CN105506131A - 检测人aeg-1基因表达量和相对表达量的引物对 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了检测人AEG-1基因表达量和相对表达量的引物对。本发明公开的检测人AEG-1基因表达量和相对表达量的引物对，为名称为AEG-1-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。本发明的引物对能够检测AEG-1在肝癌组织中的表达含量，操作相对简单，结果准确。

Description

检测人AEG-1基因表达量和相对表达量的引物对
技术领域
本发明涉及生物技术领域中检测人AEG-1基因表达量和相对表达量的引物对。
背景技术
肝癌是病死率很高的消化系统肿瘤，其中90％为肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)。在世界范围内，其发病率呈现上升的趋势。我国是肝癌大国，也是全球肝癌发病率最高的国家。据统计，目前我国肝癌发病人数占全球的55％，而死亡人数约占全世界肝癌死亡人数的45％，素有“癌中之王”的称号，对我国人民健康构成严重威胁。目前临床上主要使用AFP作为肝癌诊断的标志物，但是由于肝炎、肝硬化等影响很容易造成误诊。因此，寻找新的肝癌诊断标志物至关重要。
星形细胞上调基因-1(astrocyteelevatedgene-1，AEG-1)是近期发现的新型促癌基因。AEG-1基因编码人类AEG-1蛋白，是含有582个氨基酸，分子量为64kd的蛋白。它是RAS，C-MYC基因的下游，其过度表达可以导致下游PI3K/AKT激活NF-κB和WNT信号通路。AEG-1被确定参与调控肿瘤转移过程，并且其表达水平在大多数肿瘤组织偏高，主要包括结肠癌，卵巢癌，乳腺癌，肝癌等。尤其在肝癌当中，与癌旁组织相比，AEG-1的表达明显升高。因此，AEG-1有希望成为潜在的肝癌诊断标志物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测人AEG-1基因表达量或相对表达量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的引物对。
本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的引物对，为名称为AEG-1-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人类AEG-1基因表达量或相对表达量的成套试剂。
本发明所提供的检测或辅助检测人类AEG-1基因表达量或相对表达量的成套试剂，由所述AEG-1-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
上述成套试剂中，所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒，由所述AEG-1-P或所述成套试剂与X1组成，所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。
上述试剂或试剂盒中，所述进行定量PCR扩增所需试剂可为qPCRMIX。qPCRMIX可为北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司产品。
上述试剂或试剂盒中，所述定量PCR扩增可为实时荧光定量PCR扩增。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的系统。
本发明所提供的检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的系统，由所述AEG-1-P、所述成套试剂或所述试剂或试剂盒与Y1组成，所述Y1为进行RNA提取所需的试剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
上述系统中，所述进行RNA提取所需的试剂可为TRIzol、氯仿、异丙醇和/或乙醇。TRIzol可为上海捷瑞生物工程有限公司产品。
所述进行反转录所需的试剂可为ReverTranscriptqPCRRTKit中的试剂。ReverTranscriptqPCRRTKit为Takara公司产品。
所述进行定量PCR扩增所需仪器可为实时荧光定量pcr仪(如ABI7300或ABI7500(美国AppliedBiosystems公司))。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统，包括所述AEG-1-P、所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的系统与基因定量数据处理系统；所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量，根据所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测AEG-1基因的表达量或相对表达量的方法。
本发明所提供的检测AEG-1基因的表达量或相对表达量的方法，包括以离体的待鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板，用所述AEG-1-P进行PCR扩增，所述PCR扩增中的退火条件可为58℃35sec。反应条件具体可为：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec，40个循环。
所述PCR扩增时的反应体系可为25μL反应体系，具体如下：2μLcDNA溶液，12.5μLqPCRMix(2×)，AEG-1-F(AEG-1-F在该反应体系中的浓度为0.2μM)，AEG-1-R(AEG-1-R在该反应体系中的浓度为0.2μM)，用无菌蒸馏水补至25μL。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法。
本发明所提供的鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法，包括：检测来自待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量；如果所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量越高，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越大，如果所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量越低，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
上述方法中，所述待鉴定组织和/或细胞可为肝脏组织和/或肝脏细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述AEG-1-P、所述成套试剂、所述试剂或试剂盒或所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量；
2)制备检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量产品；
3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞；
4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
上述应用中，所述肿瘤组织和/或细胞可为肝癌、结肠癌、卵巢癌或乳腺癌组织和/或细胞。
实验证明，本发明的引物对能够检测AEG-1在肝癌组织中的表达含量，操作相对简单，结果准确。
本发明鉴于现有技术中检测肝癌样品标志物的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物，用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测AEG-1基因相对表达量的试剂盒。
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术对AEG-1基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建AEG-1和内参基因GAPDH的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和AEG-1拷贝数，相比于以往的免疫组化方法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床样品的辅助性检测。
附图说明
图1为AEG-1熔解曲线。
图2为GAPDH熔解曲线。
图3为AEG-1和GAPDH的扩增曲线。其中。左侧为GAPDH扩增曲线，右侧为AEG-1扩增曲线。
图4为8位临床肝癌患者AEG-1的相对表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本发明的用于检测AEG-1基因相对表达量的试剂盒，包括：
TRIzol(上海捷瑞生物工程有限公司)；
氯仿；
无水乙醇；
ReverTranscriptqPCRRTKit(Takara公司)；
检测体系PCR反应液：qPCRMix(2×)(北京全式金生物技术(TransGenBiotech)有限公司)、AEG-1-F/AEG-1-R各0.2μM
其中，引物序列为：
AEG-1-F:CCTGGCCTTGCTGAAGAATC(序列1)
AGE-1-R:GGCTGCTTTGCTGTTACACT(序列2)
GAPDH-F:CATGAGAAGTATGACAACAGCCT(序列3)
GAPDH-R:AGTCCTTCCACGATACCAAAGT(序列4)
实施例2
本发明试剂盒的使用方法：
(1)抽提的组织RNA:取适量的新鲜组织，加入1mLtrizol在匀浆其中研磨均匀，加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulRNase-free水溶解沉淀。
(2)参考Takara公司的ReverTranscriptqPCRRTKit试剂盒说明书，将RNA反转为cDNA，得到cDNA溶液，cDNA溶液中cDNA的浓度为50μL/μL。
(3)试剂配置：每个反应体系均为25μL反应体系，具体如下：2μLcDNA溶液，12.5μLqPCRMix(2×)，AEG-1-F或GAPDH-F(AEG-1-F或GAPDH-F在该反应体系中的浓度为0.2μM)，AEG-1-R或GAPDH-R(AEG-1-R或GAPDH-R在该反应体系中的浓度为0.2μM)，用无菌蒸馏水补至25μL。用生理盐水作为空白对照。
(4)检测：检测在实时荧光PCR仪上进行，可用仪器包括ABI7300，ABI7500(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec，40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(5)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和CT值自动计算出拷贝数。
使用该试剂盒检测得到的溶解度曲线及扩增曲线见图1，图2和图3。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床标本
检测对象：临床肝癌患者8位(所有样品为肝癌I期组织)。每个患者的肝癌组织和肝癌旁组织成对检测一共8对，按实施例2试剂盒的使用方法检测待测样本。每个样本3次重复，1份空白对照。检测时间仅需100分钟。
8位临床肝癌患者样本检测结果如下表所示：
8位临床肝癌患者样本检测结果总结见图4。
图4结果显示，使用该引物对能够检测AEG-1在肝癌组织中的表达含量，操作相对简单，结果准确。
鉴于现有技术中检测肝癌样品标志物的不足，本发明设计了检测内参/目的基因用引物，用荧光定量PCR技术检测人融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了一种用于检测AEG-1基因相对表达量的试剂盒。
使用本发明的试剂盒，将实时荧光PCR技术对AEG-1基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建AEG-1和内参基因GAPDH的标准定量曲线，精确定量样本的内参基因拷贝数和AEG-1拷贝数，相比于以往的免疫组化方法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床样品的辅助性检测。

Claims (10)

1.检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的引物对，为名称为AEG-1-P的由序列表中序列1所示的单链DNA和序列2所示的单链DNA组成的引物对。
2.检测或辅助检测人类AEG-1基因表达量或相对表达量的成套试剂，由权利要求1所述AEG-1-P与名称为GAPDH-P的与人的GAPDH基因特异结合的引物对组成。
3.根据权利要求2所述的成套试剂，其特征在于：所述GAPDH-P由序列表中序列3所示的单链DNA和序列4所示的单链DNA组成。
4.检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的试剂或试剂盒，由权利要求1所述引物对或权利要求2或3所述成套试剂与X1组成，所述X1为进行定量PCR扩增所需试剂。
5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于：所述进行定量PCR扩增所需试剂为qPCRMIX。
6.检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量的系统，由权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂或权利要求4或5所述试剂或试剂盒与Y1组成，所述Y1为进行RNA提取所需的试剂、进行反转录所需的试剂和/或进行定量PCR扩增所需仪器。
7.鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的系统，包括权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂、权利要求4或5所述试剂或试剂盒或权利要求6所述的系统与基因定量数据处理系统；所述基因定量数据处理系统用于计算将来自待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量，根据所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量确定待鉴定组织和/或细胞是否为肿瘤组织和/或细胞。
8.下述1)或2)的方法：
1)检测AEG-1基因的表达量或相对表达量的方法，包括以离体的待鉴定组织和/或细胞的cDNA或RNA为模板，用权利要求1所述引物对进行PCR扩增，所述PCR扩增中的退火条件为58℃35sec。
2)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞的方法，包括：检测来自待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量；如果所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量越高，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越大，如果所述待鉴定组织和/或细胞的AEG-1基因的表达量或相对表达量越低，所述待鉴定组织和/或细胞为或候选为肿瘤组织和/或细胞的风险越小。
9.权利要求1所述引物对、权利要求2或3所述成套试剂、权利要求4或5所述试剂或试剂盒或权利要求6或7所述系统在下述1)-5)中任一种中的应用：
1)检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量；
2)制备检测或辅助检测人AEG-1基因表达量或相对表达量产品；
3)鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞；
4)制备鉴定或辅助鉴定肿瘤组织和/或细胞产品。
10.根据权利要求7所述系统、权利要求8所述方法或权利要求9所述应用，其特征在于：权利要求7或8中所述待鉴定组织和/或细胞为肝脏组织和/或肝脏细胞；权利要求9中所述肿瘤组织和/或细胞为肝癌、结肠癌、卵巢癌或乳腺癌组织和/或细胞。
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