CN106405114B - NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒 - Google Patents

NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106405114B
CN106405114B CN201610835961.3A CN201610835961A CN106405114B CN 106405114 B CN106405114 B CN 106405114B CN 201610835961 A CN201610835961 A CN 201610835961A CN 106405114 B CN106405114 B CN 106405114B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nfatc3
cell
reagent
expression
sensitive
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610835961.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106405114A (zh
Inventor
陈思宇
张秀丽
康婷
仝营营
丁文评
张莲
谭圳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Original Assignee
XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine filed Critical XinHua Hospital Affiliated To Shanghai JiaoTong University School of Medicine
Priority to CN201610835961.3A priority Critical patent/CN106405114B/zh
Publication of CN106405114A publication Critical patent/CN106405114A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106405114B publication Critical patent/CN106405114B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/24—Heavy metals; Compounds thereof
    • A61K33/36—Arsenic; Compounds thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明提供一种NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒。本发明的NFATc3的表达调节试剂，与现有的采用基因敲除、RNAi等下调基因表达的试剂相比，本发明采用As4S4作为NFATc3的表达调节试剂的毒性小。急性毒性实验表明，用Bliss法计算LD50为19.3±1.1g/kg，95％的可信区间为18.3‑20.4g/kg,远超过《药典》中记录的毒性剂量。

Description

NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的 筛选试剂盒
技术领域
本发明涉及一种NFATc3的表达调节试剂，本发明还涉及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒。
背景技术
流行病学研究表明，胃癌在全球范围内仍是预后较差恶性程度较高的肿瘤，而几乎有一半以上的胃癌发生于亚洲，在我国，随着生活水平提高，饮食习惯改变，胃癌发病率逐年提高。目前胃癌主要治疗方式为手术治疗，但各期胃癌总生存率在5％-15％之间，主要原因是大部分患者就诊时已属晚期，丧失了根治性手术的机会；即使是进行了根治性手术，至少80％患者最终会出现局部或远处的复发或转移。因此，研究寻找能有效抑制胃癌的药物很有必要。
含砷类中药在我国传统医学有超过两千年的应用历史，近年来在治疗肿瘤方面取得了显著成果。原始的含砷金属矿石包含三种主要成分：雄黄(As4S4)雌黄(As3S2)砒霜(As2O3)。其中砒霜的主要成分三氧化二砷被成功应用于治疗急性早幼粒细胞白血病(Acutepromyelocyti cleukemia,APL)，其作用机理主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡，抑制其增殖及诱导分化等发挥作用，被誉为“古老的中药焕发出新的光辉”。自美国食品与药物管理局(FDA)批准As2O3为临床用药以来，许多研究者尝试将其用于治疗恶性血液肿瘤以及一些实体肿瘤。但是，由于As2O3口服会明显增加肝毒性，目前主要用于静脉治疗，长期维持治疗有一定局限性。雄黄的主要成分为As4S4，是硫元素和砷元素的八元络合物，毒性较氧化砷明显减低，采取一定工艺进行处理可使其副作用进一步减少，应该更有临床应用前景。
雄黄(硫化砷)治疗白血病的临床实践中未发现明显的骨髓抑制、严重感染及出血，不易并发播散性血管内凝血(DIC)。由上可见，相对于氧化砷，雄黄(硫化砷)具有以下优越性：(1)口服较安全，使用方便；(2)药源广泛，经济实用；(3)毒副作用小，硫化砷的毒性远低于As2O3。如能将硫化砷用于治疗肿瘤，将具有极大社会效益。使用纯化的As4S4用于治疗APL和慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)等多种恶性血液病取得了较好的疗效。
目前对其作用机理的认识尚处在起步阶段，研究发现主要为诱导细胞凋亡、诱导细胞分化、抑制核酸合成、作为血管内皮细胞抑制剂和直接细胞毒作用等，对其作用的分子机制进行尚未有深入研究的报道。
NFAT蛋白可分为5类：NFAT1(NFATc2，NFATp)、NFAT2(NFATc1，NFATc)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATc3，NFATx)和NFAT5(TonEBP，OREBP)。NFAT最初是在免疫细胞中被鉴定，但是后来发现，NFAT的所有亚型均能广泛表达于所有的细胞和组织内。静息状态下，NFAT以高磷酸化无活性状态处于细胞质中，当细胞受刺激后，细胞内Ca2+水平升高激活钙调蛋白磷酸酯酶(calcineurin，CN)，从而使NFAT脱磷酸化，暴露入核信号向核易位。进而NFAT与特定DNA区域相结合协同其他转录因子或共激活物等共同调节靶基因的转录表达。因此，NFAT蛋白在分子医学领域的研究价值十分突出。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种NFATc3的表达调节试剂，本发明的另一个目的在于提供一种基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒。以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
本发明提供一种As4S4在制备调节癌细胞中NFATc3表达水平的试剂中的应用。
进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：As4S4中不含有氧化砷。
进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：其中，As4S4的剂量为0.5～20μM。
进一步，上述的应用，还可以具有这样的特征：其中，癌细胞为胃癌细胞、肠癌细胞或胰腺癌细胞。
进一步，上述的应用，其特征在于：其中，胃癌细胞为AGS和MGC803两个胃癌细胞株。
进一步，上述的应用，其特征在于，其中，应用中还包括在调节癌细胞中NFATc3表达水平的试剂中加入JQ1的步骤。
一种基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，其特征在于，包括：
检测NFATc3表达水平的试剂，当肿瘤细胞的NFATc3相对于肌动蛋白的表达量大于0.2时，则判断该肿瘤细胞株对砷剂敏感；对于肿瘤组织块，当其癌组织与相应癌旁组织内NFATc3表达量比值大于等于2时，则判断该肿瘤细胞对砷剂敏感；若癌旁组织内完全无表达，而癌组织内有表达，即认为阳性，判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。
进一步，本发明的基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测NFATc3蛋白表达水平的试剂包括：
含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，5×上样缓冲液，1×上样缓冲液，一抗，二抗，TBST缓冲液。
进一步，本发明的基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，还可以具有这样的特征：其中，检测NFATc3蛋白表达水平的试剂包括：10％的甲醛，70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液，乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液，石蜡和二甲苯(1:1)的混合溶液，二甲苯，柠檬酸盐缓冲液，正常非免疫动物血清，一抗，内源性过氧化物酶，生物素标记的二抗，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，DAB，Gill’s苏木素。
进一步，本发明的基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，还可以具有这样的特征，包括：检测NFATc3基因表达水平的试剂。
发明的有益效果
本发明的As4S4在制备调节癌细胞中NFATc3表达水平的试剂中的应用。与现有的采用基因敲除、RNAi等下调基因表达试剂相比，As4S4的毒性小，急性毒性实验表明，用Bliss法计算LD50为19.3±1.1g/kg，95％的可信区间为18.3-20.4g/kg,远超过《药典》中记录的毒性剂量。
另外，由于As4S4来源广泛，因此使用As4S4制备调节癌细胞中NFATc3表达水平的试剂经济实用。为癌细胞中分子机制的研究提供了新的工具。
本发明的基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，由于仅通过检测NFATc3的表达水平就可以判断胃癌细胞株是否对砷剂敏感，因此方便快捷。
附图说明
图1是结肠癌细胞HCT116在不同浓度硫化砷作用24h后NFATc3变化；
图2是结肠癌细胞HCT116在10uM硫化砷作用不同时间后NFATc3变化；
图3是结肠癌RKO细胞不同浓度硫化砷作用24h后NFATc3变化；
图4是结肠癌RKO细胞10uM硫化砷作用不同时间后NFATc3变化；
图5结肠癌SW480细胞不同浓度硫化砷作用12h后NFATc3变化；
图6胰腺癌PANC-1细胞不同浓度硫化砷作用24h后NFATc3变化；
图7胰腺癌PANC-1细胞10uM硫化砷作用不同时间后NFATc3变化；
图8利用western blotting检测不同胃癌细胞株中NFATc3的基础表达量；
图9是图8中结果的量化柱图；
图10胃癌AGS细胞不同浓度硫化砷作用24h后NFATc3变化；
图11胃癌MGC803细胞不同浓度硫化砷作用24h后NFATc3变化；
图12在AGS中分别利用硫化砷与JQ1单用与合用的结果；
图13MGC803中分别利用硫化砷与JQ1单用与合用的结果；
图14不同胃癌细胞株对硫化砷敏感性的差异；
图15基因沉默后胃癌细胞株对硫化砷敏感性的变化结果图；
图16是对耐药株SGC7901过表达NFATc3后对硫化砷敏感性上升的结果图。
具体实施方式
以下说明本发明的具体实施方式。文中使用的实验试剂均为来自商业途径能够购得的试剂。
<实施例一>As4S4对癌细胞中NFATc3表达的调节作用。
1.1As4S4对结肠癌细胞HCT116中NFATc3表达的调节作用
取结肠癌细胞株HCT116。使用2.5到20μM浓度梯度的As4S4对上述细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM。
结果如图1所示，As4S4对HCT116细胞株的肠癌细胞具有下调NFATc3表达量的作用。尤其在20μM浓度时，下调NFATc3表达的效果尤其显著。
如图2所示，在使用10μM的As4S4处理不同时间后，下调NFATc3表达的效果逐渐加强。
1.2As4S4对结肠癌细胞RKO中NFATc3表达的调节作用
取结肠癌细胞株RKO。使用1.25到10μM浓度梯度的As4S4对上述细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM。
结果如图3所示，As4S4对RKO细胞株的肠癌细胞具有下调NFATc3表达量的作用，在10μM浓度时，下调NFATc3表达的效果最显著。
如图4所示，在使用10μM的As4S4处理不同时间后，下调NFATc3表达的效果逐渐加强。
1.3 As4S4对结肠癌细胞SW480中NFATc3表达的调节作用
取结肠癌细胞株SW480。使用2.5到10μM浓度梯度的As4S4对上述细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、2.5μM、5μM、7.5μM、10μM。
结果如图5所示，As4S4对SW480细胞株的肠癌细胞具有下调NFATc3表达量的作用，在10μM浓度时，下调NFATc3表达的效果最显著。
1.4 As4S4对胰腺癌PANC-1细胞株的NFATc3表达的调节作用
取胰腺癌PANC-1细胞株。使用2.5到10μM浓度梯度的As4S4对上述细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、2.5μM、5μM、10μM。
结果如图6所示，As4S4对胰腺癌PANC-1细胞株具有下调NFATc3表达量的作用，在10μM浓度时，下调NFATc3表达的效果最显著。
如图7所示，在使用10μM的As4S4处理不同时间后，下调NFATc3表达的效果先加强然后略有减弱。
1.5 As4S4对胃癌细胞株AGS的NFATc3表达的调节作用。
取胃癌细胞株AGS。使用0.5到4μM浓度梯度的As4S4对上述各细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM。
结果如图10所示，As4S4对AGS细胞株的胃癌细胞具有下调NFATc3表达量的作用。图中显示了不同浓度的As4S4作用24h后NFATc3的表达变化。
1.6 As4S4胃癌细胞株MGC803的NFATc3表达的调节作用。
取胃癌细胞株MGC803。使用0.5到4μM浓度梯度的As4S4对上述各细胞株进行处理，按照以下浓度梯度给药：0μM、0.5μM、1μM、2μM、4μM。
结果如图11所示，As4S4对MGC803细胞株的胃癌细胞具有下调NFATc3表达量的作用。图11显示了As4S4不同浓度作用24h后NFATc3的表达变化。
为进一步提高As4S4的调节效果，加入JQ1,如图12和图13所示，当As4S4的浓度和JQ1的浓度分别为1μM二者合用作用于AGS或MGC803时，对NFATc3的抑制效果要强于单独使用As4S4或JQ1时的抑制效果。可见，As4S4和JQ1二者合用具有协同效应，NFATc3表达量下降更多。
以上结果表明，As4S4是一种有效的NFATc3表达抑制剂，尤其对于胃癌细胞株：AGS和MGC803，其效果更加显著。
As4S4作为NFATc3表达抑制剂的优势在于其安全性和经济性：纯化雄黄(或称As4S4或硫化砷)的急性毒性实验，用Bliss法计算LD50为19.3±1.1g/kg，95％的可信区间为18.3-20.4g/kg,远超过《药典》中记录的毒性剂量，远较As2O3安全(As2O3的LD50<50mg/kg)。
<实施例二>
基于上述下调NFATc3表达的实验发现，不同的胃癌细胞株对As4S4试剂的敏感性，存在着差异。
对胃癌细胞株：AGS、MGC803、MKN28、MKN45、SGC7901进行进一步的细胞毒性实验，见图14，结果表明：在相同的给药浓度下，As4S4对AGS和MGC803的抑制作用较强，对比图8和图9中NFATc3的基础表达量，可以看到NFATc3的基础表达量最高的AGS和MGC803，对As4S4的敏感性反而最高。
如图15所示，对最敏感的两个细胞株：AGS和MGC803的NFATc3进行基因沉默后，抑制率下降，IC50值上升。
如图16所示，对耐药株SGC7901过表达NFATc3后对硫化砷敏感性上升。
综合图14、图15、图16的结果，可以得出结论：胃癌细胞株对于As4S4的敏感性与NFATc3的表达量相关。从而使NFATc3的表达量成为筛选对As4S4的敏感性的细胞株的一项重要指标。
本实施方式的基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒，使用western对胃癌细胞进行NFATc3的表达量检测，从而判断不同胃癌细胞对As4S4的敏感性，指导个性化给药。
基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒包括：
含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，1ml；
5×上样缓冲液，20ml；
1×上样缓冲液，10ml；
一抗(抗NFATc31:500)，(购自Santa Cruz Biotechnology，sc-8405)
红外染料标记的二抗，(购自invitrogen,115-625-146)
TBST缓冲液，20ml。
使用上述试剂盒对于单独培养的细胞株进行敏感性筛选的具体步骤如下：
1.取出细胞，弃去细胞培养基，PBS洗去细胞碎片，将细胞放于冰上。
2.加入适量预冷的含蛋白酶抑制剂(PMSF)的蛋白裂解液。对于6cm的细胞培养盘，每孔加入150μl。
3.冰上裂解细胞10-15min，用预冷的刮刀将细胞刮下。将样品转移入Ep管中。
4.超声破碎仪破碎细胞。
5.4℃，14000转，离心15min。
6.取上清，采用BCA Protein Assay Kit测蛋白浓度后，向蛋白中加入1/5体积的5×上样缓冲液，煮沸10min。
7.根据不同蛋白的分子量，准备不同百分比的SDS-PAGE胶，具体而言，NFATc3分子量为130左右，使用8％的胶跑电泳。一般上样总蛋白的范围在20-40μg之间。
8.将胶板装入垂直电泳槽内，检查胶板和电极架的密合度，在内池中灌满电泳液，注意不要漏液。漏液会导致各泳道之间不齐，溴酚兰带会呈“︵”或“︶”等形状。取出梳齿。
9.根据上样量计算上样体积，并用1×上样缓冲液补齐。
10.上样结束后，接上电源，将电源设为恒流300mA输出，电压80mV,待跑齐后，可改为120mV，正常情况下，电泳可以在2个小时内结束。
11.电泳结束后，将胶板卸下，同时准备好电转移所需的滤纸，PVDF膜，预冷电转移槽和电转液。用100％甲醇将PVDF膜浸湿。
12.在一个容器中倒入1000ml左右的转膜液，在转膜液中将滤纸，胶和膜叠成三明治状。从黑色负极方向到白色正极方向的顺序分别为：滤纸-胶-PVDF膜-滤纸。
13.将电转移夹插入电转移槽中，注意将靠膜的一面朝向正极，靠胶的一面朝向负极。同时插入内置的冰盒。电转移的条件设定为恒流300mA。
14.电转结束后，取出PDVF膜，可以发现原本在胶上的Marker，现在已经被转移到了膜上。立即将PVDF膜浸泡入5％的脱脂牛奶中，勿使膜变干，室温封闭PVDF膜1小时。
15.一抗孵育：用一抗稀释液稀释一抗，稀释的倍数可以参考抗体供应商的建议。4℃孵育过夜。
16.洗膜：TBST缓冲液洗膜3次，每次10分钟。二抗孵育：用含5％脱脂牛奶的TBST稀释与一抗相应的红外染料标记的二抗。于室温下孵育1小时。然后再洗膜三次，每次10min。
17.采用Odyssey红外荧光扫描成像系统(Infrared Imaging System)进行成像，与传统化学成像其优势在于：应用荧光标记，准确定量，线性范围宽广；红外：背景低条带清晰，信噪比高；双色：同时检测，同时输出。
当NFATc3的相对Actin(肌动蛋白)的表达水平大于0.2时，判断此胃癌细胞株为As4S4敏感型胃癌细胞株。
对于肿瘤组织块的western检测，其癌组织与相应癌旁组织内NFATc3表达量比值大于等于2时，则判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。此外，若癌旁组织内完全无表达，而癌组织内有表达，即认为阳性，判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。
<实施例3>
对于不同胃癌病人胃癌组织，利用免疫组化方法检测胃癌组织和癌旁组织中NFATc3的表达，从而判断不同的胃癌组织对As4S4的敏感性:
本实施方式提供的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒包括：
10％的甲醛，
70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液，
乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液，
石蜡和二甲苯(1:1)的混合溶液，
二甲苯，
柠檬酸盐缓冲液，
正常非免疫动物血清，
一抗，
内源性过氧化物酶，
生物素标记的二抗，
链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，
DAB，
Gill’s苏木素。
使用上述试剂盒对胃癌组织进行检测的过程如下:
组织切片
1、剪取组织,10％甲醛固定。
2、已经固定好的组织依次在70％、80％、90％、95％、95％、100％的乙醇溶液中浸泡15-20min；
3、再浸入乙醇和二甲苯(1:1)的混合溶液中15-20min，然后浸入二甲苯直到透明，将透明的组织浸入石蜡和二甲苯(1:1)的混合溶液中浸泡1h，用石蜡进行固定。
4、包埋、切片
免疫组化
1、组织切片置于58℃烘箱内烤片20min,然后取出待冷却后，进行脱蜡。
2、连续2次二甲苯脱蜡各15min，依次浸入100％、95％、80％乙醇、蒸馏水各2min。
3、高压抗原修复：将3L柠檬酸盐缓冲液注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于切片架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖高压锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时(加热5-6min)，此时压力锅内的温度为120℃，1.2P(1.2个标准大气压)，计时1-2min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，蒸馏水冲洗，PBS洗，切片室温冷却20min，再次PBS洗。
4、免疫化学检测
1)室温，正常非免疫动物血清封闭30min；
2)一抗(抗NFATc31:500)4℃12h；(Santa Cruz Biotechnology sc-8405)；
3)用PBS清洗两次，每次2min；
4)室温，内源性过氧化物酶阻断1h；用PBS清洗三次，每次2min；
5)室温，生物素标记的二抗30min；用PBS清洗三次，每次2min；
6)室温，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶30min；
7)DAB(免疫组化用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒)显色5min，蒸馏水冲洗；
8)Gill’s苏木素复染3min；
9)自来水流水冲洗5min；依次95％、100％的乙醇脱水3min；
10)用二甲苯透明，封片，镜检，拍照。
11)计算NFATc3的表达量。对于肿瘤组织标本，其癌组织与相应癌旁组织内NFATc3表达量比值大于等于2时，则判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。此外，若癌旁组织内完全无表达，而癌组织内有表达，即认为阳性，判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。
免疫组化结果的表达量计算使用二级计分的方法进行统计观察，即免疫组织得分IRS(immunoreactivityscore,IRS)等于染色强度得分与染色阳性率得分之积。
a)定位的判定：胞浆、胞膜、胞核
b)定性的判定：阴性、阳性
c)定量的判定：
染色强度得分：在低倍镜下观察组织点整个视野，将染色强度分为弱阳性(浅黄色，1分)、中阳性(棕黄色，2分)及强阳性(棕褐色，3分)。染色阳性率得分：在低倍镜下观察组织点整个视野，随机选取3个染色强度不同的视野，转换为高倍镜判读染色阳性率。于每个高倍镜视野中随机观察100个细胞，然后记下这100个细胞中染色阳性的细胞所占百分率X1％，同样方法观察后2个视野中染色阳性细胞所占的百分率X2％、X3％，该组织点染色阳性率为三个视野的X1％、X2％和X3％平均值。0～4％记0分，5～24％记1分，25～49％记2分，50～74％记3分，75～100％记4分。计算染色强度得分与阳性率得分之积。按照胞浆、胞核、胞膜定位分别来计分，每个样本得分则为胞浆、胞核、胞膜得分之和。
<实施例4>
使用RT-PCR检测胃癌与癌旁的NFATc3相对表达量，
PT-PCR(实时定量荧光PCR)的步骤如下:
(一)样品RNA的抽提
事先准备冰，75％的乙醇，1.5ml离心管放入冰中冷却备用，离心机提前预冷，操作带口罩。
1.取适量胃癌与癌旁组织置于研磨管中，加入1ml的Trizol，消化研磨，移入冷却好的EP管中,离心去沉淀。
2.两相分离：按Trizol：氯仿＝5：1的比例，即每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。剧烈振荡管体15s后，室温静置5min。
3.4℃下12000rpm离心15分钟。
4.离心后吸水相上层加入新的EP管中，200μl-400μl，再加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，颠倒混匀15s，室温静置10min。
5.4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
6.移去上清液(注意用枪头吸，不要倒掉)，加入与最初TRIZOL等量的75％乙醇，轻轻颠倒，洗净瓶壁。
7.4℃下12000rpm离心5分钟。
8.弃上清，弃掉残余(用200μl枪吸掉大部分乙醇溶液)，倒置晾干，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
9.加入20μl DPEC水用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液可保存于-80℃待用。
(二)RNA质量检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
(三)逆转录
20μl体系：
RNA量＝1000μg/浓度(X)；
MiXed RT试剂＝4μl；
不含RNA酶的ddH2O＝(16-X)μl；
先离心，震荡混匀，再离心；
数值：
Stage I 37℃*15：00min
Stage II 85℃*0.05s
Stage III 4℃
(四)Realtime-PCR
反应体系如表1所示：
表1：标准品反应体系(20μl体系)
2.上机步骤如下表
表2：上机步骤表
其相对表达数据如下表：
表3：癌组织与癌旁组织NFATc3相对表达量表
癌旁 癌
1 1.457
1 1.53
1 4.003
1 1.049
1 1.869
1 1.452
1 2.104
1 2.213
1 11.337
1 1.75
1 1.92
1 19.55
1 6.74
1 3.207
1 3.373
1 2.581
癌组织与癌旁组织的NFATc3的表达量的比值：
＜1.5的3例；
1.5-2的4例；
2-3的3例；
3-5的3例；
＞5的3例。
对于肿瘤组织块，其癌组织与相应癌旁组织内NFATc3表达量比值大于等于2时，则判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。此外，若癌旁组织内完全无表达，而癌组织内有表达，即认为阳性，判断该肿瘤细胞对砷剂敏感。

Claims (4)

1.检测NFATc3表达水平的试剂在制备As4S4敏感型细胞的筛选试剂盒中的应用，其特征在于，包括：
检测NFATc3表达水平的试剂，
对于肿瘤细胞，当肿瘤细胞内的NFATc3相对于肿瘤细胞内肌动蛋白的表达量大于0.2时，则判断该肿瘤细胞对As4S4敏感；对于肿瘤组织块，当其癌组织细胞与相应癌旁组织细胞内NFATc3表达量比值大于或等于2时，则判断该癌组织细胞对As4S4敏感；
若癌旁组织细胞内NFATc3完全无表达，而癌组织内有NFATc3表达，即认为阳性，则判断该癌组织细胞对As4S4敏感，所述的肿瘤细胞为胃癌细胞；所述的肿瘤组织为胃癌组织；所述的癌组织细胞为胃癌组织细胞。
2.如权利要求1所述的检测NFATc3表达水平的试剂在制备As4S4敏感型细胞的筛选试剂盒中的应用，其特征在于：
其中，所述胃癌细胞为AGS或MGC803两个胃癌细胞株。
3.如权利要求1所述的检测NFATc3表达水平的试剂在制备As4S4敏感型细胞的筛选试剂盒中的应用，其特征在于：
所述检测NFATc3的表达水平的试剂为检测NFATc3蛋白表达水平的试剂或检测NFATc3基因表达水平的试剂。
4.如权利要求3所述的检测NFATc3表达水平的试剂在制备As4S4敏感型细胞的筛选试剂盒中的应用，其特征在于：
其中，检测NFATc3蛋白表达水平的试剂为检测NFATc3蛋白的免疫组织化学检测的试剂。
CN201610835961.3A 2016-09-20 2016-09-20 NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒 Active CN106405114B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610835961.3A CN106405114B (zh) 2016-09-20 2016-09-20 NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610835961.3A CN106405114B (zh) 2016-09-20 2016-09-20 NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106405114A CN106405114A (zh) 2017-02-15
CN106405114B true CN106405114B (zh) 2018-07-13

Family

ID=57996838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610835961.3A Active CN106405114B (zh) 2016-09-20 2016-09-20 NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106405114B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109394783B (zh) * 2018-10-22 2020-12-15 上海交通大学医学院附属新华医院 As4S4和JQ1联合应用在制药中的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102805867A (zh) * 2012-09-02 2012-12-05 江南大学 转录因子nfatc3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用
WO2015061890A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 The University Of British Columbia Cancer biomarkers and classifiers and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102805867A (zh) * 2012-09-02 2012-12-05 江南大学 转录因子nfatc3作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用
WO2015061890A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 The University Of British Columbia Cancer biomarkers and classifiers and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Arsenic sulfide combined with JQ1, chemotherapy agents, or celecoxib inhibit gastric and colon cancer cell growth.;Lian Zhang, et al.;《Drug Design, Development and Therapy》;20151030;第9卷;第5851-5862页 *
Arsenic sulfide, the main component of realgar, a traditional chinese medicine, induces apoptosis of gastric cancer cells in vitro and in vivo.;Lian Zhang, et al.;《Drug Design, Development and Therapy》;20141216;第9卷;第79-92页 *
Study of Arsenic Sulfide in Solid Tumor Cells Reveals Regulation of Nuclear Factors of Activated T-cells by PML and p53.;Weiping Ding, et al.;《Scientific Reports》;20160122;摘要，第2-6、10-12页，图2、6，附加材料图S1-S3 *
清毒颗粒抑制血管新生防治乳腺癌的药理机制;赵欣;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20141115(第11期);第26-33页 *
转录因子NFATc3在胰岛β细胞增殖和功能中作用的研究;胡莉;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20150215(第2期);第3-16页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106405114A (zh) 2017-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Fatty acid synthase regulates invasion and metastasis of colorectal cancer via Wnt signaling pathway
WO2019165695A1 (zh) 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用
Yoshitake et al. Aldo-keto reductase family 1, member B10 in uterine carcinomas: a potential risk factor of recurrence after surgical therapy in cervical cancer
Yu et al. Overexpression of astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) in cervical cancer and its correlation with angiogenesis
CN112280857B (zh) 一种用于肝细胞癌诊断的生物标志物及其应用
Wang et al. Exosomal CD44 transmits lymph node metastatic capacity between gastric cancer cells via YAP-CPT1A-mediated FAO reprogramming
Zhang et al. Overexpression of ROCK1 and ROCK2 inhibits human laryngeal squamous cell carcinoma
CN109439757A (zh) 血浆外泌体miR-455-3p作为早期肝癌诊断标志物的应用
CN107099584A (zh) 一种与结直肠癌转移及预后相关的分子标记物及其应用
Chen et al. miR‐190b promotes tumor growth and metastasis via suppressing NLRC3 in bladder carcinoma
CN105287552B (zh) 阿西替尼的应用
CN106405114B (zh) NFATc3的表达调节试剂以及基于NFATc3的砷剂敏感型细胞的筛选试剂盒
Shi et al. Up-regulation of T-lymphoma and metastasis gene 1 in gastric cancer and its involvement in cell invasion and migration
Du et al. High STRN expression promotes HCC invasion and migration but not cell proliferation or apoptosis through facilitating epithelial‐mesenchymal transition
Liu et al. Aberrant expression of laminin γ2 correlates with poor prognosis and promotes invasion in extrahepatic cholangiocarcinoma
Chen et al. Role and mechanism of Dvl3 in the esophageal squamous cell carcinoma.
Koga et al. Oxysterol binding protein‐related protein‐5 is related to invasion and poor prognosis in pancreatic cancer
Zhang et al. Combined Effects of 2‐Methoxyestradiol (Hypoxia‐Inducible Factor 1α Inhibitor) and Dasatinib (A Second‐Generation Tyrosine Kinase Inhibitor) on Chronic Myelocytic Leukemia Cells
CN102353781B (zh) 一种乳腺癌检测试剂盒
Zang et al. EI24 Suppresses Tumorigenesis in Pancreatic Cancer via Regulating c‐Myc
Yuan et al. TWSG1 is a novel tumor suppressor in gastric cancer
WO2019174110A1 (zh) Rhcg基因在制备治疗癌症药物及诊断性试剂盒中的应用
CN105506131A (zh) 检测人aeg-1基因表达量和相对表达量的引物对
Zhao et al. Particularly interesting new cysteine-histidine rich protein expression in colorectal adenocarcinomas
CN110157805A (zh) 一种hoxb13联合其下游靶基因检测预测肺腺癌进展、预后及耐药的试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant