JP7152052B2 - カリマイシン又はその活性成分の用途 - Google Patents

Description

本発明は薬物分野に関し、具体的に、カリマイシン又はその活性成分の用途に関する。

カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）は、遺伝子組み換え技術によりカルボマイシン産生菌の４’’イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（４’’－ｏ－ａｃｙｌ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をスピラマイシン産生菌中にクローニングし、スピラマイシンの４’’－ＯＨを一定方向でアシル化し、４’’位にイソバレリル基側鎖を付加して形成される、４’’イソバレリルスピラマイシンを主要成分とした新規の抗生物質である。

カリマイシンは、数種のスピラマイシン誘導体からなり、主要な活性成分であるイソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）の総含量は６０％以上であり、薬学的に許容可能な薬物組成物である。中心構造は１６員環のマクロライド環で、１分子のホロサミン、１分子のミカミノース及び１分子のミカロースと結合してなる。その主要成分のイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩが、スピラマイシンの構造と異なる部分は、ミカロースの４’’位に結合するのがイソバレリル基であり、ヒドロキシ基でないことである。該薬は、瀋陽同聯などが１．１類新薬に共同で申請している。

カリマイシンの主成分の化学構造は、式（１）に示す通りである。

式中、Ｒ＝Ｈ、Ｒ’＝ＣＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩである。
Ｒ＝ＣＯＣＨ_３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩＩである。
Ｒ＝ＣＯＣＨ_２ＣＨ_３、Ｒ’＝ＣＯＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２のとき、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩである。
カリマイシンは１６員環マクロライド系抗生物質に属し、活性基のカルボキシル基、アルコキシ基、エポキシ基、ケトン基及びアルデヒド基、ならびに１対の共役したＣ＝Ｃを有し、分子量は約８８４～９８２である。似た化学構造を有するため、カリマイシン及びマクロライド系抗生物質は多くの共通性を有する。つまり、エステル類、アセトン、クロロホルム、アルコール類など多くの有機溶媒に易溶であり、石油エーテルに微溶であり、水に難溶である。分子構造中に２つのジメチルアミン基を含んで弱アルカリ性を呈し、酸性水溶液に易溶である。溶解度が温度の上昇に伴って低下する「負の溶解性」の性質を有する。カリマイシンの主要成分であるイソバレリルスピラマイシンの４’’位の炭素鎖は比較的長く、親水性が劣るため、水への溶解度はスピラマイシン及び４’’－アセチルスピラマイシンより低い。

カリマイシンは白色の非結晶粉末であり、吸湿性を少し有し、比旋光度は約－８０．８°、紫外線の最大吸収波長は２３１～２３２ｎｍである。それ自体に弱い蛍光発色基を持ち、濃硫酸又は塩酸で紫色を呈し、強い紫色の蛍光を発生させる。２３１～２３２ｎｍ部分に最大吸光度を有する。

該薬は親油性が良好で、組織浸透力が高く、内服吸収が速く、体内維持時間が長く、持続的な抗生物質持続効果を有する。薬効及び化学的立体配座の関係に基づくと、マクロライド系抗生物質の４’’位をアシル化すると、その親油性及び体内活性が上昇し、体内の抗菌活性及び臨床治療効果はいずれも顕著に上昇する。さらに抗生物質の体内における安定性は、４’’ヒドロキシエステルの炭素鎖の伸長に伴って高くなり、すなわちイソバレリルスピラマイシン＞ブチリルスピラマイシン＞プロピオニルスピラマイシン＞アセチルスピラマイシンである。

予備的な体内外での薬力学試験は、該薬が多くのＧ陽性菌に対して比較的良好な抗菌活性を有するだけでなく、一部のＧ陰性菌にも一定の作用を有することを表す。各技術指標はアジスロマイシン、エリスロマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシンより明らかに優れており、特に肺炎マイコプラズマに対する抗菌活性が最も高い。エリスロマイシン耐性菌、淋菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌、バクテロイデスフラジリス、レジオネラ菌、不活性の桿菌及びウェルシュ菌に対しても一定の抗菌活性を有し、エリスロマイシンに臨床的耐性を有する黄色ブドウ球菌に対してわずかな交差耐性を有する。カリマイシンは、主にグラム陽性菌感染症、特に上気道感染症の治療に用いられ、泌尿器系の感染などに用いられ得る。

本出願人は最近の研究で、カリマイシン又はその薬物活性成分であるイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ若しくはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ又はその組合せが、比較的良好な抗老化、抗糖尿病又は抗アルツハイマー病の作用を有することを発見した。薬物のカリマイシン又はその薬物活性成分のこの方面における臨床的普及のために理論的な根拠を提供し、さらに重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。

このことを考慮して、特に本発明を示す。

本発明の目的は、疾患を予防及び／又は治療するための薬物を提供することである。

上記目的を実現するため、本発明は以下の技術案を採用する。
疾患を予防及び／又は治療するための薬物について、前記疾患はアルツハイマー病、糖尿病又は老化である。前記薬物は第１活性成分を含み、前記第１活性成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１種；
又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。

さらに、前記薬物は第２活性成分も含む。
好ましくは、前記疾患がアルツハイマー病であるとき、前記第２活性成分は抗アルツハイマー病薬の少なくとも１種である。
前記疾患が糖尿病であるとき、前記第２活性成分は抗糖尿病薬の少なくとも１種である。
前記疾患が老化であるとき、前記第２活性成分は老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の少なくとも１種である。

さらに、前記薬物は、薬学的に許容可能な担体と共に、臨床的に許容可能な製剤、好ましくは錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤及び各種微粒子送達系が製造される。

さらに、前記薬物の用量は１０～１５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００～５００ｍｇ／ｋｇである。

本発明は、疾患を予防及び／又は治療するための配合剤をさらに提供し、前記疾患はアルツハイマー病、糖尿病又は老化である。前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の活性成分はカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１種；
或いはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種又は３種の組合せを含む。

さらに、前記配合剤は第２薬剤も含む。
好ましくは、前記疾患がアルツハイマー病であるとき、前記第２薬剤はアルツハイマー病を予防及び／又は治療するための関連薬物の少なくとも１種である。
前記疾患が糖尿病であるとき、前記第２薬剤は糖尿病を予防及び／又は治療するための関連薬物の少なくとも１種である。
前記疾患が老化であるとき、前記第２薬剤は老化を遅らせる、又は寿命を延ばす関連薬物の少なくとも１種である。

さらに、前記第１薬剤及び第２薬剤の用量比は１～９９：９９～１、好ましくは５～９５：９５～５、より好ましくは１０～９０：９０～１０、さらに好ましくは２０～８０：８０～２０である。

さらに、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための前記関連薬物は、コリン作動系に作用する薬物、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体に作用する薬物、抗酸化薬、抗炎症薬、Ａβタンパクの生成抑制薬、エストロゲン、神経成長因子、ニモジピン、抗アポトーシス剤を含む。
糖尿病を予防及び／又は治療するための前記関連薬物は、ビグアニド血糖降下薬、スルホニルウレア血糖降下薬、αグルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、非スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤又はインスリンの少なくとも１種を含む。

本発明は、アルツハイマー病、益智、糖尿病を予防及び／又は治療する、老化を遅らせる、或いは寿命を延ばす薬の調製における前記薬物又は前記配合剤の応用をさらに提供する。

具体的に、アルツハイマー病、益智を予防及び／又は治療する薬の調製における前記応用は、アセチルコリン加水分解を減少させる薬物の調製における応用、認知障害及び運動障害を改善する薬物の調製における応用、脳内神経細胞を保護する薬物の調製における応用、体重が低下しない、免疫力を向上させる、又は白血球を上昇させる薬物の調製における応用である。
糖尿病を予防及び／又は治療する薬の調製における前記応用は、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病又は特殊型糖尿病を予防及び／又は治療する薬の調製における応用であり、好ましくはインスリン分泌を促進する、又は血糖を低下させる、又は膵島β細胞を保護する薬物の調製における応用、或いは糖尿病を予防及び／又は治療して、体重を保持する薬物の調製における応用である。
老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の調製における前記応用は、転写因子ＤＡＦ－１６の活性を変化させることにより、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における応用；ＳＩＲ２の相同タンパクＳＩＲ２．１の発現レベルを高めることにより、ＳＩＲ２．１がさらにＤＡＦ－１６活性に影響を及ぼして老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における応用；或いはＡＭＰＫを活性化させることにより、直接ＦＯＸＯ／ＤＡＦ－１６の活性を増強し、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における応用である。

以下、本発明を詳細に記載する。
本発明の第１の目的は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬物を提供することである。

上記発明を実現するため、本発明は以下の技術案を採用する。
本発明は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための薬物を提供している。前記薬物の有効成分はカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩの１種；或いはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種又は３種の組合せを含む。

カリマイシンは数種の活性成分の混合物であり、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの３種の活性成分を含む以外に、その他の不純物も含む。

さらに、前記薬物は薬学的に許容可能な担体を含む。

さらに、前記薬物を用いて、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤及び各種微粒子送達系が製造される。

さらに、前記薬物の用量は１０～１５００ｍｇ／ｋｇである。

さらに、前記薬物の用量は５０～１０００ｍｇ／ｋｇである。

さらに、前記薬物の用量は１００～５００ｍｇ／ｋｇである。

本発明は、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための配合剤をさらに提供している。前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の活性成分はカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩの１種；或いはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種又は３種の組合せを含む。

さらに、前記配合剤は第２薬剤も含む。

さらに、前記第２薬剤はアルツハイマー病を予防及び／又は治療するための関連薬物の少なくとも１種を含む。

さらに、アルツハイマー病を予防及び／又は治療するための前記関連薬物は、コリン作動系に作用する薬物、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体に作用する薬物、抗酸化薬、抗炎症薬、Ａβタンパクの生成抑制薬、エストロゲン、神経成長因子、ニモジピン、抗アポトーシス剤を含む。

本発明は、アルツハイマー病、益智の予防及び／又は治療における上記いずれか１つの前記薬物又は配合剤の応用をさらに提供している。

アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性痴呆を主な臨床症状とする神経変性疾患である。コリン作動性仮説は、比較的早くに認められたアルツハイマー病（ＡＤ）の学説であり、コリン作動性障害はＡＤの重要な病因であると考えられ、コリン作動系もＡＤ薬物の重要な標的であると考えられる。実験により、本発明の薬物がアセチルコリン加水分解を減少させることにより、大脳海馬及び大脳皮質のアセチルコリン含量を増加させることを明らかにし、これにより認知機能を改善し、アルツハイマー病に対する予防及び／又は治療を実現した。

本発明は、アセチルコリン加水分解の減少における上記いずれか１つの前記薬物又は配合剤の応用をさらに提供している。

本発明は、認知障害及び運動障害の改善における上記いずれか１つの前記薬物又は配合剤の応用をさらに提供している。

本発明は、脳内神経細胞の保護における上記いずれか１つの前記薬物又は配合剤の応用をさらに提供している。

本発明は、体重が低下しない、免疫力を向上させる、白血球を上昇させることにおける上記いずれか１つの前記薬物又は配合剤の応用をさらに提供している。

本発明の第２の目的は、糖尿病を予防及び／又は治療するための薬物を提供することである。

本発明の第２の目的を実現するため、本発明は以下の技術案を採用する。
糖尿病を予防及び／又は治療する薬物において、前記薬物の有効成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。

本発明で述べる薬物は、薬学的に許容可能な担体を含む。

本発明で述べる薬物及び薬学的に許容可能な担体を用いて、錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤又は微粒子送達系を調製することができる。

本発明の前記薬物における有効成分の用量は、１００～４００ｍｇ１５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１００～５００ｍｇ／ｋｇである。

前記糖尿病は、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病又は特殊型糖尿病である。

糖尿病の病因は多く、糖尿病を予防及び／又は治療する本発明の薬物は、主にＴｈ１及びＴｈ２細胞及びその発現因子が不均衡である、ウイルスが人体に進入してβ細胞が失われる、ＵＣＰ２遺伝子が過剰に発現する、又は常染色体に異変が生じることによる糖尿病を対象とする。

本発明は、糖尿病を予防及び／又は治療する配合剤をさらに提供する。前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の有効成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。

本発明で述べる配合剤は第２薬剤も含み、前記第２薬剤は糖尿病治療に用いることができる薬物の少なくとも１種を含む。

好ましくは、前記第２薬剤は、ビグアニド血糖降下薬、スルホニルウレア血糖降下薬、αグルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、非スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤又はインスリンの少なくとも１種を含む。

好ましくは、第１薬剤及び第２薬剤の用量比は１～９９：９９～１、好ましくは５～９５：９５～５、より好ましくは１０～９０：９０～１０、さらに好ましくは２０～８０：８０～２０である。

本発明は、カリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの少なくとも１種を、糖尿病を予防及び／又は治療する薬の調製に用いる用途をさらに提供する。
前記糖尿病は、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病又は特殊型糖尿病である。

本発明は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの少なくとも１種を、インスリン分泌を促進する、又は血糖を低下させる、又は膵島β細胞を保護する薬物の調製に用いる用途をさらに提供する。

本発明は、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの少なくとも１種を、糖尿病を予防及び／又は治療して、体重を保持する薬物の調製に用いる用途をさらに提供する。

本発明の第３の目的は、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬を提供することである。

本発明の第３の目的を実現するため、本発明は以下の技術案を採用する。
老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす組成物について、前記組成物は第１活性成分を含み、前記第１活性成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。

さらに、前記組成物は第２活性成分も含む。

さらに、前記第２活性成分は、老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の少なくとも１種を含む。

本発明において、第１活性成分の少なくとも１種及び第２活性成分の少なくとも１種を用いて、合剤を製造することができる。

さらに、合剤を製造するとき、第１活性成分及び第２活性成分の用量比は１～９９：９９～１、好ましくは５～９５：９５～５、より好ましくは１０～９０：９０～１０、さらに好ましくは２０～８０：８０～２０である。

さらに、前記組成物及び許容可能な添加剤を用いて、薬物、健康食品又は食品添加物を調製する。

さらに、前記薬物は薬学的に許容可能な剤形である。

さらに、前記薬学的に許容可能な剤形は錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤及び微粒子送達製剤である。

本発明は、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす配合剤をさらに提供する。このうち、前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の活性成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。

本発明において、カリマイシンは数種の活性成分の混合物であり、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの３種の活性成分を含む以外に、その他の不純物も含む。

さらに、前記配合剤は第２薬剤も含む。

さらに、前記第２薬剤は抗老化又は老化を遅らせる薬の少なくとも１種を含む。

本発明において、第１薬剤及び第２薬剤を併用投与することもできる。併用投与するとき、第１薬剤及び第２薬剤の投与順は、先に第１薬剤を使用しても、先に第２薬剤を使用しても、２つの薬剤を同時に使用してもよい。

併用投与するとき、第１薬剤及び第２薬剤の用量比は１～９９：９９～１、好ましくは５～９５：９５～５、より好ましくは１０～９０：９０～１０、さらに好ましくは２０～８０：８０～２０である。

さらに、前記第１薬剤は薬学的に許容可能な剤形である。

さらに、前記薬学的に許容可能な剤形は、錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤及び微粒子送達製剤である。

本発明は、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす製品の調製における前記組成物又は配合剤の応用をさらに提供する。

具体的に、転写因子ＤＡＦ－１６活性を変化させることにより、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における前記配合剤の応用；ＳＩＲ２の相同タンパクＳＩＲ２．１の発現レベルを高めることにより、ＳＩＲ２．１がさらにＤＡＦ－１６活性に影響を及ぼして老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における応用；或いはＡＭＰＫを活性化させることにより、直接ＦＯＸＯ／ＤＡＦ－１６の活性を増強し、老化を遅らせる、及び／又は寿命を延ばす薬の調製における応用に関する。

さらに、前記製品は薬物、健康食品又は食品添加物である。

野生型カエノラブディティス・エレガンスを選択して投与群、ブランク対照群に分け、まず異なる濃度を投与した測定線虫の成長曲線を作成し；線虫の産卵量及び行動活動能力の変化などの寿命と関連する生理学的指標に対するカリマイシンの影響を研究により考察した。さらにカリマイシンを投与後、線虫に３７℃の高温ストレス、紫外線照射刺激を与え、生存率を測定する。

線虫を抗老化モデルに用いる利点は、以下の通りである。
線虫の６０～８０％の遺伝子及びヒトの関連遺伝子は高度に保存され、さらに現在までに発見されたシグナル伝達経路のうち、線虫は１２経路を有するため、本発明は抗老化薬をスクリーニングするモデル生物としてカエノラブディティス・エレガンスを利用する。線虫の豊富な遺伝資源を利用することができ、研究の目的に基づいて、適した突然変異体を選択し、老化及び抗老化のメカニズムを研究する。実質的に老化のメカニズムのいくつかの理論は、線虫で証明されている。従って、線虫に対して抗老化作用を有する薬物は、通常、ヒトにも同様の効果を有すると考えられる。

カエノラブディティス・エレガンスは寿命の分析に用いられ、その歴史は現在までにすでに３０年に及ぶ。その独特な特徴により、老化研究で最もよく知られたモデルとなっている。線虫の世代周期は短く、通常、寿命が短ければ３日前後であり、通常は３週間前後である。これにより、実験の繰り返しによる安定性が得られる。実験方法の信頼性及び実験結果の正確性を確実に保証し、薬物スクリーニングにおいて、より多くの正確で、信用できる情報を得ることができることを確実に保証するため、繰り返し実験は必要である。カエノラブディティス・エレガンスは以上の独特な特徴を有し、老化研究で最もよく知られたモデルとなっている。従って、線虫は組成物の抗老化作用の評価に用いることができ、さらには組成物が抗老化薬の調製に用いられるかを判断する。

研究結果は、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスに対して抗老化作用を有することを表している。

本発明において、本分野で通常の方法により、前記薬物を用いて薬学的に許容可能な各種剤形、例えば錠剤、カプセルなどを調製することができる。

本発明において、前記薬物の用量は１０～１５００ｍｇ／ｋｇ；好ましくは５０～１０００ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１００～５００ｍｇ／ｋｇである。

本出願人は、試験により、カリマイシン又はその薬物活性成分のイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ若しくはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ又はその組合せが、比較的良好な抗アルツハイマー病、抗糖尿病又は抗老化の作用を有することを証明する。薬物のカリマイシン又はその活性成分のこの方面における臨床的普及のために理論的根拠を提供し、さらに重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。

図１は、本発明のラットＹ迷路試験における各群ラットのＹ迷路自発的交替行動率である。 図２は、本発明のラットＹ迷路試験における各群ラットの総アーム進入回数である。 図３は、本発明のラット新奇物体認識試験における各群ラットの１ｈ後の新奇物体に対する選好指標である。 図４は、本発明のラット新奇物体認識試験における各群ラットの２４ｈ後の新奇物体に対する選好指標である。 図５は、本発明のラット新奇物体認識試験における各群ラットの１ｈ後の新奇物体に対する識別指数である。 図６は、本発明のラット新奇物体認識試験における各群ラットの２４ｈ後の新奇物体に対する識別指数である。 図７は、本発明のラット水迷路試験における各群ラットの逃避潜時である。 図８は、本発明のラット水迷路試験における各群ラットのプラットフォーム横断回数である。 図９は、本発明のラット水迷路試験における各群ラットの遊泳速度である。 図１０は、カリマイシン投与後の寿命周期に対する影響である。 図１１ａは、５μｇ／ｍｌのカリマイシンを投与後の運動指標である。 図１１ｂは、１０μｇ／ｍｌのカリマイシンを投与後の運動指標である。 図１２は、カリマイシンを投与後、熱ストレス反応下での生存率である。 図１３は、カリマイシンを投与後、ＵＶ照射下での生存率である。 図１４ａは、カリマイシン投与１０日後の蛍光強度である。 図１４ｂは、カリマイシン投与１５日後の蛍光強度である。 図１５は、カリマイシンを投与後の蛍光強度である。 図１６ａは、カリマイシン投与６日後のＴＪ３５６線虫におけるＤＡＦ－１６の核内移行状況である。 図１６ｂは、カリマイシン投与６日後のＴＪ３５６線虫における蛍光強度である。

図中、ＫＬはカリマイシンを、ＲＥＳはレスベラトロールを表す。
本発明の実施例の目的、技術案及び利点をより明確にするため、以下、本発明の実施例を組み合わせて、実施例中の技術案を明確、完全に記載する。以下の実施例は本発明を説明するのに用いるが、本発明の範囲を限定するものではない。

説明する必要があることは、以下の実施例に関する薬物のカリマイシンが、イソバレリルスピラマイシンＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１種或いは数種の組合せでもよいことである。

カリマイシン錠
規格：２００ｍｇ／３５０ｍｇ
裸錠の処方：
カリマイシン ２００ｇ
微結晶セルロース １１０ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム ２２ｇ
ポビドンＫ_３０（５％） １５ｇ
ステアリン酸マグネシウム ３ｇ
製造 １０００錠
コーティング液の処方：
オパドライＩＩ ２１ｇ
蒸留水 適量
製造 １０５ｍｌ

調製工程：
裸錠の調製：主薬及び添加剤をそれぞれ１００メッシュに通し、処方量のカリマイシン、微結晶セルロース及び処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウムを均一に混合する。その後５％ポビドンＫ_３０水溶液を添加して練合物を作製し、１８メッシュで造粒し、湿潤顆粒を６０℃の通風条件下で２ｈ乾燥させる。乾燥後１８メッシュで整粒し、さらに処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合した後、直径１１ｍｍの臼で打錠すると、重量が３５０ｍｇ、硬度が６．５ｋｇの薬物含有裸錠が得られる。

コーティング液の調製：調製容器中に必要なオパドライＩＩ（白色）を量り、必要量の水を添加する。何回かに分けて添加し、すべて添加した後、撹拌速度を低下させて渦を消失させ、引き続き３０ｍｉｎ撹拌して得られる。

フィルムコーティング錠の調製：裸錠をコーティングパン内に入れる。コーティング条件を確定し、主機の速度２０ｒ／ｍｉｎ、給気温度４０℃、排気温度３０℃、噴霧圧力０．０２ＭＰａ、噴霧流量１ｍｌ／ｍｉｎでコーティングを行う。安定すると、錠剤表面が滑らかで、色合いが均等になるまで噴霧コーティングを１．５ｈ続け、フィルムコーティングの検査基準に符合すると合格である。コーティングで重量が５％前後増す。

カリマイシン素錠（１００００錠で計算）
処方：
カリマイシン原料粉末 １０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％） ９２．５ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム（３％） ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％） １８．５ｇ
デンプン 総重量－その他の原料、添加剤の重量
総重量 １８５０ｇ

調製工程：適量のデンプンを秤取して１５％濃度まで希釈し、糊状になるまで加熱して接着剤を作製する。主原料のカリマイシン、添加剤のデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムをそれぞれ１００メッシュに通し、処方量に応じて、必要な主原料及び添加剤を秤取する。薬物Ａ、デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを均一になるまで十分に混合した後、１５％濃度のデンプン糊で練合物を作製する。１４メッシュで造粒し、５０～６０℃で乾燥させて、水分を３～５％に制御し、１４メッシュで整粒する。カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、顆粒含量を測定する。顆粒含量に基づいて錠剤の重量を計算し、打錠（Φ９ｍｍの臼）して、錠剤重量の差を測定する。検査に合格後、包装する。

カリマイシンカプセル剤（１００００粒で計算）
処方：
カリマイシン原料粉末 １０００ｇ
デンプン １０８０－薬物Ａ原料粉末の重量
薬用３号カプセル １０００粒
流動パラフィン ５０ｍｌ

調製工程：主原料のカリマイシン、添加剤の薬用デンプンを工程の処方量に応じてそれぞれ秤取した後、混合器に入れて１．５～２時間十分に混合する。サンプリングし、含量を測定して得られたデータは、理論データと基本的に一致するべきである（各カプセルに詰める重量は約０．１０５ｇである）。検査に合格した薬用３号カプセル及び混合した原料を全自動カプセル充填機の操作の要求に応じ、それぞれローディング装置に入れて充填し、充填したカプセルに対して有意検定を行う（±１０％以内、＜０．３ｇ）。溶出率は要求に符合する。検査後、要求に符合するカプセルを艶出し機内に入れ、流動パラフィンを添加して１５～２０分間艶出しを行った後、取り出して完成品の包装及び検査を行う。

カリマイシンドライシロップ（１００００袋で計算）
処方：
カリマイシン原料粉末 １２５０ｇ
クエン酸（０．５％） １５ｇ
スクロース 総重量－その他の原料、添加剤
総重量 約５０００ｇ
色素（クルクミン） 約１ｇ

調製工程：カリマイシン原料粉末、クエン酸、スクロースをそれぞれ高速気流粉砕機で粉砕し、顆粒の８５％が３００メッシュを、１５％が１８０メッシュを通るようにする。その後、粉砕した微粉を処方量に応じて秤取後、１～１．５時間十分に混合し、その含量を測定し、容量（理論容量は各袋５００ｍｇ）を計算する。その後混合物を包装機中に入れ、アルミ箔を取り付け、包装機の操作の要求に応じて包装する。容量の差は±５％以内であり、包装後、検査に合格したものの外部包装を行う。

カリマイシン顆粒剤（１００００袋で計算）
処方：
カリマイシン原料粉末 １２５０ｇ
粉糖 ２００００ｇ
デキストリン ９０００ｇ
５％ＰＶＰ－Ｋ_３０ 適量

調製工程：カリマイシン原料粉末、粉糖、デキストリンを１２０メッシュに通し、処方量に応じてカリマイシン、粉糖、デキストリンを秤取して均一に混合する。均一に混合した上記材料を５％ＰＶＰ－Ｋ_３０溶液を用いて練合物にし、振動造粒機で造粒し、７０℃で乾燥させて整粒する。検査に合格後、包装する。

カリマイシン凍結乾燥粉末注射剤
カリマイシン原料粉末５００ｍｇおよび等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、５ｍｌ水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、ｐＨは４．６～５．６の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール４０ｍｇを添加し、低温で９ｈ急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に１０ｍｌの滅菌水で溶解する。

試験例１、細胞実験によりカリマイシンが膵島細胞保護作用を有するかどうかを確定する
測定の目的は、測定試料カリマイシンの体外での膵島β細胞保護作用を評価することである。
細胞株：ラットインスリノーマ細胞ＩＮＳは、中国医学科学院基礎研究所細胞資源中心から購入する。
試薬：
ＲＰＭＩ１６４０培地、ウシ血清は米国Ｇｉｂｃｏ社から購入する。トリプシン、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）、アロキサン（Ａｌｌｏｘａｎ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、純度≧９８．０％）はいずれも米国Ｓｉｇｍａ社から購入する。
機器：
炭酸ガスインキュベータ（Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）、酵素免疫測定装置（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）、９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）、倒立顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ、Ｃｈｉｎａ）。

操作の工程は以下の通りである。
接着細胞：
ＩＮＳ－１は接着細胞である。対数期のＩＮＳ－１細胞をトリプシンで消化し、完全培地で吹き付けて、単一の細胞懸濁液を調製し、細胞濃度を１×１０^５個／ｍｌに調整する。９６ウェル細胞プレートに各ウェル１００μｌで接種し、５％ＣＯ_２、３７℃インキュベータで２４ｈ培養する。実験の需要に基づいて群分けし、投与群の細胞に２４ｍｍｏｌ／Ｌのアロキサンを投与して損傷させ、それと同時にそれぞれ異なる濃度（０．２、０．４、０．８ｍＭ）の測定薬物カリマイシンを投与する。各濃度に４つの重複ウェルを設定し、３７℃で引き続き２４ｈ培養する。他に、正常対照群（いずれの薬物も投与しない）、モデル群（アロキサンのみを投与して損傷させる）、陽性対照群（アロキサン処理を基にメトホルミン０．５ｍｍｏｌ／Ｌを添加する）も設定する。上清液を捨て、ＰＢＳで慎重に３回洗浄し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む新しく調製した培地を１００μＬ添加し、３７℃で続けて４ｈ培養する。慎重に上清を除去し、１５０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、小型振盪器で１０ｍｉｎ均一に混合した後、マイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ部分の光学密度値を測定する。

結果の評価：
下式により、薬物によるＩＮＳ－１細胞の生存率を計算する。
ＩＮＳ細胞の生存率（％）＝Ａ_４９２（投与群）／Ａ_４９２（正常対照群）×１００％
結果：膵島細胞の保護に対する測定薬物の評価結果は、下表１の通りである。

試験例２：
測定の目的は、糖尿病マウスの血糖に対する測定試料カリマイシンの作用を評価することである。
試薬：
アロキサン（Ａｌｌｏｘａｎ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、純度≧９８．０％）及びメトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ、純度９７％）は、いずれもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から提供される。
インスリン測定キットは、上海栄盛生物薬業有限公司から購入する（ロット番号：Ｅ０２Ｉ０００６）。
機器：
Ｏｎｅ－ｔｏｕｃｈ血糖測定器及び血糖値試験紙（米国ジョンソンエンドジョンソン）、電子分析天秤。
動物：
ＳＰＦグレード昆明マウス、体重１８～２０ｇ。

方法：
カリマイシンの血糖降下作用の研究は、昆明マウスを用い、アロキサン１６０ｍｇ／ｋｇを１回腹腔注射してモデルを作製する。その後、血糖値がモデルレベル（１０～２５ｍｍｏｌ／Ｌ）で安定したマウスを選んで、無作為にモデル対照群、陽性対照群（メトホルミン２００ｍｇ／ｋｇ）、投与群（薬物のカリマイシン、２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ）に分け、さらに生理食塩水を胃内注入する正常対照群も設定する。

モデル作製後、３０、４５日間胃内投与を行い、１６ｈ絶食させ、マウスの体重を量る。計量後、断尾採血し、血糖値測定器で空腹時血糖値を測定する。空腹時血糖値を測定した後、引き続き１回胃内投与し、２ｈ後、各群マウスに２ｇ／ｋｇでグルコース溶液を胃内投与する。断尾採血し、グルコース投与後０、０．５、２ｈの血糖値（Ｂｇ０、Ｂｇ０．５、Ｂｇ２）を測定し、下式で血糖曲線下面積（ＡＵＣ）（耐糖能を反映する）を計算する：
ＡＵＣ＝０．２５×（Ｂｇ０＋４×Ｂｇ０．５＋３×Ｂｇ２）。

モデル作製後、４５日間胃内投与を行い、１６ｈ絶食し、眼底静脈叢から採血する。採血の前に、毛細管をヘパリンで湿らせ、眼底静脈叢から０．５ｍｌ採血し、３５００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、血漿を分離して測定に備える。上清液を吸い取り、ＥＬＩＳＡ法でインスリンを測定する。具体的な操作はキットの説明書に基づいて行う。

インスリン抵抗指数（Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）の測定：空腹時の血糖及びインスリン濃度を測定した後、公式でインスリン抵抗指数を算出する。
インスリン抵抗指数＝空腹時血糖×空腹時インスリン／２２．５（最近＞２．６であればインスリン抵抗性有と判断すると示された）

すべてのデータはＳＰＳＳ１６．０ソフトウェアで統計分析を行い、実験で得られたデータはいずれも平均値プラスマイナス標準偏差（ｘ±ｓ）で表す。一元配置分散（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）検定で各群の平均間の差を比較し、Ｐ＜０．０５は有意差があることを表す。結果は表２～表６に示す通りである。モデルを作製し、３０日及び４５日間胃内投与すると、正常対照群と比較して、モデル群動物の体重は顕著に低下し、空腹時血糖は顕著に上昇し、耐糖能は低下する。空腹時血清に対するインスリンの影響は明らかでないが、インスリン抵抗指数は顕著に上昇する。

カリマイシンは、糖尿病マウスの体重低下の症状を改善し、マウスの空腹時血糖を低下させ、耐糖能を上昇させる。空腹時血清に対するインスリンの影響は明らかでないが、インスリン抵抗指数を低下させることができ、カリマイシンが良好な血糖降下効果を有することを表す。

試験例３、両側海馬のＣＡ１領域にＡβ_１－４２を注射したＳＤラットのＡＤモデルに対するカリマイシンの影響
実験動物：
健康な雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（ＳＰＦグレード）（体重２２０～２６０ｇ）は、遼寧長生生物技術有限公司（許可証番号：ＳＣＸＫ（遼）２０１５－０００１）から購入する。
実験薬品及び試薬：
カリマイシン
Ａβ_１－４２：Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）から購入
レスベラトロール（Ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）：阿拉丁公司（Ｌｏｔ＃Ｋ１４１４０５２）（Ｌ．Ａ．、ＣＡ、ＵＳＡ）
実験機器：
脳定位固定装置：米国Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、型番５１６００（Ｋｉｅｌ、ＷＩ、ＵＳＡ）
Ｍｏｒｒｉｓ水迷路及び自動収集分析装置：北京碩林苑科技有限公司（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）
Ｙ迷路及び自動収集分析装置：北京碩林苑科技有限公司（Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）

操作工程：
群分け：雄ＳＤラット（体重２２０～２６０ｇ）に３日間適応給餌する。自由に飲水、摂餌させ、１２ｈで昼夜を繰り返す。無作為に仮手術対照群、モデル群、カリマイシン２５、５０及び１００ｍｇ／ｋｇ、陽性薬レスベラトロール３０ｍｇ／ｋｇの６群に分ける。

実験過程：Ａβ_１－４２をヘキサフルオロイソプロパノール／滅菌生理食塩水溶液で濃度が２μｇ／μＬになるように溶解し、４℃で２４ｈインキュベートして老化させ、Ａβオリゴマーを形成させて使用に備える。手術時、３．５％の抱水クロラール（３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射してラットを麻酔した後、脳定位固定装置に固定する。大泉門を円の中心として、後に３．６ｍｍ、左右±２．５ｍｍ、針の深さ３．１ｍｍで、マイクロシリンジを用いて両側海馬のＣＡ１領域に１回注入する。各側海馬は５ｍｉｎ内に２．５μＬ（０．５μＬ／ｍｉｎ）注射し、針を５ｍｉｎ残しておき、ラット認知症モデルを作製する。仮手術対照群ラットには、同じ操作方法で両側海馬のＣＡ１領域に同体積の生理食塩水を注射する。すなわち動物モデルはＡβ_１－４２を側脳室に注射する方法でモデル作製し；仮手術対照群ラットには、同じ操作方法で両側海馬のＣＡ１領域に同体積の生理食塩水を注射する。アミロイドβタンパク質（Ａβ）のアミロイド斑は現在公認されているＡＤの病理マーカである。以上の動物モデルを採用して、カリマイシンが中枢神経系疾患アルツハイマーを治療する作用が十分に理論的根拠を有するかを考察する。

モデル構築後２日目、仮手術対照群及びモデル群に相応する溶媒を胃内投与し、その他の各実験群にはそれぞれカリマイシン２５、５０及び１００ｍｇ／ｋｇ及び陽性薬レスベラトロール３０ｍｇ／ｋｇを胃内投与する。海馬内にＡβ_１－４２を注射した後、１２日目から順番にＹ迷路、新奇物体認識及び水迷路試験を開始する。行動学実験期間は、行動学実験が終了するまで毎日１回引き続き投与する。

ラットＹ迷路試験：投与１２日目に、各群ラットにＹ迷路試験を行う。ラットＹ迷路試験は、ラットの自発的交替行動及び動作記憶に対するカリマイシンの影響を考察することを目的とする。装置は夾角が１２０度の３つの木製アームからなり、それぞれＡ、Ｂ、Ｃの３つのアームである。実験はラットをＡアームの末端に置き、自由に３つのアームに出入りさせ、８ｍｉｎ内に各ラットが３つのアームに進入する総回数及びアームに進入する順序を記録する。連続して３つの異なるアームに進入したのを１回の正確な交替行動とし、正確な交替行動の回数を記録する。自発的交替行動率を用いて、空間の動作記憶能力を反映する。

ラット新奇物体認識試験：投与１４～１５日目に、各群ラットに新奇物体認識試験を行う。ラット新奇物体認識試験は、ラットのイメージ識別記憶に対するカリマイシンの影響を考察することを目的とする。実験装置は黒色のプラスチックで円形のオープンフィールドであり、直径約６０ｃｍ、高さ２０ｃｍである。本実験は、適応段階及び測定段階に分けられる。適応段階では、毎回２～３匹のラットをオープンフィールドに入れ、３ｍｉｎ自由に探索させて環境に適応させ、これを毎日２回、２日間行う。３日目に測定を行う。毎回１匹のラットをオープンフィールドに入れ、先に３ｍｉｎ自由に探索させてから、ラットを取り出す。２つの同じ物体（Ａ１、Ａ２）をオープンフィールドの中央に置き、ラットを入れ、５ｍｉｎ内で２つの物体を探索する時間（ｔＡ１、ｔＡ２）を記録する。１ｈ後、物体Ａ２を新しい物体Ｂに変え、ラットを再び入れ、２つの物体を探索する時間（ｔＡ１、ｔＢ）を記録する。２４ｈ後、物体Ｂを物体Ｃに変え、ラットを再び入れ、２つの物体を探索するのに要する時間（ｔＡ１、ｔＣ）を記録する。探索の判定基準はラットが鼻で物体を指し、物体までの距離が１ｃｍ以内であるか、又は鼻が触れる、物体を舐める、又は前爪で物体に触れる、である。新奇物体の選好指標（Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｄｅｘ）及び識別指数（Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）を計算する。
選好指標の計算式は以下の通りである。
選好指標（１ｈ）＝ｔＢ／（ｔＡ１＋ｔＢ）
選好指標（２４ｈ）＝ｔＣ／（ｔＡ１＋ｔＣ）
識別指数の計算式は以下の通りである。
識別指数（１ｈ）＝（ｔＢ－ｔＡ１）／（ｔＡ１＋ｔＢ）
識別指数（２４ｈ）＝（ｔＣ－ｔＡ１）／（ｔＡ１＋ｔＣ）

ラット水迷路試験：投与１６～２０日目に、各群ラットにＭｏｒｒｉｓ水迷路試験を行う。Ｍｏｒｒｉｓ水迷路試験は、空間学習記憶障害に対するカリマイシンの影響を考察することを目的とする。水迷路装置は直径１．５メートル、高さ５０センチメートルの黒色でステンレスの円形プール、及び直径１０センチメートルの円形で金属の１つのプラットフォームからなり、プラットフォームは自由に位置を移動することができる。実験前、プールに注水（水温２４±１℃）し、水面の高さをプラットフォームより１センチメートル高くする。訓練段階では、毎日午前午後にそれぞれ１回訓練し、６日間続ける。プラットフォームは第４象限に置き、ラットをプール壁に向かって水中に入れ、９０秒を記録する。９０秒内でラットがプラットフォームを見つけた場合、プラットフォーム上で１０秒休憩させ、９０秒でプラットフォームを見つけなかった場合、ラットをプラットフォーム上に誘導して１０秒休憩させる。訓練終了後、測定する。プラットフォームを撤去して、ラットを９０秒自由に泳がせる。迷路システムはラットが元のプラットフォームの象限（目標の象限）に留まる時間を自動的に記録する。

結果：
Ｙ迷路はラットの動作記憶能力を測定する。実験結果は、仮手術対照群と比較して、モデル群ラットのＹ迷路自発的交替行動率は顕著に低下し；モデル群と比較して、カリマイシン（２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ）群及びレスベラトロール（３０ｍｇ／ｋｇ）対照群ラットのＹ迷路自発的交替行動率は顕著に増加することを表している（図１を参照）。各群ラットの総アーム進入回数は有意差を示さない（図２を参照）。Ａβ_１－４２誘導によるラットの動作記憶障害をカリマイシンが改善することができることがわかる。

新奇物体認識試験はラットのイメージ記憶能力を測定する。実験結果は、Ａ１及びＡ２の２つの同じ物体に対する各群ラットの識別指数は有意差がないことを表している（表７を参照）。新奇物体認識試験において、仮手術対照群と比較して、モデル群ラットは１ｈ及び２４ｈ後、新奇物体の選好指標及び識別指数が顕著に低下し；モデル群と比較して、カリマイシン及びレスベラトロール群ラットは、１ｈ及び２４ｈで、新奇物体に対する選好指標（図３、図４を参照）及び識別指数（図５、図６を参照）がいずれも顕著に上昇する。従って、Ａβ_１－４２誘導によるラットのイメージ記憶障害をカリマイシンが改善する。

Ｍｏｒｒｉｓ水迷路はラットの学習記憶能力を測定する。実験結果は、ナビゲーションテストにおいて、訓練回数の増加に伴い、各群実験ラットの逃避潜時はいずれも短くなることを表しており、ラットの空間探索学習能力がいずれも上昇することを示している。実験２日目、仮手術対照群と比較して、モデル群ラットの逃避潜時は顕著に延長され；モデル群と比較して、カリマイシン及びレスベラトロール群の逃避潜時は顕著に低下し、３日及び４日目、この傾向は保持される（図７を参照）。

プローブテストの結果は、仮手術対照群と比較して、モデル群ラットがプラットフォームを横断する回数は顕著に低下し；モデル群と比較して、カリマイシン及びレスベラトロール群のプラットフォーム横断回数は顕著に上昇し（図８を参照）；各群ラットの遊泳速度に有意差がない（図９を参照）ことを示し、カリマイシン及びレスベラトロールはラットがプラットフォームを横断する回数を上昇させることができることを説明している。実験結果は、Ａβ_１－４２誘導によるラットの学習記憶及び空間探索能力の障害をカリマイシンが改善することができることを表している。

上記試験は、本発明の薬物が中枢神経系疾患アルツハイマーに対して比較的良好な治療作用を有することを証明している。中枢神経系疾患の治療における本発明の薬物の応用及び臨床的普及のために理論的根拠を提供するだけでなく、重要な経済的及び社会的利益及び効果を備える。

試験例４、寿命試験により、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスに対して寿命延長作用を有するかどうかを確定する
実験材料、試薬及び機器
１．１菌株、線虫
Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０ 瀋陽薬科大学実験室に保存
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ Ｎ２ 瀋陽薬科大学実験室に保存
１．２主要な試薬
無水エタノール（分析試薬） 北京化工廠
水酸化ナトリウム（分析試薬） 北京化工廠
トリプトン ＯＸＯＩＤ
寒天末 鼎国生物工程公司
酵母粉末 ＯＸＯＩＤ
塩化ナトリウム（分析試薬） 北京化工廠
塩化カルシウム（分析試薬） 北京化工廠
コレステロール（分析試薬） 上海化学試剤公司
硫酸マグネシウム（分析試薬） 北京化工廠
硫酸カリウム（分析試薬） 北京化工廠
リン酸二水素カリウム（分析試薬） 上海試剤二廠
リン酸水素二ナトリウム（分析試薬） 北京化工廠
ジメチルスルホキシド
１．３主要な機器
ゲル撮影装置 Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
クリーンベンチ 蘇州浄化設備有限公司
生化学インキュベータ 哈爾濱東聯電子技術開発有限公司
７５２型分光光度計 上海精密科学儀器
光学顕微鏡 ＯＬＹＭＰＵＳ
恒温空気浴振とう器 哈爾濱東聯電子技術開発有限公司
低温遠心分離機 Ｈｅｔｔｉｃｈ ｚｅｎｔｒｉｆｕｇ
ウォーターバス 河北黄ファ航天儀器
オートクレーブ 日本ＳＡＮＹＯ
電気送風乾燥器 南京実験儀器廠
電子分析天秤 ＳＨＩＭＡＤＺＵ

操作の工程は以下の通りである。
１．１ 線虫の培養
大腸菌ＯＰ５０（Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０）を塗布した線虫の標準培地（Ｎｅｍａｔｏｄｅ ｇｒｏｗｔｈ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＧＭ）上で雌雄同体の線虫を飼育する。培養温度は２０℃である。線虫の成長状況を観察し、新しくＥ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０を塗布したＮＧＭ培地に線虫を定期的に移す。

１．２線虫の同期化
まず、産卵期の数匹の線虫を同一プレート中に採取する（具体的な数量は必要な線虫の数を判断して決める。一般的に１匹の産卵期の線虫は１時間で８個前後の卵を産むことができる）。３０ｍｉｎ後、プレートの線虫を取り出し、プレート中の卵が孵化すると、同一の発育時期にある。

１．３寿命試験
系統のために、線虫の寿命を正確に測定する。液体培養の方法を使用し、投与群及びブランク群を設定する。投与群の薬物濃度を選定し、生理食塩水で薬物を必要な濃度に希釈する。２４ウェルプレートを使用し、各ウェルにそれぞれ４２０マイクロリットルの液体培地、３０マイクロリットルの菌液、５０マイクロリットルのカリマイシン薬物（ブランク群はＳ－ｍｅｄｉｕｍ液体培地を使用する）を加え、各ウェルの液体の総体積を５００マイクロリットルにする。各ウェルに２５匹の同期化した線虫を入れ、それぞれ２４ｈ後、生存している線虫を同じ条件の次の新しい培地ウェル中に移し、死亡するまで続ける。機械的刺激に反応がない、及び嚥下又は排泄しない線虫は死亡したと判断する。２４ｈごとに移動させ、各群の生存数を記録し、各群線虫の最長生存日数及び平均生存日数の統計をとる。

実験結果は表８及び図１０に示し、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスの平均寿命を延長することができ、５μｇ／ｍｌ濃度下で明らかな効果を有することを表す。

試験例５、運動能力指数を測定し、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスに対して寿命延長作用を有するかどうかを確定する
試薬：試験例４と同じ
機器：試験例４と同じ
実験対象：カエノラブディティス・エレガンス
方法：投与群の線虫及び対照群の線虫をそれぞれ同期化処理し、各群で得られた一定数の同期化した線虫を培養する。これらが成虫期（一般的に３日目）に入ると、カリマイシンを投与し、４８時間後、その運動速度を測定する。２４時間おきに、各群から無作為に１０匹の線虫を採取し、一定時間内に運動した距離を測定し、２０秒内に線虫が通り過ぎた峰数を記録する。

実験結果は、それぞれ５μｇ／ｍｌ及び１０μｇ／ｍｌでカリマイシンを投与後、線虫の行動運動能力を顕著に上昇させることができることを示し、図１１ａ及び図１１ｂに示す通りである。

試験例６：熱ストレス条件下におけるカエノラブディティス・エレガンスの生存率を測定し、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスの寿命延長作用を有するかどうかを確定する。
試薬：試験例４と同じ
機器：試験例４と同じ
実験対象：カエノラブディティス・エレガンス
方法：正常な培養条件下で、線虫をＬ４期まで同期培養し、一定数の雌雄同体の線虫を、２ｍｌのＳ－ｍｅｄｉｕｍを加えた３０ｍｍの使い捨てシャーレに採取し、２０℃で引き続き培養する。培地はカリマイシン、Ｅ．ｃｏｌｉ ＯＰ５０菌体（ＯＤ６００＝０．２～０．３）、５０μＭのＦＵｄＲ（子世代の線虫の成長を阻止する）を含み、対照群はカリマイシンを含まないＳ－ｍｅｄｉｕｍ液体培地で培養する。毎日、線虫を新鮮な培地を含むシャーレに採取して、培地を交換すべきことに注意する。４８ｈ以降、線虫を３７℃に移して引き続き１０ｈ培養し、培養終了後に生存している線虫の数を該実験の生存率として記録する。実験は並行して２～３回繰り返すべきであり、平均値を最終的な生存率の結果とする。

実験結果として、図中から、対照群と比較して、カリマイシンは線虫の耐熱能力を顕著に増強することができ、線虫の３７℃での平均生存時間を延長させることがわかり、図１２に示す通りである。

試験例７：紫外線照射実験下におけるカエノラブディティス・エレガンスの生存率を測定し、カリマイシンがカエノラブディティス・エレガンスに対して寿命延長作用を有するかどうかを確定する。
試薬：試験例４と同じ
機器：試験例４と同じ
実験対象：カエノラブディティス・エレガンス
方法：Ｉ４期まで同期化した線虫の実験培養プレートを紫外灯下に固定して、予め照射をそれぞれ２４０秒間行い、線虫の死亡、生存数を記録する。線虫の死亡基準は寿命試験と同じである。紫外線の波長は２５４ｎｍ、紫外灯から培養プレートまでの高さは１５ｃｍ、電力は１×１０^－３Ｗ／ｃｍ^３である。実験の群分けはブランク群及び投与群である。

実験結果として、図中から、カリマイシンが紫外照射による酸化的損傷に対して一定の保護作用を有することがわかり、図１３に示す通りである。

結果
実験は少なくとも３回繰り返す。結果は平均値及び標準偏差の形式で示す。有意差検定はｔ検定を主とする。すべてのデータの統計分析及び製図は、Ｅｘｃｅｌ及びＳＰＳＳ１６．０ソフトウェアを使用する。

試験例８：カリマイシンが野生型カエノラブディティス・エレガンス体内におけるリポフスチンの蓄積を減少させることができるかどうかを測定する。
方法：寿命試験における培養方法に基づいて、１０日間、１５日間、２０日間培養する。ＮａＮ３で麻酔後、倒立蛍光顕微鏡下、励起光３４０～３８０ｎｍ、放射光４３０ｎｍで、線虫体内のリポフスチンレベルを観察する。蛍光写真を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで線虫体内のリポフスチンの蛍光レベルを分析処理する。

架橋タンパクなどの蓄積及び凝集により、リポフスチンは人体の各組織、器官の細胞中に蓄積する。細胞代謝が遅くなり、活性が低下し、これにより人体器官の機能が衰退して老化が生じる。したがって、リポフスチンは老化のマーカとみなされる。リポフスチンは自家蛍光の特徴を有するため、蛍光顕微鏡下で線虫を観察すると、その蛍光強度に基づいて、老化の程度を判断することができる。測定結果は図１４ａ及び図１４ｂに示す。結果は、投与群のリポフスチンの蓄積量が対照群より顕著に減少することを表す。

試験例９：線虫の寿命に対するカリマイシンの影響のメカニズムを研究する。
ｓｏｄ－３含量を測定すると、投与群の線虫は投与後に体内のｓｏｄ－３発現量が低下することを表しており、リポフスチンの蛍光含量については、投与群は投与後にリポフスチン含量が低下することを表している。本発明は、ｓｏｄ－３の上流遺伝子ｄａｆ－１６及びｄａｆ－１５に対してカリマイシンが影響するかどうかを考察する。

１、カリマイシンは線虫体内の抗老化遺伝子ｓｏｄ－３の発現を高めることができる
方法：本実験は、ｇｆｐ標識を有する線虫株ＣＦ１５５３を採用してｓｏｄ－３の発現量を観察する。成熟期に入った線虫をカリマイシンで６日間続けて処理し、それぞれ１０ｍＭのアジ化ナトリウムで２群の線虫を麻酔し、５％アガロースゲル中に固定する。その後励起波長４８８ｎｍ、発光波長５００ｎｍ～５３０ｎｍの蛍光顕微鏡で線虫の蛍光強度を観察、撮影する。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで蛍光強度を定量分析する。各群の線虫試料は１５匹であり、実験は２回繰り返す。

フリーラジカル及び老化の理論に基づくと、ＲＯＳは人体の老化及び疾患の主な原因である。老化の過程に伴って、線虫体内のフリーラジカルは次第に増加する。本発明は、カリマイシンが野生型線虫の耐熱能力を増強することができることにより、線虫の細胞内ストレス抵抗を増強する。従って、本発明人はＫＬが抗酸化遺伝子ｓｏｄ－３に影響を及ぼすことにより、老化に抵抗するかどうかを推測する。ＣＦ１５５３（ｓｏｄ－３：：ＧＦＰ）型線虫をカリマイシンで連続して６日間処理した後、蛍光顕微鏡で観察し、投与群線虫の緑色蛍光タンパクの発現量が対照群線虫より顕著に上昇することを発見した。結果を図１５に示す。カリマイシンが抗酸化遺伝子ｓｏｄ－３を上昇させることにより、線虫体内のＲＯＳレベルが低下し、寿命を延ばし得ることを表す。

２、カリマイシンはＤＡＦ－１６の細胞内分布に影響を及ぼすことができる
方法：各群３０匹のＬ４期にあるＴＪ３５６（ＤＡＦ－１６：：ＧＦＰ）線虫を、ＯＰ５０により成長が良好なＮＧＭプレートに採取し、３～４時間産卵させ、線虫の同期化を完了する。卵が成虫に成長した後、各群３０匹に群分けして投与する。６日間投与したＴＪ３５６線虫におけるＤＡＦ－１６の核内移行状況を測定し、倒立蛍光顕微鏡を使用してＤＡＦ－１６の核内移行状況を観察する。

ＤＡＦ－１６は細胞核内で凝集するか、又は細胞質内で分散して分布し、その活性と直接関係する。正常な状況下では、ＤＡＦ－１６は体内で細胞質中に定位する。外部ストレス環境下では、異なるタンパクが活性化され、さらには細胞核に進入して転写する機能が促進され、下流遺伝子の発現を起動して線虫の寿命を延ばす。ある研究は、インスリン欠乏又は酸化ストレスがいずれもＤＡＦ－１６を細胞核内に凝集させることができ、線虫が酸化ストレスに抵抗する能力を高めて、線虫の寿命を延ばすことを明らかにしている。

カリマイシンが線虫の寿命を延ばすのは、ＤＡＦ－１６と関係するため、本発明人はカリマイシンがＤＡＦ－１６の細胞内における分布に影響を及ぼし得ると推測する。本発明は、ＤＡＦ－１６：：ＧＦＰ遺伝子組み換え線虫ＴＪ３５６を利用して、ＤＡＦ－１６の細胞内における分布を考察する。成虫期に入ったばかりの線虫をカリマイシンで処理し、投与の６日後、倒立蛍光顕微鏡で観察する。

結果から、カリマイシン処理したＴＪ３５６線虫の緑色の蛍光は細胞核中に集中して点状凝集状態となり、カリマイシン処理していないＴＪ３５６線虫の緑色の蛍光は細胞全体で分散して分布することを発見した。カリマイシン５、１０μｇ／ｍｌで６日間処理したとき、ＤＡＦ－１６の細胞核内での凝集は、未処理の線虫より顕著に増加する。これは、カリマイシンがＤＡＦ－１６の細胞核への進入を促進することができることを表し、図１６ａ及び図１６ｂに示す。

Claims (12)

1. 疾患を予防又は治療するための薬物であって、前記疾患はアルツハイマー病、糖尿病又は老化であり；前記薬物は第１活性成分を含み、前記第１活性成分はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩＩから選択される１種；
   又はイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩから選択される２種若しくは３種を含み、
   前記カリマイシンの主成分の化学構造は、式（１）で表されることを特徴とする薬物。
   

   

   （ここで、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＯＣＨ _３ またはＣＯＣＨ _２ ＣＨ _３ 、Ｒ’はＣＯＣＨ _２ ＣＨ（ＣＨ _３ ） _２ である。）
2. 第２活性成分も含み；
   前記疾患がアルツハイマー病であるとき、前記第２活性成分は抗アルツハイマー病薬の少なくとも１種であり；
   前記疾患が糖尿病であるとき、前記第２活性成分は抗糖尿病薬の少なくとも１種であり；
   前記疾患が老化であるとき、前記第２活性成分は老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載の薬物。
3. 薬学的に許容可能な担体と共に、臨床的に許容可能な製剤が製造されることを特徴とし、前記製剤は、錠剤、カプセル、丸剤、注射剤、徐放剤又は微粒子送達系を含む、請求項１又は２に記載の疾患を予防又は治療するための薬物。
4. 前記薬物の用量が１０～１５００ｍｇ／ｋｇである、請求項３に記載の疾患を予防又は治療するための薬物。
5. 前記薬物の用量が５０～１０００ｍｇ／ｋｇである、請求項３に記載の疾患を予防又は治療するための薬物。
6. 前記薬物の用量が１００～５００ｍｇ／ｋｇである、請求項３に記載の疾患を予防又は治療するための薬物。
7. 疾患を予防又は治療するための配合剤であって、前記疾患がアルツハイマー病、糖尿病又は老化であり；前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤の活性成分はカリマイシン又はイソバレリルスピラマイシンＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩ又はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩから選択される１種；
   或いはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩから選択される２種又は３種を含み、
   前記カリマイシンの主成分の化学構造は、式（１）で表されることを特徴とする配合剤。
   

   

   （ここで、式中、Ｒは、Ｈ、ＣＯＣＨ _３ またはＣＯＣＨ _２ ＣＨ _３ 、Ｒ’はＣＯＣＨ _２ ＣＨ（ＣＨ _３ ） _２ である。）
8. 第２薬剤も含み；
   前記疾患がアルツハイマー病であるとき、前記第２薬剤はアルツハイマー病を予防又は治療するための関連薬物の少なくとも１種であり；
   前記疾患が糖尿病であるとき、前記第２薬剤は糖尿病を予防又は治療するための関連薬物の少なくとも１種であり；
   前記疾患が老化であるとき、前記第２薬剤は老化を遅らせる、又は寿命を延ばす関連薬物の少なくとも１種であることを特徴とする、請求項７に記載の配合剤。
9. 前記第１薬剤及び前記第２薬剤の用量比が１：９９から９９：１であることを特徴とする、請求項８に記載の配合剤。
10. アルツハイマー病を予防又は治療するための前記関連薬物が、コリン作動系に作用する薬物、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体に作用する薬物、抗酸化薬、抗炎症薬、Ａβタンパクの生成抑制薬、エストロゲン、神経成長因子、ニモジピン、抗アポトーシス剤を含み；
    糖尿病を予防又は治療するための前記関連薬物が、ビグアニド血糖降下薬、スルホニルウレア血糖降下薬、αグルコシダーゼ阻害剤、インスリン増感剤、非スルホニルウレア系インスリン分泌促進剤又はインスリンの少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項８に記載の配合剤。
11. アルツハイマー病、糖尿病を予防又は治療する、老化を遅らせる、或いは寿命を延ばす薬の調製における、請求項１～４のいずれか１項に記載の薬物又は請求項７～１０のいずれか１項に記載の配合剤の使用方法。
12. アルツハイマー病を予防又は治療する薬の調製における前記使用方法が、アセチルコリン加水分解を減少させる薬物の調製における使用方法、認知障害及び運動障害を改善する薬物の調製における使用方法、脳内神経細胞を保護する薬物の調製における使用方法、体重が低下しない、免疫力を向上させる、又は白血球を上昇させる薬物の調製における使用方法であり；
    糖尿病を予防又は治療する薬の調製における前記使用方法が、Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病又は特殊型糖尿病を予防又は治療する薬の調製における使用方法であり、好ましくはインスリン分泌を促進する、又は血糖値を低下させる、又は膵島β細胞を保護するための薬物の調製における使用方法、或いは糖尿病を予防又は治療して、体重を保持する薬物の調製における使用方法であり；
    老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の調製における前記使用方法が、転写因子ＤＡＦ－１６の活性を変化させることにより、老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の調製における使用方法；ＳＩＲ２の相同タンパクＳＩＲ２．１の発現レベルを高めることにより、ＳＩＲ２．１がさらにＤＡＦ－１６活性に影響を及ぼして老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の調製における使用方法；或いはＡＭＰＫを活性化させることにより、直接ＦＯＸＯ／ＤＡＦ－１６の活性を増強し、老化を遅らせる、又は寿命を延ばす薬の調製における使用方法であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用方法。

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