-10在此模型上具有显著抗焦虑活性，且化合物M2与II-3、II-4、II-5、II-10相比，其抗焦虑活性最优。
表13.化合物M2及其结构类似物对小鼠进入开臂次数及在开臂停留时间的影响
Figure BDA0003659551720000332
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与M2相比，#P<0.05，##P<0.01
4.3化合物M2及结构类似物单次给药药效对比研究(饮水冲突实验)
饮水冲突实验研究结果表明，化合物M2及其结构类似物化合物II-3、II-4、II-5、II-10以20mg/kg单次灌胃给药均能在不同程度上增加饮水冲突实验中大鼠饮水次数，其中化合物M2、化合物II-5、化合物II-10组与溶剂对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，表明化合物M2及其结构类似物化合物II-5、II-10在此模型上具有显著抗焦虑活性，且化合物M2与II-3、II-4、II-5、II-10相比，其抗焦虑活性最优。
表14.化合物M2及其结构类似物对Vogel饮水冲突模型大鼠饮水次数的影响
Figure BDA0003659551720000341
注：与溶剂对照组相比，*P<0.05；与M2相比，#P<0.05
五、实验结论
综上，化合物M2具有显著的抗焦虑活性，单次给药的有效剂量为20mg/kg(小鼠)，且化合物M2与其结构类似物化合物II-3、II-4、II-5、II-10相比，其抗焦虑活性最优。

Claims (12)

1.一种取代桂皮酰胺化合物，结构式如下：
Figure FDA0003659551710000011
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物还可以溶剂化物的形式存在。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物还可以药学上可接受的盐形式存在。
4.含有权利要求1-3任何一项化合物的药物组合物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，可以是任何可服用的药物形式；任选地，所述药物形式选自：片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂和贴剂；所述的片剂任选地为糖衣片剂、薄膜衣片剂或肠溶衣片剂；所述胶囊剂任选地为硬胶囊剂或软胶囊剂；所述注射剂任选地为注射液、冻干粉针剂和水针剂中的一种。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，使用时可以和其他抗抑郁药或抗焦虑药物联合应用，或者，所述药物组合物还包括其他抗抑郁药或抗焦虑药物；所述其他抗抑郁药或抗焦虑药物选自：萘法唑酮、舒必利、阿普唑仑、罗拉、丁螺环酮、坦度螺酮、哌甲酯、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、来士普、氟伏沙明、瑞波西汀、文拉法辛、三氟噻吨、四甲蒽丙胺、路忧泰。
7.权利要求1所述化合物的制备方法，所述的制备方法为：
Figure FDA0003659551710000021
(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(即中间体A)与NH3反应，得到化合物M2。
8.权利要求7所述化合物的制备方法，包括以下反应路线：
Figure FDA0003659551710000022
9.根据权利要求8所述的制备方法，操作步骤如下：
将(E)-3-(3’,4’-亚甲二氧基-5’-三氟甲基-苯基)-丙烯酸(中间体A)溶于二氯甲烷中，加入催化量N,N-二甲基甲酰胺，冰浴下滴加草酰氯，室温搅拌至原料反应完全；反应液浓缩干燥后，加入二氯甲烷溶解，冰浴下滴加氨水，室温反应至反应结束；减压蒸除溶剂后，加入稀盐酸调节至酸性，析出固体经过滤水洗后得粗品，后经硅胶柱色谱纯化，得M2。
10.权利要求1至3中任一项所述的化合物、或者权利要求4至6中任一项的药物组合物，用于药物的使用。
11.权利要求1至3中任一项所述的化合物、或者权利要求4至6中任一项的药物组合物在制备抗抑郁、抗焦虑或抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用。
12.权利要求1至3中任一项所述的化合物、或者权利要求4至6中任一项的药物组合物和其他抗抑郁药或抗焦虑药联合应用，或者，权利要求1至3中任一项所述的化合物与一种或多种另外的抗抑郁药或抗焦虑药相组合在制备抗抑郁、抗焦虑、或抗抑郁和抗焦虑的药物中的应用；这里，所述其他抗抑郁药或抗焦虑药，或者另外的抗抑郁药或抗焦虑药，可以选自以下预防和治疗精神疾病药物中的一种或几种：如萘法唑酮、舒必利、阿普唑仑、罗拉、丁螺环酮、坦度螺酮、哌甲酯、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、西酞普兰、来士普、氟伏沙明、瑞波西汀、文拉法辛、三氟噻吨、四甲蒽丙胺和路忧泰。
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