CN105287552B - 阿西替尼的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿西替尼的新应用，阿西替尼可用于制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物，用于预防和治疗肥胖以及与肥胖相关的疾病。此药物在体外能够促进原代白色脂肪细胞的褐色化，即增强褐色脂肪细胞标志基因解偶联蛋白1(UCP1)的表达，在体内能够促进腹股沟处白色脂肪组织中的米色脂肪细胞增多和UCP1的表达升高；能抵抗高脂饲料诱导的肥胖和胰岛素不敏感，同时具有治疗脂肪肝的作用。

Description

阿西替尼的应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别是涉及一种阿西替尼的新应用。

背景技术

肥胖是指在一定程度上明显的脂肪层过厚以及体重超标，多是因机体代谢的能量失衡所引起的。当前随着经济发展和人们生活水平的日益提高，生活、工作压力的不断加大，肥胖患者的人数在全球不断攀升。肥胖既是一个独立的疾病，又是2型糖尿病、血管病、高血压、中风和多种癌症的危险因素，被世界卫生组织列为导致疾病负担的危险因素之一。

人们在了解肥胖对健康危害的同时认识到研发安全有效的减肥药物刻不容缓。不幸的是目前用于体重控制的药物不但数量有限而且效果也不明确，曾经有很多种药物用于降体重的治疗，但由于明显的副作用(如高血压、严重的情绪障碍、明显的心肌病理改变和死亡率的增加)而不得不终止治疗。因此开发出新的治疗肥胖的药物可不容缓。

肥胖患者主要表现为腹部脂肪组织增多，这表明脂肪细胞在肥胖的发生过程中发挥重要作用。脂肪细胞传统观念认为，哺乳动物体内的脂肪组织分为白色脂肪组织(whiteadipose tissue，WAT)和褐色脂肪组织(BAT)，WAT又分为皮下WAT和内脏WAT。脂肪组织是由大量的成熟脂肪细胞和少量前脂肪细胞、巨噬细胞和免疫细胞以及纤维结缔组织、血管、神经组织织等构成。WAT和 BAT两者在形态、分布、功能上具有明显差别，具体表现为以下几点：白色脂肪细胞含有一个大的脂滴，占据了绝大部分的细胞质容积，褐色脂肪细胞则含有多个小的脂滴；白色脂肪细胞含有相对较少的线粒体，而褐色脂肪细胞则含有大量的线粒体；WAT主要分布在皮下、附睾、肠系膜和肾周等处，BAT主要分布在颈部、肩胛下、肩胛间和主动脉周围等区域；BAT与WAT相比，BAT有更丰富的血管，并受神经系统的支配；WAT主要以三酰甘油的形式储存过剩的能量，BAT主要通过产热的方式来消耗能量，调节体内能量代谢，并在维持动物体温和能量平衡中起重要作用；人类的WAT自出生后才开始出现并逐渐增多，而BAT从胎儿期即开始出现，婴儿时期达到高峰，并随着年龄增长而减少；白色脂肪细胞中不表达UCP1，而BAT中高表达UCP1，这是其发挥生物作用的重要原因，也是其最重要的和独特的分子标记。所以，褐色脂肪细胞的主要功能就是通过UCP1来产热从而消耗能量而不产生ATP：即褐色脂肪细胞可以通过UCP1，将线粒体内的电子传递链与ATP合成解偶联，进而通过氧化磷酸化解偶联呼吸，将脂肪酸β氧化产生的能量以热量的形式散失掉。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能，可以维持体温恒定，也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量，从而降低肥胖发生。

传统的观念认为，WAT与BAT在分布上是完全隔离的，但近年的研究表明，两种脂肪组织可能是混合分布的，只是在不同类型的脂肪组织中占优势的类别不同而已，即在WAT中，除占主导地位的白色脂肪细胞之外，在一定调节的刺激下，也会出现褐色样的脂肪细胞.人们把在WAT中发现的这种与BAT 一样具有产热功能的细胞成为“米色脂肪细胞”(beige cell)，这种现象也被认为是白色脂肪细胞的褐色化。经典的褐色脂肪细胞与米色脂肪细胞，虽然都能表达具有产热作用的UCP1，但两种褐色脂肪细胞的分布是不同的，经典的褐色脂肪细胞主要分布于啮齿动物的肩胛骨区域，而米色脂肪细胞主要分布于腹股沟区域的皮下脂肪组织中。对于人类来说，褐色脂肪细胞主要存在于婴儿体内，但是目前研究发现，成年人的颈部、锁骨上也含有相当量的褐色脂肪细胞，且它们与啮齿动物的米色脂肪细胞相似。除了分布差异外，两种褐色脂肪细胞的来源也不同。经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源。促进白色脂肪细胞褐色化的细胞因子FGF21等可以有效的抵抗肥胖等疾病的发生。因此寻找能够促进白色脂肪细胞褐色化的药物成为了研究热点研究发现，此类研究对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。

阿西替尼(axitinib)是由美国Pfizer公司研发的一种多靶点酪氨酸激酶抑制剂。于2012年1月27日获美国FDA批准上市，商品名为Inlyta。该药为片剂，用于治疗对药物没有应答的晚期肾癌(肾细胞癌)。阿西替尼的中文化学名称：N-甲基-2-((3-((1E)-2-(吡啶-2-基)乙烯)-1H-吲唑-6-基)硫)苯甲酰胺；英文化学名称：N-methyl-2-((3-((1E)-2-(pyridin-2-yl)ethenyl)-1H-indazol-6-yl) sulfanyl)benzamide；分子式：C22H18N4OS；分子量：386.47；CAS登记号： 319460-85-0。近年来还发现阿西替尼具有治疗非小细胞肺癌和白血病的作用，但阿西替尼具有促进白色脂肪细胞褐色化的作用尚没有报道。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种阿西替尼的新应用。

具体的技术方案如下：

阿西替尼在制备治疗肥胖以及与肥胖相关的疾病的药物中的应用。

在其中一些实施例中，所述与肥胖相关的疾病为代谢综合症、2型糖尿病以及脂肪肝中的任一种。

本发明的另一目的是提供阿西替尼的另一新应用。

阿西替尼在制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。

本发明的有益效果：

阿西替尼可用于制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物，用于预防和治疗肥胖以及与肥胖相关的疾病。此药物在体外能够促进原代白色脂肪细胞的褐色化，即增强褐色脂肪细胞标志基因解偶联蛋白1(UCP1)的表达，在体内能够促进腹股沟处白色脂肪组织中的米色脂肪细胞增多和UCP1的表达升高；能抵抗高脂饲料诱导的肥胖和胰岛素不敏感，同时具有治疗脂肪肝的作用。

附图说明

图1为阿西替尼在体外促进白色脂肪细胞中UCP1的表达与剂量的关系图；

图2为阿西替尼促进UCP1在小鼠体内白色脂肪细胞中表达的比较图 (DMSO，二甲基亚砜；Axitinib，阿西替尼；iWAT,腹股沟处脂肪组织；eWAT，附睾处脂肪组织)；

图3为阿西替尼对高脂饲料诱导的小鼠体重的影响图；

图4为阿西替尼对小鼠脂肪组织和肝脏组织的重量的影响比较图；

图5为阿西替尼对高脂饲料诱导的小鼠葡萄糖耐量异常的影响图；

图6为阿西替尼对高脂饲料诱导的小鼠胰岛素抵抗的影响图；

图7为阿西替尼缓解脂质在肝脏中的累积图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

如无特殊说明，以下实施例中所使用的试剂均来源于市售，操作方法均为现有常规操作方法。

实施例1 阿西替尼在体外呈剂量依赖性促进白色脂肪细胞褐色化

腹股沟处白色脂肪间充质细胞的分离

1)取一只约10周龄的成年小鼠，断颈处死，在75％的酒精中浸泡5分钟，然后转移到操作台中，取出腹股沟处的白色脂肪；

2)用PBS清洗3次，用剪刀将脂肪组织剪碎，1g脂肪组织加入10ml胶原酶I溶液(用D-Hanks溶液配制，100ml加入0.1g胶原酶I)，放置37℃消化40 分钟；

3)用250μm滤膜过滤，加入细胞培养液，然后转移到离心管中，1000rpm 离心3分钟；

4)离心后的上浮层为成熟的脂肪细胞，转移到装有PBS溶液的离心管中，混匀后再次离心。再次分离的上层成熟的脂肪细胞可以收集后用于提取RNA，蛋白等；

5)第一次离心后的底部细胞为脂肪间充质细胞，弃除上清后，用新鲜的培养液悬起，铺到培养板中，第二天换液。

6)获得的脂肪间充质细胞在添加10％胎牛血清(Hyclone)高糖的DMEM (Hyclone)的培养液生长至满；

7)更换培养液为添加了MDIR(0.5mM异丁基黄嘌呤，1μM地塞米松，87nM 胰岛素和0.5μM罗格列酮：IBMX+Dex+Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液 (添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，培养2天。

8)2天后，培养液更换为只添加IR(87nM胰岛素和0.5μM罗格列酮:Insulin+rosiglitazone)的诱导培养液(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，每两天更换一次，直到细胞完全分化为脂肪细胞。

9)将培养基更换为正常的培养基(添加10％胎牛血清高糖的DMEM的培养液)，同时添加不同浓度的阿西替尼药物刺激两天。两天后，裂解细胞，提取 RNA，并反转录为cDNA，检测细胞中UCP1的表达。

结果如图1所示，与空白组(DMSO)相比，随着阿西替尼剂量提高，细胞中UCP1的表达明显提高。

脂肪细胞的基因表达鉴定

RNA提取：利用Trizol法提取，具体操作如下：

1)将分化后的细胞取出，移除培养基，用PBS洗涤一次，然后加入1ml Trizol，裂解30分钟，然后转移到EP管中；

2)加入200μl氯仿/ml Trizol,用力振荡混匀15秒，室温放置3分钟，4℃， 12,000g离心15分钟；

3)溶液分成三层，品分为三层：无色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相，小心吸取上清至新的离心管；

4)加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，4℃，12,000g离心 10分钟；

5)小心去除上清，加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻混匀，悬浮沉淀， 4℃，7500g离心5分钟；

6)去除上清，自然烘干5分钟左右，加入40μl DEPC水溶解RNA沉淀；

7)取5μl进行电泳检测提取RNA的质量，28S条带亮度是18S条带两倍的 RNA是质量较好的RNA，凝胶与电泳缓冲液需新鲜配制；

8)取2μl测定RNA浓度，RNA的浓度＝OD₂₆₀×稀释倍数×0.04μg/μL， OD_260nm/OD_280nm在1.8～2.0视为抽提的RNA的纯度很高。

RNA逆转录：利用SuperScriptTMⅡRT逆转录试剂盒合成cDNA；

荧光实时定量PCR：采用Takara公司RT-PCR Kit(Perfect Real Time)定量PCR试剂盒，根据说明进行定量PCR反应。

反应条件：

预变性：95℃ 20秒；

变性：95℃，10秒；

退火：60℃，20秒；

孵育：70℃ 1秒；

根据基因的表达量重复38～45个循环，65～95℃做溶解曲线，每0.5℃读一次板，时间为1秒。

结果如图1所示：在0-1uM浓度范围内，随着阿西替尼浓度的升高，UCP1 的表达逐步升高，这表明阿西替尼能显著促进白色脂肪细胞的褐色化。

实施例2 10周龄的小鼠在高脂饲料喂养的同时以10mg/kg的剂量灌胃阿西替尼，空白组灌胃相同剂量的PBS，8周后，检测体内腹股沟的白色脂肪细胞的褐色化和小鼠体重及内脏器官的重量变化。

脂肪组织的基因表达鉴定

RNA提取：利用Trizol法提取，具体操作如下：

将小鼠分离的脂肪组织称取100mg，然后加入1ml的Trizol，用研钵研磨30 分钟，然后转移到EP管中；其余步骤与脂肪细胞的基因表达鉴定相同。

结果如图2，图3和图4所示，较对照组，阿西替尼灌胃小鼠中iBAT和iWAT 中UCP1的表达显著升高，体重明显降低，iWAT，eWAT，Liver的重量也明显下降。这表明阿西替尼可以有效治疗肥胖症状。

实施例3 10周龄的小鼠在高脂饲料喂养的同时以10mg/kg的剂量灌胃阿西替尼，8周后，检测体内的葡萄糖耐受和胰岛素敏感。

葡萄糖耐受和胰岛素耐受实验

用生理盐水配制20％的葡萄糖溶液，然后按照2g葡萄糖/kg体重的剂量注射小鼠，腹腔注射经12小时禁食(晚上9点～次日早上9点)的小鼠。以血糖仪监测注射前(0分钟)以及注射后小鼠在不同时间点的血糖浓度(15分钟、30分钟、 60分钟、120分钟)，时间误差控制在5秒以内。

胰岛素耐受实验所用胰岛素剂量为0.5单位/kg体重。但是禁食时间为6小时(早上9点～下午3点)，其余操作方法与葡萄糖耐受实验一致。

结果如图5和图6所示，较单纯高脂肪饮食对照组，阿西替尼灌胃组小鼠胰岛素抵抗及葡萄糖耐量异常状态有了明显改善，表明阿西替尼可以很好地治疗胰岛素抵抗或2型糖尿病。

实验例4 10周龄的小鼠在高脂饲料喂养的同时以10mg/kg的剂量灌胃阿西替尼，8周后，检测脂质在肝脏中的累积

检测脂质在肝脏中的累积

1)常规肝脏石蜡切片

2)HE染色石蜡切片在二甲苯中脱蜡5-10分钟，入100％、95％、85％、 70％酒精，各级为2-5分钟；经蒸馏水转入染液；苏木精染液染色5～15分钟；0.5-1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻；0.1-0.5％伊红染液染色1-5分钟；依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2-3分钟，二甲苯透明(二次)，共约10分钟。封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。

结果如图7所示，较单纯高脂肪饮食对照组，阿西替尼灌胃组小鼠肝脏中脂质的累积明显降低，这表明阿西替尼可以有效地治疗脂肪肝。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.阿西替尼在制备促进白色脂肪细胞褐色化的药物中的应用。