CN107638569A - 增强褐色脂肪细胞产热效率的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了增强褐色脂肪细胞产热效率的方法和应用，具体地，本发明提供了一种产热增强化合物的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于用于增强NE受体及其下游cAMP‑PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率；其中，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。本发明的产热增强化合物与第一化合物(NE受体及其下游cAMP‑PKA信号通路增强剂)联用可显著增强NE受体及其下游cAMP‑PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率。

Description

增强褐色脂肪细胞产热效率的方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及增强褐色脂肪细胞产热效率的方法和应用。

背景技术

肥胖的发生主要是摄入的营养物质多余营养物质的消耗(Celi,2009)。肥胖是导致二型糖尿病、高血脂和癌症等疾病的重要因素之一。现有治疗肥胖症的方法主要包括节食、增强运动、药物治疗等；节食和增强运动有一定效果，但难以长期坚持，药物治疗的效果非常有限(Celi,2009；Tseng et al.,2010)，而且此类减肥的药品都缺乏完整的作用与副作用评估，导致药品使用风险较大。

营养物质的能量除了用来对外做功消耗以外，还以产热方式消耗。褐色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)是动物体内一种重要的储存脂滴的组织，具有产热作用(Thermogenesis)，可以用于消耗过多的营养物质，从而达到治疗肥胖症的目的。有报道称，在人体中完全调动小于体重0.1％(约40-50g)的BAT所产生的热量相当于人体日常耗能的20％(Rothwell and Stock,1983)。

不同于通常所说的白色脂肪细胞，褐色脂肪细胞(Brown adipocytes，BA)中的脂滴小而致密，并且具有大量线粒体，线粒体内膜上含有丰富的解偶联蛋白1(Uncouplingprotein-1，UCP1)。目前，已经知道冷刺激可以激活交感神经释放去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)，NE可以诱导褐色脂肪组织或细胞的产热。目前对于NE诱导褐色脂肪细胞产热的机制研究的比较清楚，简而言之，NE主要通过β肾上腺素受体激活Gs(兴奋性G蛋白)及下游的cAMP-PKA信号通路，磷酸化激素敏感脂肪酶(HSL)，HSL促进脂滴中的甘油三脂水解生成游离脂肪酸，游离脂肪酸进而激活UCP1，UCP1激活时可以将线粒体膜间隙的质子传递进线粒体基质，消耗一部份氧化磷酸化过程中产生并维持的质子电化学势，这种消耗质子电化学势的方式并不产生储能分子ATP(Adenosine triphosphate)，而是以热量形式耗散(综述见：Cannon and Nedergaard,2004；Lowell and Spiegelman,2000)。因此，BAT可以大量产热，同时消耗大量氧。由于BAT产热作用对于婴幼儿防止体温过低的重要性，以及最近其在成年人体中的发现(Cypess et al.,2009；Lichtenbelt et al.,2009；Virtanenet al.,2009)，BAT的产热作用成为了营养代谢领域的一大热点。BAT的产热特性不仅与人体体温的维持存在一定关系，而且对肥胖症的治疗，以及与肥胖相关的代谢紊乱治疗都有潜在应用价值(Brondani et al.,2012；Cannon and Nedergaard,2004；Zhang et al.,2007)。但目前，利用BAT产热来治疗肥胖症的药物研究却遇到了障碍(Carey et al.,2013；Larsen et al.,2002)，这与诱导BA产热效率的低下(Wikstrom et al.,2014；Arch,2011)可能有一定关系。

NE受体是G蛋白偶联受体(GPCR)，目前除了去甲肾上腺素等配体依赖的G蛋白偶联受体激活外，还可以利用光来激活GPCR，通过Gs进一步活化下游cAMP-PKA信号通路(Zhang,F.et al.,2010)。

为了利用BAT产热来治疗肥胖症，本领域迫切需要开发一种能够提高BAT产热效率的方法，以及能够增加能量消耗且副作用小的治疗肥胖的潜在药物、化妆品、食品及保健品。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高褐色脂肪组织(BAT)产热效率的方法，以及能够增加能量消耗且副作用小的治疗肥胖的潜在药物、化妆品、食品及保健品。

本发明第一方面提供了一种产热增强化合物的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率；其中，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂为质子泵抑制剂。

在另一优选例中，通过激活所述NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路，从而诱导褐色脂肪细胞产热。

在另一优选例中，用第一化合物激活所述NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路，其中，所述第一化合物为NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂。

在另一优选例中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

在另一优选例中，所述肾上腺素受体激动剂包括β肾上腺素受体激动剂。

在另一优选例中，所述β肾上腺素受体激动剂选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗(Cimaterol)、多巴酚丁胺(Dobutamine)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、L796568、SB251023、CGP12177、TAK-677、麻黄碱(ephedrine)、辛弗林(synephrine)、米拉贝隆(mirabegron)、或其组合。

在另一优选例中，所述cAMP-PKA信号通路的增强剂选自下组：布拉地新(Bucladesine)、咖啡因(caffeine)、茶碱(theophylline)、弗斯可林(Forskolin)、或其组合。

在另一优选例中，所述Gs增强剂选自下组：5-羟色胺受体5-HT4和5-HT7(5-HTreceptors types 5-HT4and 5-HT7)、促肾上腺皮质激素受体aka MC2R(ACTH receptoraka MC2R)、腺苷受体A2a和A2b(Adenosine receptor types A2a and A2b)、精氨酸血管升压素2型受体(Arginine vasopressin receptor 2)、β-肾上腺素能受体β1,β2和β3(β-adrenergic receptors typesβ1,β2andβ3)、降钙素受体(Calcitonin receptor)、降钙素基因相关肽受体(Calcitonin gene-related peptide receptor)、促肾上腺皮质激素释放激素受体(Corticotropin-releasing hormone receptor)、多巴胺受体D1和D5(Dopaminereceptors D1-like family(D1and D5))、组胺H2受体(Histamine H2 receptor)。

在另一优选例中，所述UCP1增强剂选自下组：游离脂肪酸。

在另一优选例中，所述HSL增强剂选自下组：cAMP、PKA、或其组合。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂选自下组：槲皮黄酮(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、桑色素(morin)、根皮素(phloretin)、芹黄素(apigenin)、黄豆苷元(daidzein)、efrapeptin、叠氮化物(azide)、寡霉素(oligomycin)、aurovertin B、白皮杉醇(piceatannol)、白藜芦醇(resveratrol)、表棓儿茶酚棓酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin gallate)、姜黄色素(curcumin)、染料木黄酮(genistein)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还包括第一化合物，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物还可与物理方法联用。

在另一优选例中，所述物理方法选自下组：声、光、电、热、磁、或其组合。

在另一优选例中，所述物理方法包括光激活NE受体信号通路的方法。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于预防和/或治疗肥胖、或肥胖相关疾病。

在另一优选例中，所述组合物或制剂选自下组：药物、化妆品、食品或保健品。

在另一优选例中，所述肥胖相关疾病选自下组：高血脂、II型糖尿病、脂肪肝、高血压、动脉粥样硬化、冠心病、胆囊炎、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症、肥胖引起的儿童性发育异常、痤疮、脂溢性皮炎、或其组合。

本发明第二方面提供了一种组合物，包括：

(i)第一化合物，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；和

(ii)产热增强化合物，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

在另一优选例中，所述组分(i)与组分(ii)的摩尔比为1-1000：1-1000，较佳地，1-200：1-200，更佳地，1-20：1-20。

在另一优选例中，所述组分(i)和组分(ii)占所述组合物总重量的0.01-99.9wt％,较佳地，0.05-95wt％，更佳地，0.1％-90wt％。

在另一优选例中，所述组合物选自下组：食品组合物、保健品组合物、药物组合物、化妆品组合物、或其组合。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，包括：

(i)第一化合物，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

(ii)产热增强化合物，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂；和

(iii)药学上可接受的载体。

本发明第四方面提供了一种药盒，所述药盒包括：

(a)含有第一化合物的第一制剂，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

(b)含有产热增强化合物的第二制剂，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂；和

(c)说明书。

在另一优选例中，所述(a)和(b)可分别放置不同容器(或包装)或置于同一容器(或包装)。

在另一优选例中，所述的第一制剂和第二制剂的剂型是相同或不同的。

在另一优选例中，所述第一制剂和第二制剂的剂型独立地选自下组：胶囊、片剂、栓剂、颗粒剂、口服液、或静脉注射剂(包括冻干制剂)。

在另一优选例中，所述第一制剂中第一化合物的浓度为0.01μmol/L-500mmol/L，较佳地，0.05μmol/L-100mmol/L，更佳地，0.1μmol/L-10mmol/L。

在另一优选例中，所述第一制剂中第一化合物的浓度为0.01μmol/1000g--500mmol/1000g，较佳地，0.05μmol/1000g-100mmol/1000g，更佳地，0.1μmol/1000g-10mmol/1000g制剂。

在另一优选例中，第二制剂中产热增强化合物的浓度为0.01μmol/L-500mmol/L，较佳地，0.05μmol/L-100mmol/L，更佳地，0.1μmol/L-10mmol/L。

在另一优选例中，第二制剂中产热增强化合物的浓度为0.01μmol/1000g--500mmol/1000g，较佳地，0.05μmol/1000g-100mmol/1000g，更佳地，0.1μmol/1000g-10mmol/1000g。

本发明第五方面提供了一种本发明第二方面所述组合物的用途，用于制备药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗肥胖、或肥胖相关疾病；(ii)增加哺乳动物能量消耗；和/或(iii)增强哺乳动物的褐色脂肪细胞的产热效率。

本发明第六方面提供了一种组合物，包括：

(i)NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路抑制剂；和

(ii)线粒体复合物V/ATP水解酶促进剂。

在另一优选例中，所述NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路抑制剂包括胰岛素(insulin)。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP水解酶促进剂选自下组：胰岛素(insulin)、葡萄糖、或其组合。

本发明第七方面提供了一种本发明第六方面所述组合物的用途，用于制备药物，所述药物用于(i)减少哺乳动物能量消耗；和/或(ii)降低哺乳动物的褐色脂肪细胞的产热效率。

本发明第八方面提供了一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，包括步骤：

(a)提供一线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在第一化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1，其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

在另一优选例中，所述的检测褐色脂肪细胞的产热程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：线粒体膜电压变化、胞内pH值的变化、或胞内ATP的浓度变化。

在另一优选例中，所述的褐色脂肪细胞的产热增加表现为：线粒体膜电压下降，胞内pH值上升，胞内ATP的浓度下降。

在另一优选例中，所述“显著高于”指产热程度Q1/产热程度Q2之比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥2.5。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

本发明第九方面提供了一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，包括步骤：

(a1)提供一线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂作为测试化合物；

(b1)在测试组中，在培养体系中，在所述测试化合物的存在下，用物理方法处理褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c1)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

在另一优选例中，所述物理方法选自下组：声、光、电、热、磁、或其组合。

在另一优选例中，所述物理方法还包括光激活NE受体信号通路的方法。

在另一优选例中，所述的检测褐色脂肪细胞的产热程度包括检测选自下组的一个或多个指标的变化：线粒体膜电压变化、胞内pH值的变化、或胞内ATP的浓度变化。

在另一优选例中，所述的褐色脂肪细胞的产热增加表现为：线粒体膜电压下降，胞内pH值上升，胞内ATP的浓度下降。

在另一优选例中，所述“显著高于”指产热程度Q1/产热程度Q2之比值≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥2.5。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。

本发明第十发面提供了一种体外非治疗性的增强哺乳动物产热的方法，包括步骤：

在第一化合物和产热增强化合物存在下，培养褐色脂肪细胞，从而增强哺乳动物的产热，其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂为质子泵抑制剂。

在另一优选例中，所述线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂选自下组：槲皮黄酮(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、桑色素(morin)、根皮素(phloretin)、芹黄素(apigenin)、黄豆苷元(daidzein)、efrapeptin、叠氮化物(azide)、寡霉素(oligomycin)、aurovertin B、白皮杉醇(piceatannol)、白藜芦醇(resveratrol)、表棓儿茶酚棓酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin gallate)、姜黄色素(curcumin)、染料木黄酮(genistein)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)、或其组合。

在另一优选例中，所述NE类化合物选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

在另一优选例中，所述肾上腺素受体激动剂包括β肾上腺素受体激动剂。

在另一优选例中，所述β肾上腺素受体激动剂选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗(Cimaterol)、多巴酚丁胺(Dobutamine)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、L796568、SB251023、CGP12177、TAK-677、麻黄碱(ephedrine)、辛弗林(synephrine)、米拉贝隆(mirabegron)、或其组合。

在另一优选例中，所述cAMP-PKA信号通路的增强剂选自下组：Bucladesine(布拉地新)、咖啡因(caffeine)、茶碱(theophylline)、弗斯可林(Forskolin)、或其组合。

在另一优选例中，所述Gs增强剂选自下组：5-羟色胺受体5-HT4和5-HT7(5-HTreceptors types 5-HT4and 5-HT7)、促肾上腺皮质激素受体aka MC2R(ACTH receptoraka MC2R)、腺苷受体A2a和A2b(Adenosine receptor types A2a and A2b)、精氨酸血管升压素2型受体(Arginine vasopressin receptor 2)、β-肾上腺素能受体β1,β2和β3(β-adrenergic receptors typesβ1,β2andβ3)、降钙素受体(Calcitonin receptor)、降钙素基因相关肽受体(Calcitonin gene-related peptide receptor)、促肾上腺皮质激素释放激素受体(Corticotropin-releasing hormone receptor)、多巴胺受体D1和D5(Dopaminereceptors D1-like family(D1and D5))、组胺H2受体(Histamine H2receptor)。

在另一优选例中，所述UCP1增强剂选自下组：游离脂肪酸。

在另一优选例中，所述HSL增强剂选自下组：cAMP、PKA、或其组合。

在另一优选例中，所述第一化合物与所述产热增强化合物的摩尔比为1-100：10-1000，较佳地，1-5：50-500，更佳地，1-2：100-200。

在另一优选例中，所述第一化合物的作用浓度为0.01μmol/L-50mmol/L，较佳地，0.05μmol/L-5mmol/L，更佳地，0.1μmol/L-1mmol/L。

在另一优选例中，所述产热增强化合物的作用浓度为0.1-50000μg/mL，较佳地，1-5000μg/mL，更佳地，5-500μg/mL。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如小鼠、大鼠。

本发明第十一方面提供了一种提高褐色脂肪细胞产热效率的方法，包括步骤：

提供一培养体系，所述培养体系含有褐色脂肪细胞，在产热增强化合物存在下，用第一化合物和/或物理方法处理所述褐色脂肪细胞，从而提高褐色脂肪细胞产热效率；其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

在另一优选例中，用所述物理方法激活所述NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路或Gs信号通路。

在另一优选例中，所述物理方法选自下组：声、光、电、热、磁、或其组合。

在另一优选例中，所线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂为质子泵抑制剂。

在另一优选例中，所述方法为非治疗性和非诊断性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了NE仅诱导部分褐色脂肪细胞产热。(A和B)具有代表性的褐色脂肪细胞热成像，其中，(A)0.1μM NE处理前细胞的热成像；(B)0.1μM NE处理20分钟时细胞的热成像，部分细胞没有明显的产热响应；(C)具有代表性的单次实验的细胞DIC图；(D)具有代表性的单次实验0.1μM NE诱导褐色脂肪细胞线粒体膜电压的变化(n＝23)，可以看到超极化和去极化两种现象，归一化膜电位大于1为超级化，小于1为去极化；(E)0.1μM NE引起的单个细胞的产热反应，仅部分细胞产热，并且每个细胞的产热幅度不尽相同(n＝23)；(F)0.1μM NE引起的褐色脂肪细胞的线粒体膜电压和胞浆pH呈负相关的变化关系图(红线是皮尔森相关系数分析,r＝-0.82,n＝23,P＝1.23e-6)，可以看到不产热的褐色脂肪细胞线粒体膜电压超极化(Δm>0)，并且胞浆酸化(ΔpH<0)。

图2显示了NE激活褐色脂肪细胞线粒体质子泵(H⁺-ATPase)。(A和B)具有代表性的褐色脂肪细胞胞浆及线粒体内ATP变化图，其中，(A)0.1μMNE处理前后褐色脂肪细胞胞浆ATP(AT1.03荧光)变化(YFP/CFP比值的变化反映了ATP浓度的变化)；(B)0.1μM NE处理前后褐色脂肪细胞线粒体ATP(mitAT1.03荧光)变化；(C)NE处理诱导的单个细胞胞浆ATP变化，NE加入时，细胞内的ATP骤然下降(n＝29)；(D)NE处理诱导的单个细胞的线粒体内ATP变化，NE加入时，线粒体内的ATP变化有较大的波动(n＝26)；(E)0.1μM NE诱导的褐色脂肪细胞的胞浆和线粒体ATP平均值的变化(胞浆：n＝29，黑色曲线；线粒体：n＝26，红色曲线)；(F)0.1μM NE(红点，n＝23)引起的褐色脂肪细胞胞浆pH部分酸化(ΔpH<0)，以及部分碱化(ΔpH>0)；寡霉素抑制线粒体复合物V后(黑色三角，n＝17)，0.1μM NE诱导绝大多数褐色脂肪细胞胞浆酸化(ΔpH<0)。

图3显示了在抑制线粒体复合物V功能后，NE高效诱导褐色脂肪细胞产热。(A和B)抑制线粒体复合物V功能后，具有代表性的褐色脂肪细胞热成像，其中，(A)0.1μM NE处理前细胞的热成像；(B)0.1μM NE处理20分钟时细胞的热成像，几乎所有褐色脂肪细胞在寡霉素抑制线粒体复合物V功能后都产热；(C)具有代表性的单次实验的细胞DIC图；(D)抑制线粒体复合物V功能后，具有代表性的单次实验0.1μM NE诱导褐色脂肪细胞线粒体膜电压的变化(n＝17)，几乎所有褐色脂肪细胞在抑制线粒体复合物V功能后线粒体膜电压去极化；(E)寡霉素抑制线粒体复合物V功能后，0.1μM NE高效诱导褐色脂肪细胞的产热(紫色曲线，n＝17)，产热幅度和线粒体解偶联剂10μM CCCP(红色曲线，n＝88)诱导的产热幅度相当；黑色曲线为不加寡霉素的情况。

图4显示了EGCG抑制线粒体复合物V质子泵(H⁺-ATPase)功能后，NE高效诱导褐色脂肪细胞产热。(A和B)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能，但不影响胞浆ATP。(A)0.1μM NE(红点，n＝50)引起的褐色脂肪细胞胞浆pH部分酸化(ΔpH<0)，以及部分碱化(ΔpH>0)；EGCG抑制线粒体复合物V后(空心黑色三角，n＝32)，0.1μM NE诱导绝大多数褐色脂肪细胞胞浆酸化(ΔpH<0)；(B)EGCG处理不影响褐色脂肪细胞胞浆ATP(n＝26)；(C)EGCG处理不影响褐色脂肪细胞线粒体膜电压(n＝34)；(D)EGCG单独刺激褐色脂肪细胞不能诱导产热(n＝34)；(E)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵功能后，具有代表性的单次实验0.1μM NE诱导褐色脂肪细胞线粒体膜电压的变化(n＝34)，几乎所有褐色脂肪细胞在抑制线粒体复合物V功能后线粒体膜电压去极化；(F)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能后，0.1μM NE高效诱导褐色脂肪细胞的产热(红色，n＝34)，产热幅度比NE单独诱导(黑色，n＝29)的产热幅度有显著提高。

图5显示了EGCG抑制线粒体复合物V质子泵(H⁺-ATPase)功能后，辛弗林(synephrine)高效诱导褐色脂肪细胞产热。(A)1μM辛弗林(n＝22)引起的绝大多数褐色脂肪细胞胞线粒体膜电压超极化；(B)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能后(n＝24)，绝大多数褐色脂肪细胞胞线粒体膜电压去极化；(C)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能后，1μM辛弗林高效诱导褐色脂肪细胞的产热(红色，n＝24)，产热幅度比辛弗林单独诱导(蓝色，n＝22)的产热反应速度及幅度有显著提高。

图6显示了EGCG抑制线粒体复合物V质子泵(H⁺-ATPase)功能后，弗斯可林(Forskolin)高效诱导褐色脂肪细胞产热。(A)10μM弗斯可林(n＝38)引起的绝大多数褐色脂肪细胞胞线粒体膜电压超极化；(B)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能后(n＝24)，10μM弗斯可林诱导绝大多数褐色脂肪细胞胞线粒体膜电压去极化；(C)EGCG抑制线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能后，10μM弗斯可林高效诱导褐色脂肪细胞的产热(红色，n＝24)，产热幅度比弗斯可林单独诱导(蓝色，n＝38)的产热幅度有显著提高。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率的一类产热增强化合物。具体地，该产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂，本发明的产热增强化合物可显著增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率。此外，本发明人还首次发现，NE可激活线粒体复合物V/ATP水解酶的质子泵的功能，从而拮抗UCP1质子漏的产热，导致NE诱导的褐色脂肪细胞产热低下，并且，发明人的实验充分表明，通过激活肾上腺素受体及下游cAMP-PKA信号通路，并同时抑制线粒体复合物V的功能(尤其抑制其质子泵功能)，可显著增强褐色脂肪细胞的产热效率。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“线粒体质子泵(H⁺-ATPase)”、“线粒体复合物V/ATP水解酶”、“线粒体复合物V”、“线粒体复合物V的质子泵”、“ATP水解酶”可互换使用，指线粒体膜上的同一复合物，即线粒体复合物V，通常情况下具有ATP合成酶功能，但在特定情况下可水解ATP，发挥质子泵的功能。

本发明的研究表明，线粒体复合物V具有双功能：ATP合成酶(ATP synthase)和ATP水解酶(ATPase)，当NE刺激褐色脂肪细胞后，线粒体复合物V发挥ATP水解酶功能，并具有质子泵(H⁺-ATPase)的功能。

如本文所用，术语“NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路”指肾上腺素受体-Gs-cAMP-PKA-HSL-UCP1信号通路；术语“激活NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路”、“NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路激活”指直接或间接激活肾上腺素受体-Gs-cAMP-PKA-HSL-UCP1信号通路上的任一靶点并最终导致UCP1激活，其激活方法包括(但并不限于)利用化合物激活以及利用声、光、电、热、磁等物理方法激活等方法。

如本文所用，术语“NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂”指能够直接或间接激活肾上腺素受体-Gs-cAMP-PKA-HSL-UCP1信号通路上的任一靶点并最终导致UCP1激活的化合物，包括(但并不限于)：肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、或UCP1增强剂。

如本文所用，术语“BRL37344”指(RR+SS)-(±)-4-[2-(2-(3-氯苯基)-2-羟乙基)氨基)丙基]苯氧乙酸((RR+SS)-(±)-4-[2-(2-(3-chlorophenyl)-2-hydroxyethyl)amino)propyl]phenoxyacetate)，具有如下所示的结构：

BRL37344

如本文所用，术语“CL 316243”指5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并二氧-2,2-二羧酸(5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3-benzodi oxole-2,2-dicarboxylic acid)，具有如下所示的结构：

如本文所用，术语“L755507”指4-[[(乙基氨基)羰基]氨基]-N-[4-[2-[[(2S)-2-羟基-3-(4-羟基苯氧基)丙基]氨基]乙基]苯基]-苯磺酰胺(4-[[(Hexylamino)carbonyl]amino]-N-[4-[2-[[(2S)-2-hydroxy-3-(4-hydroxyphenoxy)propyl]amino]ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide)，具有如下所示的结构：

如本文所用，术语“L796568”指N-[4-[2-[2(R)-羟基-2-(3-吡啶基)乙胺基]乙基]苯基]-4-[4-[4-(三氟甲基)苯基]噻唑-2-基]苯磺酰胺(N-[4-[2-[2(R)-Hydroxy-2-(3-pyridyl)ethylamino]ethyl]phenyl]-4-[4-[4-(trifluoro methyl)phenyl]thiazol-2-yl]benzenesulfonamide dihydrochloride)，具有如下所示的结构：

如本文所用，术语“SB251023”具有如下所示的结构：

如本文所用，术语“CGP12177”指4-[3-[(1,1-二甲基乙基)氨基]2-羟丙氧基]-1,3-二氢-2H-苯并咪唑酮-2-酮盐酸盐(4-[3-[(1,1-Dimethylethyl)amino]2-hydroxypropoxy]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one hydrochloride)，具有如下所示的结构：

如本文所用，术语“TAK-677”指雷法贝隆，又被称为AJ-9677或AD 9677,指2-((3-((R)-2-(((R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基)氨基)丙基)-1H-吲哚-7-基)氧)乙酸(2-((3-((R)-2-(((R)-2-(3-chlorophenyl)-2-hydroxyethyl)amino)propyl)-1H-indol-7-yl)oxy)acetic acid)，具有如下所示的结构：

如本文所用，“MRS2690”指焦磷酸1-α-D-吡喃葡萄糖基酯2-[(4'-甲基硫代)尿苷-5”-基]酯二钠盐(Diphosphoric acid 1-α-D-glucopyranosyl ester 2-[(4'-methylthio)uridin-5”-yl]ester disodium salt)。

如本文所用，“BRL37344”指(R*，R*)-(±)-4-[2-[(2-(3-氯苯基)-2-羟乙基)氨基]丙基]苯氧乙酸((R*,R*)-(±)-4-[2-[(2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl)amino]propyl]phenoxyacetic acid)。

如本文所用，“CL316243”指5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-氯苯基)-2-羟乙基]氨基]丙基]-1,3-苯并二氧杂环戊烯-2,2-二羧酸(5-[(2R)-2-[[(2R)-2-(3-Chlorophenyl)-2-hydroxyethyl]amino]propyl]-1,3-benzodioxole-2,2-dicarboxylic acid)。

如本文所用，“GR265162X”指文献(Mouse beta 3a-and beta 3b-adrenoceptorsexpressed in Chinese hamster ovary cells display identical pharmacology bututilize distinct signalling pathways，Br J Pharmacol.2002Apr；135(8):1903-14.)中提到的化合物。

如本文所用，“L755507”指4-[[(己胺)羰基]氨基]-N-[4-[2-[[(2S)-2-羟基-3-(4-羟基苯氧基)丙基]氨基]乙基]苯基]-苯磺酰胺基(4-[[(Hexylamino)carbonyl]amino]-N-[4-[2-[[(2S)-2-hydroxy-3-(4-hyd roxyphenoxy)propyl]amino]ethyl]phenyl]-benzenesulfonamide)。

如本文所用，“SB251023”指4-[4-[2(S)-羟基-3-[3-(4-羟基苯氧基)丙基氨基]环戊基甲基]苯氧基甲基](苯基)膦酸(4-[4-[2(S)-Hydroxy-3-[3-(4-hydroxyphenoxy)propylamino]cyclopentyl methyl]phenoxymethyl](phenyl)phosphonic acid)。

如本文所用，“CGP12177”指4-[3-[(1,1-二甲基乙基)氨基〕-2-羟基丙氧基]-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮盐酸盐(4-[3-[(1,1-Dimethylethyl)amino]2-hydroxypropoxy]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one hydrochloride)。

产热增强化合物

如本文所用，术语“产热增强化合物”指的是ATP水解酶抑制剂。

此外，所述的产热增强化合物还可以与第一化合物(如NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂)以及含有药学上可接受的载体组合成为具有增强褐色脂肪细胞产热活性的药物组合物。

适用于本发明的所述第一化合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、或UCP1增强剂。

适用于本发明的所述ATP水解酶抑制剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：槲皮黄酮(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、桑色素(morin)、根皮素(phloretin)、芹黄素(apigenin)、黄豆苷元(daidzein)、efrapeptin、叠氮化物(azide)、寡霉素(oligomycin)、aurovertin B、白皮杉醇(piceatannol)、白藜芦醇(resveratrol)、表棓儿茶酚棓酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)、表儿茶素(epicatechin gallate)、姜黄色素(curcumin)、染料木黄酮(genistein)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)。

适用于本发明的所述NE类化合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：去甲肾上腺素、西马特罗、多巴酚丁胺、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、SB251023、CGP12177、或其组合。

适用于本发明的所述肾上腺素受体激动剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：β肾上腺素受体激动剂，选自下组：去甲肾上腺素、西马特罗(Cimaterol)、多巴酚丁胺(Dobutamine)、异丙肾上腺素(isoprenaline)、BRL37344、CL316243、GR265162X、L755507、L796568、SB251023、CGP12177、TAK-677、麻黄碱(ephedrine)、辛弗林(synephrine)、米拉贝隆(mirabegron)、或其组合。

适用于本发明的所述cAMP-PKA信号通路的增强剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：布拉地新(Bucladesine)、咖啡因(caffeine)、茶碱(theophylline)、或弗斯可林(Forskolin)。

本发明的产热增强化合物与第一化合物(如NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂)组合使用时，产热增强化合物与第一化合物之间的比例没有任何限制。通常，各组分应当满足其最低的有效浓度。在一优选例中，所述产热增强化合物与第一化合物的最低有效浓度如下所示：

典型地，在本发明中，所述产热增强化合物的最低有效浓度为0.1-50000μg/mL，较佳地，1-5000μg/mL，更佳地，5-500μg/mL。

典型地，在本发明中，所述第一化合物的最低有效浓度为0.01μmol/L-50mmol/L，较佳地，0.05μmol/L-5mmol/L，更佳地，0.1μmol/L-1mmol/L。

通常，所述产热增强化合物与第一化合物的摩尔比为1-1000：1-1000，较佳地，1-200：1-200，更佳地，1-20：1-20。

本发明所述的产热增强化合物可显著增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率，使得总产热效率可达到约8倍或更高。

筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法

本发明还提供了一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，包括步骤：

(a)提供一线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在第一化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的Q1和Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

或，所述方法包括步骤：

(a1)提供一线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂作为测试化合物；

(b1)在测试组中，在培养体系中，在所述测试化合物的存在下，用物理方法处理褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c1)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

在一优选实施方式中，所述的方法还包括步骤(d)：将步骤(c)或(c1)中所确定的增强褐色脂肪细胞产热的化合物施用于动物，并测定其对动物产热的影响。

在一优选实施方式中，所述方法还包括用温敏染料成像法测定产热程度的一个或多个指标(如胞内pH值的变化)。

在另一优选例中，所述温敏染料成像所用的染料包括罗丹明800和罗丹明B甲酯的组合。

制剂和组合物

本发明还提供了一种制剂或组合物，它们包括所述的产热增强化合物和第一化合物(NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂)以及任选的其它载体或赋形剂。

优选地，所述的组合物为药物组合物、化妆品组合物、食品组合物、保健品组合物等。

以药物组合物为例，本发明的药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量两类活性成分：(i)所述的产热增强化合物，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂；和(ii)第一化合物，所述第一化合物为NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的载体”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-100mg/kg动物体重(较佳地0.0001mg-10mg/kg动物体重，更佳地0.001mg-1mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于(i)增强褐色脂肪细胞的产热效率；(ii)预防和/或治疗肥胖等相关疾病。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明首次发现产热增强化合物(如线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂)可显著增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路诱导的褐色脂肪细胞的产热效率，与NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路单独诱导的褐色脂肪细胞产热幅度相比，总产热效率能够达到8倍或更高(如8－10倍)。

(2)本发明首次发现可将产热增强化合物(如线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂)与NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路增强剂联用来预防和/或治疗脂代谢紊乱及肥胖相关疾病(如痤疮、脂溢性皮炎、糖尿病、高血压、心血管疾病等)。

(3)本发明首次提出胞内pH值、线粒体膜电压、胞内ATP浓度等指标的变化可以用于筛选利用褐色脂肪产热进行肥胖症治疗的药物。

(4)本发明首次揭示，NE可激活线粒体复合物V/ATP水解酶的质子泵的功能，从而拮抗UCP1质子漏的产热，导致NE诱导的褐色脂肪细胞产热低下。

(5)本发明首次揭示，激活肾上腺素受体及下游cAMP-PKA信号通路并同时抑制线粒体复合物V的功能(尤其是抑制其质子泵功能)，可显著增强褐色脂肪细胞的产热效率。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法和相关材料

1.褐色脂肪细胞原代培养

所用材料及试剂

3-4周小鼠(C57，雄，西普尔-必凯)，长丝滴管(粗细两种)，培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、小牛血清(NCS)、PBS(pH7.4)和青霉素链霉素(Pen Strep)都是购自美国ThermoFisher公司，胶原酶II和胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)购自美国Sigma-Aldrich公司，Matrigel购自美国BD Biosciences公司，玻片Coverslips购自美国Thermo Fisher公司。

具体试验方法

1)将老鼠4℃冻过夜，不禁食水。一般三只老鼠做8个dish；

2)取两个6cm dish分别加入37℃预热的10mL的PBS和4％NCS DMEM；

3)将老鼠断颈处死，在消毒酒精浸泡10min，在此期间将手术剪刀和镊子用消毒酒精消毒，放于灭过菌的水中；

4)将小鼠背部剪开取出肩胛骨处的褐色脂肪组织，放于PBS中；

5)在PBS中将白色脂肪组织去除，将褐色脂肪组织放于4％NCS的DMEM中；

6)将组织吸到EP管中，用剪刀剪碎，大概1mm左右的小块；

7)再次转移到15mL离心管中，10mL 4％NCS DMEM洗一次，吸掉上清；

8)1mL 1％胶原酶II(PBS中)，加入到4mL 4％NCS DMEM中(胶原酶II用PBS pH7.4配制，分装，-20℃保存，避免反复冻存)，过滤，加入组织中；

9)37℃，30min，将小水浴锅放在左右摇摆的摇床上，速度为10，在此期间，将长丝滴管口用酒精灯烧到圆润，细口的烧到大概0.5mm左右；

10)将消化液吸掉，4％NCS DMEM洗一次；

11)2mL 4％NCS DMEM，用粗口滴管吹打5次左右，将上清1吸掉，重新加上分离液，粗口滴管吹打5-7次，再用细口滴管吹打大概7次左右；

12)将第二次的上清吸出到新的离心管中，剩余的沉淀如果多的话可以进行三次吹打，以得到尽量多的细胞；

13)离心900g，9min，得沉淀细胞；

14)将沉淀用5％FBS DMEM重悬，铺到盖玻片上；

15)2-3小时后加入5％FBS DMEM 2mL；

16)第二天换液，用含4μM ARA-C的5％FBS DMEM半换液(抑制前体细胞的生长)；

17)以后每2天用5％FBS DMEM半换液一次，3-8天的细胞用于实验。

2.褐色脂肪细胞转染

实验材料和仪器

1)高质量的质粒：260:280>1.8，浓度大于1mg/mL(所用质粒及来源见表1)；

2)电转仪：BTX公司ECM830方波电转系统；

3)电转液：20mM Hepes,135mM KCl,2mM MgCl₂,0.5％Ficol 400,1％DMSO，pH7.6；

4)20mM ATP:50mM Glutathione储存液(pH～7.4).100x；

5)0.4cm电转杯。

电转步骤

电转作用一切试剂及材料都经灭菌处理，所需溶液放至室温。

1)将分离出来的小鼠原代脂肪细胞用PBS洗涤一次，900g离心9分钟，电转的细胞密度需达到1～1.5x 10⁶个细胞每毫升；

2)将100x的ATP与Glutathione储存液加入到电转液中；

3)加入10-40μg质粒到电转液中；

4)用大约420μl的电转液重悬细胞；

5)将含有质粒及细胞的电转液加入到0.4cm电转杯中，混匀，盖上盖子；

6)迅速进行电击，条件为10ms,115V square wave,2次脉冲,时间间隔1s；

7)加入2mL 10％NCS DMEM,混匀，900g离心9分钟；

8)用正常培养基600ul重悬，100μl/盖玻片；

9)每个培养皿(3.5cm)加入2mL培养基，培养箱培养24小时，半换液，加入ARA-C至终浓度2μM。

实施例的质粒为常规质粒，来源见表1。

表1

3.染料装载及细胞成像

活细胞图像采集所用溶液为Tyrode：NaCl，8.4738g，KCl，3mL(1mol/L)，HEPES，2.383g，葡萄糖，1.8g，溶于1L ddH₂O中，pH7.4。所用试剂均购自Sigma公司。罗丹明B(RhB)、罗丹明800(Rh800)和CCCP购自美国Sigma-Aldrich公司，去甲肾上腺素(NE)购自美国SantaCruz公司，SR-59230A购自英国Abcam公司，CGP-20712购自英国Tocris Bioscience公司。

细胞在含有30nM的罗丹明B甲酯与罗丹明800的tyrode溶液中，33℃共染1小时。高分辨率图像则用50nM染料共染。罗丹明B甲酯通道设置的伪彩为红色(559nm激发，575-620nm收光)，罗丹明800通道赋予的伪彩为绿色(635nm激发，655-755nm收光)，时间连续图像的拍摄用40×/0.95物镜512×512点分辨率，高分辨率图像的获得则用100×/1.4O物镜1600×1600点分辨率(图像数据为12比特)。

4.胞内pH成像

胞内pH成像使用5μM SNARF-1AM(购自美国Thermo Fisher公司)37℃染30min，tyrode溶液洗一次，置于2mL tyrode溶液，33℃恒温。559nm激发，655-755nm收光与575-620nm收光的比值为pH相对值。时间连续图像的拍摄用40×/0.95物镜512×512点分辨率(图像数据为12比特)。

表2细胞成像所用仪器和软件及作用

表3细胞成像所用参数

5.数据收集及处理

成像时细胞均保持在33℃恒温，成像的时间间隔为30s，在第11张加NE处理，抑制剂则在拍照前20分钟加入。

扣除背景之后，将需要处理两个通道(热成像Rh800/RhB-ME、钙成像340/380、氧化还原势FAD/(FAD+DANH)、fret CFP/CFP)的数值做点对点做比值，为了减少噪音，信号值与噪音值的比值小于1.5的点去除，剩余的进行5×5的平均。根据3-sigma规则，比值的极端值(99.7％的容许区间)去掉。每个细胞的比值均为此细胞上所有点比值的平均值。用处理前的数值表示细胞的稳定状态来做数值的归一化处理，那么细胞的反应值Δr可以用公式Δr＝(r_t-r₀)/r₀来计算，此公式中r_t是反应最后五分钟的平均值，r₀是加药前的起始状态的平均值。

本发明所用数据均为平均值±s.d，在图中则使用平均值±s.e.m。

实施例1 NE诱导的褐色脂肪细胞产热反应

利用基于罗丹明B甲酯(RhB-ME)与罗丹明800(Rh800)的线粒体温度检测方法来检测细胞内的产热情况(具体方法参见：新型温敏荧光化合物及其应用，专利申请号201410850735.3)。简而言之，褐色脂肪细胞内有大量的线粒体，是细胞内产生热量的主要场所，利用线粒体温度测量方法进行褐色脂肪细胞产热的研究，可以在单细胞水平上得到大量的线粒体产热的数据，从而反映褐色脂肪细胞的产热情况。荧光染料RhB-ME和Rh800可以定位于褐色脂肪细胞的线粒体，RhB-ME的荧光强度随着温度的变化而变化，而Rh800的荧光强度基本恒定，不随温度而改变，因此可以用光敏染料Rh800与RhB-ME的荧光强度的比值来表示细胞温度的变化。

利用上述方法检测NE诱导的褐色脂肪细胞产热反应，发现NE仅诱导部分褐色脂肪细胞产热，结果如图1所示。图1是一次典型的NE测试结果。结果显示，0.1μM NE诱导的褐色脂肪细胞升温反应并不一致，存在在0.1μM NE刺激下不产热的褐色脂肪细胞(图1B)，图1A和1B分别为NE处理前后的热成像图片，而图1C为褐色脂肪细胞对应的明场图片。NE诱导的线粒体膜电压变化呈现两级分化的现象，即超极化及去极化(图1D)，同时NE仅诱导部分褐色脂肪细胞产热(图1E)。NE刺激可激活UCP1(Cannon and Nedergaard,2004)，UCP1消耗线粒体内膜质子梯度产热会导致胞浆碱化，但是在NE刺激下不产热的褐色脂肪细胞中线粒体膜电压超极化，并且胞浆pH酸化(图1F)，这提示了在这些细胞中可能存在线粒体质子泵将质子重新泵回胞浆中，由于将质子泵回胞浆是一个吸热的过程(Dittrich et al.,2003)，因此拮抗了UCP1质子漏的产热功能，导致细胞总体表现为不产热或产热很低。

结果表明，0.1μM NE处理褐色脂肪细胞，其产热效率低下，仅部分细胞产热，而且产热幅度差异很大。

实施例2 NE激活ATP依赖的质子泵(H⁺-ATPase)

经过电转的原代培养的褐色脂肪细胞，表达ATP敏感的荧光蛋白后，置于Tyrode溶液中，用去甲肾上腺素刺激，激光共聚焦对ATP敏感的荧光蛋白的FRET信号全程实时观察和成像，然后进行图形数据分析。

为了检测是否NE激活了ATP依赖的质子泵(H⁺-ATPase)，利用胞浆和线粒体ATP敏感的荧光蛋白AT1.03及mitAT1.03(Imamuraet al.,2009)，检测了NE刺激褐色脂肪细胞时胞浆和线粒体ATP的变化(图2，A-E)。结果发现，0.1μM NE刺激褐色脂肪细胞导致胞浆和线粒体ATP的下降，这提示NE刺激激活了某种ATP水解酶(ATPase)。考虑到线粒体复合物I-V只有线粒体复合物V可以在特定情况下消耗ATP(即是一种ATPase)并起质子泵的作用，NE很有可能激活了线粒体复合物V的质子泵的功能，导致胞浆酸化，拮抗了UCP1的产热功能。为了验证这一点，本发明利用寡霉素抑制线粒体复合物V的功能，检测了胞浆pH的变化情况，结果发现，寡霉素存在时，NE刺激的褐色脂肪细胞胞浆几乎全部碱化(图2F)，提示NE刺激确实激活了线粒体复合物V的质子泵的功能，拮抗UCP1质子漏的产热，导致NE诱导的褐色脂肪细胞产热低下。

实施例3寡霉素或EGCG分别与NE联用可显著提高褐色脂肪细胞的产热效率

经过罗丹明B甲酯(RhB-ME)与罗丹明800(Rh800)染色的原代培养褐色脂肪细胞，置于Tyrode溶液中，用去甲肾上腺素与线粒体复合物V功能抑制剂共同刺激，激光共聚焦对热敏及线粒体膜电压信号全程实时观察和成像，然后进行图形数据分析。

如果是线粒体复合物V导致了NE诱导的褐色脂肪细胞产热低下，本发明推测抑制线粒体复合物V的功能应该可以增强NE诱导的褐色脂肪细胞产热效率。实验结果(图3)表明，在利用寡霉素抑制线粒体复合物V功能的情况下，NE能诱导几乎所有的褐色脂肪细胞产热(图3，A-C)，线粒体膜电压基本都去极化(图3D)，与0.1μM NE单独刺激相比，0.1μM NE和10μg/ml寡霉素的联用下，能显著提高褐色脂肪细胞的产热效率，并且产热效率和10μM解偶联剂CCCP(羰基氰化氯苯腙)的产热效率相当(图3E)。这提示，NE和寡霉素联用有显著的协同作用。

此外，通过大量筛选，筛选出一种线粒体复合物V抑制剂——表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)，它可以抑制线粒体复合物V的质子泵的功能，导致褐色脂肪细胞胞浆碱化(图4A)，但不影响细胞ATP的水平(图4B)；此外，它在增强NE诱导的褐色脂肪细胞产热效率的同时还能避免寡霉素潜在的细胞毒性问题，而且EGCG单独刺激褐色脂肪细胞，线粒体膜电压的变化或产热反应增强不明显(图4,C-D)。进一步研究发现，在0.1μM NE和25μM EGCG的联用下，可以导致所有褐色脂肪细胞线粒体膜电压的去极化(图4E)，并且与NE单独刺激相比，NE和EGCG联用能显著提高褐色脂肪细胞的产热效率(图4F)，这提示，NE和EGCG联用有显著的协同作用。

实施例4辛弗林与EGCG联用可显著提高褐色脂肪细胞的产热效率

经过罗丹明B甲酯(RhB-ME)与罗丹明800(Rh800)染色的原代培养褐色脂肪细胞，置于Tyrode溶液中，用辛弗林(synephrine)与线粒体复合物V功能抑制剂EGCG共同刺激，激光共聚焦对热敏及线粒体膜电压信号全程实时观察和成像，然后进行图形数据分析。

NE作为神经递质可以和所有肾上腺素受体结合并发挥作用，比如α和β肾上腺素受体，尤其是通过β肾上腺素受体。除了对脂肪细胞有作用，由于心肺也分别高表达β1和β2肾上腺素受体，NE作为药物往往对心肺具有副作用。因此，有必要选择特异性更好的肾上腺素受体激动剂。

通过大量筛选，筛选出与NE具有相似功能的NE替代物，如辛弗林(synephrine)，是较为特异的β3肾上腺素受体激动剂(Carpéné et al.,1999；Jordan et al.,1987)。

结果显示，1μM辛弗林单独使用并不能显著诱导褐色脂肪细胞的产热，并且诱导大部分褐色脂肪细胞线粒体膜电压超极化(图5A)；1μM辛弗林和25μM EGCG的联用下，可以导致大部分褐色脂肪细胞线粒体膜电压的去极化(图5B)，并且与辛弗林单独刺激相比，辛弗林和EGCG联用能显著提高褐色脂肪细胞的产热效率(图5C)。这提示，辛弗林和EGCG联用有显著的协同作用。

实施例5弗斯可林与EGCG联用可显著提高褐色脂肪细胞的产热效率

经过罗丹明B甲酯(RhB-ME)与罗丹明800(Rh800)染色的原代培养褐色脂肪细胞，置于Tyrode溶液中，用弗斯可林(Forskolin)与线粒体复合物V功能抑制剂EGCG共同刺激，激光共聚焦对热敏及线粒体膜电压信号全程实时观察和成像，然后进行图形数据分析。

NE可通过β肾上腺素受体激活下游的信号通路，因此，cAMP-PKA信号通路的增强化合物(Montoya et al.,2014；Stohs and Badmaev,2016；Seamon etal.,1981)，比如天然化合物咖啡因(caffeine)、茶碱(theophylline)、弗斯可林(Forskolin)可以模拟NE的作用。

结果如图6所示。结果显示，10μM弗斯可林诱导的褐色脂肪细胞产热效率也比较低下，和辛弗林一样诱导大部分褐色脂肪细胞线粒体膜电压超极化(图6A)；然而，10μM弗斯可林和25μM EGCG的联用下，可以导致大部分褐色脂肪细胞线粒体膜电压的去极化(图6B)。

结果表明，与弗斯可林单独刺激相比，弗斯可林和EGCG联用能显著提高褐色脂肪细胞的产热效率(图6C)。这提示，弗斯可林和EGCG联用有显著的协同作用。

讨论

NE诱导的褐色脂肪细胞的产热效率低下是由于线粒体质子泵的拮抗所致，通过细胞内ATP及pH变化的检测，本发明揭示了NE诱导激活了线粒体复合物V的质子泵(H⁺-ATPase)功能。利用线粒体复合物V抑制剂或线粒体质子泵的抑制剂，如寡霉素和EGCG，发现肾上腺素受体及下游cAMP-PKA信号通路增强化合物、与线粒体复合物V功能抑制剂或线粒体质子泵(H⁺-ATPase)抑制剂的组合能显著提高褐色脂肪细胞的产热效率。

因此，可以基于此研究来利用BAT产热治疗脂代谢异常及肥胖相关疾病(如痤疮、脂溢性皮炎、糖尿病、高血压、心血管疾病等)。并且还可以利用天然化合物，开发一系列能够高效增加能量消耗且副作用小的预防或治疗肥胖及相关疾病的潜在化合物组合，并应用于化妆品、保健品、食品及药物等领域。

参考文献

1.Cannon,B.,and Nedergaard,J.(2004).Brown adipose tissue:Function andphysiological significance.Physiological reviews 84,277-359.

2.Dittrich,M.,Hayashi,S.&Schulten,K.,2003.On the Mechanism of ATPHydrolysis in F1-ATPase.Biophysical Journal,85(4),2253–2266.

3.Imamura,H.et al.,2009.Visualization of ATP levels inside singleliving cells with fluorescence resonance energy transfer-based geneticallyencoded indicators.Proceedings of the National Academy of Sciences,106(37),15651–15656.

4.Carpéné,C.et al.,1999.Selective activation ofβ3-adrenoceptors byoctopamine:comparative studies in mammalian fat cells.Archiv fürExperimentelle Pathologie und Pharmakologie,359(4),310–321.

5.Jordan,R.et al.,1987.β-Adrenergic activities of octopamine andsynephrine stereoisomers on guinea-pig atria and trachea.Journal of Pharmacyand Pharmacology,39(9),752–754.

6.Lowell,B.B.&Spiegelman,B.M.,2000.Towards a molecular understandingof adaptive thermogenesis.Nature.404,652–660.

7.Montoya,G.A.et al.,2014.Modulation of 3′,5′-cyclic AMP homeostasisin human platelets by coffee and individual coffee constituents.BritishJournal of Nutrition,112(9),1427–1437.

8.Stohs,S.J.&Badmaev,V.,2016.A Review of Natural Stimulant and Non-stimulant Thermogenic Agents.Phytotherapy Research,30(5),732–740.

9.Seamon,K.B.,Padgett,W.&Daly,J.W.,1981.Forskolin:unique diterpeneactivator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America,78(6),3363–3367.

10.Zhang,F.et al.,2010.Optogenetic interrogation of neural circuits:technology for probing mammalian brain structures.Nat.Protocols,5(3),439–456.

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种产热增强化合物的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于增强NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路所诱导的褐色脂肪细胞的产热效率；其中，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：

(i)第一化合物，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；和

(ii)产热增强化合物，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：

(i)第一化合物，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

(ii)产热增强化合物，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂；和

(iii)药学上可接受的载体。

4.一种药盒，其特征在于，所述药盒包括：

(a)含有第一化合物的第一制剂，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

(b)含有产热增强化合物的第二制剂，所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂；和

(c)说明书。

5.一种权利要求2所述组合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗肥胖、或肥胖相关疾病；(ii)增加哺乳动物能量消耗；和/或(iii)增强哺乳动物的褐色脂肪细胞的产热效率。

6.一种组合物，其特征在于，包括：

(i)NE受体及其下游cAMP-PKA信号通路抑制剂；和

(ii)线粒体复合物V/ATP水解酶促进剂。

7.一种权利要求6所述组合物的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于(i)减少哺乳动物能量消耗；和/或(ii)降低哺乳动物的褐色脂肪细胞的产热效率。

8.一种筛选增强褐色脂肪细胞产热的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂作为测试化合物；

(b)在测试组中，在培养体系中，在第一化合物和所述测试化合物的存在下，培养褐色脂肪细胞一段时间T1，检测所述测试组的所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q1，其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；

并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中褐色脂肪细胞的产热程度Q2；

(c)将上一步骤所检测的产热程度Q1和产热程度Q2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是增强褐色脂肪细胞产热的化合物；

其中，如果产热程度Q1显著高于产热程度Q2时，则表示所述测试化合物为增强褐色脂肪细胞产热的化合物。

9.一种体外非治疗性的增强哺乳动物产热的方法，其特征在于，包括步骤：

在第一化合物和产热增强化合物存在下，培养褐色脂肪细胞，从而增强哺乳动物的产热，其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。

10.一种非治疗性的提高褐色脂肪细胞产热效率的方法，其特征在于，包括步骤：

提供一培养体系，所述培养体系含有褐色脂肪细胞，在产热增强化合物存在下，用第一化合物和/或物理方法处理所述褐色脂肪细胞，从而提高褐色脂肪细胞产热效率；其中，所述第一化合物选自下组：NE类化合物、肾上腺素受体激动剂、Gs增强剂、cAMP-PKA信号通路的增强剂、HSL增强剂、UCP1增强剂、或其组合；所述产热增强化合物为线粒体复合物V/ATP水解酶抑制剂。