CN110051679B - 一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物应用领域，具体地说，涉及一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物及其用途。所述的组合物包括第一活性成分，所述的第一活性成分为可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ两种或三种的组合。本发明涉及可利霉素延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，对其运动能力有提高、氧化应激方面对秀丽隐杆线虫具有保护作用。因此，本发明药物能显著延长秀丽隐杆线虫平均寿命，从而延长个人的生命，具有很好的药用价值，也可与药学上可接受的载体组成组合物，制备临床上可接受的片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及各种微粒给药系统。

Description

一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物及其用途

技术领域

本发明属于药物应用领域，具体地说，涉及一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物及其用 途。

背景技术

随着经济高速发展和工业化进程的加速，生活方式的改变和老龄化进程的加速，衰老是 老龄化社会持续关注的社会和经济问题之一，据2012年2月22日国家统计局发布的数据显 示，我国65岁及以上老年人口比重已达到9.1％，老年人口达到12288万人，我国已经进入 老龄化社会。预计到2040年，我国60岁以上老年人口将达到约4亿人，占总人口26％。衰 老以及与衰老相关的疾病已成为日趋严重的社会问题，因此阐明衰老的机制以及干预衰老进 程具有重要的现实意义。

衰老是一种普遍存在的，连续性的，进行性的，内在的且具有破坏力的生理过程，能降 低机体面对环境胁迫维持动态平衡的能力，进而增加机体患病和死亡的可能性。衰老(senescense)又称老化，是指生物体在其生命的后期所进行的全身性、多方面、循序渐进的退 化过程，这种退化过程在整体水平、组织细胞水平及分子水平各个层次均有体现。人类对衰 老机制的研究始于整体水平和器官水平，主要表现为机体形态结构和功能方面出现的一系列 退行性改变，细胞凋亡或坏死导致细胞数量减少，脏器萎缩，组织弹性减低等，从而进一步 引起多种器官生理功能的逐步减退。随着生命科学的飞速进展，有关衰老机制的细胞水平及 分子水平的研究越来越深入，并且被认为是揭开衰老本质、防治老年病的重要环节。人们也 已经从多个物种找到了与衰老有关的基因，探讨了衰老期间基因及其调控变化的特点，进一 步研究了衰老与老年性疾病发生、发展的相关性。深入研究和阐释衰老机制的分子水平研究， 对改善和预防老年性疾病的发生十分重要。

目前抗衰老相关信号通路有：

1.胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导通路

胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导通路(insulin/insulin growth gactor1signalling pathway，IIS)在线虫体内抗衰老的具体过程已经被证实。机体受环境影响产生神经传导信号， 释放胰岛素肽，与特异性胰岛素/胰岛素样生长因子-1受体DAF-2结合，使细胞内信号发生 级联反应。FOXO/DAF-16转移因子被磷酸化，无法向细胞核内转移，抵抗应激和修复DNA 损伤等抗衰老基因不能正常转录启动，从而影响生物体的寿命。这一信号通路在多种模式生 物如秀丽隐杆线虫、果蝇、鼠等体内均有调节寿命的作用。因此当IIS信号传导减弱时，DAF-16 蛋白向核内的转移数量增多，可以有效减缓线虫组织的衰老，使线虫寿命大幅度延长。DAF-2， AGE-1基因也是通过改变转录因子DAF-16活性从而延长线虫的寿命。研究发现，IIS信号通 路与热量限制、胁迫抗性等反馈信号通路有一定的关系，对模式生物寿命有延长作用，并且 与中老年相关疾病例如糖尿病等相关，因此，胰岛素/胰岛素样生长因子1信号传导通路对抗 衰老的研究有着重要的意义。

2.Sirtuin家族信号通路

SIR2(silent information regulator 2，SIR2)最先发现于啤酒酵母中，属于NAD+依赖的脱乙 酰蛋白激酶，其功能为对细胞内环境的变化进行反馈。提高SIR2同源蛋白SIR2.1的表达水 平能够延长秀丽隐杆线虫的寿命，SIR2.1通过影响DAF-16活性来延长线虫的寿命。SIR2还 具有抗氧化损伤的作用。Sirtuin是一类特殊的蛋白质，影响蛋白质的乙酰化与代谢，与代谢 和衰老也有相关影响。NAD和NADH是代谢反应的重要调节因子，因此在饮食限制引起的 寿命延长中Sirtuin蛋白也具有重要的作用。

3.雷帕霉素靶蛋白(TOR)信号通路

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，m TOR)属于丝氨酸/苏氨酸激酶的一种， 主要功能是调节蛋白的合成，在细胞生长、增殖、分化和凋亡等过程中发挥作用。TOR信号 通路与饮食限制延长寿命也有一定关系，同时也与生物体感知营养和环境变化有关。抑制TOR 信号通路，可以提高生物体对环境压力的抵抗力，使酵母等多个物种的寿命延长。线虫相关 实验表明，TOR信号通路对寿命的调节是独立的，不依赖于IIS信号通路。TOR的小分子抑 制剂雷帕霉素(rapamycin，RAPA)，作用方式和热量限制相似，具有一定的延长寿命作用。

4.AMPK蛋白途径

AMPK(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase)即AMP依赖的蛋白激酶，也 属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，负责协调能量和代谢，与糖尿病及其他代谢相关疾病关 系密切。秀丽隐杆线虫中存在两种基因AAK-1和AAK-2用于编码AMPKa亚基，其中AAK-2 可以调节线虫抵抗应激压力。AMPK在生物体代谢相关的器官中广泛存在，细胞内AMP /ATP的比值变化决定AMPK的激活，能被环境压力、运动等刺激激活。AMPK在糖代谢、 脂质代谢、自噬、细胞生长发育等过程中也起着重要的作用。AMPK也在IIS信号通路引起 线虫寿命延长的过程中发挥了重要作用。降糖类药物二甲双胍就是通过激活AMPK，使小鼠 寿命延长。另外，饥饿也可以激活AMPK，直接增强FOXO/DAF-16的活性，延长线虫的寿命。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)N2，是一种常见的小型土壤线虫，因其生命周 期短，繁殖时间快，与人类的生化和基因通路上有很大的同源性，而且其调控寿命的遗传及 药理学机制均已明确，因而被作为一种研究衰老常见的模式生物。

可利霉素(Carrimycin)，又称必特螺旋霉素(Bitespiramycin)、生技霉素(Shengjimycin) 是由中国医科院生物技术研究所与本申请人合作，通过转基因技术将碳霉素产生菌的4”异戊 酰基转移酶基团(4”-o-acyl-transferase)克隆至螺旋霉素产生菌中，定向酰化螺旋霉素4”-OH， 在4”位加入异戊酰基侧链所形成的以4”位异戊酰基螺旋霉素为主要组分的新型抗生素。

可利霉素是由多种螺旋霉素衍生物组成，主要活性成分异戊酰螺旋霉素(I+II+III)总含 量不低于60％，酰化螺旋霉素的总含量不低于80％，于药学上是一种可接受的药物组合物。 中心结构为16元内酯环，与一分子福洛胺糖、一分子碳霉胺糖和一分子碳霉糖连接而成，其 主要成分异戊酰螺旋霉素I、II、III与螺旋霉素结构不同之处在于碳霉糖4”位上连接的基团 为异戊酰基而不是羟基。化学结构，如式(1)所示，共包含十余种组分。目前可利霉素成品 组成标准为药物异戊酰螺旋霉素III≥30％，异戊酰螺旋霉素I、II、III的比例总和≥60％，总 酰化螺旋霉素的比例≥80％，其它未知组分的总和≤5％。

可利霉素属于16元大环内酯类抗生素，具有活性基团羧基、烷氧基、环氧基、酮基和醛 基以及一对共轭的C＝C，分子量约为884～982。由于具有相似的化学结构，可利霉素与大环 内酯类抗生素具有很多共性：易溶于酯类、丙酮、氯仿、醇类等大多数有机溶剂，微溶于石 油醚，难溶于水；分子结构中含有两个二甲胺基而呈弱碱性，易溶于酸性水溶液；具有溶解 度随温度的升高而降低的“负溶解度”性质。由于可利霉素主要组分异戊酰螺旋霉素4”位碳 链较长，亲水性差，其水中溶解度比螺旋霉素及4”-乙酰螺旋霉素小。

可利霉素是一种白色非结晶粉末，略有引湿性，比旋度约为-80.8°，紫外最大吸收波长为 231～232nm，本身带有弱荧光发色基团，遇浓硫酸或盐酸呈紫色反应，产生强紫色荧光，在 231～232nm处有最大吸光值。

该药具有亲脂性好，组织渗透能力强，口服吸收快，体内维持时间长，有持续的抗生素 后效应。根据药效与化学构象的关系，大环内酯类抗生素4”位酰化后，其亲脂性和体内活性 提高，体内抗菌活性与临床治疗效果均得到了显著提升，并且抗生素在体内的稳定性随着4” 羟基酯的碳链增长而增强，即异戊酰螺旋霉素＞丁酰螺旋霉素＞丙酰螺旋霉素＞乙酰螺旋霉 素。

初步体内外药效学试验表明，该药不仅对多数G⁺菌有较好抗菌活性，对部分G^-菌也有一 定作用，各项技术指标明显优于阿奇霉素、红霉素、乙酰螺旋霉素、麦迪霉素，尤其对肺炎 支原体的抗菌活性最强，对红霉素耐药菌、淋球菌、肺炎球菌、金葡菌、绿脓假单胞菌、流 感杆菌、流感嗜血杆菌、脆弱拟杆菌、军团菌、多行杆菌和产气荚膜梭菌也有一定抗菌活性， 对临床耐红霉素的金葡球菌仅有极少交叉耐药性。可利霉素将主要用于治疗革兰氏阳性菌感 染性疾病，尤其是上呼吸道感染，并可能用于泌尿系统感染等。

药代动力学研究结果表明，可利霉素中具有活性的有效组分主要为药物异戊酰螺旋霉素 I、异戊酰螺旋霉素II、异戊酰螺旋霉素III。可利霉素进入体内后很快代谢为螺旋霉素，以母 体药物异戊酰螺旋霉素I、II、III和活性代谢物螺旋霉素I、II、III的AUC_0-t总和计算，其口 服绝对生物利用度平均为91.6％。文献报道，螺旋霉素人体口服绝对生物利用度为 30-40％[Frydman AM et al J Antimicrob Chemother.1988，22(suppl B):90-103]。说明异戊酰螺旋 霉素的结构明显改善了活性成分螺旋霉素的生物利用度。单次服药可利霉素消除较慢，T_1/2β 在23-27小时之间。

本申请人在近期的一项研究中发现，可利霉素或其药物活性成分异戊酰螺旋霉素I、异戊 酰螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III或其组合具有较好的抗衰老作用，为药物可利霉素或其 药物活性成分在这方面的临床推广提供了理论依据，而且具有重要的经济效益和社会效益。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种延缓衰老和/或延长寿命的组合物，其中，所述的组合物包括第一活性成分，所述的 第一活性成分为可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一， 或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中的两种或三种的组合。

进一步的，所述的组合物还包括第二活性成分。

进一步的，所述的第二活性成分包括延缓衰老或延长寿命药物中的至少一种。

本发明中，可以将第一活性成分中的至少一种与第二活性成分中的至少一种做成复方制 剂。

进一步的，在制成复方制剂时，第一活性成分与第二活性成分的用量比为1～99：99～1， 优选5～95：95～5，更优选10～90：90～10，再优选20～80：80～20。

进一步的，所述的组合物与可接受的辅料制备成药物、保健品或食品添加剂。

进一步的，所述的药物为药学上可接受的剂型。

进一步的，所述的药学上可接受的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及微粒给 药制剂。

本发明还提供一种延缓衰老和/或延长寿命的组合产品，其中，所述的组合产品包括第一 药剂，所述的第一药剂的活性成分包括可利霉素、异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、 异戊酰螺旋霉素Ⅲ之一，或者异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ中 的两种或三种的组合。

本发明中，可利霉素为多种活性成分的混合物，除了包括异戊酰螺旋霉素Ⅰ、异戊酰螺 旋霉素Ⅱ、异戊酰螺旋霉素Ⅲ这三种活性成分，还含有其他的杂质。

进一步的，所述的组合产品还包括第二药剂。

进一步的，所述的第二药剂包括抗衰老或延缓衰老药物中的至少一种。

本发明中，还可以将第一药剂与第二药剂进行联合用药，在联合用药时，第一药剂与第 二药剂的用药顺序不分先后，可以先用第一药剂，也可以先用第二药剂，也可以两个药剂同 时使用。

在联合用药时，第一药剂和第二药剂的用量比为1～99：99～1，优选5～95：95～5，更 优选10～90：90～10，再优选20～80：80～20。

进一步的，所述的第一药剂为药学上可接受的剂型。

进一步的，所述的药学上可接受的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及微粒给 药制剂。

本发明还提供所述的组合物或组合产品在制备延缓衰老和/或延长寿命产品中的应用。

具体地说，涉及所述的组合产品在制备通过改变转录因子DAF-16活性来延缓衰老和/或 延长寿命的药物中的应用；通过提高SIR2同源蛋白SIR2.1的表达水平，SIR2.1再通过影响 DAF-16活性来延缓衰老和/或延长寿命的药物中的应用；或通过激活AMPK，直接增强 FOXO/DAF-16的活性，延缓衰老和/或延长寿命药物中的应用。

进一步的，所述产品为药物、保健品或食品添加剂。

研究选用野生型秀丽隐杆线虫分给药组、空白对照组，首先给予不同浓度的测定线虫的 生长曲线；考察了可利霉素对与寿命相关的生理指标如线虫的产卵量和行为活动能力变化的 影响。还通过测定给予可利霉素之后线虫在37℃高温胁迫、紫外照射刺激后的存活率。

线虫用于抗衰老模型具有以下优点：

由于线虫60％-80％的基因与人类的相关基因高度保守，而且至今发现的条信号传导途径， 线虫具有其中的12条，因此本发明利用秀丽隐杆线虫作为筛选抗衰老药物的模型生物。可利 用线虫丰富的遗传资源，根据研究目的选择合适的突变体，研究衰老及抗衰老机制，实质上 衰老机制的几大理论都是在线虫中被证明。因此，对线虫有抗衰老作用的药物通常也被认为 对人类也具有同样功效。

秀丽隐杆线虫被用于寿命分析，至今已有30年的历程。因其独特的优势，成为衰老研究 的首推模型。线虫世代周期短，通常为3天左右寿命短，通常为3周左右。这使实验的重复 稳定性成为可能。为了确保实验方法的可靠性和实验结果的准确性、药物筛选能得到更多准 确的、可信的信息，重复实验是必要的。由于秀丽隐杆线虫具有以上独特的优势，而成为衰 老研究的首推模型。因此线虫可以被用于评价组合物的抗衰老作用，进而判断组合物被用于 制备抗衰老药物。

研究结果表明，可利霉素对秀丽隐杆线虫有抗衰老方面作用。

本发明中，所述的药物可采用本领域常规的方法制备成药学上可接受的各种剂型，如片 剂、胶囊等。

本发明中，所述的药物的剂量为10～1500mg/kg；优选50～1000mg/kg；更优选100～ 500mg/kg。

本发明的有益效果是：本发明证明了药物可利霉素具有较好抗衰老方面作用，为药物可 利霉素其临床推广提供了理论依据，而且具有重要的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为给予可利霉素后对寿命周期的影响；

图2-a为给予5μg/ml可利霉素后运动指标测定；

图2-b为给予10μg/ml可利霉素后运动指标测定；

图3为给予可利霉素后热应激反应下生存率测定；

图4为给予可利霉素后UV照射下生存率测定；

图5-a为给予可利霉素10天后荧光强度测定；

图5-b为给予可利霉素15天后荧光强度测定；

图6为给予可利霉素后荧光强度测定；

图7-a为给予可利霉素6天TJ356线虫DAF-16入核情况测定；

图7-b为给予可利霉素6天TJ356线虫荧光强度测定；

其中，图中KL表示可利霉素。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对实 施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发 明的范围。

需要说明的是：以下实施例中涉及的药物可利霉素也可以是异戊酰螺旋霉素I或异戊酰 螺旋霉素II或异戊酰螺旋霉素III中的一种或几种的组合物。

实施例1、可利霉素片

规格：200mg/350mg

片芯处方：

包衣液处方：

制备工艺：

片芯的制备：主药和辅料分别过100目筛，将处方量可利霉素、微晶纤维素与1/2处方 量的羧甲淀粉钠混合均匀，然后加入5％聚维酮K₃₀水溶液制软材，以18目筛制粒，湿颗粒在60℃通风条件下干燥2h；干燥后以18目筛整粒，再加入1/2处方量的处方量羧甲淀粉钠与硬脂酸镁混合均匀后，用直径11mm的浅凹冲模压片，制得片重350mg、硬度6.5kg的含 药片芯。

包衣液的配制：称好所需的欧巴代II(白色)在配液容器中加入所需量的水，分次加入， 待全部加入后，降低搅拌速度，使蜗旋消失，继

续搅拌30min，即得。

薄膜包衣片的制备：将片芯置包衣锅内，确定包衣条件，主机速度为20r/min，进风温度 40℃，出风温度30℃，喷雾压力0.02Mpa，喷浆流量为1ml/min进行包衣，恒定后持续喷包 1.5h，至片粒表面光滑、色泽均匀，符合薄膜衣检验标准为合格。包衣增重5％左右。

实施例2、可利霉素片(按10000片计算)

处方：

制备工艺：称取适量淀粉，稀释至15％浓度，加热至糊状，制成粘合剂；主料可利霉素、 辅料淀粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁分别过100目筛，按处方量，称 取所需主料和辅料；药物可利霉素、淀粉、低取代羟丙基纤维素充分混合均匀后，用15％淀 粉浓度的淀粉糊制成软材，14目筛制粒，50-60℃干燥，水份控制在3-5％，14目筛整粒，加 羧甲基淀粉钠，硬脂酸镁混合，测定颗粒含量；根据颗粒含量，计算片重，压片(Φ9mm浅凹冲头)，检测片重差异；经检验合格后进行包装。

实施例3、可利霉素胶囊剂(按10000粒计算)

处方：

制备工艺：将主料可利霉素、辅料药用淀粉按工艺配方量分别称取后，装入混合器充分 混合后1.5-2小时；取样检测含量所得数据应和理论数据基本一致(每粒胶囊所装重量约为 0.105g)，将经检验合格的药用3号胶囊及混合好的待装原料按全自动胶囊机操作要求，分别 填入装料器进行填充，将填充好的胶囊进行差异检验(±10％以内，＜0.3g)，溶出度符合要 求，将检验后符合要求的胶囊，放入打光机内加入液体石蜡进行15-20分钟的打光，然后取 出进行成品包装盒检验。

实施例4、可利霉素干糖浆(按10000袋计算)

制备工艺：可利霉素原粉，柠檬酸、蔗糖分别用高速气流粉碎机粉碎成颗粒85％通过300 目，15％通过180目，然后将粉碎后的细粉按处方量称取后充分混合1-1.5小时，测其含量， 计算装量(理论装量为每袋500mg)，然后将混合物装入袋装机中，装好铝箔纸，按分装机操 作要求分装，装量差异在±5％以内，装好后进行检验合格后外包装。

实施例5、可利霉素颗粒剂(按10000袋计算)

处方：

制备工艺：药物可利霉素原粉、糖粉、糊精过120目筛，按处方量称取药物可利霉素、 糖粉、糊精混合均匀，将混合均匀的上述物料用5％PVP-K₃₀胶浆制成软材，摇摆式颗粒剂制 粒70℃干燥、整粒，送检合格后分装。

实施例6、可利霉素冻干粉针剂

称取可利霉素原粉500mg与等摩尔的己二酸混合均匀后溶解于5ml水中，得到淡黄色澄 明溶液，pH在4.6-5.6之间。再加入甘露醇40mg作为冻干支撑剂，低温快速冷冻9h后，冷 冻干燥，获得淡黄色疏松块状物，使用前用10ml无菌水溶解。

试验例一：

利用寿命实验确定可利霉素是否对秀丽隐杆线虫寿命有延长作用

实验材料、试剂和仪器

1.1菌株、线虫

E.coli OP50 沈阳药科大学实验室保存

C.elegans N2 沈阳药科大学实验室保存

1.2主要试剂

二甲基亚砜

1.3主要仪器

操作步骤如下：

1.1线虫的培养

将雌雄同体线虫饲养于涂布大肠杆菌OP50(E.coli OP50)的线虫标准培养基(Nematode growth medium，NGM)上，培养温度20℃，观察线虫生长情况，定期将线虫转至新的涂有 E.coli OP50的NGM培养基中。

1.2线虫的同期化

首先挑取处于产卵期的线虫若干条在同一平板中(具体数量视所需要的线虫数量而定， 一般一条产卵期线虫一小时可以产卵8个左右)。30min后，将平板中线虫挑出，平板中的卵 孵化后即处于同一发育时期。

1.3寿命周期实验

为了系统而准确地测定线虫的寿命，使用液体培养的方法设定给药组和空白组，选定给 药组药物浓度，用生理盐水将药物稀释到所需浓度，使用24孔板，每孔分别加420微升液体 培养液，30微升菌液，50微升药物可利霉素(空白组使用S-medium液体培养基)使得每孔 液体总体积为500微升，每孔放入25只同期化线虫，每24h后将存活的线虫转移到下一个 新的相同条件的培养液孔中，直到死亡。对机械刺激没有反应及不咽食或排泄的线虫判断为 死亡每24h转移后记录每组存活只数统计每组线虫最长存活天数和平均存活天数。

实验结果见表1，结果表明：可利霉素可延长秀丽隐杆线虫的平均寿命，且在浓度5μg/ml 浓度下有明显效果，见图1所示。

表1

试验例二：

检测运动能力指标确定可利霉素是否对秀丽隐杆线虫寿命有延长作用。

试剂：同试验例一

仪器：同试验例一

实验对象：秀丽隐杆线虫

方法：分别将给药组线虫和对照组线虫进行同期化处理，每组得到一定数量的同期化线 虫进行培养。当其进入成虫期后(一般为第三天)，给药48小时后测量其运动速度。每隔24 小时每组随机挑选10条线虫测定其在一段时间内运动的距离，并记录20S内线虫走过的峰数。

实验结果分别给予5μg/ml及10μg/ml可利霉素后能够显著提高线虫的行为运动能力， 见图2a和图2b所示。

试验例三：

检测热激条件下秀丽隐杆线虫存活率确定可利霉素是否对秀丽隐杆线虫寿命有延长作 用。

试剂：同试验例一

仪器：同试验例一

实验对象：秀丽隐杆线虫

方法：在正常培养条件下同期培养线虫至L4期，将一定数量的雌雄同体线虫挑取到加有 2ml S-medium的30mm一次性培养皿中，于20℃继续培养。培养液含有药物可利霉素，E.coli OP50菌体(OD600＝0.2-0.3)，50μM FUdR(阻止子代线虫生长)，对照组为不含可利霉素 的S-medium液体培养基培养。注意应每天将线虫挑取到含新鲜培养基的培养皿中以更换培 养液。48h以后，将线虫转到37℃继续培养10h，记录培养结束后存活的线虫的数目做为 该实验的存活率，实验应平行重复2-3次，取平均值作为最终存活率结果。

实验结果从图中可以看出与对照组相比，可利霉素能够显著增强线虫的耐热能力，延长 线虫在37℃的平均生存时间，见图3所示。

试验例四：

检测紫外照射实验下秀丽隐杆线虫存活率确定可利霉素是否对秀丽隐杆线虫寿命有延长 作用。

试剂：同试验例一

仪器：同试验例一

实验对象：秀丽隐杆线虫

方法：将同期化至I4期的线虫的实验培养板固定在紫外灯下进行预实验照射，分别240s， 记录线虫死亡、存活数目。线虫死亡标准同寿命实验。紫外线波长为254nm，紫外灯距离培 养板的高度为15cm，功率为1×10^-3W/cm³。实验分组为空白组和给药组。

实验结果从图中可知，可利霉素对紫外照射氧化损伤有一定的保护作用，见图4所示。

结果

实验至少重复3次。结果以均值和标准差的形式给出。显著性检验以t检验为主。所有 数据统计分析和制图使用Excel和SPSS16.0软件。

试验例五：

检测可利霉素是否可以减少野生型秀丽隐杆线虫体内脂褐素积累。

方法：按照寿命实验中的培养方法培养10d、15d、20d。NaN3麻醉后，倒置荧光显微镜下，激发光340-380nm,发射光430nm，观察线虫体内的脂褐素水平，拍摄荧光图片，利用Image J软件分析处理线虫体内脂褐素荧光水平。

由于交联蛋白等的累积和聚集，脂褐素沉积在人体各组织器官细胞中，导致细胞代谢减 慢，活性下降，从而造成人体器官功能衰退产生衰老。因此脂褐素被认为是衰老的标志。脂 褐素具有自发荧光的特点，在荧光显微镜下观察线虫，可以根据其荧光强度来判断其衰老程 度。测定结果见图5-a和图5-b。结果表明，给药组的脂褐素积累量较对照组显著减少。

试验例六：

研究可利霉素对线虫寿命的影响机制。

由于sod-3含量测定表明，给药后给药组线虫体内sod-3表达量降低，且脂褐素荧光含 量表明，给药后给药组的脂褐素含量降低。本发明考察可利霉素是否对sod-3上游基因daf-16 和daf-15有影响。

1、可利霉素可提高线虫体内抗衰老基因sod-3表达

方法：本实验采用带有gfp标签的线虫株CF1553观察sod-3的表达量。用可利霉素持续 处理进入成熟期的线虫6天，分别用10mM的叠氮化钠将两组线虫进行麻醉，固定于5％琼 脂凝胶中，然后用激发波长488nm，发射波长500nm-530nm的荧光显微镜对线虫荧光强度进 行观察，拍照。用ImageJ软件对荧光强度进行定量分析，每组线虫样本数为15条，实验重复两次。

根据自由基与衰老理论，ROS是造成机体衰老及疾病的主要原因。随着衰老的过程线虫 体内的其体内的自由基逐渐增多，本发明通过考察可利霉素可以增强野生型线虫的耐热能力， 增强线虫的胞内胁迫抵抗。因此本发明人猜想KL是否通过影响抗氧化基因sod-3从而抗衰老， 用可利霉素连续处理6天CF1553(sod-3::GFP)型线虫后，用荧光显微镜观察发现给药组线虫 的绿色荧光蛋白表达量较对照组线虫显著提高。结果见图6。表明可利霉素可能是通过提高 抗氧化基因sod-3降低线虫体内ROS的水平从而延长寿命。

2、可利霉素可以影响DAF-16在细胞内的分布

方法：将处于L4期TJ356(DAF-16：：GFP)线虫每组30只挑取到OP50长势良好的NGM平板，产卵3-4小时，线虫的同期化完毕。卵长至成虫后每组30只分组给药。测给药6天TJ356线虫DAF-16入核情况，使用倒置荧光显微镜观察DAF-16入核情况。

DAF-16在细胞核内聚集还是在细胞质内弥散分布同其活性直接相关。正常情况下DAF-16 在体内定位于细胞质中，如果在外界胁迫环境下，不同的蛋白被激活，进而促进进入细胞核 进行转录功能来启动下游基因表达来延长线虫的寿命。有研究表明缺乏胰岛素或氧化应激均 能使DAF-16在细胞核内聚集，提高线虫抵抗氧化应激的能力并延长线虫寿命。

由于可利霉素延长线虫的寿命和DAF-16有关，本发明人推测可利霉素可能会影响DAF-16 在细胞内的分布。本发明利用DAF-16::GFP转基因线虫TJ356考察DAF-16在细胞内的分布的 研究。用可利霉素处理刚进入成虫期的线虫，给药6天后，用倒置荧光显微镜观察。

结果发现可利霉素处理的TJ356线虫绿色荧光集中于细胞核中成点状聚集状态，而未经 可利霉素处理的TJ356线虫绿色荧光弥散分布于整个细胞中。可利霉素5,10μg/ml处理6 天时，DAF-16在细胞核内的聚集较未处理的线虫显著增加。这表明可利霉素可以促进DAF-16 进入细胞核，见图7-a和图7-b。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发 明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本发明的技术人员在不脱 离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许变动或修饰为等同变化的 等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所 作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims (13)

1.异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可利霉素中的至少一种在制备延缓衰老和/或延长寿命的药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括延缓衰老或延长寿命药物中的至少一种。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的药物与可接受的辅料制备成药物、保健品或食品添加剂。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为药学上可接受的剂型。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及微粒给药制剂。

6.异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可利霉素中的至少一种在制备延缓衰老和/或延长寿命的组合产品方面的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的组合产品还包括延缓衰老或延长寿命药物中的至少一种。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述的组合产品为药学上可接受的剂型。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的药学上可接受的剂型为片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释剂及微粒给药制剂。

10.异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可利霉素中的至少一种在制备通过改变转录因子DAF-16活性来延缓衰老和/或延长寿命的药物方面的应用。

11.异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可利霉素中的至少一种在制备通过提高SIR2同源蛋白SIR2.1的表达水平，SIR2.1再通过影响DAF-16活性来延缓衰老和/或延长寿命的药物方面的应用。

12.异戊酰螺旋霉素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、可利霉素中的至少一种在制备通过激活AMPK，直接增强FOXO/DAF-16的活性，延缓衰老和/或延长寿命药物方面的应用。

13.根据权利要求10-12任一所述的应用，其特征在于，所述药物为保健品或食品添加剂。

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