CN111494366A - 二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗衰老药物，具体涉及一种二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，将二甲基氨基含笑内酯与医药上可接受的辅料制备成药剂。本发明的二甲基氨基含笑内酯处理降低了血液中几种与衰老相关的炎症细胞因子的水平，并抑制了一些衰老组织中的NF‑κB活性。结果表明，长期二甲基氨基含笑内酯处理可以促进健康，延缓衰老。

Description

二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用

技术领域

本发明属于自身免疫性疾病的医药领域，具体涉及二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用。

背景技术

人体衰老是一个自然过程，是人体机能变缓的直接表现，根据生物分子自然交联学说，人体体系中各种生物分子具有大量的活泼基团，它们必然相互作用发生化学反应使生物分子缓慢交联以趋向化学活性的稳定。随着时间的推移，交联程度不断增加，生物分子的活泼基团不断消耗减少，原有的分子结构逐渐改变，这些变化的积累会使生物组织逐渐出现衰老现象，衰老容易导致功能紊乱和各种老年疾病。

尽管衰老是自然过程，但是人们通过研究发现还是可以根据生物体的特点，通过抑制某些转录因子的活性，从而调控相应基因表达来延缓衰老。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制转录因子NF-κB的活性，从而调控相应基因表达的药物。具体是一种二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用。

本发明的另一优选方案是，所述二甲基氨基含笑内酯能抑制生物体组织中NF-κB活性。

本发明的另一优选方案是，所述二甲基氨基含笑内酯为水溶性二甲基氨基含笑内酯。

本发明的另一优选方案是，将二甲基氨基含笑内酯与医药上可接受的辅料制备成药剂。

本发明的另一优选方案是，所述药剂为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。

本发明的另一优选方案是，所述药剂为注射剂。

本发明的另一优选方案是，所述药剂为颗粒剂。

本发明的另一优选方案是，所述药剂为口服液。

NF-κB激活目前被认为是衰老过程的驱动力之一。NF-κB信号通路的遗传损伤或NF-κB活性的药理学抑制已被证明可延长健康寿命和自然寿命并延迟或减少许多衰老相关的症状。然而，目前仍缺乏合适的小分子化合物用于抑制NF-κB的活性以干预衰老进程。本发明采用水溶性的二甲基氨基含笑内酯(dimethylaminomicheliolide，DMAMCL)来抑制NF-κB的活性。在本项研究中，我们发现从中年小鼠开始长期服用DMAMCL耐受良好且安全，并能改善雄性老年小鼠的健康状况。DMAMCL处理改善了多种衰老相关的症状，例如神经行为表型，身体活动能力，心脏功能，血液学指标，免疫衰老表型，血液生化指标和葡萄糖稳态。在分子水平上，DMAMCL处理降低了血液中几种与衰老相关的炎症细胞因子的水平，包括IL-6，IL-1α，IL-1β，TNF-α，IFN-γ和CXCL2，并抑制了一些衰老组织中的NF-κB活性。我们的结果表明，长期DMAMCL处理可以改善老年小鼠的健康状况，成功研发了基于DMAMCL进行衰老干预，从而促进健康，延缓衰老的技术成果。

附图说明

图1是本发明实施例图1DMAMCL处理对小鼠体重和生存率的影响图。其中(A)DMAMCL的化学结构式。(B)长期DMAMCL处理以及进行多种分析的时间节点图。小鼠54周龄时开始DMAMCL处理，实验持续15个月。(C)体重。(D)Kaplan-Meier生存曲线(n＝23只/组×4组：对照组，10，25和50mg/kg给药组)。

图2是本发明实施例DMAMCL对一些衰老相关的神经行为表型和身体活动能力影响图。(A-D)用Morris水迷宫实验检测小鼠的学习和记忆能力(n＝12)。(A)潜伏期(小鼠成功找到平台所需的时间)。(B)实验中小鼠第一次成功找到平台所需的时间。(C)第六天的平均游泳速度。(D)实验中小鼠在目标象限所占时间百分比及其他象限所占时间百分比。TQ代表目标象限，OQ代表其他象限。(E)小鼠从转棒上掉落的潜伏期(n＝8-12)。(F和G)小鼠在跑步机上的跑步距离和时间(n＝9-10)。(H和I)开放旷场实验中小鼠的活动总路程和中央区活动时间(n＝13-14)。(J)高架十字迷宫实验中小鼠的开臂滞留时间百分比(n＝14)。^*P<0.05和^**P<0.01vs对照组(双尾t检验)。由图2可知DMAMCL对一些衰老相关的神经行为表型和身体活动能力有明显地改善。

图3是本发明实施例DMAMCL处理对小鼠骨结构、身体成分以及心脏结构和功能的影响图。(A-C)双能X射线吸收测定法(DEXA)测量小鼠的骨密度和身体成分(n＝10)。(A)骨密度(bone mineral density，BMD)。(B)脂肪百分比。(C)肌肉/脂肪比率。(D-J)超声心动图评估小鼠的心脏结构和功能(n＝6-8)。(D)左心室舒张末期内径(LVIDD)。(E)左心室收缩末期内径(LVIDS)。(F)左室后壁舒张期厚度(LVPWD)。(G)左室后壁收缩期厚度(LVPWS)。(H)射血分数(EF)。(I)左心室短轴缩短率(FS)。(J)E/e'比值。^*P<0.05和^**P<0.01vs对照组(双尾t检验)。由图可知，DMAMCL处理改善了老年小鼠的心脏舒张功能。

图4是本发明实施例DMAMCL对一些基本的血液学指标的影响图。使用血液分析仪测定不同类型血细胞的数量和大小(n＝10)。(A)红细胞计数(RBC)。(B)红细胞压积(HCT)。(C)红细胞平均体积(MCV)。(D)红细胞分布宽度(RDW)。(E)血红蛋白(HGB)。(F)红细胞平均血红蛋白量(MCH)。(G)平均血红蛋白浓度(MCHC)。(H)血小板计数(PLT)。(I)血小板压积(PCT)。(J)平均血小板体积(MPV)。(K)血小板分布宽度(PDW)。(L)白细胞计数(WBC)。^*P<0.05和^**P<0.01vs对照组(双尾t检验)。由图可知，DMAMCL处理明显改善了一些基本的血液学指标。

图5是本发明实施例DMAMCL对部分衰老相关的免疫影响图。用十色的多色流式细胞仪分析外周血白细胞(n＝7-10)。(A)T细胞比例。(B)Ly6C⁺T细胞比例。(C)B细胞比例。(D)粒细胞比例。(E)Ly6C⁺单核细胞比例。(F)自然杀伤(NK)细胞比例。(G)Ly6C⁺NK细胞比例。^*P<0.05vs对照组(双尾t检验)。由图可知，DMAMCL处理改善了部分衰老相关的免疫衰老表型。

图6是本发明实施例DMAMCL处理对小鼠血液生化指标和葡萄糖稳态的影响图。使用全自动生化分析仪测量小鼠血液生化指标(n＝7-10)。(A-E)心肌酶谱指标，包括(A)肌酸激酶(CK)，(B)肌酸激酶Mb型(CK-MB)，(C)α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)，(D)天冬氨酸氨基转移酶(AST)，(E)乳酸脱氢酶(LDH)。(F)丙氨酸氨基转移酶(ALT)。(G)葡萄糖(GLU-God)。(H)甘油三酯(TG)。(I)总蛋白(TP)。(J)白蛋白(ALB)。(K)总胆固醇(TC)。(L)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。(M)低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。(N)LDL-C/HDL-C比率。(O)尿素(UREA)。(P)尿酸(UA)。(Q)肌酐(CREA-J)。(R)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)测定的血糖浓度(n＝10)。^*P<0.05和^**P<0.01vs对照组。由图可知，DMAMCL处理改善了老年小鼠的许多心肌酶谱指标和葡萄糖代谢状况。

图7是DMAMCL处理对老年小鼠血液中几种重要的衰老相关炎症细胞因子的影响图。用小鼠Luminex芯片检测小鼠血清中七种重要炎症细胞因子的水平，包括(A)IL-6,(B)IL-1α，(C)IL-1β，(D)TNF-α,(E)IFN-γ,(F)CXCL2,(G)GM-CSF。^*P<0.05vs对照组(n＝10，双尾t检验)。由图可知，DMAMCL处理显著降低了老年小鼠血液中几种重要的衰老相关炎症细胞因子的水平。

图8是DMAMCL处理对老年小鼠多个组织中的NF-κB活性影响图。从心、脾、肾三个组织中提取总蛋白，用Western印迹分析检测目的蛋白的含量(n＝3-8)。(A)对照组和中剂量DMAMCL处理组小鼠心肌组织中p65和p-p65的蛋白表达水平。(B)对照组和中剂量DMAMCL处理组小鼠脾组织中p65和p-p65的蛋白表达水平。(C)对照组和低剂量DMAMCL处理组小鼠肾组织中IκBα、Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。由图可知，DMAMCL处理抑制了老年小鼠多个组织中的NF-κB活性。

图9是DMAMCL处理对小鼠体重的影响图。(A)对照组和低剂量DMAMCL处理组小鼠的体重。(B)对照组和中剂量DMAMCL处理组小鼠的体重。(C)对照组和高剂量DMAMCL处理组小鼠的体重。由图可知，低剂量DMAMCL对小鼠体重几乎没有影响，中剂量DMAMCL明显降低小鼠体重，而高剂量DMAMCL可能在后期降低老年小鼠体重。

图10是DMAMCL处理对小鼠生存率的影响图。低剂量(A)(log-rank test：P＝0.4143),中剂量(B)(log-rank test:P＝0.4962)和高剂量(C)(log-rank test:P＝0.3514)DMAMCL处理组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。由图可知，对照组和DMAMCL处理组小鼠的生存曲线在给药的后期开始分离，在所有三种剂量的DMAMCL处理组中，存活的小鼠都比对照组多。

图11是Morris水迷宫试验结果图。Morris水迷宫试验中，低剂量(A)(two-wayrepeated-measures ANOVA:treatment x time F(8,160)＝0.8227,P＝0.5837；time F(8,160)＝4.484,P<0.0001；treatment F(1,20)＝0.07017,P＝0.7938),中剂量(B)(two-wayrepeated-measures ANOVA:treatment x time F(8,160)＝0.9149,P＝0.5057；time F(8,160)＝4.244,P<0.0001；treatment F(1,20)＝0.1172,P＝0.7356),和高剂量(C)(two-wayrepeated-measures ANOVA:treatment x time F(8,160)＝0.8062,P＝0.5980；time F(8,160)＝5.745,P<0.0001；treatment F(1,20)＝0.009139,P＝0.9248)DMAMCL处理组小鼠的潜伏期(小鼠成功找到平台所需的时间)(n＝12)。由图可知，低剂量和中剂量DMAMCL处理改善了老年小鼠的空间学习和记忆能力。

图12是DMAMCL处理对小鼠葡萄糖体内平衡的影响图。(A)对照组、低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠的OGTT曲线。(B)对照组和高剂量DMAMCL处理组小鼠的OGTT曲线(n＝10)。由图可知，DMAMCL处理可以降低老年小鼠的血糖水平，从而改善老年小鼠体内葡萄糖代谢。

图13是DMAMCL处理对老年小鼠多个组织中蛋白表达的影响图。从心、脾、肾三个组织中提取总蛋白，用Western印迹分析检测目的蛋白的含量(n＝3-8)。(A)对照组和高剂量DMAMCL处理组小鼠心肌组织中p-p65、p65、IκBα和HO-1的蛋白表达水平。(B)对照组和低剂量DMAMCL处理组小鼠脾组织中p65和p-p65的蛋白表达水平。(C)对照组和高剂量DMAMCL处理组小鼠脾组织中p65和p-p65的蛋白表达水平。(D)对照组和高剂量DMAMCL处理组小鼠肾组织中IκBα和HO-1的蛋白表达水平。由图可知，DMAMCL处理抑制了老年小鼠多个组织中的NF-κB活性。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细描述，本部分的描述仅是示范性和解释性，不应对本发明的保护范围有任何的限制作用。此外，本领域技术人员根据本文件的描述，可以对本文件中实施例中以及不同实施例中的特征进行相应组合。

实施例1

本实施例使用DMAMCL，化学名称为：(3R,3aS,9R,9aS,9bS)-3-((二甲基胺基)甲基)-9-羟基-6,9-二甲基-3,3a,4,5,7,8,9,9a-八氢化薁并[4,5-b]呋喃-2(9bH)-酮富马酸盐，是一种含笑内酯衍生物。实验所用的DMAMCL为天津尚德药缘科技股份有限公司所生产。分子式如图1A所示。

药理药效实验如下：

研究表明，NF-κB信号通路的遗传增加或损伤可加速或延缓生理衰老的进展。NF-kB信号通路是指哺乳动物的转录因子NF-kB家族。NF-kB1缺陷小鼠表现出NF-κB的过度激活和全身炎症的升高，从而导致了早老和许多衰老相关的疾病，表明NF-κB是衰老过程的真正驱动因素。下丘脑中NF-κB信号通路的遗传激活也加速了衰老过程并缩短了小鼠寿命。相反，NF-κB的遗传敲除可延长Sirt6缺陷小鼠、Ercc1缺陷型和Ercc1^-/Δ小鼠、Zmpste24缺陷小鼠、Lmna^G609G小鼠和野生型小鼠的寿命。此外，NF-κB的缺失也减弱了这些小鼠模型表现出的多种衰老相关症状和病理。与之类似，药理学试剂，例如，由11个肽组成的IKK的抑制剂，称为NEMO结合结构域(8K-NBD)，通过抑制NF-κB延长了Ercc1缺陷型和Ercc1^-/Δ小鼠的寿命并减少了衰老相关的病理。吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)，一种NF-κB的抑制剂，可增加黑腹果蝇的平均寿命。次氯酸(HOCl)通过抑制IKK活性改善了NF-κB介导的皮肤病和皮肤衰老。然而，目前仍然缺乏能够抑制NF-κB活性并且适合于在哺乳动物中长期进行衰老干预的小分子化合物。

含笑内酯(micheliolide，MCL)是一种天然愈创木烷型倍半萜内酯化合物(GSL)。据报道，MCL可通过抑制NF-κB活性进而抑制硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导的炎症性肠病、结肠炎相关癌症、风湿性关节炎和LPS诱导的小胶质细胞或免疫细胞炎症反应，以及减弱高葡萄糖诱导的NF-κB激活。MCL的水溶性二甲氨基Michael加成产物，二甲基氨基含笑内酯(DMAMCL，也称为ACT001)，可缓慢释放MCL进入血浆和体内。DMAMCL在体外和体内均可抑制胶质瘤细胞的生长并且最近在澳大利亚被批准用于治疗脑胶质瘤的临床试验(试验编号:ACTRN12616000228482)。DMAMCL还通过抑制NF-κB的表达和活性，显著延长人急性髓性白血病(AML)小鼠模型的寿命。此外，DMAMCL对动物的毒副作用非常低，使之成为一种能在体内长期使用的安全、合适的药物。然而，DMAMCL是否适合在哺乳动物中进行抗衰老干预，以及是否通过抑制NF-κB活性发挥抗衰老作用并且有望成为一种抗衰老药物仍然完全未知。

在本研究中，我们的目的是检测三种不同剂量的DMAMCL(又叫ACT001)长期处理15个月，对中年雄性C57BL/6小鼠健康寿命的影响，以及长期使用的安全性和毒性。我们提供的证据表明长期补充DMAMCL改善了小鼠多种重要的衰老相关退行性改变和功能衰退，而没有明显的副作用。在分子水平上，我们发现DMAMCL处理降低了血液中几种重要炎性细胞因子的水平，包括IL-6，IL-1α，IL-1β，TNF-α，IFN-γ和CXCL2，并抑制了几种老年组织中NF-κB的活性。我们从这项长期的给药研究中得出的结论为进一步研究DMAMCL能否成为一种有效的预防衰老相关生理衰退的抗衰老化合物提供了基本的证据。

一、DMAMCL抗衰老实验一：

1、DMAMCL处理对体重和生存率的影响

为了确定长期DMAMCL给药对衰老相关病理生理学的影响，我们用标准饮食(SD)喂养12月龄的雄性C57BL/6小鼠，每隔一天(EOD)通过灌胃摄入DMAMCL，连续给药15个月(图1B)。DMAMCL的化学结构如图1A所示。我们检测了三种剂量的DMAMCL，10(低)，25(中)和50(高)mg/kg/EOD，(相当于DMAMCL与药学上可接受的酯、盐和溶剂形成药剂后给予人体，即分别相当于人体1.1mg/kg、2.75mg/kg和5.5mg/kg的剂量)从12月龄开始一直到27月龄(n＝23只/组×4组：对照，10，25和50mg/kg)。

在15个月的干预期间，我们每隔一周测量一次小鼠的体重。我们发现10mg/kg/EOD处理组小鼠的平均体重在整个实验期间都与对照组小鼠非常相似(图1C和图9A)。然而，在DMAMCL处理10周后，25mg/kg/EOD处理组小鼠的平均体重开始变得比对照组小鼠轻，并且之后变得更轻(图1C和图9B)。然而，与其他三组小鼠相比，50mg/kg/EOD处理组小鼠没有显示出平均体重的剂量依赖性降低。50mg/kg/EOD处理组小鼠的平均体重在100周之前与对照组小鼠相似，然后开始变得小于对照组小鼠(图1C和图9C)。

在15个月的处理期间，我们还监测了对照组和DMAMCL处理组小鼠的生存曲线。在整个处理期间，对照组和三种剂量DMAMCL处理组小鼠之间的生存曲线和平均寿命均没有显著差异(图1D和图10A-C)。然而，我们注意到对照组和DMAMCL处理组小鼠的生存曲线在处理的后期开始分离。事实上，在15个月给药期结束时，三种剂量DMAMCL处理组中，每组均有8到10只小鼠仍然存活，而对照组只有5只小鼠存活(图1D，和图10A-C)。

2、DMAMCL处理改善了一些衰老相关的神经行为表型和身体活动能力

我们检测了对照组和DMAMCL处理组小鼠的多种生理、生化和分子指标。衰老伴随着认知功能的下降，包括学习和记忆能力的减弱。我们用Morris水迷宫实验检测了小鼠的学习和记忆能力。训练小鼠找到隐藏在水面下方的平台，平台在水池的固定位置。我们观察到与年龄一致的对照组老年小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理组老年小鼠在5天训练期间的潜伏期(即找到平台的时间)略有改善，但差异无统计学意义(图2A和图11A，B)。而高剂量DMAMCL处理组小鼠的潜伏期与对照组小鼠非常相似(图2A和图11C)。为了测试动物学习和记忆平台位置的准确程度，我们从水池中撤除平台并在第6天分析动物的游泳模式。在第六天，中剂量给药组老年小鼠第一次成功找到平台所需的时间显著少于对照组(图2B)。与该结果一致，中剂量处理组小鼠在第6天的平均游泳速度也显著大于对照组小鼠(图2C)。这些结果表明，长期中剂量DMAMCL处理显著改善了小鼠的空间学习和记忆能力。与对照组相比，我们还观察到低剂量给药组老年小鼠的空间学习和记忆能力有轻微的改善，但无统计学意义，高剂量给药组小鼠没有改善(图2B，C)。对目标探索进行测量发现与对照组小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠的目标象限所占时间百分比(TQ)可能轻微增加，其他象限所占时间百分比(OQ)可能稍有减少，但是差异无统计学意义(图2D)。此外，高剂量DMAMCL处理组小鼠和对照组小鼠之间的TQ和OQ没有差异(图2D)。

我们还用加速旋转的转棒实验测试了小鼠的运动协调和平衡能力。与对照组老年小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠从转棒上掉落的潜伏期可能有所改善，但差异无统计学意义，高剂量DMAMCL处理组小鼠和对照组小鼠之间没有差异(图2E)。

我们用跑步机实验检测了小鼠的运动能力。先训练小鼠在跑步机上跑步2天，随后第三天在加速的跑步机上测试小鼠的运动能力。我们观察到与对照组老年小鼠相比，三种剂量的DMAMCL处理组小鼠在跑步机上的跑步距离和时间均有所增加，但只有低剂量DMAMCL处理组显著增强了老年小鼠的运动能力(图2F，G)。

我们进一步用开放旷场实验(open field test，OFT)检测了小鼠的自发活动行为和探索行为。开放旷场实验是将小鼠置于一个开放的旷场装置中，允许小鼠自由地探索一个新的环境。高剂量DMAMCL处理组老年小鼠的活动总路程显著大于对照组(图2H)，低剂量和中剂量处理组小鼠和对照组小鼠之间没有差异。此外，与对照组小鼠相比，高剂量DMAMCL处理组小鼠的中央区活动时间明显减少，但差异无统计学意义(图2I)。另外，在高架十字迷宫实验中，高剂量DMAMCL处理组小鼠的开臂滞留时间百分比(开臂滞留时间/总时间)显著低于对照组(图2J)。这些结果表明，长期高剂量DMAMCL处理可能会有副作用，引起小鼠的焦虑行为。然而，低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠的中央区活动时间和开臂滞留时间百分比与对照组没有差异，这表明长期低剂量和中剂量DMAMCL处理更安全，没有引起小鼠的焦虑。

3、DMAMCL处理对小鼠骨骼和身体成分的影响

衰老相关的进行性骨质流失导致骨质疏松症，骨强度降低和骨折。我们用双能X射线吸收测定法(DEXA)测量小鼠的骨密度(bone mineral density，BMD)。与对照组相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理对骨密度没有任何可测量的影响。而高剂量DMAMCL处理导致了骨密度轻微低于对照组，差异有统计学意义(图3A)，这表明长期高剂量DMAMCL处理可能导致小鼠骨质流失。

衰老伴随着身体脂肪含量比例的增加和肌肉含量比例的减少(脂肪和肌肉量与体重相比)。因此，我们还通过DEXA检测了肌肉和脂肪量。与对照组小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠脂肪百分比降低，肌肉/脂肪比率升高，但差异无统计学意义(图3B，C)。相反，与对照组小鼠相比，高剂量DMAMCL处理组小鼠脂肪百分比增加，肌肉/脂肪比率降低，差异也没有统计学意义(图3B，C)。

4、DMAMCL处理对衰老相关的心脏结构变化没有明显作用但改善了舒张功能

衰老伴随着心脏结构和功能的显著变化。为了检测心脏衰老表型，我们进行超声心动扫描测量心脏的尺寸和功能。超声心动扫描所检测的一些心脏尺寸参数随着衰老而增加，包括左心室舒张末期内径(LVIDD)，左心室收缩末期内径(LVIDS)，左室后壁舒张期厚度(LVPWD)和左室后壁收缩期厚度(LVPWS)。与对照组老年小鼠相比，在低剂量DMAMCL处理下，这些参数可能略微减小，但差异无显著性，而中剂量和高剂量处理对这些参数没有任何可测量的影响(图3D-G)。

衰老也伴随着超声心动扫描所测量的一些心脏功能参数的降低，包括射血分数(EF)和左心室短轴缩短率(FS)。我们的结果显示DMAMCL处理没有改善这些心脏功能的下降，相反，低剂量DMAMCL处理略微减少了EF和FS但差异无统计学意义(图3H，I)。E/e'是评估左心室舒张功能和左心室充盈压(LVFP)非常重要的指标，E/e'的比值随着增龄而升高。我们观察到低剂量和中剂量DMAMCL处理组老年小鼠的E/e'比值显著低于对照组小鼠，而在高剂量处理组小鼠中该比例保持不变(图3J)。这些结果表明长期低剂量和中剂量DMAMCL处理可能改善老年小鼠的心脏舒张功能。

5、DMAMCL处理改善了一些基本的血液学指标

C57BL/6小鼠衰老伴随着外周血细胞组成的改变。因此，我们检测了所有DMAMCL处理组和对照组老年小鼠的基本血液学指标。老年小鼠的红细胞计数(RBC)，红细胞压积(HCT)，血红蛋白(HGB)和平均血红蛋白浓度(MCHC)显著降低，而红细胞分布宽度(RDW)显著增加。此外，红细胞平均体积(MCV)随着衰老轻微增加，而红细胞平均血红蛋白量(MCH)在衰老时几乎保持不变。与对照组老年小鼠相比，长期低剂量DMAMCL处理总体上升高了RBC，HCT和HGB，而所有剂量DMAMCL处理均显著升高了MCHC(图4A，B，E，G)。此外，与对照组相比，所有剂量DMAMCL处理都显著降低了MCV，并总体降低了RDW(图4C，D)。DMAMCL处理组和对照组的MCH相比几乎保持不变(图4F)。

老年小鼠的血小板计数(PLT)，血小板压积(PCT)，平均血小板体积(MPV)和血小板分布宽度(PDW)均显著增加。我们的结果显示所有剂量的DMAMCL处理均提升了PLT但无显著性差异(图4H)。此外，与对照组老年小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理只轻微增加了PCT，但高剂量DMAMCL处理显著升高了PCT(图4I)。相反，与对照组老年小鼠相比，所有剂量DMAMCL处理均可能导致MPV和PDW轻微降低，但只有低剂量DMAMCL处理显著降低了MPV(图4J，K)。

老年小鼠的白细胞计数(WBC)可能会增加，但差异无统计学意义。与对照组小鼠相比，在中剂量DMAMCL处理组小鼠中观察到WBC升高，而低剂量和高剂量DMAMCL处理组小鼠的WBC减少(图4L)，但差异均无统计学意义。

6、DMAMCL处理改善了一部分衰老相关的免疫变化

衰老伴随着免疫系统功能紊乱。免疫衰老表型影响到淋巴细胞，包括T，B和自然杀伤(NK)细胞数量减少，单核细胞和粒细胞比例增加。为了检测DMAMCL处理是否影响这些免疫衰老表型，我们用十色的多色流式细胞术定量DMAMCL处理组和对照组小鼠的免疫细胞亚群。我们的结果显示，与对照组老年小鼠相比，所有剂量的DMAMCL处理均导致T细胞比例增加，而中剂量处理显著提高了T细胞比例，差异具有统计学意义(图5A)。衰老伴随着表达记忆标志物如CD44和/或Ly6C的T细胞比例的增加。虽然低剂量DMAMCL处理组小鼠的Ly6C⁺T细胞可能有微弱的减少，但整体来看，所有剂量的DMAMCL处理对Ly6C⁺T细胞几乎没有影响(图5B)。

所有剂量DMAMCL处理均未逆转衰老相关的B细胞减少。相反，与对照组相比，所有剂量DMAMCL处理进一步降低了B细胞比例，但差异无统计学意义(图5C)。低剂量和高剂量DMAMCL处理几乎不影响粒细胞比例，中剂量DMAMCL处理虽减少了粒细胞比例，但差异没有统计学意义(图5D)。所有剂量DMAMCL处理均降低了衰老相关的Ly6C⁺单核细胞比例的升高，但差异无显著性(图5E)。此外，低剂量DMAMCL处理逆转了衰老相关的NK细胞和Ly6C⁺NK细胞比例的降低，但差异无统计学意义(图5F，G)。总之，这些结果表明DMAMCL处理改善了淋巴细胞内的部分免疫衰老表型(例如对T细胞，粒细胞，Ly6C⁺单核细胞，NK细胞和Ly6C⁺NK细胞的作用)。

7、DMAMCL处理显著降低了许多心肌酶谱指标，并改善了一些其他衰老相关的血液生化指标

衰老伴随着许多血液生化指标的变化，包括天冬氨酸氨基转移酶(AST或GOT)，乳酸脱氢酶(LDH)，丙氨酸氨基转移酶(ALT或GPT)，甘油三酯(TG)，总蛋白(TP)，和尿素(UREA)的增加，以及葡萄糖(GLU-God)和白蛋白(ALB)的减少。为了确定DMAMCL处理是否对这些衰老相关的改变有任何作用，我们对DMAMCL处理组和对照组小鼠进行了血液生化研究(血浆取自禁食状态的小鼠)。我们观察到DMAMCL处理对大多数心肌酶谱指标都有明显的作用(图6A-E)。几乎所有剂量的DMAMCL处理都会部分或显著地降低肌酸激酶(CK)，肌酸激酶Mb型(CK-MB)，α-羟丁酸脱氢酶(α-HBDH)，AST和LDH。此外，DMAMCL对这些指标的抑制作用可能在某种程度上显示出剂量依赖性方式(图6A-E)。我们注意到，与对照组小鼠相比，中剂量和高剂量DMAMCL处理组小鼠的ALT可能轻微的下降(图6F)，但是低剂量DMAMCL处理组小鼠的ALT却有所升高，但差异无统计学意义。

DMAMCL处理可能剂量依赖性地逆转衰老相关的GLU-God的减少，但差异无显著性(图6G)。几乎所有剂量的DMAMCL处理都轻微地降低衰老相关的TG(低剂量DMAMCL除外)和TP的增加，但差异无统计学意义(图6H，I)。相对于对照组小鼠，中剂量和高剂量DMAMCL处理组小鼠的ALB几乎保持不变，低剂量DMAMCL处理组小鼠的ALB可能轻微减少(图6J)。

与对照组小鼠相比，所有剂量DMAMCL处理都部分或显著地降低总胆固醇(TC)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)(图6K-M)。我们还观察到，DMAMCL处理组小鼠的LDL-C/HDL-C比率可能稍稍低于对照组小鼠但差异无统计学意义(图6N)。

DMAMCL处理可能非常轻微地减少衰老相关的UREA的增加，但差异无统计学意义(图6O)。与对照组小鼠相比，低剂量和高剂量DMAMCL处理显著降低了UA水平，而中剂量DMAMCL增加了UA水平但差异无显著性(图6P)。类似地，与对照组小鼠相比，低剂量和高剂量DMAMCL处理稍微降低了肌酐(CREA-J)水平，但差异无统计学意义，中剂量DMAMCL处理组小鼠的肌酐水平保持不变(图6Q)。

8、DMAMCL处理显著改善了老年小鼠的葡萄糖体内平衡

衰老与胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关。为了研究DMAMCL处理是否对衰老相关的葡萄糖耐量变化有作用，我们进行了口服葡萄糖耐量试验(OGTT)(禁食6小时)。所有剂量DMAMCL处理组小鼠的空腹血糖水平都低于对照组小鼠(图6R和图12A，B)。更重要的是，我们观察到低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠在OGTT峰值(15分钟)的血糖水平显著低于对照组，随后各时间点的血糖水平也低于对照组，但差异无统计学意义(图6R和图S4A)，这表明DMAMCL处理组小鼠的葡萄糖清除率更高。虽然高剂量DMAMCL处理也降低了OGTT的葡萄糖水平，但差异无显著性(图6R和图12B)。

9、DMAMCL处理显著降低了老年小鼠血液中几种重要的衰老相关炎症细胞因子的水平

与年轻个体相比，老年个体血液中一些炎症细胞因子的水平会升高，包括IL-6，TNF-α，干扰素(IFN)-γ，IL-18，IL-8和IL-1β等，并且这与老年个体发病率和死亡率的增加密切相关。NF-κB是调节这些炎症细胞因子表达的主要转录因子。因为DMAMCL可以抑制NF-κB活性，所以我们试图研究长期DMAMCL处理是否可以降低老年小鼠血液中炎症细胞因子的水平。因此，我们通过Luminex实验测量了血液中七种炎症细胞因子的水平，包括IL-6，IL-1α，IL-1β，TNF-α，IFN-γ，CXCL2和GM-CSF。所有剂量DMAMCL处理组小鼠的IL-6水平均显著低于对照组小鼠(图7A)。中剂量和高剂量DMAMCL处理显著地或部分抑制了IL-1α水平，而低剂量处理组和对照组小鼠之间没有明显差异(图7B)。与对照组小鼠相比，中剂量和高剂量DMAMCL处理分别轻微或显著地抑制了IL-1β水平，而低剂量DMAMCL处理对IL-1β水平没有明显影响(图7C)。与对照组小鼠相比，所有剂量DMAMCL处理均抑制了TNF-α水平，但仅低剂量DMAMCL处理组与对照组的差异有统计学意义(单尾t检验)(图7D)。与对照组小鼠相比，中剂量和高剂量DMAMCL处理也显著降低了IFN-γ水平(单尾或双尾t检验)(图7E)。此外，与对照组小鼠相比，所有剂量DMAMCL处理都降低了CXCL2水平，其中，中剂量和高剂量DMAMCL处理组与对照组比差异有统计学意义(分别为双尾或单尾t检验)(图7F)。所有剂量DMAMCL处理组小鼠的GM-CSF水平与对照组相比没有明显变化(图7G)。总之，这些结果表明，长期DMAMCL处理可以降低老年小鼠血液中几种重要的衰老相关炎症细胞因子的水平。

10、DMAMCL处理抑制了老年小鼠几种组织和器官中的NF-κB活性

最后，我们通过蛋白质免疫印迹方法检测DMAMCL是否能够抑制老年小鼠某些组织和器官中的NF-κB活性。与对照组相比，中剂量和高剂量DMAMCL处理大幅降低了心肌组织中的p-p65水平，升高了IκBα水平，表明中剂量和高剂量DMAMCL处理明显抑制了心脏中的NF-κB活性(图8A和图13A)。有报道MCL能通过增强NF-E2相关因子2(Nrf2)的活性来促进抗氧化蛋白血红素加氧酶-1(HO-1)的表达。我们也观察到DMAMCL处理增强了心脏中HO-1的表达(图13A)。与对照组相比，所有剂量的DMAMCL处理均显著抑制了脾中的NF-κB活性(图8B和图13B，C)。此外，与对照组相比，低剂量和高剂量DMAMCL处理组小鼠肾组织中的NF-κB活性降低，而Nrf2和HO-1的表达水平升高(图8C和图13D)。总之，这些结果表明DMAMCL处理抑制了老年小鼠多种组织和器官中的NF-κB活性。

结论

在哺乳动物的各种组织中，NF-κB的活性随着衰老而增加，并且与许多衰老相关的疾病和病理有关。越来越多的证据表明NF-κB激活与衰老过程之间存在着因果关系，并且通过遗传缺陷或药理学试剂抑制NF-κB的活性可减轻许多衰老相关的症状，延长各种动物模型的健康寿命和自然寿命。然而，目前仍缺乏能够靶向NF-κB活性并且适合于在哺乳动物中进行抗衰老干预的小分子化合物。DMAMCL能够在多种生理或病理生理条件下抑制NF-κB的活性。此外，DMAMCL是水溶性的，易于穿过血脑屏障(BBB)，并且已证实即使在体内长期使用对动物的副作用也非常低。这些特性使DMAMCL成为了一种适合进行抗衰老干预的药物。在本项研究中，我们使用三种不同剂量的DMAMCL处理中年C57BL/6雄性小鼠，通过检测DMAMCL对小鼠多种功能和结构衰老表型的作用，来确定DMAMCL处理是否能延缓哺乳动物衰老速率。我们的结果表明长期低剂量或中剂量DMAMCL处理能够减轻小鼠衰老相关的生理衰退，而高剂量DMAMCL可能引起有限的副作用。

我们发现，长达15个月的中剂量DMAMCL处理降低了小鼠的平均体重(图1C和图9A-C)。与该结果一致，与对照组小鼠相比，中剂量DMAMCL处理组小鼠的脂肪百分比降低且肌肉/脂肪比率增加(图3B，C)，中剂量和高剂量DMAMCL处理组小鼠的TG也降低(图6H)。这些结果表明，长期DMAMCL处理可能会影响小鼠的脂肪代谢。高剂量DMAMCL处理导致了BMD小幅度的但差异显著的降低，但在低剂量和中剂量DMAMCL处理组小鼠中未见这种副作用(图3A)。

我们观察到，与对照组小鼠相比，低剂量和中剂量DMAMCL处理改善了老年小鼠的空间学习和记忆能力(图2A-D)、运动协调、平衡(图2E)和身体活动能力(图2F，G)，但对探索行为没有影响(图2H-J)。这些结果表明，长期低剂量或中剂量DMAMCL处理可减轻神经功能和运动能力的衰退。NF-κB的激活以及炎症与神经退行性疾病有关，如阿尔茨海默病和帕金森病。我们之前发现MCL及其衍生物DMAMCL能够在小胶质细胞和小鼠模型中，通过抑制NF-κB活性抑制LPS诱导的神经炎症反应。此外，DMAMCL是水溶性的并且易于穿过BBB。总之，这些结果有力地表明，DMAMCL是否对包括阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病有作用值得进一步研究。同时，我们也注意到高剂量DMAMCL可能引起小鼠的焦虑行为(图2I，J)，但使用较低剂量的DMAMCL可以避免这种副作用。

DMAMCL处理对心脏结构和心脏功能相关的EF和FS的衰老相关改变没有作用(图3D-I)，但低剂量和中剂量DMAMCL处理显著降低了E/e'比值(图3J)。E/e'比值被认为是评估左心室充盈压(LVFP)，左心室舒张功能(LVDF)，急性和慢性舒张性心力衰竭(DHF)，急性心肌梗死(AMI)和急性冠状动脉综合征(ACS)的重要标志物。与此结果一致，DMAMCL处理也部分或显著地减弱了大多数心肌酶谱指标，包括CK，CK-MB，α-HBDH，AST和LDH(图6A-E)，这些指标在临床上用于诊断AMI和心肌损伤。总之，这些结果有力地表明DMAMCL可能具有心脏保护功能，并且值得进一步探索DMAMCL是否在各种心脏功能障碍中起作用。

DMAMCL处理升高了老年小鼠中降低的RBC，HCT，HGB和MCHC(图4A，B，E，G)，减少了老年小鼠中增加的RDW(图4D)。DMAMCL处理也增加了PLT和PCT，但减小了MPV和MCV(图4C，H-J)。这些血液学指标变化潜在的作用还需要进一步探索。

衰老相关的免疫改变，例如T细胞和NK细胞数量的减少，以及粒细胞和单核细胞比例的增加，被DMAMCL处理在不同程度上逆转(图5A，D-G)。考虑到NF-κB信号在调节免疫中发挥的关键作用以及DMAMCL是NF-κB活性的抑制剂，我们的结果表明长期DMAMCL处理似乎可以改善老年小鼠的免疫衰老表型，而不是抑制免疫系统。

长期DMAMCL处理部分或显著地降低TC，HDL-C和LDL-C(图6K-M)。这些结果表明，长期DMAMCL处理可能会影响小鼠的胆固醇代谢。DMAMCL处理对TP和ALB没有明显的作用(图6I，J)。长期DMAMCL处理部分或显著地降低AST，ALT(图6D，F)，UA以及CREA-J(图6P，Q)，而不是导致肝肾毒性。这些结果表明，DMAMCL处理似乎改善了老年小鼠的肝肾功能衰退，而且表明长期DMAMCL处理是安全的。

在OGTT实验中，我们观察到所有剂量的DMAMCL处理均部分或显著地降低了老年小鼠的血糖水平(图6R和图12A，B)。这些结果提示DMAMCL处理可以改善胰岛素敏感性和葡萄糖体内平衡，并可能预防衰老过程中的2型糖尿病。因此，DMAMCL能否对年龄或肥胖相关的胰岛素抵抗和2型糖尿病起预防作用值得进一步研究。

慢性，低水平的炎症是衰老的主要标志之一，称为“炎症衰老”。可通过测量老年个体血液中的一些炎性细胞因子、趋化因子和急性期蛋白来评估炎症衰老。在这些炎症标志物中，衰老相关的IL-6，TNF-α，IL-1β和IFN-γ等的升高是老年个体发病率和死亡率的强预测因子。我们发现用不同剂量的DMAMCL长期处理小鼠，可以不同程度地降低老年小鼠血液中IL-6，IL-1α，IL-1β，TNF-α，IFN-γ和CXCL2的水平(图7A-F)。在分子水平上，我们进一步证明DMAMCL处理抑制了老年小鼠几种组织和器官中的NF-κB活性(图8A-C和图13A-D)。总之，这些结果表明长期DMAMCL处理能抑制系统性炎症并减轻老年小鼠的“炎症衰老”。

应该提到的是，除了高剂量DMAMCL处理可能引起小鼠焦虑(图2I，J)和降低BMD(图2)之外，所有剂量的DMAMCL处理在整个15个月的干预期间都没有产生明显的毒性和严重的副作用。所有剂量的DMAMCL处理也没有增加死亡率。事实上，所有剂量的DMAMCL处理(包括高剂量)都可能提高了生存率，因为在15个月干预期结束时，三种剂量DMAMCL处理组中，每组都有8至10只小鼠存活，而对照组仅有5只小鼠存活(图1D和图10A-C)。这些结果表明DMAMCL处理具有良好的耐受性，长期DMAMCL处理对小鼠是安全的，这与之前的报道一致。目前DMAMCL(也称为ACT001)正在澳大利亚进行治疗胶质母细胞瘤患者的临床试验(试验ID：ACTRN12616000228482)。ACT001在复发性胶质母细胞瘤和其他晚期实体肿瘤患者中的I期剂量递增研究结果表明，在耐受剂量时，ACT001在一部分患者中展现出令人满意的生物利用度和抗肿瘤活性。ACT001剂量水平为100mg BID，200mg BID，400mg BID和600mg BID。所有剂量治疗的耐受性良好，在治疗10个月后未发生剂量限制性毒性。因此，病人的一期临床试验结果和我们在小鼠中的发现均表明DMAMCL的长期使用耐受良好且是安全的。因此，DMAMCL有望成为一种有前景的抗衰老药。根据我们用三种剂量DMAMCL干预小鼠得到的所有结果，我们建议用低至中剂量的DMAMCL(约15至20mg/kg/EOD，相当于对人体的给药量是120mg BID至160mg BID)在小鼠中进行更全面的衰老干预研究。

我们的研究有一些局限性。(1)我们仅检测了单个近交小鼠品系和性别(即雄性C57BL/6小鼠)。DMAMCL是否会改善其他品系和/或雌性小鼠的健康寿命需要在将来进行研究。(2)我们在小鼠12月龄时(中年老鼠)开始DMAMCL处理，在27月龄时结束。我们没有检测其他中间年龄或更老的小鼠。然而，从生存曲线上我们注意到，对照组和DMAMCL处理组雄性小鼠的存活曲线在干预后期开始分离(图1D和图10A-C)。研究结束时，在所有三种剂量的DMAMCL处理组中，存活的小鼠都比对照组多。该结果暗示，当在小鼠的老年阶段，即约20至22月龄，开始抗衰老干预时，DMAMCL处理对健康的改善可能更明显和有效。这种老年阶段的衰老干预策略可能具有更大的转化医学意义。该假设需要在将来进行验证。(3)由于每组样本量有限，我们在小鼠27月龄时结束了抗衰老干预。因此，我们没有获得DMAMCL处理小鼠的寿命延长信息。为了评估长期DMAMCL处理是否可以延长小鼠寿命(从中年或老年开始干预)，在将来需要更大的样本量来确定DMAMCL的寿命延长作用。

总之，在本研究中，我们首次证明长期DMAMCL处理能够改善小鼠的许多衰老相关的生理衰退，即促进小鼠的健康寿命。同时，我们证明长期DMAMCL处理对小鼠具有良好的耐受性和安全性。考虑到DMAMCL正在进行临床试验，我们从这项长期给药研究中得出的结论可能为开发DMAMCL作为有效的抗衰老化合物提供了一些线索。

二、抗衰老效果进一步实验二

(一)材料与方法

1、动物

92只7月龄的雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于北京大学医学部实验动物科学部。实验期间，小鼠单笼单只饲养，自由摄食饮水，房间保持温度为22±2℃，湿度为55±5％，光暗比12h/12h。在54周龄时，将小鼠随机分成4组：(A)对照组(n＝23)，(B)低剂量DMAMCL处理组(10mg/kg/EOD；n＝23)，(C)中剂量DMAMCL处理组(25mg/kg/EOD；n＝23)，和(D)高剂量DMAMCL处理组(50mg/kg/EOD；n＝23)。DMAMCL为白色粉末，易溶于水，分子量为409.47，分子式为C₁₇H₂₇NO₃·C₄H₄O₄，纯度为99.12％，由天津尚德药缘科技股份有限公司(中国天津)提供。DMAMCL粉末阴凉、密封保存(防止受潮)，使用时溶解在无菌水中。我们用隔天灌胃的方式来保证给药剂量的精确性，对照组给予等量的无菌水。整个实验期间，每两周测量一次小鼠体重，每天观察一次小鼠，记录每只小鼠的确切死亡日期。使用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线。所有研究方案均经北京大学医学部动物福利委员会批准(LA2017173，于2017年2月28日批准)。

2、转棒实验

用一个加速的转棒仪测量小鼠的运动协调和平衡能力。第1天，进行适应性试验，把小鼠放置在以恒定速度(4rpm)旋转的转棒上并且让小鼠在转棒上保持1分钟。第二天，将小鼠置于转棒上，转棒的转速在5分钟内从4rpm加速至40rpm。每只小鼠从转棒上掉下三次后实验结束，记录时间。每只动物进行3次试验，间隔为30分钟。计算每只小鼠三次实验结果的平均值，作为每只小鼠从转棒掉下来的潜伏期，并进行统计学分析(每组n＝8-12)。

3、开放旷场实验

开放旷场实验(open field test，OFT)用于检测小鼠自发活动行为和探索行为。实验装置由一个方形的灰色箱子组成，顶部是敞开的，底部被分成中央区和周边区。将小鼠轻轻地放置在旷场装置的中央，用录像系统记录小鼠在旷场内的活动，总时间5分钟。每只小鼠测试完后，用75％乙醇彻底清洁实验装置。测量值包括活动总路程和中央区活动时间(每组n＝13-14)。

4、跑步机实验

跑步机测试中，要求小鼠在跑步机上持续奔跑直至力竭。跑步机的跑道是水平的，一次可测试六只小鼠。第1天，让小鼠在4m min^-1恒定速度的跑道上适应性训练5分钟。第二天，每只小鼠在加速的跑道上进行测试。跑道加速条件为：试验开始的0-3分钟为7m min^-1，3-7分钟为12m min^-1，7-25分钟为15m min^-1，25分钟后为19m min^-1。当小鼠在10秒内受到三次电击或无法跑出电击区时，认为小鼠已经力竭。记录小鼠在跑步机上运动的总距离和时间(每组n＝9-10)。

5、高架十字迷宫实验

高架十字迷宫(EPM)由两个相对的开放臂(50×10厘米)和两个闭合臂(50×10厘米，被40厘米高的黑色墙围绕)组成，高出地面75厘米。当小鼠的四只爪子和尾巴根部都在臂内时，认为小鼠已经进入该臂。在每次实验开始时，将动物置于迷宫的中央，面向开放臂，然后记录小鼠5分钟内的活动情况。每次实验后，用75％乙醇溶液清洁迷宫，去除气味。实验的观察指标包括小鼠开放臂进入次数和停留时间以及闭合臂进入次数和停留时间，据此计算出开放臂停留时间比例。用开放臂停留时间比例的减少来衡量小鼠的焦虑状态(每组n＝14)。

6、Morris水迷宫实验

在第0天，训练小鼠找到藏于水面下的可见的平台，该平台在水池的固定位置，一共训练4次。然后，在接下来的5天，每只小鼠在隐藏平台的Morris水迷宫中接受每天4次的训练实验。当小鼠成功爬上逃避平台或者1分钟计时结束(以先到者为准)时，完成训练实验。为了评估动物学习和记忆逃避平台位置的准确性，我们在训练实验结束后第6天进行了探索实验。在第六天，我们测定了动物入水后第一次成功找到站台所需的时间(firsttime-D6)以及平均游泳速度(D6-probe_average speed)。此外，我们测定了探索实验中，小鼠在目标象限(target quadrant，TQ，原站台所在的象限)或其他象限(other quadrants，OQ)的搜索时间(每组n＝12)。

7、骨结构和身体成分分析

用UltraFocus DXA骨密度仪测量小鼠的骨密度(bone mineral density，BMD)和身体成分(肌肉重和脂肪重)。脂肪百分比和肌肉/脂肪比例根据原始数据计算得出(n＝10per group)。

8、超声心动图

用超声心动图评估小鼠的心脏结构和功能。1.5％异氟烷麻醉小鼠，允许自由呼吸。采用Vevo 770小动物超声仪(Visualsonics公司，加拿大)，30MHz探头探测胸骨旁左心室长轴切面和左心室短轴切面。于胸骨旁左心室短轴切面乳头肌水平应用M型超声记录左心室前后壁运动曲线，测量左室舒张末期和收缩末期内径(LVIDD和LVIDS)，舒张末期和收缩末期左室后壁厚度(LVPWD和LVPWS)。分析连续测量3个心动周期的参数，计算均值。根据标准方法计算左室短轴缩短率(FS)，射血分数(EF)和E/e'比值(每组n＝6-8)。

9、血液采集

用非肝素化的玻璃毛细管(直径1.0mm)穿刺小鼠的眼眶以收集血液样品。将血液样品收集在肝素抗凝管中。每个管立即翻转五次使抗凝血剂均匀分布。将肝素抗凝管在室温下放置1-2小时。然后，通过离心步骤(10分钟，5000×g，8℃)分离细胞和血浆。血浆用于血液生化指标评估和Luminex实验。细胞沉淀用于基于流式细胞荧光分选技术的外周血白细胞(PBLs)分析。

10、血液学指标检测

使用HEMAVET 950血液学分析仪测定全血细胞计数(每组n＝10)。

11、血液生化指标检测

使用迈瑞BS180全自动生化分析仪(迈瑞，深圳，中国)测量血清中的代谢物(每组n＝7-10)。

12、Luminex实验

用商品化的小鼠Luminex芯片(RnD,Cat#LXSAHM-07,R&D Systems Europe,Abingdon,UK)测量小鼠血清中的IL-6，IL-1α，IL-1β，TNF-α，IFN-γ，CXCL2和GM-CSF的水平(每组n＝10)。

13、基于流式细胞荧光分选技术(FACS)的外周血白细胞(PBLs)分析

每只小鼠的PBLs分析使用100μl的全血。将每种全血样品与荧光标记抗体混合在室温下孵育20分钟。接着用溶血素裂解红细胞3分钟。然后300g离心5分钟将细胞沉淀下来，用PBS缓冲液(PH＝7.2-7.4)洗涤细胞沉淀两次，然后离心。最后，将细胞悬浮在PBS缓冲液中并用10色流式细胞仪(Gallios,Beckman Coulter)进行分析。采集阈值设置在CD45通道上。每个样品总共检测80,000-140,000个白细胞。用分析软件来确定单个PBL的比例(每组n＝7-10)。

检测了以下主要白细胞亚群：T细胞(CD45.2⁺CD3⁺)，Ly6C⁺T细胞(CD45.2⁺CD3⁺Ly6C⁺)，B细胞(CD45.2⁺CD19⁺)，粒细胞(CD45.2⁺Ly6G⁺)，NK细胞(CD45.2⁺NK1.1⁺)，Ly6C⁺NK细胞(CD45.2⁺NK1.1⁺Ly6C⁺)，和Ly6C⁺单核细胞(非淋巴细胞，CD14⁺Ly6C⁺)。

14、口服葡萄糖耐量实验(OGTT)

小鼠禁食6小时后，灌胃2g/kg葡萄糖。在灌胃前和摄入葡萄糖后15,30,60,90和120分钟，使用ONETOUCH UltraEasy血糖仪测定血糖水平(每组n＝10)。

15、蛋白质免疫(Western)印迹分析

通过Western印迹分析测定p65，p-p65，IκBα，Nrf2和HO-1的蛋白质表达。抗p65，p-p65和IκBα的抗体购自Cell Signaling(Beverly，MA，USA)，抗Nrf2的抗体购自RuiyingBiological，抗GAPDH和β-tubulin的抗体购自Bioworld。用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解组织。然后将裂解液在4℃，12,000×g离心15分钟，收集上清液并用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。SDS-PAGE分离蛋白质，采用湿式转印法将蛋白质转移至NC(nitrocellulose)膜上，用洗膜缓冲液TBST洗涤5min，5％脱脂奶粉室温封闭1h，然后一抗4℃孵育过夜。在第二天，NC膜与二抗室温孵育1h，然后根据说明书用增强的化学发光试剂检测蛋白信号。

16、统计学分析

在所有实验中，数据均表示为平均值±SEM。若无特殊说明，用T检验分析组间的统计学差异。使用GraphPad(版本6.01)进行统计学分析。双尾P值小于0.05即被认为对照组和DMAMCL处理组之间存在统计学上的显著性差异。*P<0.05,**P<0.01,和***P<0.001的置信区间分别是95％,99％和99.9％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用。

2.根据权利要求1所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述二甲基氨基含笑内酯能抑制生物体组织中NF-κB活性。

3.根据权利要求1所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述二甲基氨基含笑内酯为水溶性二甲基氨基含笑内酯。

4.根据权利要求1所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，将二甲基氨基含笑内酯与医药上可接受的辅料制备成药剂。

5.根据权利要求4所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述药剂为液体剂、气体剂、固体剂型或半固体剂。

6.根据权利要求5所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述药剂为注射剂。

7.根据权利要求5所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述药剂为颗粒剂。

8.根据权利要求5所述二甲基氨基含笑内酯在制备抗衰老药物上的应用，其特征是，所述药剂为口服液。

Images