CN117448445B - Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 - Google Patents
Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117448445B CN117448445B CN202311774806.1A CN202311774806A CN117448445B CN 117448445 B CN117448445 B CN 117448445B CN 202311774806 A CN202311774806 A CN 202311774806A CN 117448445 B CN117448445 B CN 117448445B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tsc2
- pten
- tsc1
- gene
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-N aristolochic acid I Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C2=C(C(O)=O)C=C3OCOC3=C2C2=C1C(OC)=CC=C2 BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 70
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 102000014160 PTEN Phosphohydrolase Human genes 0.000 title abstract description 21
- 108010011536 PTEN Phosphohydrolase Proteins 0.000 title abstract description 21
- 102100031561 Hamartin Human genes 0.000 title description 24
- 101000795643 Homo sapiens Hamartin Proteins 0.000 title description 20
- 101000795659 Homo sapiens Tuberin Proteins 0.000 title description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 35
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 18
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 10
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract description 2
- BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-M Aristolochate I Natural products C1=C([N+]([O-])=O)C2=C(C([O-])=O)C=C3OCOC3=C2C2=C1C(OC)=CC=C2 BBFQZRXNYIEMAW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 102100031638 Tuberin Human genes 0.000 description 13
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 9
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 9
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 5
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 5
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 5
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 5
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 5
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 208000009999 tuberous sclerosis Diseases 0.000 description 5
- 241000758794 Asarum Species 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 101710147325 Calcineurin B homologous protein 3 Proteins 0.000 description 3
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 3
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 3
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241001061264 Astragalus Species 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 235000006533 astragalus Nutrition 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 210000004233 talus Anatomy 0.000 description 2
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- VMRYFYIDRLZSES-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenanthrene-1-carboxylic acid Chemical class C1=CC2=CC=CC=C2C2=C1C(C(=O)O)=C([N+]([O-])=O)C=C2 VMRYFYIDRLZSES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000758795 Aristolochiaceae Species 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000004884 Balkan Nephropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010004542 Bezoar Diseases 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000031648 Body Weight Changes Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010007269 Carcinogenicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000002927 Hamartoma Diseases 0.000 description 1
- 206010019695 Hepatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000018716 Impatiens biflora Species 0.000 description 1
- 235000015912 Impatiens biflora Nutrition 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010023421 Kidney fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000004138 Lymphangiomyoma Diseases 0.000 description 1
- 201000004458 Myoma Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 206010071986 PTEN gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 235000003181 Panax pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 1
- 235000005155 Tanacetum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000026911 Tuberous sclerosis complex Diseases 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000004579 body weight change Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001914 calming effect Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000260 carcinogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007670 carcinogenicity Effects 0.000 description 1
- 208000020291 cardiac rhabdomyoma Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 208000002741 leukoplakia Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000003589 nefrotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000381 nephrotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000032678 sex differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 208000004371 toothache Diseases 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 206010044412 transitional cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000002477 vacuolizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010085 xinqin Substances 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
- 239000009284 zhennaoning Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
- G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及PTEN，TSC1和TSC2基因的在马兜铃酸敏感性检测中的应用。本发明提供AA‑Ⅰ的敏感性基因PTEN，TSC1和TSC2，所述的基因PTEN，TSC1和TSC2的表达量能够有效用于马兜铃酸毒性反应个体化差异的早期监测。PTEN、TSC1、TSC2基因测序FPKM数值小于0.5以下定义为不表达上述基因的个体，以此判断临床个体为AA‑Ⅰ敏感个体，为含马兜铃酸中药的用药安全提供技术支持。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及PTEN、TSC1和TSC2基因的在马兜铃酸敏感性检测中的应用。
背景技术
马兜铃酸（Aristolochic acids，AAs）是一类硝基菲类羧酸，具有肾脏毒性和致癌性。在马兜铃酸类化合物中，主要的毒性成分为马兜铃酸Ⅰ（AA-Ⅰ）和马兜铃酸Ⅱ（AA-Ⅱ）。已报道的大量马兜铃酸肾病（AAN）病例中，有些AAN患者后续发生尿路上皮癌和膀胱癌。泌尿系统致癌性的发现使马兜铃酸被列为Ⅰ类致癌物。现在存于2020版药典中的马兜铃科植物仅有细辛一种，细辛临床应用广泛，主要用于治疗过敏性哮喘、鼻炎、咳嗽以及新冠病毒感染等症。除了入汤剂外，大量的中成药制剂中亦含有细辛。申请人前期使用质谱检测了中国药典中收载的含有细辛的中成药中AA-Ⅰ的含量，在人参再造丸、珠贝定喘丸、小青龙汤口服液、通天口服液、儿童清肺口服液、九味羌活颗粒、辛芩颗粒、养血清脑丸颗粒、参芪十一味颗粒、醒脑再造丸胶囊、参三七伤药胶囊中未检测出AA-Ⅰ；鹭鸶咯丸、同仁大活络丸、散风活络丸、十一味参芪片、胃炎宁颗粒、小青龙汤颗粒中的AA-Ⅰ含量在质谱检测限以下；在平肝舒络丸、乌梅丸、风湿安泰片、参三七伤药片、鼻炎灵片、猴枣牛黄散、正天丸、痧气丸、追风透骨片、鼻渊舒口服液、齿痛消炎灵颗粒、镇脑宁胶囊、感特灵胶囊、辛芳鼻炎胶囊、十一味参芪胶囊中检测出AA-Ⅰ含量范围在0.01-0.05μg/g。
药物摄入体内后经肝组织代谢，机体的遗传背景不同、以及是否处于疾病状态会影响机体对药物的代谢，导致机体对药物出现不同的反应，因此筛选药物敏感性基因对临床安全用药至关重要。含马兜铃酸中药在临床应用一直争议较大，AA-Ⅰ长期给药造成肾脏损伤及肾纤维化，而针对AA-Ⅰ是否能诱导肝脏损伤，各个研究团队结果并不一致。临床结果显示马兜铃酸肾病患者具有性别差异性，以女性患者居多。由此推测马兜铃酸毒性可能具有人群易感性，本申请旨在提供马兜铃酸毒性易感基因，为临床安全用药提供科学依据。
PTEN基因突变会导致错构瘤综合征，为常染色体显性遗传病。患者会发生乳腺癌、甲状腺癌、子宫内膜癌和其他癌症。TSC1、TSC2基因突变会导致结节性硬化症，其为一种多器官受累的常染色体显性遗传病，临床诊断指标为大脑皮质结节、室管膜下巨细胞和星形细胞瘤、肾脏的血管肌脂肪瘤、淋巴管性肌瘤病、心脏横纹肌瘤、面部血管纤维瘤、皮肤皮革样病变和白斑。TSC1与TSC2在体内是以复合体形式存在，TSC2敲除后会导致TSC1的降解。
现有技术中尚未公开PTEN、TSC1和TSC2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了PTEN、TSC1和TSC2可作为马兜铃酸敏感性基因分子标志物，用于马兜铃酸毒性反应个体化差异的早期监测。
一方面，本发明提供了一种用于检测分子标志物的试剂在制备马兜铃酸敏感性检测产品中的应用，所述的分子标志物为PTEN、TSC1或TSC2中的至少一种。
具体地，所述的产品用于检测对马兜铃酸毒性的敏感性。
所述的PTEN、TSC1或TSC2的基因突变会诱导马兜铃酸毒性增强。
进一步具体地，所述的产品用于检测PTEN、TSC1或TSC2的表达量，即PTEN、TSC1或TSC2mRNA和蛋白表达可以诊断马兜铃酸毒性的个体化差异。
更进一步具体地，所述的PTEN、TSC1、TSC2基因测序FPKM数值小于0.5以下判断临床个体为马兜铃酸毒性敏感个体。
具体地，所述的试剂为特异性结合PTEN、TSC1或TSC2的试剂。
优选地，所述的特异性结合PTEN、TSC1或TSC2的试剂可以是PTEN、TSC1或TSC2的抗体。
具体地，所述的试剂为特异性结合PTEN、TSC1或TSC2的核酸的试剂。
具体地，所述的试剂为用于检测PTEN、TSC1或TSC2表达量的试剂。
优选地，所述的试剂为特异性扩增PTEN、TSC1或TSC2基因的引物和特异性识别PTEN、TSC1或TSC2的 mRNA的探针。
具体地，所述的产品包括但不限于：特异性分析PTEN、TSC1或TSC2的芯片或试剂盒。
在一些实施例中，所述的产品为芯片；所述的芯片包括但不限于：固相载体和特异性识别PTEN、TSC1或TSC2的探针。
在一些实施例中，所述的产品为试剂盒；所述试剂盒的包括但不限于：核酸抽提试剂、荧光染料、探针和引物中的一种或多种。
在另一些实施例中，所述的产品为试剂盒；所述的试剂盒为检测PTEN、TSC1或TSC2的ELISA试剂盒；所述试剂盒的包括特异性识别PTEN、TSC1或TSC2的抗体；所述试剂盒的还包括固相载体、标准品、底物、终止液和缓冲液中的一种或多种。
具体地，所述的产品针对的检测组织包括但不限于：血清、肝组织、肾组织、心脏组织、神经组织、皮肤组织、子宫组织、甲状腺组织、乳腺组织、血管或心脏组织。
又一方面，本发明提供了检测马兜铃酸敏感性的方法。
所述的方法中包括：药物喂食小鼠，检测小鼠组织中PTEN、TSC1或TSC2的表达量。
所述的组织包括但不限于：血清、肝组织、肾组织、心脏组织、神经组织、皮肤组织、子宫组织、甲状腺组织、乳腺组织、血管或心脏组织。
本发明所取得的技术效果：PTEN、TSC1或TSC2的基因突变会诱导马兜铃酸毒性增强。PTEN、TSC1或TSC2的基因突变会导致PTEN、TSC1或TSC2mRNA和蛋白质表达水平下降，因此检测PTEN、TSC1或TSC2的mRNA和蛋白表达可以诊断马兜铃酸毒性的个体化差异。
附图说明
图1为AA-Ⅰ处理PTEN缺失细胞及其对照细胞24h后的生存率，野生型对照细胞(WT)；PTEN基因缺失细胞（PTEN -/-）。
图2为AA-Ⅰ处理TSC2缺失细胞及其对照细胞24h后的生存率， 野生型对照细胞(WT)；TSC2基因缺失细胞（TSC2 -/-）。
图3为AA-Ⅰ处理肝脏PTEN基因缺失小鼠（Alb-PTEN -/-）及其对照鼠（WT）后的体重变化曲线。
图4为AA-Ⅰ处理肝脏PTEN基因缺失小鼠（Alb-PTEN -/-）及其对照鼠（WT）后的血清生化指标变化。
图5为AA-Ⅰ处理肝脏PTEN基因缺失小鼠（Alb-PTEN -/-）及其对照鼠（WT）后肝脏组织病理HE染色切片。
图6为PTEN缺失细胞及其野生型对照细胞蛋白与mRNA检测；其中A为PTEN蛋白表达水平检测结果；B为PTENmRNA检测结果。
图7为TSC2缺失细胞及其野生型对照细胞蛋白与mRNA检测；其中A为TSC1、TSC2蛋白表达水平检测结果；B为TSC1、TSC2的 mRNA检测结果。
图8为正常肝组织与肝癌组织中 PTEN、TSC1、TSC2蛋白表达情况。
图9为正常肝组织PTEN、TSC1、TSC2基因表达情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1AA-Ⅰ对PTEN基因缺失细胞敏感
1、试验试剂
AA-I (分子式为：C17H11NO7，分子量为341.27)，购自北京赛百草科技有限公司，批号：SH21031903。
CCK，购自北京全式金生物技术有限公司，批号：Q10707。
2、试验材料
小鼠PTEN基缺失成纤维细胞系(PTEN -/-)及其野生型对照细胞系(WT) 由中国医学科学院基础医学研究所张宏冰教授赠予。
3、试验仪器
细胞培养箱：Thermo Forma Steri-cycle；安全柜：YATAIKELONG；酶标仪：TECANSPARK。
4、试验方法
细胞培养96孔板每孔铺104个细胞，AA-I及其溶剂对照加入细胞中，培养24h后，加入CCK试剂，酶标仪选择450nm滤光片，检测细胞活性。
5、试验结果
AA-I药物设置10μM，20μM，40μM，100μM几个浓度梯度，结果显示WT细胞系IC50值为45μM，PTEN -/-细胞细胞系IC50值为19μM。即PTEN基因缺失会导致AA-I对细胞敏感性增强，毒性增强。
实施例2AA-Ⅰ对TSC2基因缺失细胞敏感
试验试剂、仪器与方法如实施例1
1、试验材料
小鼠TSC2基因缺失成纤维细胞系(TSC2 -/-)及其野生型对照细胞系(WT)，实验室自建。
2、试验结果
AA-I药物设置10μM，20μM，40μM，100μM几个浓度梯度，结果显示WT细胞系IC50值为45μM，TSC2 -/-细胞细胞系IC50值为19μM。即TSC2基因缺失会导致AA-I对细胞敏感性增强，毒性增强。TSC1与TSC2在体内以复合体的形式存在，TSC2缺失后必然会导致TSC1蛋白降解，故TSC1基因缺失也会导致AA-I对细胞敏感性增强，毒性增强。
实施例3AA-Ⅰ造成PTEN基因缺失小鼠肝脏组织损伤
1、试验试剂
AA-I (分子式为：C17H11NO7，分子量为341.27)，购自北京赛百草科技有限公司，批号：SH21031903。
CMC-Na，购自北京索莱宝科技有限公司，批号：1020M021。
2、试验材料
小鼠基因型：肝脏敲除PTEN基因小鼠（Alb-PTEN -/-）及其野生对照鼠（WT），本实验室繁殖。
小鼠品系：C57B6J；性别：雄性；动物周龄：6-8周。
动物要求：无特殊病原菌。
试验期间动物饲养地点：中国中医科学院中药研究所屏障环境动物实验室。饲养条件：屏障系统，温度20-26℃，相对湿度为40-70%，全新风。采取人工光照，12小时明暗周期。动物饲养于聚碳酸酯小鼠饲养笼。饲料：使用标准小鼠颗粒饲料，由北京市科澳协力饲料有限公司提供。饮用水：饮用纯净水，每周更换两次高压灭菌的饮水瓶。
3、试验仪器
动物天平：Sartorius，德国，型号：BSA3202s-CW、BSA224S-CW。
4、试验方法
4.1 随机分组
小鼠分为4组：野生型溶剂对照组（WT），野生型AA-I灌胃给药组（WT+AA-I），肝敲除PTEN溶剂对照组（Alb-PTEN -/-），肝敲除PTENAA-I灌胃给药组（Alb-PTEN -/-+AA-I）。
4.2 研究方法
溶剂对照组小鼠灌胃给予0.5% CMC-Na 7天，AA-I组，灌胃给予AA-I（5mg/kg）7天后。小鼠给药结束后，观察至14天，观察期间记录小鼠体重变化，记录小鼠生存状态。观察期结束后处死小鼠，留取小鼠组织进行后续试验研究。
4.3 胃、肾组织病理检查
留取小鼠血清、肝组织和肾组织，其中肝和肾组织留取2份，一份冻存于-80℃，另一份用10％的中性福尔马林将肺组织固定备用。送检组织经甲醛充分固定后，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，常规制备3μm石蜡切片。用HE染色，光学显微镜( DP71型，OLYMPUS，放大400倍)检查组织损伤情况。血清用于生化检测。
5、试验结果
试验起始时，WT+AA-I组小鼠与Alb-PTEN -/-+AA-I组小鼠体重无明显差别，给药后至实验结束期间，WT+AA-I组小鼠体重略高于Alb-PTEN -/-+AA-I组小鼠（图3），而溶剂对照组则表现为Alb-PTEN -/-组小鼠体重略高于小鼠WT组（图3），此结果提示Alb-PTEN -/-小鼠对AA-I敏感性高于WT小鼠。
血液生化结果显示Alb-PTEN -/-+AA-I组小鼠碱性磷酸酶（ALP）显著高于WT+AA-I组小鼠，而WT组小鼠与WT+AA-I组小鼠无明显差异（图4），此结果提示Alb-PTEN -/-小鼠对AA-I敏感性高于正常小鼠，即AA-I会造成Alb-PTEN -/-小鼠肝损伤，对正常小鼠无明显影响。
AA-I 造成Alb-PTEN -/-小鼠肝脏组织病理结果改变，主要表现为细胞质产生空泡样变性，细胞核消失不见（图5），而对正常小鼠影响不大此结果提示AA-I会造成Alb-PTEN -/-小鼠肝损伤，即PTEN基因敲除后造成机体对AA-I敏感性增强。
实施例4临床样本AA-Ⅰ敏感个体筛查
在Human Protein Atlas 数据库中查询PTEN、TSC1、TSC2在肝组织中的表达情况，结果发现在正常个体中PTEN均可检测到中度表达，但是在肝脏肿瘤细胞中未检测到PTEN表达（图8），同时在正常肝脏组织中PTEN基因的FPKM值为18（图9）。TSC1在正常肝组织呈现中度表达，在肝癌组织中呈现中、高度表达，有些病人肝癌组织中未检测到TSC1表达（图8），同时在正常肝脏组织中TSC1基因的FPKM值为2.43（图9）。TSC2在正常肝组织呈现高表达，在肝癌组织中呈现中、高度表达，有些病人肝癌组织中未检测到TSC2表达（图8），同时在正常肝脏组织中TSC2基因的FPKM值为13.2。综合以上结果，将PTEN、TSC1、TSC2基因测序FPKM数值小于0.5以下定义为不表达上述基因的个体，以此判断临床个体是否为AA-Ⅰ敏感个体。
实施例5一种检测AA-Ⅰ敏感性基因的试剂盒
1、试验材料如实施例1、实施例2。
2、试验试剂
RNA提取试剂盒，购自OMEGA公司，批号：R6934010000E1PU021。
cDNA反转录试剂盒，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司，批号：061200。
qPCR试剂盒，购自北京全式金生物有限公司，批号：P20814。
PTEN抗体，购自Cell signalling公司，批号：7。
TSC1抗体，购自Cell signallin公司，批号：3。
TSC2抗体，购自Cell signalling公司，批号：1。
预制胶，购自Invitrogen公司，批号：21100210。
Actin抗体，购自SantaCruze公司，批号：E0615。
3、试验仪器
分光光度计：Thermos，美国，型号：NANODROP 2000。
实时荧光定量PCR仪器：Roche，美国，型号：LightCycler 480 Ⅱ。
显影仪：Proteinsimple，美国，型号：FluorChem E。
4、试验方法
（1）PTEN、TSC1、TSC2基因mRNA实时荧光定量PCR检测
mRNA提取：使用OMEGA公司RNA提取试剂盒进行提取RNA工作，提取的细胞系包括：PTEN -/-及其对照WT细胞系，TSC2 -/-及其WT对照细胞系，按照说明书操作即可。
mRNA反转录：使用东洋纺公司mRNA反转录试剂盒进行大鼠胃组织mRNA的转录，按照说明书操作即可。
实时荧光定量qPCR：使用全式金real-time PCR试剂盒对cDNA进行qPCR反应，具体按照说明书操作即可。小鼠、人源的PTEN、TSC1、TSC2基因信息见表1，小鼠qPCR反应所使用的引物序列见表2。
表1：PTEN、TSC2基因信息
表2PTEN、TSC1、TSC2qPCR引物信息
（2） PTEN、TSC1、TSC2蛋白表达western-blot检测
蛋白提取：使用蛋白裂解液裂解细胞。
Western-blot：使用invitrogen公司预制胶进行蛋白质电泳，按照说明书操作即可。一抗：1:1000稀释，二抗1:10000稀释。使用显色试剂进行显影。
5、试验结果
qPCR结果显示，PTEN -/-细胞系与其对照WT细胞系相比PTEN基因的mRNA和蛋白表达明显下调见图6。；TSC2-/-细胞系与其WT对照细胞系相比TSC1、TSC2基因的mRNA和蛋白表达明显下调，见图7。
实施例6试剂盒实际检测效果验证
使用基因敲除小鼠验证试剂盒的检测效果。使用心脏TSC1基因敲除小鼠，提取心脏组织mRNA，进行TSC1、TSC2基因的qPCR反应，结果显示心脏组织中TSC1、TSC2的mRNA表达量明显下调。使用肝脏PTEN基因敲除小鼠，提取肝组织mRNA，进行PTEN基因的qPCR反应，结果显示心脏组织中PTEN的mRNA表达量明显下调。
使用人源的肝细胞系LO2验证试剂盒的检测效果。提取细胞mRNA，进行TSC1基因、TSC2基因、PTEN基因的qPCR反应，结果显示肝细胞中均可检测到这3个基因的表达。
Claims (10)
1.用于检测TSC2的试剂在制备成纤维细胞马兜铃酸敏感性检测产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂为特异性结合TSC2的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂为特异性结合TSC2的核酸的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂为用于检测TSC2表达量的试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的试剂为特异性扩增TSC2基因的引物和特异性识别TSC2的mRNA的探针。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品为特异性分析TSC2的芯片或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的芯片包括固相载体和特异性识别TSC2的探针。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的包括核酸抽提试剂、荧光染料、探针和引物中的一种或多种。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的包括特异性识别TSC2的抗体。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的还包括固相载体、标准品、底物、终止液和缓冲液中的一种或多种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311774806.1A CN117448445B (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311774806.1A CN117448445B (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117448445A CN117448445A (zh) | 2024-01-26 |
| CN117448445B true CN117448445B (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=89591471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311774806.1A Active CN117448445B (zh) | 2023-12-22 | 2023-12-22 | Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117448445B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110117652A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-13 | 箐健科技(天津)有限公司 | 肝癌早期诊断方法 |
| CN112237168A (zh) * | 2019-07-18 | 2021-01-19 | 上海交通大学 | 用马兜铃酸i或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法 |
| CN114807361A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-07-29 | 中国中医科学院中药研究所 | 马兜铃酸毒性分子标志物及其应用 |
-
2023
- 2023-12-22 CN CN202311774806.1A patent/CN117448445B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110117652A (zh) * | 2018-02-05 | 2019-08-13 | 箐健科技(天津)有限公司 | 肝癌早期诊断方法 |
| CN112237168A (zh) * | 2019-07-18 | 2021-01-19 | 上海交通大学 | 用马兜铃酸i或其联合四氯化碳构建小鼠肝癌模型的方法 |
| CN114807361A (zh) * | 2022-06-27 | 2022-07-29 | 中国中医科学院中药研究所 | 马兜铃酸毒性分子标志物及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 马兜铃酸相关肝癌发现和验证;路兆宁等;生命的化学;20191231;第39卷(第5期);1045-1048 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117448445A (zh) | 2024-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112245596B (zh) | 一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法 | |
| CN106222170A (zh) | 环状RNA circ‑CCNY及其用途 | |
| Zhu et al. | Effects of Enterocytozoon hepatopenaei single-infection or co-infection with Vibrio parahaemolyticus on the hepatopancreas of Penaeus vannamei | |
| KR20210153015A (ko) | 폴리펩티드를 함유한 생체 다중효과를 가진 약제학적 조성물 및 그 용도 | |
| CN111249299B (zh) | 大豆rna提取物在制备预防及治疗肠炎的药物中的应用 | |
| CN116808065B (zh) | lncRNA在治疗肥胖症中的应用 | |
| CN117448445B (zh) | Pten、tsc1和tsc2基因在马兜铃酸敏感性检测中的应用 | |
| CN114807361B (zh) | 马兜铃酸毒性分子标志物及其应用 | |
| CN117298121A (zh) | 蒲公英甾醇在幽门螺旋杆菌诱导的胃炎或胃癌中的应用 | |
| CN111304146B (zh) | 一种促中华绒螯蟹造血组织发育免疫增强剂的筛选模型构建方法 | |
| CN109402228A (zh) | RT-qPCR检测树鼩SLC2A9/Glut9基因转录水平的方法 | |
| CN105506131A (zh) | 检测人aeg-1基因表达量和相对表达量的引物对 | |
| CN110904233A (zh) | 检测样本中abcg2基因相对表达量的寡核苷酸和方法 | |
| CN105039536A (zh) | mo-miR-877在制备肾毒性生物标志物中的用途 | |
| Samir et al. | Comparative study on the effect of Probiotics and Silymarin on renal cortex in a rat model of high-fat, high-fructose diet | |
| CN110776521A (zh) | 一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用 | |
| CN112553342B (zh) | 一种肺腺癌诊断的生物标志物及其应用 | |
| TWI593703B (zh) | Polypeptide for use in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment or / and prevention of a disease associated with a target | |
| Li et al. | Research Article Investigation of the Effects of Glabridin on the Proliferation, Apoptosis, and Migration of the Human Colon Cancer Cell Lines SW480 and SW620 and Its Mechanism Based on Reverse Virtual Screening and Proteomics | |
| Zhang et al. | STAT3-mediated ferroptosis is involved in α-synuclein pathology | |
| Wang et al. | Differential expression of microRNAs in serum exosomes of obese and non-obese mice and analysis of their function | |
| CN106377530B (zh) | 一种治疗癌症尤其是肝癌的药物组合物 | |
| CN115919882A (zh) | 刺芒柄花苷在制备预防和/或治疗tdo介导病理特征疾病的药物中的应用 | |
| CN105018494A (zh) | mo-miR-374在制备肾毒性生物标志物中的用途 | |
| CN118416226A (zh) | Ku复合物抑制剂在靶向肿瘤中的治疗策略及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |