CN101023357A

CN101023357A - 治疗代谢相关病症的gpr43和其调节剂

Info

Publication number: CN101023357A
Application number: CNA2005800318189A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·N·伦纳德; 亚龙·哈卡克
Original assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-09-22
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2007-08-22
Also published as: WO2006036688A2; US20100093604A1; JP2008513792A; EP1797435A2; AU2005289810A1; JP2009051847A; CA2580130A1; US9017949B2; WO2006036688A3; SG155896A1; IL181777A0; WO2006036688A9

Abstract

本发明涉及一种鉴别代谢稳定化合物的方法，其是通过：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明所述候选化合物是代谢稳定化合物。此外，本发明涉及一种用于鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性的增加表明所述候选化合物是代谢稳定化合物。另外，本发明涉及一种用于鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性的降低表明所述候选化合物是代谢稳定化合物。

Description

治疗代谢相关病症的GPR43和其调节剂

技术领域

本发明涉及通过测定化合物是否调节GPR43功能性来鉴别代谢稳定化合物的方法。因此，本发明的化合物可用于预防或治疗代谢相关病症，诸如低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

背景技术

细胞使用葡萄糖作为主要能量来源。因此，食物在被利用前首先被身体分解成葡萄糖。随后，内脏将葡萄糖释放到血液中，导致血糖含量升高。胰岛β细胞对这种葡萄糖含量升高起反应而增加其产量和胰岛素分泌。胰岛素在血液内循环且充当信使，将信号传送到胰岛素反应器官(诸如脂肪组织、肌肉和肝脏)以增加其对葡萄糖的摄取。以这种方式，血糖升高将伴随有随后β细胞的胰岛素分泌的增加。胰岛素升高起到使血糖含量回归正常的作用。在健康个体中，血糖含量始终保持相当恒定。这一称为血糖量正常(normoglycemia)(正常葡萄糖含量)的平衡状态受胰岛素严格控制。

在诸如糖尿病的疾病中，这种对血糖含量的严格调控丧失，导致于糖尿病患者体内所观察到的血糖含量增加。高血糖状态(高葡萄糖含量)可由胰腺β细胞的胰岛素产量不足和/或由目标器官(诸如肌肉、肝脏和脂肪)对葡萄糖的摄取不充分而引起。结果导致血糖含量增加。因此，可认为糖尿病是由两种类型的异常引起：β细胞的胰岛素分泌异常和主要胰岛素反应器官的胰岛素敏感性异常。这种胰岛素敏感性异常(也被称为胰岛素抵抗(因为器官对胰岛素的作用具有抗性))意味着需要更多胰岛素来使目标器官增加其对葡萄糖的摄取。由于β细胞需要增加其胰岛素分泌来补偿胰岛素抵抗，故胰岛素抵抗使β细胞的压力增加。这是一个日趋严重的问题，其将首先引起葡萄糖耐受性异常，且最终由于胰腺无法满足对于胰岛素日益增加的需求而导致胰岛素分泌的完全丧失。

糖尿病为一组以导致血糖升高的异常葡萄糖体内平衡(abnormal glucosehomeostasis)为特征的病症的诊断术语。存在多种类型的糖尿病，但最常见的两种类型为I型糖尿病，也称为胰岛素依赖型糖尿病或IDDM；和II型糖尿病，也称为非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM。I型糖尿病主要为年轻时开始的疾病，且是归因于由免疫系统引起的胰腺中胰岛素分泌β细胞的破坏。在这一情况下，身体无法识别胰腺β细胞自身且破坏其自身细胞。因β细胞的破坏而引起胰岛素分泌的完全丧失且受此影响的个体需完全依赖于胰岛素存活。II型糖尿病主要为较年长时(通常在40岁以后)开始的疾病，但近年来，年轻人被诊断患有II型糖尿病的情形愈来愈常见。II型糖尿病主要以胰岛素抵抗和β细胞衰竭为特征，且通常与肥胖症关联。II型糖尿病比I型糖尿病常见，且全世界所有确诊糖尿病病例中有90-95％为II型糖尿病。

使组织长期面临高血糖可导致多种并发症，包括神经病、视网膜病和肾病的微血管问题以及中风、冠心病和末梢血管疾病的大血管并发症。血糖含量的不适当控制也是除糖尿病外的其它疾病(诸如肥胖症和X综合症)的特征。举例而言，X综合症的特征之一为胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受(glucose intolerance)。此外，肥胖症的特征在于高胰岛素血症和胰岛素抵抗，其与NIDDM、高血压和动脉粥样硬化的特征相同。另外，肥胖症是引起NIDDM的主要风险因素。30％或30％以上超重的受检者发展成NIDDM的风险将增加三倍，且四分之三的NIDDM患者超重。

在实验动物和人类中，由热量摄入与能量支出的失衡引起的肥胖症与胰岛素抵抗和糖尿病高度相关。然而，肥胖症-糖尿病综合症所涉及的分子机制仍在研究之中。在肥胖症发展的早期，胰岛素分泌增加使胰岛素抵抗保持平衡且使患者免于高血糖(Le Stunff等人， Diabetes 43：696-702(1989))。然而，随时间的变迁，β细胞功能衰退，且约20％的肥胖个体发展成非胰岛素依赖型糖尿病(Pederson，P.， Diab.Metab.Rev.5：505-509(1989)，和Brancati，F.L.等人， Arch.Intern.Med.159：957-963(1999))。在现代社会，随着肥胖的日趋流行，肥胖症因此已成为引起NIDDM的主导风险因素(Hill，J.O.等人， Science280：1371-1374(1998))。然而，使一些患者易于对脂肪积累作出反应而改变胰岛素分泌的因素尚未可知。不幸的是，治疗肥胖症的有效的长期疗法仍不可行。

糖尿病使全世界数百万人深受其害。仅在美国，就有超过一千八百万的糖尿病患者，同时每年会有600,000个确诊的新病例。患糖尿病的人员将具有较高的罹患心脏病、失明、肾衰竭、感染、肢体截肢(extremity amputation)和其它病况的风险。据估计，2002年美国针对糖尿病的直接医药支出和间接支出高达1320亿美元。总之，糖尿病并发症在美国是死亡的主导原因之一。

确已存在治疗糖尿病的疗法，诸如α-葡糖苷酶抑制剂、双胍、噻唑烷二酮(thiazolidinedione)、美格替耐(meglitinide)、磺酰脲和外源性胰岛素。然而，这些疗法具有有限的效用，且与显著的安全性和耐受性问题相关，诸如有引起低血糖事件、体重增加、胃肠道功能紊乱和贫血的风险。此外，许多治疗选择都需要注射或每日多次给药，这存在依从性问题。

因此，需要鉴别安全及有效地治疗诸如糖尿病、动脉粥样硬化和肥胖症的代谢相关病症的药剂。本发明满足这一需求且也提供相关优势。

发明内容

申请者意外地发现，GPR43在胰岛中表达且在db/db糖尿病患者和ob/ob肥胖小鼠体内GPR43上调。此外，申请者也公开GPR43在分化脂肪细胞中高度诱导。另外，申请者还公开GPR43的反向激动剂或拮抗剂可用于治疗代谢相关病症，诸如胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常和糖尿病。

第一方面，本发明提供鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述GPR43为人类GPR43。在一些实施例中，所述测定包含第二信使分析。

第二方面，本发明提供根据第一方面的方法鉴别的代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂或拮抗剂。

第三方面，本发明提供制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物是由第一方面的方法鉴别。

第四方面，本发明提供医药组合物，其包含、基本上由或由第二方面的化合物组成。

第五方面，本发明提供治疗或预防有此需要的个体的代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的第四方面的化合物。在一些实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一些实施例中，第五方面的方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的第四方面的化合物的组合。在一些实施例中个体为哺乳动物，且在一些实施例中个体为人类。

第六方面，本发明提供制造药物的方法，所述药物包含用作代谢稳定化合物的第四方面化合物；和制造药物的方法，所述药物包含用于治疗代谢相关病症的第四方面化合物。

第七方面，本发明提供鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性的降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述GPR43为人类GPR43。在一些实施例中，所述测定包含第二信使分析。

第八方面，本发明提供根据第七方面的方法鉴别的代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂或拮抗剂。

第九方面，本发明提供制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物是由第七方面的方法鉴别。

第十方面，本发明提供医药组合物，其包含、基本上由或由第二方面的化合物组成。

第十一方面，本发明提供治疗或预防有此需要的个体的代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的第十方面的化合物。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一些实施例中，第十一方面的方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的第十方面的化合物的组合。在一些实施例中个体为哺乳动物，且在一些实施例中个体为人类。

第十二方面，本发明提供制造药物的方法，所述药物包含用作代谢稳定化合物的第十方面化合物；和制造药物的方法，所述药物包含用于治疗代谢相关病症的第十方面化合物。

第十三方面，本发明提供治疗或预防代谢相关病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43调节剂。在一些实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症或衰老，且所述调节剂为激动剂。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病，且所述调节剂为反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，第十三方面的方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。

第十四方面，本发明提供治疗或预防可通过降低GPR43功能来治疗或预防的病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述病症为代谢相关病症，例如胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一些实施例中，所述代谢相关病症为II型糖尿病。在一些实施例中，第十四方面的方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。

附图说明

图1绘示对于小鼠成年和胎儿组织和细胞中小鼠GPR43表达的Affymetrix基因芯片分析。

图2绘示对所选人类组织和细胞中人类GPR43表达(上图)和所选小鼠组织、细胞和细胞系中小鼠GPR43表达(下图)的RT-PCR分析。

具体实施方式

申请者已于本文公开小鼠GPR43在脂肪、大肠和胰岛细胞中高度表达(参看图1)，而且与来自野生型小鼠的胰岛相比，小鼠GPR43在从db/db糖尿病患者和ob/ob肥胖小鼠分离的胰岛中上调(参看图1)。此外，申请者也于本文公开小鼠GPR43在分化3T3-L1脂肪细胞中高度诱导(参看图1)。另外，申请者已公开，人类GPR43在包括胰腺的若干个组织中表达(参看图2，上图)，且小鼠GPR43在若干个组织和胰岛细胞系中表达(参看图2，下图)。

尽管人类体内存在多类受体，但迄今，最丰富且治疗相关的受体类型是由G蛋白偶合受体(GPCR)类所代表。据估计，人类基因组内存在约30,000-40,000个基因，且估计其中有大约2％的基因编码GPCR。GPCR代表着医药产品研发的重要领域：已由100种已知GPCR中的大约20种研发出所有处方药物中的大约60％。

GPCR共有共同的结构基元，其具有七个含有22至24个疏水氨基酸的序列，所述序列形成七个各自跨膜(每一跨越都以数字标识，意即，跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)的α螺旋。跨膜螺旋是通过细胞膜外部或“胞外”侧的跨膜-2与跨膜-3、跨膜-4与跨膜-5和跨膜-6与跨膜-7之间的氨基酸链接合(这些分别称为“胞外”区域1、2和3(EC-1、EC-2和EC-4))。跨膜螺旋也是通过细胞膜内部或“胞内”侧的跨膜-1与跨膜-2、跨膜-3与跨膜-4和跨膜-5与跨膜-6之间的氨基酸链接合(这些分别称为“胞内”区域1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))。受体的“羧基”(“C”)端位于细胞内的胞内间隙中，而受体的“氨基”(“N”)端位于细胞外侧的胞外间隙中。

一般说来，当配体与受体结合(通常称为受体的“活化”)时，引起受体构形的改变，其有助于胞内区域与胞内“G-蛋白”之间的偶合。据报导，GPCR关于G蛋白是“混杂的”，意即GPCR可与一种以上的G蛋白相互作用。参看Kenakin，T.，43 Life Sciences1095(1988)。尽管也存在其它G蛋白，但目前已鉴别出的G蛋白为Gq、Gs、Gi、Gz和Go。经配体活化的GPCR与G蛋白的偶合会引发信号级联过程(称为“信号转导”)。在正常条件下，信号转导最终将导致细胞活化或细胞抑制。尽管不希望受理论束缚，但认为IC-3环以及受体的羧基端都与G蛋白相互作用。

也存在似乎将数类GPCR与磷脂酶C路径偶合的混杂G蛋白(诸如Gα15或Gα16)(Offermanns&Simon， J Biol Chem270：15175-80(1995))，或经设计为使多种不同GPCR与相同路径(例如磷脂酶C)偶合的嵌合G蛋白(Milligan&Rees， Trends in Pharmaceutical Sciences20：118-24(1999))。

Gi偶合GPCR降低胞内cAMP含量。黑素细胞技术(参看下文)可用于鉴别Gi偶合GPCR，而且也可以用于鉴别所述Gi偶合GPCR的调节剂。

在生理条件下，GPCR是以两种不同构形之间的平衡存在于细胞膜中：“非活性”状态和“活性”状态。处于非活性状态的受体无法与胞内信号转导路径连接以引发信号转导，从而引起生物反应。受体构形改变成活性状态将允许与转导路径连接(通过G蛋白)并产生生物反应。

可用配体或化合物(诸如药物)使受体稳定于活性状态。最近的发现(包括但不专门限于对受体氨基酸序列的修饰)提供除配体或药物之外的方式以促进并稳定活性状态构形的受体。这些方式通过刺激配体与受体结合的作用而有效地使受体稳定于活性状态。由所述不依赖于配体的方式进行的稳定化作用被称为“组成性受体活化作用”。

GPR43的序列首先发表于Sawzdargo等人的文献中(Sawzdargo等人， Biochem. Biophvs.Res.Comrnun.，239：543-547(1997))。Sawzdargo等人使用PCR以基于人类和大鼠甘丙肽(galanin)受体1(GALR1)和大鼠GALR2内的保守序列的简并引物扩增人类基因组DNA。一种产物含有展示出与一部分人类CD22基因的3-引物区100％同源的区段。作者在序列数据库中鉴别出与这一区域重叠且含有新颖GPCR基因GPR43的PAC克隆。无内含子的GPR43基因位于GPR42基因下游大约77Kb处。GPR43编码具有7个跨膜结构域的经推导具330个氨基酸的蛋白。GPR43蛋白与GPR40共有28％的氨基酸一致性，但与GALR几乎无相似性。此外，GPR43与GPR41共有43％的氨基酸一致性。第三个家族成员GPR42很可能为GPR41的近期基因副本，且可能为假基因。

GPR43被归类为孤儿受体(orphan receptor)，意味着尚未鉴别出所述受体的配体。近来，Brown等人已报导GPR43是由乙酸根和其它短链羧酸阴离子活化(Brown等人， J. Biol.Chem.，278：11312-11319(2003))。此外，Brown等人指出GPR43活化G蛋白的G_i、G_q和G₁₂家族。另外，Brown等人报导已发现GPR43在诸如嗜中性粒细胞和单核细胞的免疫细胞中具有最高含量。

定义

由受体引伸而来的科学文献中已采用大量术语以涉及对受体具有不同作用的配体。为清晰和一致性起见，本专利文献中将使用以下定义。

激动剂应意谓当与受体结合时活化胞内反应的物质，例如配体或候选化合物。举例而言，胞内反应可为增强GTP与膜的结合，或调节诸如cAMP或IP3的第二信使的含量。在一些实施例中，激动剂为先前未知的当与受体结合时活化胞内反应的物质(例如，增强GTPγS与膜的结合或降低胞内cAMP含量)。在一些实施例中，激动剂为先前未知的当与受体结合时降低血糖含量的物质。术语激动剂也包括部分激动剂，其为当与受体结合时以比完全激动剂低的程度或范围活化胞内反应的物质，例如配体或候选化合物。

拮抗剂应意谓在与激动剂相同的位点处与受体竞争性结合，但不活化胞内反应且可由此抑制由激动剂所引起的胞内反应的物质，例如配体或候选化合物。在不存在激动剂的情况下，拮抗剂并不会降低基线胞内反应。在一些实施例中，拮抗剂为先前未知的当与受体结合时与激动剂竞争以抑制细胞反应的物质(例如，其中细胞反应为GTPγS与膜的结合或胞内cAMP含量的降低)。

在本文中抗体旨在涵盖单克隆抗体和多克隆抗体。术语抗体进一步旨在涵盖IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。抗体包括完整抗体(其包括单链完整抗体)和其抗原结合片段(其包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2)。抗体可来自任何天然或合成来源，例如来自人类、鼠类、兔、山羊、豚鼠、仓鼠、骆驼、驴、绵羊、马或鸡。抗体可具有解离常数或Kd值例如小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的结合亲和性。本发明的抗体可由所属领域中已知的任何适当方法制备。

候选化合物应意谓受筛检技术检验的分子(例如化合物)。术语候选化合物特别排除已知用于调节GPR43的任何化合物，例如已知的GPR43激动剂。

组合物应意谓包含至少两种化合物或两种组份的物质，例如“医药组合物”为组合物。

化合物功效应意谓与受体结合亲和性相对，化合物抑制或刺激受体功能性的能力的度量。

组成性活化受体应意谓经受组成性受体活化的受体。

组成性受体活化应意谓通过不同于受体与其内源配体或其化学等效物结合的方式使受体稳定于活性状态。

接触应意谓无论在体外系统或是在体内系统中使至少两个部分集中在一起。

如本文所使用的糖尿病旨在涵盖由例如包括以下清单的任何方法所作出的对糖尿病的常见诊断：糖尿病症状(例如，多尿、多饮、多食)和大于或等于200mg/dl的随机血糖(casual blood glucose)含量，其中随机血糖是定义为不考虑饮食消耗时刻的一天中任何时间的血糖；或大于或等于126mg/dl的8小时空腹血糖含量；或经口投与75g溶解于水中的无水葡萄糖后两小时大于或等于200mg/dl的血糖含量。此外，如本文所使用的术语糖尿病包括“前糖尿病”状态，美国糖尿病协会(American DiabetesAssociation)将所述“前糖尿病”状态定义为100-125mg/dl空腹血糖含量或经口投与葡萄糖后两小时140-199mg/dl的血糖含量。糖尿病可由若干病况促成，例如包括β胰岛细胞的自体免疫破坏、β细胞凋亡或妊娠(妊娠期糖尿病(gestational diabete))。

内源性应意谓哺乳动物天然产生的物质。关于(例如且不限于)术语“受体”的内源性应意谓哺乳动物(例如且不限于人类)或病毒天然产生的物质。相反，在本文中，术语非内源性应意谓并非由哺乳动物(例如且不限于人类)或病毒天然产生的物质。举例而言且不限于，内源形式不具组成性活性但在经操纵后变得具有组成性活性的受体最优选在本文中称为“非内源性组成性活化受体”。两种术语都可用于描述“体内”和“体外”系统。举例而言且不限于，在筛检方法中，内源性或非内源性受体都可与体外筛检系统相关。

有效量意谓于组织、系统或个体中引起研究人员或医师或其它临床医师所寻求的所需生物或医学反应的活性化合物或医药组合物的量。举例而言，有效剂量可为可治疗代谢相关病症的量。举例而言，有效剂量也可为可预防代谢相关病症的量。

如本文所使用的葡萄糖耐受性异常(IGT)旨在表明与胰岛素抵抗相关的病况，其为明显2型糖尿病(frank type 2 diabete)与正常葡萄糖耐受(NGT)之间的中间病况。IGT是通过以下程序诊断：当通过2小时餐后血浆葡萄糖含量评定时，受感染人员的餐后葡萄糖反应经测定为异常。在这一测试中，将被测数量的葡萄糖提供给患者，且以规律间隔测量血糖含量，通常为前两小时每半小时且此后每小时进行测量。在“正常”或非IGT个体中，葡萄糖含量在前两小时中升高到小于140mg/dl的含量，随后迅速下降。在IGT个体中，血糖含量较高且以较慢速率逐渐下降。

如本文所使用的需要预防或治疗是指由护理人员(例如，在人类的情况下为医师、护士、护理从业人员等；在动物、包括非人类哺乳动物的情况下为兽医)所作的关于个体或动物需要治疗或将从治疗获益的判断。这一判断是基于护理人员的专业知识领域内的多种因素作出，且所述多种因素包括有关个体或动物因可由本发明化合物治疗的病况而生病或即将生病的知识。

如本文所使用的个体是指任何动物，包括哺乳动物，优选为小鼠、大鼠、其它啮齿动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物且最优选为人类。

与术语“反应”有关联的抑制应意谓，与不存在化合物的情况相比，在化合物存在下反应被降低或阻止。

如本文所述的胰岛素抵抗旨在涵盖由多种方法中的任一种所作出的关于胰岛素抵抗的常见诊断，所述方法包括(但不限于)静脉内葡萄糖耐受性测试或空腹胰岛素含量的测量。众所周知，空腹胰岛素含量的高度与胰岛素抵抗的程度之间存在良好的相关性。因此，出于确认哪些正常葡萄糖耐受(NGT)个体具有胰岛素抵抗的目的，可使用空腹胰岛素含量升高作为胰岛素抵抗的替代标志。也可以使用正常血糖胰岛素钳夹测试(euglycemic glucose clamp test)对胰岛素抵抗进行诊断。

反向激动剂意谓与内源形式或组成性活化形式的受体结合以便降低在不存在激动剂时所观察的受体的基线胞内反应的物质，例如配体或候选化合物。举例而言，胞内反应可为调节GTP与膜的结合，或调节诸如cAMP或IP3的第二信使的含量。在一些实施例中，反向激动剂为先前未知的降低不存在激动剂时所观察的受体基线胞内反应的物质。

配体应意谓对天然存在的内源性受体特异的天然存在的内源性分子。

代谢相关病症意谓代谢病症。举例而言，如本文所使用的代谢相关病症旨在包括低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

代谢稳定化合物旨在意谓稳定代谢参数的化合物。代谢参数包括对于代谢的任何度量，诸如脂质、糖、酶或对代谢过程起反应的其它蛋白的含量。举例而言，代谢稳定化合物可稳定个体的血糖含量。

如本文所使用的术语调节应意谓是指特定活性、功能或分子的量、品质、反应或作用的增加或降低。GPR43调节剂为调节GPR43受体的药剂。

医药组合物应意谓包含至少一种化合物和医药学上可接受的载剂的组合物。举例而言，医药组合物可包含至少一种活性成份，借此使组合物可受对于动物(例如哺乳动物，诸如人类)体内指定有效结果的调查的检验。基于技术人员的需要，所属领域技术人员将理解和了解适于测定活性成份是否具有所需有效结果的技术。

受体功能性应该是指受体接收刺激物且调节细胞内作用的正常运作，其包括(但不限于)调控基因转录、调控离子的流入或流出、实现催化反应和/或通过G蛋白调节活性。举例而言，GPR43功能性可为结合诸如Gi、Gq或G12的G蛋白；通过诸如cAMP、IP3或钙的第二信使进行信号传输；与GPR43特异性抗体结合；或与诸如GPR43激动剂的化合物结合。

第二信使应意谓由受体活化所引起的胞内反应。举例而言，第二信使可包括三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)和Ca²⁺。可测量第二信使反应以测定受体活化。此外，可测量第二信使反应以直接鉴别候选化合物，其例如包括反向激动剂、部分激动剂、激动剂和拮抗剂。

本发明提供鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

如本文所使用的“GPR43”是指具有如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽，或所述序列实质上保留具有如SEQ ID NO：2所提及的氨基酸序列的多肽的功能的变异体或同源物。

应了解，可在不损害功能的情况下对GPR43进行有限变异或修饰。举例而言，GPR43旨在包括其它GPR43多肽，例如人类GPR43多肽的哺乳动物物种同源物。数据库中存在人类GPR43的物种同源物的核苷酸和氨基酸序列，例如，GPR43的小鼠同源物可以寄存编号第NM_146187号见于GenBank中，且GPR43的大鼠同源物可以寄存编号第AB106675号见于GenBank中。此外，GPR43包括GPR43的变异体，诸如对偶基因变异体、剪接变异体和保守氨基酸取代变异体。举例而言，GPR43包括实质上保留野生型GPR43多肽的功能的变异体，所述功能例如为通过G-αi、G-αq或G-α12进行信号传输的能力、与GPR43特异性抗体结合的能力或与诸如已知配体或激动剂的化合物结合的能力。GPR43变异体无需与野生型GPR43起到相同程度的作用，而且也无需含有野生型GPR43的每一种功能。

可使用可用算法和程序(诸如基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool，“BLAST”))使用默认设置将氨基酸序列的保守和非保守氨基酸改变、缺失和插入与参考序列相比较[例如参看Karlin和Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)87：2264-8；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215：403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3：266-72；和Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)25：3389-3402]。

应了解，所述定义中包括实质上保留整个多肽的功能的GPR43片段。举例而言，可使用GPR43的信号产生结构域或GPR43的化合物结合结构域代替整个多肽。此外，GPR43可含有异源序列，诸如抗原决定部位标签或其它融合多肽。另外，GPR43可含有标记，例如放射性标记、荧光标记或酶标记。

在一实施例中，可使用与SEQ ID NO：2具有99％、98％、95％、92％、90％、85％、80％或75％序列一致性的多肽来应用本发明的方法。

在一些实施例中，所述GPR43变异体为GPR43的非内源性、组成性活化突变体。在一实施例中，所述GPR43是来源于哺乳动物。在另一实施例中，所述GPR43是人类GPR43。

在某些实施例中，所述GPR43为重组体。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞或宿主细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的聚核苷酸。在一些实施例中，所述接触是在已知的GPCR激动剂存在下进行。

在某些实施例中，所述方法进一步包含以下步骤：将由候选化合物引起的受体调节与通过使受体与受体的已知调节剂接触所引起的另一受体调节相比较。在某些实施例中，所述已知调节剂为激动剂。

在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为血糖稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为胰岛素分泌调节剂。

在一些实施例中，所述测定包含第二信使分析，例如，测定是通过测量与包含所述GPCR的膜结合的GTPγS进行。在某些实施例中，所述GTPγS是经[³⁵S]标记。在某些实施例中，所述测定是通过测量选自由下列各物组成的群组的第二信使的含量进行：环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶活性和钙(Ca²⁺)。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是使用全细胞腺苷酰基环化酶分析进行。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是用包含所述GPCR的膜进行。在某些实施例中，所述测定是通过测量胞内IP3进行。在某些实施例中，所述第二信使为MAP激酶活性。在一些实施例中，所述测定是通过CRE报告基因分析进行。在某些实施例中，所述报告基因为荧光素酶。在一些实施例中，所述报告基因为β-半乳糖苷酶。在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过例如使用FLIPR分析测量胞内钙(Ca²⁺)进行。

在一些实施例中，所述测定是通过测量从哺乳动物获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取进行。

在某些实施例中，所述测定是通过使用黑素细胞分析进行。

在本发明的方法中，可进行对照反应以展示反应的特异性。举例而言，可将经模拟转染的细胞(mock-transfected cell)与经GPR43转染的细胞相比较以展示对GPR43受体的反应的特异性。

在本发明的方法中，在某些实施例中，所述候选化合物不是抗体或其抗原结合衍生物。在某些实施例中，所述候选化合物不是肽。在某些实施例中，所述候选化合物不是多肽。

如上所述，受体功能性是指受体接收刺激物且调节细胞内作用的正常运作，其包括(但不限于)调控基因转录、调控离子的流入或流出、实现催化反应和/或通过G蛋白调节活性。举例而言，GPR43功能性可为结合诸如Gi、Gq或G12的G蛋白；通过诸如cAMP、IP3或钙的第二信使进行信号传输；与GPR43特异性抗体结合；或与诸如GPR43激动剂的化合物结合。

在本发明的方法中，测定可包含第二信使分析。例如可通过测量第二信使的含量来确定胞内信号的起始，所述第二信使诸如为环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶或钙。所属领域中众所周知用于测量这些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素细胞分析或CRE-报告基因分析。此外，本文的实例6-11中公开第二信使分析的实例。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在其它实施例中，所述第二信使为IP3。在其它实施例中，所述第二信使为钙。

在一实施例中，所述测定是通过测量与包含所述GPCR的膜结合的GTPγS进行。这些分析已为所属领域中众所周知，且于本文的实例6和8中加以例示说明。在某些实施例中，所述GTPγS是经[³⁵S]标记。

本发明也涉及可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

举例而言，本发明提供可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

在一实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43激动剂。在一些实施例中，所述激动剂为先前未知的当与GPR43受体结合时活化胞内反应的物质。

在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为EC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为EC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为EC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为EC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的激动剂。

在某些实施例中，所述EC50是使用选自由以下分析组成的群组的分析测定：IP3分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染HEK293细胞进行；和黑素细胞分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染黑素细胞进行。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于9μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于8μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于7μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于6μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于5μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于4μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于3μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于2μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于1μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于900nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于800nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于700nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于600nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于500nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于400nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于300nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于200nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于100nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于90nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于80nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于70nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于60nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于50nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于40nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于30nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于20nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的激动剂。在某些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物对GPCR具有选择性。

在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在某些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。

在某些实施例中，所述IC50是使用选自由以下分析组成的群组的分析测定：IP3分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染HEK293细胞进行；和黑素细胞分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染黑素细胞进行。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于10μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于9μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于8μM的反向反向激动剂或拮抗剂或反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于7μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于6μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于5μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于4μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于3μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于2μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于1μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于900nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于800nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于700nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于600nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于500nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于400nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于300nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于200nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于100nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于90nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于80nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于70nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于60nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于50nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于40nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于30nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于20nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50小于10nM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中IC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物对GPCR具有选择性。

在一些实施例中，所述代谢稳定化合物可经口服生物利用。在一些实施例中，相对于腹膜内投药而言，所述口服生物利用度为至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，相对于腹膜内投药而言，所述口服生物利用度为至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些实施例中，所述可经口服生物利用的代谢稳定化合物另外能够穿越血脑屏障。

此外，本发明提供用于制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物可通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。举例而言，本发明提供用于制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物是通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明还提供医药组合物，其包含、基本上由或由可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

可使用所属领域技术人员熟知的技术将化合物调配成医药组合物。所属领域技术人员可用除本文所提及的那些载剂外的适当医药学上可接受的载剂；例如参看Remington′sPharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.，(Oslo等人编辑)。

尽管在替代使用中可能以化学原料或纯化学物质的形式投与由本发明的方法所鉴别的化合物以用于预防或治疗，但提供另外包含医药学上可接受的载剂的医药调配物或组合物形式的化合物或活性成份也是有用的。

因此，本发明进一步提供医药调配物，其包含由本发明的方法鉴别的化合物或其医药学上可接受的盐或衍生物连同一种或一种以上其医药学上可接受的载剂和/或预防成份。在载剂可与调配物中的其它成份相容且不会对其接受者过度有害的意义上来说，载剂是“可接受的”。

医药调配物包括适于经口、经直肠、经鼻、经局部(包括口腔和舌下)、经阴道或不经肠(包括肌内、皮下和静脉内)投药或为适于经吸入或吹入投药的形式的医药调配物。

因此，可将本发明的化合物连同常规佐剂、载剂或稀释剂一起放置成医药调配物和其单位剂量的形式，且在所述形式下其可以下列形式使用：经口使用的固体形式(诸如片剂或填充胶囊)或液体形式(诸如溶液、悬浮液、乳液、酏剂、凝胶或填充有所述物质的胶囊)、经直肠投药的栓剂形式或不经肠(包括皮下)使用的无菌注射溶液形式。在有或没有其它活性化合物或成份的情况下，这些医药组合物和其单位剂型都可包含常规比例的常规成份，且所述单位剂型可含有与打算使用的每日剂量范围相称的任何适当有效量的活性成份。

对于经口投药而言，医药组合物可为例如片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。可将医药组合物制成含有特定量的活性成份的剂量单位的形式。所述剂量单位的实例为胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂或悬浮液，其具有常规添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；粘合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；和润滑剂，诸如滑石或硬脂酸镁。也可通过以组合物形式注射来投与活性成份，例如在所述组合物中可将生理食盐水、右旋糖或水用作适当的医药学上可接受的载剂。

本发明提供治疗或预防有此需要的个体的代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据以下方法鉴别的化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一些实施例中，所述代谢相关病症为II型糖尿病。在一实施例中，所投与的化合物包含GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的医药组合物的组合，所述医药组合物包含、基本上由或由根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。举例而言，在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的含有GPR43反向激动剂的医药组合物的组合。在一实施例中个体为哺乳动物，且在另一实施例中个体为人类。在一实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症且所述所投与的化合物包含GPR43激动剂。

如本文所用的关于病症的术语“治疗”意谓使与特定病症相关的一种或一种以上症状的严重程度降低。因此，治疗病症未必意谓使与病症相关的所有症状的严重程度都降低，且未必意谓使与病症相关的一种或一种以上症状的严重程度完全降低。类似地，术语“预防”意谓对与特定病症相关的一种或一种以上症状的发生或发作的预防，且未必意谓对病症的完全预防。本发明的方法可用于治疗代谢相关病症，例如包括糖尿病。

当使用本发明的方法所鉴别的化合物时，剂量可于广泛界限内变化，并且作为医师的惯例且如其所知，将针对每一个别病例中的个别情况定制剂量。举例而言，其取决于待治疗的疾病的性质和严重程度、患者的情况、所使用的化合物、进行治疗或预防的病状为急性或慢性或除本发明方法所鉴别的化合物外是否投与其它活性化合物。本发明的代表性剂量包括约0.01mg至约1000mg、约0.01mg至约750mg、约0.01mg至约500mg、0.01mg至约250mg、0.01mg至约200mg、约0.01mg至150mg、约0.01mg至约100mg和约0.01mg至约75mg。可在一天中投与多次剂量(例如2、3或4次剂量)，尤其是当认为需要相对大量时。适当时，视个体行为而定和适当时由患者的医师或护理人员决定，可能需要上调或下调每日剂量。

治疗用所需的活性成份或其活性盐或衍生物的量不仅将随所选择的特定盐而变化，而且也随投药途径、所治疗的病况的性质和患者的年龄和情况而变化，且最终将取决于主治医师或临床医师的判断。一般说来，所属领域技术人员应了解怎样由模型系统、通常为动物模型中获得的体内数据外推至另一模型，诸如人类。动物模型通常包括(但不限于)啮齿动物糖尿病模型(其它动物模型已由Reed和Scribner于Diabetes，Obesity andMetabolism，1：75-86(1999)中进行报导)。在一些情况下，这些外推可仅基于动物模型与另一动物模型(诸如哺乳动物，例如人类)的体重比较，然而，更常见的是，这些外推并非简单地基于体重，而是并入多种因素考虑。代表性因素包括患者的类型、年龄、体重、性别、饮食和健康情况、疾病的严重程度、投药途径、所使用的特定化合物的药理学考虑(诸如活性、功效、药物动力学和毒理学概况)、是否利用药物传递系统、进行治疗或预防的病状为急性或慢性或除本发明的方法所鉴别且作为药物组合的部分的化合物外是否投与其它活性化合物。用于以本发明的化合物和/或组合物治疗疾病病况的剂量方案是根据上文所述的多种因素选择。因此，所用的实际剂量方案可广泛变化，且因此可偏离优选剂量方案，且所属领域技术人员将认识到可对这些典型范围以外的剂量和剂量方案进行测试，且适当时，可将其用于本发明的方法中。

所需剂量方便地可以单剂量形式或以经适当间隔投与的分剂量形式(例如，每天2次、3次、4次或更多分剂量)提供。举例而言，分剂量本身可进一步细分成多个不连续的松散间隔的投药。尤其当认为投与相对大量适当时，可将每日剂量细分成若干份投药，例如2、3或4份。适当时，视个体行为而定，可能需要上调或下调所指定的每日剂量。

由本发明的方法鉴别的化合物可以广泛多种经口和不经肠剂型投与。所属领域技术人员将了解，以下剂型可包含本文所公开或由本发明方法所鉴别的化合物或由本发明方法所鉴别的化合物的医药学上可接受的盐作为活性组份。

就由本发明的方法所鉴别的化合物制备医药组合物而言，适当的医药学上可接受的载剂的选择可为固体、液体或两者的混合物。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载剂可为一种或一种以上还可以充当稀释剂、调味剂、增溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或封装材料的物质。

在粉剂中，载剂为与细粉状(finely divided)活性组份混合的细粉状固体。在片剂中，活性组份与具有必需的结合能力的载剂以适当比例混合，且经压制成所需的形状和尺寸。

粉剂和片剂可含有不同百分比数量的活性化合物。粉剂或片剂中的代表性数量可含有0.5至约90％活性化合物；然而，所属领域技术人员将了解何时需要所述范围以外的量。粉剂和片剂的适当载剂为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”旨在包括活性化合物与作为载剂的封装材料的调配物，从而提供其中含有或不含载剂的活性组份由载剂包围且因此互相缔合的胶囊。类似地，包括扁囊剂和糖锭。片剂、粉剂、胶囊、丸剂、扁囊剂和糖锭都可用作适于经口投与的固体形式。

对于制备栓剂而言，首先将低熔点蜡(诸如脂肪酸甘油酯或可可油的混合物)熔融，并如通过搅拌使活性组份均匀分散于其中。随后，将熔融的均匀混合物倒入适宜尺寸的模具中，使其冷却，并由此使其固化。

适于经阴道投与的调配物可以子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊状物、泡沫或喷雾形式提供，除活性成份外其还含有诸如所属领域中已知适当的载剂。

液体形式的制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水-丙二醇溶液。举例而言，可将不经肠注射用液体制剂调配成聚乙二醇水溶液中的溶液。可根据已知技术使用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可为无毒不经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒剂和溶剂为水、林格氏溶液(Ringer′s solution)和等渗氯化钠溶液。此外，通常将无菌的不挥发性油用作溶剂或悬浮介质。出于这一目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。此外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备可注射物。

因此，可调配用于不经肠投与(例如，通过注射，例如团注(bolus injection)或连续输注)的本发明的化合物，且其可以添加有防腐剂的安瓿、预填充注射器、小容量输注或多剂量容器中的单位剂型提供。医药组合物可采用诸如油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液的形式，且可含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的调配剂。或者，活性成份可为通过无菌分离无菌固体或通过由溶液冻干而获得的粉末形式，其在使用前用适当媒剂(例如无菌无热原质水)复水。

适于经口使用的水溶液可通过将活性组份溶解于水中并视需要加入适当着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。

适于经口使用的水性悬浮液可通过将细粉状活性组份分散于含有粘性材料的水中而制得，所述粘性材料诸如为天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其它众所周知的悬浮剂。

还包括打算在即将使用前转化成用于经口投与的液体形式制剂的固体形式制剂。所述液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。这些制剂除活性组份外还可含有着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。

对于向表皮局部投药而言，可将本发明的化合物调配成油膏、乳膏或洗液，或调配成透皮贴片。

举例而言，可以水性或油性基质调配油膏和乳膏，同时加入适当的增稠剂和/或胶凝剂。可以水性或油性基质调配洗液，且其通常也含有一种或一种以上的乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂或着色剂。

适于在口中局部投与的调配物包括糖锭，其包含调味基质(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)中的活性剂；锭剂，其包含惰性基质(诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性成份；和漱口液，其包含适当液体载剂中的活性成份。

溶液或悬浮液是通过常规方式、例如用滴管、吸液管或喷雾器直接施加到鼻腔中。调配物可以单剂量或多剂量形式提供。在用滴管或吸液管的后一情况下，这可通过患者投与适当的预定体积的溶液或悬浮液实现。在喷雾器的情况下，这可例如借助于计量雾化喷雾泵实现。

也可借助于在具有适当推进剂的加压包装中提供活性成份的气雾剂调配物实现向呼吸道投药。如果以气雾剂形式(例如鼻气雾剂)或通过吸入投与由本发明的方法鉴别的化合物或包含其的医药调配物，那么这可例如使用喷雾器、雾化器、雾化泵(pumpnebulizer)、吸入设备、计量式吸入器(metered inhaler)或干粉吸入器进行。可通过所属领域技术人员众所周知的方法制备用于投与由本发明的方法所鉴别的化合物的医药形式(如气雾剂形式)。就其制备而言，例如，所使用的由本发明的方法所鉴别的化合物于水、水/醇混合物或适当生理食盐水溶液中的溶液或悬浮液中可使用常用添加剂(例如苯甲醇)或其它适当的防腐剂、用于增加生物利用度的吸收增强剂、增溶剂、分散剂等，且适当时可使用常用推进剂，其例如包括二氧化碳、CFC(诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷或二氯四氟乙烷)等。气雾剂适宜地也可含有表面活性剂，诸如卵磷脂。药物的剂量可通过提供量阀进行控制。

在打算用于向呼吸道投与的调配物(包括鼻内调配物)中，化合物通常将具有例如约10微米或10微米以下的小粒度。可通过所属领域中已知的方式、例如通过微粉化获得所述粒度。需要时，可使用适于提供活性成份的持续释放的调配物。

或者，活性成份可以干粉形式提供，例如化合物于适当粉末基质中的粉末混合物，所述粉末基质诸如为乳糖、淀粉、淀粉衍生物(诸如羟丙基甲基纤维素)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。适宜地，粉末载剂将于鼻腔内形成凝胶。粉末组合物可以单位剂型提供，例如明胶胶囊或药包或可借助于吸入器从其中投与粉末的发泡包装。

医药制剂可为单位剂型。在这种形式下，将制剂再分成含有适量活性组份的单位剂量。单位剂型可为包装制剂，所述包装含有个别量的制剂，诸如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉剂。同样，单位剂型可为胶囊、片剂、扁囊剂或糖锭本身，或其可为适当数量的所述包装形式的单位剂型中的任一者。

用于经口投与的片剂或胶囊和用于静脉内投与的液体为特别有用的组合物。

代谢相关病症例如包括低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

低血糖症是定义为异常低的血糖。举例而言，低血糖症可由过量的胰岛素或较差饮食引起。举例而言，当患有糖尿病的人注射过多的胰岛素、食用过少的食物或在不食用额外食物的情况下进行锻炼时，可引发低血糖症。低血糖症的症状例如包括感觉焦虑或虚弱、头痛、视力模糊、饥饿和多汗。

衰老是当有机体变老时出现的生理学过程。热量限制使胰岛素分泌下调，且有理由怀疑这些作用是热量限制对寿命产生有利影响的关键介导物。此外，胰岛素或胰岛素信号传输路径的突变影响线虫(C.elegans)的衰老。因此，下调胰岛素的策略可用于减缓衰老进程并增加寿命。

上文已描述糖尿病、肥胖症和相关病况，诸如胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常和高血糖症。在一些实施例中，所述代谢相关病症为高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压、X综合症和末梢血管疾病。

胰腺中的β细胞产生胰岛素。胰岛素刺激葡萄糖从血液中到身体细胞中的摄取。如上所述，当身体细胞对胰岛素的作用产生抗性时，称为胰岛素抵抗。由于胰岛素抵抗，使得胰腺产生比正常水平多得多的胰岛素。这称为高胰岛素血症。

血脂异常为意谓体内脂质含量失调的常用术语。高脂血症为血流中脂质(脂肪)含量升高。这些脂质包括胆固醇、胆固醇酯(化合物)、磷脂和甘油三酯。所述脂质是作为被称为脂蛋白的大分子的部分转运至血液中。这些脂蛋白是五个主要家族的血液(血浆)脂蛋白：乳糜微粒、极低密度脂蛋白(VLDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。当根据血液中脂蛋白升高的类别定义高脂血症时，使用术语高脂蛋白血症。高胆固醇血症是关于血液中高胆固醇含量的术语。高甘油三酯血症是指血液中的高甘油三酯含量。

动脉粥样硬化为脂肪物质、胆固醇和其它物质的沉积物积聚于动脉内层中的过程。所述积聚物是称为斑块。破裂的斑块导致形成可阻断血液流到心脏(心脏病发作)或脑部(中风)的血凝块。在美国，心脏病发作是导致男性和女性死亡的首要原因，且中风是导致死亡的第三号原因[例如参看Nature Medicine，Special Focus on Atherosclerosis，(2002)8：1209-1262]。异常高含量的循环脂质是发展动脉粥样硬化的主要诱发因素。高含量的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、高含量的甘油三酯或低含量的高密度脂蛋白(HDL)胆固醇独立地为动脉粥样硬化和相关病理学的风险因素。

心脏病包括(但不限于)心功能不全、冠状动脉功能不全、冠状动脉疾病和高血压。末梢血管疾病是指心脏和脑部外侧血管的疾病。有机末梢血管疾病是由血管的结构改变(诸如发炎和组织损伤)引起。实例为末梢动脉疾病。末梢动脉疾病(PAD)是与冠状动脉疾病和颈动脉疾病类似的病况。在PAD中，脂肪沉积物沿动脉壁积聚，并影响血液循环，主要影响通向腿和脚的动脉中的血液循环。在PAD早期，常见症状为活动时腿和臀部抽筋或疲劳。当人站立不动时，所述抽筋症状将减退。这被称为“间歇性跛行(intermittent claudication)”。患有PAD的人具有较高的因中风和心脏病发作而死亡的风险，这是因为形成血凝块的风险。

X综合症(也称为代谢综合症)是以一个人体内的一组代谢风险因素为特征。这些风险因素包括：中心型肥胖(central obesity)(腹部中和腹部周围脂肪组织过多)、致动脉粥样硬化的血脂异常(血脂病症，主要是高甘油三酯和低HDL胆固醇)、高血压(130/85mmHg或更高)、胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受、血栓前状态(prothrombotic state)(例如，血液中高含量的血纤维蛋白原或血纤维蛋白溶酶原活化因子抑制剂[-1])和促炎症状态(proinflammatory state)(例如，血液中高敏感性C反应蛋白含量升高)。

高血压是血压保持异常高(140/90mmHg或更高的读数)的常见病症。市面上存在若干种可治疗高血压的药物。高血压是若干种严重病况(包括中风)的风险因素。

末梢血管疾病是心脏外侧动脉中动脉粥样硬化斑块的积聚。末梢血管疾病的症状视影响何种动脉和血流降低的严重程度而定。举例而言，患者可经历钝痛、绞痛、麻痹或刺痛或皮肤颜色改变。临床研究已确认增加末梢血管疾病风险的因素，诸如糖尿病或吸烟。可使用(例如)踝臂指数(ankle brachial index，ABI)测试、超声波多普勒测试(ultrasound Doppler test)或血管造影对末梢血管疾病进行诊断。末梢血管疾病可用药物、外科手术、微创介入程序(minimally invasive interventional procedure)或这些疗法的组合进行治疗。

尽管由本发明的方法所鉴别的化合物可如上文所述作为唯一的活性医药剂投与，但其也可与一种或一种以上药剂组合使用，所述药剂例如包括用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂。举例而言，诸如GPR43反向激动剂或拮抗剂的化合物可与一种或一种以上属于一类被称为α-葡糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、双胍、噻唑烷二酮、美格替耐、磺酰脲、胰岛素、HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、贝特类化合物(fibrate compound)、LDL分解代谢增强剂、血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、脂肪酶抑制剂、血清素和/或去甲肾上腺素释放剂或再摄取抑制剂的药物的药剂组合使用。

α-葡糖苷酶抑制剂属于竞争性抑制胰腺和/或小肠内的消化酶的一类药物，所述消化酶诸如为α-淀粉酶、麦芽糖酶、α-糊精酶、蔗糖酶等。α-葡糖苷酶抑制剂的可逆抑制通过延缓淀粉和糖的消化来阻碍、减小或降低血糖含量。α-葡糖苷酶抑制剂的一些代表性实例包括阿卡波糖(acarbose)、N-(1，3-二羟基-2-丙基)井岗霉醇胺(N-(1，3-dihydroxy-2-propyl)valiolamine)(通用名：伏格列波糖(voglibose))、米格列醇(miglitol)和所属领域中已知的α-葡糖苷酶抑制剂。

醛糖还原酶抑制剂类为抑制多元醇路径中的第一阶段限速酶并由此预防或阻止糖尿病并发症的药物。在糖尿病的高血糖状态下，多元醇路径中对于葡萄糖的利用增加，且由此引起的胞内积累的过量山梨糖醇充当组织毒素，并因此引起诸如糖尿病神经病变、视网膜病和肾病的并发症的发作。醛糖还原酶抑制剂的实例包括托勒司他(tolurestat)、依帕司他(epalrestat)、3，4-二氢-2，8-二异丙基-3-硫代-2H-1，4-苯并恶嗪-4-乙酸、2，7-二氟螺(9H-芴-9，4′-咪唑烷)-2′，5′-二酮(通用名：咪瑞司他(imirestat))、3-[(4-溴-2-氟苯基)甲基]-7-氯-3，4-二氢-2，4-二氧代-1(2H)-喹唑啉乙酸(通用名：折那司他(zenarestat))、6-氟-2，3-二氢-2′，5′-二氧代-螺[4H-1-苯并吡喃-4，4′-咪唑烷]-2-甲酰胺(SNK-860)、唑泊司他(zopolrestat)、索比尼尔(sorbinil)和1-[(3-溴-2-苯并呋喃基)磺酰基]-2，4-咪唑烷二酮(M-16209)和所属领域中已知的醛糖还原酶抑制剂。

双胍为刺激无氧糖酵解、增加周围组织对胰岛素的敏感性、抑制葡萄糖从肠的吸收、抑制肝糖原异生和抑制脂肪酸氧化的一类药物。双胍的实例包括芬法敏(phenformin)、美氟明(metformin)、丁福明(buformin)和所属领域中已知的双胍。

胰岛素分泌增强剂属于具有促进胰腺β细胞分泌胰岛素的特性的一类药物。胰岛素分泌增强剂的实例包括磺酰脲(SU)。磺酰脲(SU)为通过经由细胞膜中的SU受体传输胰岛素分泌信号来促进胰腺β细胞分泌胰岛素的药物。磺酰脲的实例包括甲苯磺丁脲(tolbutamide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)、妥拉磺脲(tolazamide)、乙酸磺环己脲(acetohexamide)、4-氯-N-[(1-吡咯烷基氨基)羰基-苯磺酰胺(通用名：格列克比脲(glycopyramide))或其铵盐、格列本脲(glibenclamide)(格列本脲(glyburide))、格列齐特(gliclazide)、1-丁基-3-间氨基苯磺酰基脲、氨磺丁脲(carbutamide)、格列波脲(glibonuride)、格列吡嗪(glipizide)、格列喹酮(gliquidone)、格列派特(glisoxepid)、格列噻唑(glybuthiazole)、格列布唑(glibuzole)、格列己脲(glyhexamide)、格列嘧啶(glymidine)、格列平脲(glypinamide)、苯磺丁脲(phenbutamide)、甲磺环己脲(tolcyclamide)、格列美脲(glimepiride)和所属领域中已知的其它胰岛素分泌增强剂。其它胰岛素分泌增强剂包括N-[[4-(1-甲基乙基)环己基)羰基]-D-苯丙氨酸(那格列奈(Nateglinide))、(2S)-2-苯甲基-3-(顺-六氢-2-异吲哚啉基羰基)丙酸钙二水合物(米格列奈(Mitiglinide)，KAD-1229)和所属领域中已知的其它胰岛素分泌增强剂。

噻唑烷二酮属于通常更被称为TZD的一类药物。噻唑烷二酮为通过增加细胞对胰岛素的敏感性来降低血糖的一类用于2型糖尿病的药物。随后胰岛素可使葡萄糖从血液移动到细胞中以用于能量目的。这些药物也可增加HDL。

噻唑烷二酮的实例包括罗格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)和所属领域中已知的噻唑烷二酮。在美国，雷株林(Rezulin)(曲格列酮(troglitazone))是这类药物中的首个药物，但由于肝脏毒性而退出市场。当前可用的具有较好安全性概况的姐妹化合物(sister compound)包括艾可拓(Actos)(吡格列酮)和文迪雅(Avandia)(罗格列酮)。使用这些药物的主要禁忌症包括肝病和心力衰竭。这些药物也可引起体液潴留(fluid retention)的显著增加并因此使心力衰竭的风险增加。

美格替耐是用于终止患2型糖尿病的人员进食后可能立即出现的血糖快速升高。例如包括瑞格列奈(repaglinide)(普瑞丁(Prandin))和那格列奈(唐力(Starlix))的这些化合物通过以与磺酰脲药物起作用的方式类似的方式增加胰腺产生胰岛素的量来起作用。美格替耐是在进食前服用。与这类药物相关的副作用包括低血糖、上呼吸道感染(包括窦病症(sinus condition))、头痛、关节和背部疼痛、恶心、腹泻和便秘。

根据胰岛素开始作用(起始)的快慢程度和其持续作用(持续时间)的时间长短对不同类型的胰岛素进行分类。当前可用的类型包括速效胰岛素、短效胰岛素、中效胰岛素和长效胰岛素。存在可用的预混合速效和中效胰岛素，其包括：70％中效胰岛素(NPH)和30％短效常规胰岛素，称为70/30胰岛素；50％中效胰岛素(NPH)和50％短效常规胰岛素，称为50/50胰岛素；75％中效胰岛素(NPH)和25％速效优泌乐(Humalog)(赖脯胰岛素(lispro))，称为75/25胰岛素；70％中效胰岛素(NPH)和30％速效诺和诺德(NovoLog)(门冬胰岛素(insulin aspart))，称为诺和诺德混合物(NovoLog Mix)70/30。胰岛素通常是以注射液形式提供到皮肤下(皮下)组织中。也可通过胰岛素泵或无针注射器(jet injector)(一种将药物喷到皮肤中的装置)提供胰岛素。

胰岛素使糖(葡萄糖)进入细胞内，糖于其中用于能量目的。在无胰岛素的情况下，血糖含量上升到对身体安全的含量以上。通常，采用速效或短效和中效或长效胰岛素提供身体所需的恒定和可变含量的胰岛素。短效胰岛素迅速降低血糖含量且随后逐渐消失。当速效或短效胰岛素开始消失时，一些长效胰岛素开始生效。新颖长效胰岛素兰德仕(Lantus)在给药后数分钟内起效，并且以相同速率持续作用约24小时。

速效或短效胰岛素与中效或长效胰岛素的组合协助使血糖含量一整天都保持在对身体安全的范围内。因此，可使用胰岛素治疗胰腺产生极少或不产生胰岛素或口服药物无法控制血糖的1型糖尿病患者和2型糖尿病患者。这些人可仅采用胰岛素或同时采用胰岛素和口服药物，所述人员为因严重疾病或大外科手术而具有高血糖含量的2型糖尿病患者；无法用饮食和锻炼使血糖含量保持在安全范围内的处于妊娠或哺乳期的患有2型糖尿病的妇女。仅已研究出一种口服糖尿病药物(格列本脲(glyburide))在妊娠期使用。

胰岛素的主要副作用可为危险低的血糖含量(严重低血糖症)。极低血糖含量可在10至15分钟内显现。胰岛素可促成体重增加，尤其是对于已超重的2型糖尿病患者而言。长期使用胰岛素的其它可能的副作用包括其中注射胰岛素的脂肪组织的损失(脂肪代谢障碍)和罕见的过敏性反应(包括肿胀(浮肿))。

他汀(statin)化合物属于通过抑制羟甲基戊二酰基辅酶A(HMG-CoA)还原酶来降低血液胆固醇含量的一类药物。HMG-CoA还原酶为胆固醇生物合成中的限速酶。抑制这种还原酶的他汀通过上调LDL受体活性和负责将LDL从血液中清除来降低血清LDL浓度。他汀化合物的实例包括罗苏伐他汀(rosuvastatin)、普伐他汀(pravastatin)和其钠盐、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)和所属领域中已知的HMG-CoA还原酶抑制剂。

角鲨烯合成抑制剂属于通过抑制角鲨烯合成来降低血液胆固醇含量的一类药物。角鲨烯合成抑制剂的实例包括(S)-α-[双[2，2-二甲基-1-氧代丙氧基)甲氧基]氧膦基(phosphinyl)]-3-苯氧基苯丁烷磺酸单钾盐(BMS-188494)和所属领域中已知的角鲨烯合成抑制剂。

贝特类化合物属于通过抑制肝脏中甘油三酯合成和分泌并活化脂蛋白脂肪酶来降低血液胆固醇含量的一类药物。已知贝特类活化过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferators-activated receptor)并诱导脂蛋白脂肪酶的表达。贝特类化合物的实例包括苯扎贝特(bezafibrate)、贝罗贝特(beclobrate)、比尼贝特(binifibrate)、刺博贝特(ciplofibrate)、克利贝特(clinofibrate)、氯贝特(clofibrate)、氯贝酸(clofibricacid)、依托贝特(etofibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil)、尼可贝特(nicofibrate)、吡贝特(pirifibrate)、氯烟贝特(ronifibrate)、双贝特(simfibrate)、益多脂(theofibrate)和所属领域中已知的贝特类。

LDL(低密度脂蛋白)分解代谢增强剂属于通过增加LDL(低密度脂蛋白)受体的数量来降低血液胆固醇含量的一类药物，实例包括所属领域中已知的LDL分解代谢增强剂。

血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂属于通过抑制血管收缩素转化酶来部分降低血糖含量同时降低血压的一类药物。血管收缩素转化酶抑制剂的实例包括卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、阿拉普利(alacepril)、地拉普利(delapril)、雷米普利(ramipril)、赖诺普利(lisinopriL)、咪哒普利(imidapril)、贝那普利(benazepril)、西罗普利(ceronapril)、西拉普利(cilazapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、莫夫普利(moveltopril)、培多普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)、雷多普利(randolapril)和所属领域中已知的血管收缩素转化酶抑制剂。

脂肪酶抑制剂例如包括抗肥胖症化合物，诸如奥利司他(Orlistat)(XENICAL^TM)。奥利司他直接抑制脂肪吸收，并且倾向于产生高发生率的使胃部不适的副作用(诸如腹泻和肠胃气胀)。

另一类抗肥胖症药物包括血清素和/或去甲肾上腺素释放剂或再摄取抑制剂。举例而言，西布曲明(sibutramine)(Meridia^TM)为混合5-HT/去甲肾上腺素再摄取抑制剂。西布曲明的主要副作用可为使一些患者的血压和心率增加。已报导血清素释放剂/再摄取抑制剂芬氟拉明(fenfluramine)(Pondimin^TM)和右旋氟苯丙胺(dexfenfluramine)(Redux^TM)可长时间(大于6个月)降低食物摄入和体重。然而，在报导与使用这两种产品有关的心脏瓣膜畸形的初步证据后，不再使用这两种产品。

本发明的一些实施例包括医药组合物，其包含本文所公开或由本发明的方法所鉴别的化合物或其医药学上可接受的盐与至少一种选自由下列各物组成的群组的成员的组合：α-葡糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、双胍、HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、贝特类化合物、LDL分解代谢增强剂和血管收缩素转化酶抑制剂。在另一实施例中，HMG-CoA还原酶抑制剂是选自由普瓦他汀(prevastatin)、辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀和利匹妥(lipitor)组成的群组。

根据本发明，可通过使各别活性组份一起或独立地与上文所述的生理学上可接受的载剂、赋形剂、粘合剂、稀释剂等混合并且经口或不经口投与一种或一种以上医药组合物形式的混合物来使用所述组合。当作为组合疗法或预防投与化合物或化合物混合物与另一活性化合物时，可将治疗剂调配为在相同时间或不同时间给药的单独医药组合物，或可提供单一组合物形式的治疗剂。

本发明还提供制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用作代谢稳定化合物的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明进一步提供制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用于治疗代谢相关疾病的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否受到调节，其中对GPR43功能性的调节表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明涉及鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

在一实施例中，所述GPR43是来源于哺乳动物。在另一实施例中，所述GPR43是人类GPR43。

在某些实施例中，所述GPR43为重组体。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞或宿主细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的聚核苷酸。在一些实施例中，所述接触是在已知的GPCR激动剂或如本文所公开的激动剂存在下进行。

在某些实施例中，所述方法进一步包含以下步骤：将由候选化合物所引起的受体功能性增加与通过使受体与受体的已知配体或激动剂接触所引起的另一受体功能性增加相比较。

在一些实施例中，所述测定包含第二信使分析，例如，测定是通过测量与包含所述GPCR的膜结合的GTPγS进行。在某些实施例中，所述GTPγS是经[³⁵S]标记。在某些实施例中，所述测定是通过测量选自由下列各物组成的群组的第二信使的含量进行：环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶活性和Ca²⁺。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是使用全细胞腺苷酰基环化酶分析进行。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是用包含所述GPCR的膜进行。在某些实施例中，所述测定是通过测量胞内IP3进行。在某些实施例中，所述第二信使为MAP激酶活性。在一些实施例中，所述测定是通过CRE-报告基因分析进行。在某些实施例中，所述报告基因为荧光素酶。在一些实施例中，所述报告基因为β-半乳糖苷酶。在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过测量胞内Ca²⁺进行。

在某些实施例中，所述测定是通过使用黑素细胞分析进行。

在某些实施例中，所述GPR43为重组体。在某些实施例中，所述接触包含与表达GPCR的宿主细胞或宿主细胞膜接触，其中所述宿主细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码受体的聚核苷酸。在一些实施例中，所述接触是在GPCR激动剂存在下进行。

在本发明的方法中，可进行对照反应以展示反应的特异性。举例而言，可将经模拟转染的细胞与经GPR43转染的细胞相比较以展示对GPR43受体的反应的特异性。

在本发明的方法中，测定可包含第二信使分析。例如，可通过测量第二信使的含量来确定胞内信号的起始，所述第二信使诸如为环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶或钙。所属领域中众所周知用于测量这些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素细胞分析或CRE-报告基因分析。此外，本文的实例6-11中公开第二信使分析的实例。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在其它实施例中，所述第二信使为IP3。在其它实施例中，所述第二信使为钙。

在一实施例中，所述测定是通过测量与包含所述GPCR的膜结合的GTPγS进行。这些分析已为所属领域中众所周知，且于本文实例6和8中加以例示说明。在某些实施例中，所述GTPγS是经[³⁵S]标记。

本发明也涉及可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

举例而言，本发明涉及可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

在某些实施例中，所述EC50是使用选自由以下分析组成的群组的分析测定：IP3分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染HEK293细胞进行；和黑素细胞分析，其是使用表达重组GPR43多肽的经转染黑素细胞进行。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于9μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于8μM的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于7μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于6μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于5μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于4μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于3μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于2μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于1μM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于900nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于800nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于700nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于600nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于500nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于400nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于300nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于200nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于100nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于90nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于80nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于70nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于60nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于50nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于40nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于30nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于20nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50小于10nM的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为在所述分析中EC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的激动剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物对GPCR具有选择性。

此外，本发明涉及制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物可通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。举例而言，本发明涉及制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物可通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明还涉及医药组合物，其包含、基本上由或由可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明的一些实施例包括制造医药组合物的方法，其包含使至少一种根据本文所公开的化合物实施例中任一者的化合物与医药学上可接受的载剂混合。

可使用所属领域技术人员熟知和本文所述的技术将化合物调配成医药组合物。

尽管在替代使用中可能以化学原料或纯化学物质的形式投与本文所公开或由本发明的方法所鉴别的化合物以用于预防或治疗，但提供另外包含医药学上可接受的载剂的医药调配物或组合物形式的化合物或活性成份也是适用的。

因此，本发明进一步提供医药调配物，其包含本文所公开或由本发明的方法所鉴别的化合物或其医药学上可接受的盐或衍生物连同一种或一种以上其医药学上可接受的载剂和/或预防成份。在载剂可与调配物中的其它成份相容且不会对其接受者过度有害的意义上来说，载剂是“可接受的”。

医药调配物、投药途径和剂量已于上文进行描述。

本发明涉及治疗或预防有此需要的个体的代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据以下方法所鉴别的化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症或衰老。在一实施例中，所投与的化合物包含GPR43激动剂。在一实施例中个体为哺乳动物，且在另一实施例中个体为人类。

尽管由本发明的方法所鉴别的化合物可如上文所述作为唯一的活性医药剂投与，但其也可与一种或一种以上药剂组合使用。

本发明还涉及制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用作代谢稳定化合物的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明另外涉及制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用于治疗代谢相关疾病的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否增加，其中GPR43功能性增加表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明提供鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

在一些实施例中，所述测定包含第二信使分析，例如，测定是通过测量与包含所述GPCR的膜结合的GTPγS进行。在某些实施例中，所述GTPγS是经[³⁵S]标记。在某些实施例中，所述测定是通过测量选自由下列各物组成的群组的第二信使的含量进行：环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶活性和Ca²⁺。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是使用全细胞腺苷酰基环化酶分析进行。在某些实施例中，所述对cAMP的测量是用包含所述GPCR的膜进行。在某些实施例中，所述测定是通过测量胞内IP3进行。在某些实施例中，所述第二信使为MAP激酶活性。在一些实施例中，所述测定是通过CRE-报告基因分析进行。在某些实施例中，所述报告基因为荧光素酶。在一些实施例中，所述报告基因为β-半乳糖苷酶。在某些实施例中，所述测定或所述比较是通过例如使用FLIPR分析测量胞内Ca²⁺进行。

在一些实施例中，所述测定是通过测量从哺乳动物所获得的脂肪细胞的葡萄糖摄取进行。

在某些实施例中，所述测定是通过使用黑素细胞分析进行。

在本发明的方法中，可进行对照反应以展示反应的特异性。举例而言，可将经模拟转染的细胞与经GPR43转染的细胞相比较以展示对GPR43受体反应的特异性。

在本发明的方法中，测定可包含第二信使分析。例如，可通过测量第二信使的含量来确定胞内信号的起始，所述第二信使诸如为环AMP(cAMP)、环GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰基甘油(DAG)、MAP激酶或钙。所属领域中众所周知用于测量这些第二信使的若干分析，例如cAMP分析、IP3分析、FLIPR分析、黑素细胞分析或CRE-报告基因分析。此外，在本文的实例6-11中公开第二信使分析的实例。在某些实施例中，所述第二信使为cAMP。在其它实施例中，所述第二信使为IP3。在其它实施例中，所述第二信使为钙。

本发明也涉及可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

举例而言，本发明提供可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

在一实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂。在一实施例中，所述代谢稳定化合物为GPR43拮抗剂。

在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至10μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至1μM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至100nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。在一些实施例中，所述代谢稳定化合物为IC50具有选自1nM至10nM的区间内的值的反向激动剂或拮抗剂。

此外，本发明涉及制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物可通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。举例而言，本发明提供制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物可通过以下方法鉴别：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明还提供医药组合物，其包含、基本上由或由可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

医药调配物、投药途径和剂量已于上文进行描述。

本发明提供治疗或预防有此需要的个体的代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据以下方法所鉴别的化合物：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一些实施例中，所述代谢相关病症包括高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一实施例中，所述代谢相关病症为II型糖尿病。在一实施例中，所投与的化合物包含GPR43反向激动剂或拮抗剂。

在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的医药组合物的组合，所述医药组合物包含、基本上由或由根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。举例而言，在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的含有GPR43反向激动剂的医药组合物的组合。

在一实施例中个体为哺乳动物，且在另一实施例中个体为人类。

尽管由本发明的方法所鉴别的化合物可如上文所述作为唯一的活性医药剂投与，但其也可与一种或一种以上药剂组合使用，所述药剂例如包括用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂。举例而言，诸如GPR43反向激动剂或拮抗剂的化合物可与一种或一种以上属于一类被称为α-葡糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、双胍、噻唑烷二酮、美格替耐、磺酰脲、胰岛素、HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、贝特类化合物、LDL分解代谢增强剂、血管收缩素转化酶(ACE)抑制剂、脂肪酶抑制剂、血清素和/或去甲肾上腺素释放剂或再摄取抑制剂的药物的药剂组合使用。

本发明的一些实施例包括医药组合物，其包含由本发明的方法鉴别的化合物或其医药学上可接受的盐与至少一种选自由下列各物组成的群组的成员的组合：α-葡糖苷酶抑制剂、醛糖还原酶抑制剂、双胍、HMG-CoA还原酶抑制剂、角鲨烯合成抑制剂、贝特类化合物、LDL分解代谢增强剂和血管收缩素转化酶抑制剂。在另一实施例中，HMG-CoA还原酶抑制剂是选自由普瓦他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀、氟伐他汀和利匹妥组成的群组。

本发明还提供制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用作代谢稳定化合物的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明进一步提供制造包含医药组合物的药物的方法，所述医药组合物包含、基本上由或由用于治疗代谢相关疾病的可根据以下方法鉴别的代谢稳定化合物组成：a)使候选化合物与GPR43接触，和b)测定GPR43功能性是否降低，其中GPR43功能性降低表明候选化合物是代谢稳定化合物。

本发明还涉及增加GPR43功能的方法，其包含使GPR43与有效量的GPR43激动剂接触。本发明还涉及增加细胞中GPR43功能的方法，其包含使表达GPR43的细胞与有效量的GPR43激动剂接触。细胞可例如在个体体内，或细胞可为已分离的细胞。在一些实施例中，所述激动剂为先前未知的当与GPR43受体结合时活化胞内反应的物质。

本发明还涉及降低GPR43功能的方法，其包含使GPR43与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂接触。本发明还涉及降低细胞内GPR43功能的方法，其包含使表达GPR43的细胞与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂接触。细胞可例如在个体体内，或细胞可为已分离的细胞。

本发明提供治疗或预防代谢相关病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43调节剂。

在一实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症或衰老。在一实施例中，所述调节剂为激动剂。在一些实施例中，所述激动剂为先前未知的当与GPR43受体结合时活化胞内反应的物质。

在一实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一些实施例中，所述代谢相关病症包括高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一实施例中，所述调节剂为反向激动剂或拮抗剂。在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。在一实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一实施例中，所述代谢相关病症为II型糖尿病。在一实施例中个体为哺乳动物，且在另一实施例中个体为人类。

本发明涉及治疗或预防可通过增加GPR43功能来治疗或预防的病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43激动剂。在一实施例中，所述病症为代谢相关病症。在一些实施例中，所述代谢相关病症为低血糖症或衰老。在一些实施例中，所述激动剂为先前未知的当与GPR43受体结合时活化胞内反应的物质。

本发明提供治疗或预防可通过降低GPR43功能来治疗或预防的病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂。在一实施例中，所述病症为代谢相关病症。在一实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。在一些实施例中，所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。在一实施例中，所述代谢相关病症为II型糖尿病。在一实施例中，所述方法进一步包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。在一实施例中个体为哺乳动物，且在另一实施例中个体为人类。

本发明还涉及增加有此需要的个体的血糖含量的方法，其包含向所述个体投与有效量的GPR43激动剂。本发明还涉及降低有此需要的个体的血糖含量的方法，其包含向所述个体投与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂。

此外，本发明涉及降低有此需要的个体的胰岛素分泌的方法，其包含向所述个体投与有效量的GPR43激动剂。

本发明的一个目的涉及以下方法：a)进行本发明的方法以鉴别代谢稳定化合物；和b)视情况，确定所述化合物的结构；和c)提供所述化合物或所述化合物的名称或结构。此外，本发明涉及以下方法：a)进行本发明的方法以鉴别代谢稳定化合物；和b)视情况，确定所述化合物的结构；c)视情况，提供所述化合物的名称或结构；和d)制造或合成所述化合物。本发明另外涉及调节GPCR的功能性的方法，其包含：进行本发明的方法以鉴别代谢稳定化合物，且随后在足以调节GPCR功能性的条件下，使GPCR与所述代谢稳定化合物接触或将所述代谢稳定化合物投与个体。

申请者保留从本发明的任何实施例中排除任一种或一种以上候选化合物的权利。申请者还保留从本发明的任何实施例中排除任一种或一种以上调节剂的权利。申请者另外还保留从本发明的任何实施例中排除任何聚核苷酸或多肽的权利。申请者另外还保留从本发明的任何实施例中排除任何代谢相关病症的权利。

所属领域技术人员基于对本专利文献的回顾将了解所公开的受体和方法的其它用途。

提供以下实例以说明本发明，且所述实例不打算以任何方式限制本发明：

实例

提供实例以进一步定义本发明，然而，所述实例不将本发明限于这些实例的细节。

实例1

小鼠成年和胎儿组织和细胞中小鼠GPR43表达的Affymetrix基因芯片分析

在本实例中，使用Affymetrix基因芯片测定若干小鼠成年和胎儿组织和细胞中小鼠GPR43的表达水平(由左至右为：胎脑、脑桥脊髓、下半部脊髓、SN脑桥丘脑(SN ponsthalamus)、嗅球、丘脑、海马区(hippocampus)、swiss-3T3、3T3-LI脂肪细胞、BV2+LPS 24hr、NIH-3T3、3T3-LI前脂肪细胞、NIT-1、分化的N1E-115、E14TG2A、BV2、N1E-115、BV2+LPS4hr、NIT CTL、C57BL6 ES、D3 ES、淋巴结、骨髓、T细胞、CD4+卵清蛋白、脾、T细胞、CD4+天然细胞、胸腺、十二指肠、皮肤脂肪、褐色脂肪、附睾脂肪、心室、心房、大动脉、纤维原细胞、新生儿心脏、心肌细胞、缺氧-再给氧(hypoxia-reoxyg)、新生儿、心肌细胞、常氧(normoxia)、新生儿、心肌细胞、心肌细胞、缺氧、新生儿、心室、左TAC、心室、左侧sham(left sham)、近侧大肠、胃糜(stomachfondues)、小肠、大肠末梢、胃窦、白血细胞、肝脏、肺、气管、唾液腺、骨、纤维原细胞、真皮、肾上腺、骨骼肌、皮肤、膀胱、皮肤、嘴、口腔粘膜、嘴、表皮、食道、肾、胆囊、β胰岛、ob/ob16 wk、β胰岛、ob/ob 6wk、MIN6、βTC6、β胰岛、C57B1/6、αTC9、β胰岛、db/db、子宫、脐带、卵巢)。

1.AFFYMETRIX GENECHIP技术

将与若干G蛋白偶合受体(GPCR)对应的核苷酸序列提交给Affymetrix。Affymetrix设计并制造出寡核苷酸微阵列以用于经由GeneChip技术测量在各种组织中这些受体的mRNA表达水平。扩增来自大量组织和细胞类型的RNA样本，标记，使其与微阵列杂交，并且根据制造商的说明分析数据。

如果表达指数大于50(基于并根据制造商的说明)，那么确定GPCR得到表达。分析数据，且数据表明，由于先前已报导神经元组织中所表达的大量已知GPCR具有大于50的表达指数，故以大于50的表达指数来分类GPCR是合理的。

使用GeneChip，申请者发现GPR43在脂肪、大肠、胰岛及胰岛细胞系和3T3脂肪细胞中具有高表达水平(参看图1)。

实例2

对于人类和小鼠组织和细胞中GPR43表达的RT-PCR分析

在本实例中，使用RT-PCR分析测定若干人类和小鼠组织和细胞类型中人类和小鼠GPR43的表达水平。如图2所示，在上图中，观察到若干人类组织和细胞中的人类GPR43基因表达，所述人类组织和细胞例如包括胎盘、肺、肝脏、肾、胰腺、脾、前列腺和白细胞。此外，如图2所示，在下图中，观察到若干小鼠组织、细胞和细胞系中的小鼠GPR43基因表达，所述小鼠组织、细胞和细胞系例如包括肺、胰腺、骨骼肌、小肠、脾、胃、胰岛3T3-L1分化脂肪细胞、Nit-1细胞、Min6细胞和βTC-6细胞。

就本实验而言，人类cDNA是从Human MTC Panel I和Human MTC Panel II(Clontech)获得。小鼠PolyA+RNA是从Clontech获得。随后，根据制造商的方案用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA。将1μl经1∶10稀释的小鼠PolyA+、8μl5×iScript反应混合物和2μliScript反转录酶连同水组合成40μl的总体积以用于反应。于PCR机器中执行反应：在25℃下执行5分钟；42℃下30分钟；85℃下5分钟。

使用Trizol分离细胞系RNA和小鼠胰岛RNA，并且根据制造商的方案使用无DNA试剂盒(Ambion)用DNA酶进一步进行处理。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)，使用40μl总反应体积的2μg经DNA酶处理的RNA。

用Invitrogen的Platinum PCR Supermix进行人类和小鼠GPR43的PCR反应。对于各反应而言，将2μl cDNA、48μl Supermix、0.2μl各引物(100μM储备液)组合成50μl的总体积。在PCR机器中进行人类GPR43的反应：在95℃下变性4分钟，随后进行30个以下循环：95℃下1分钟、60℃下30秒、72℃下1分钟，最后以在72℃下延长7分钟作为终止。小鼠GPR35所使用的退火温度为63℃。

由Clontech提供G3PDH 5′和3′PCR引物在Human MTC Panel I和II中作为对照。就G3PDH PCR反应而言，将2μl cDNA、45μl Platinum PCR Supermix(Invitrogen)、1μl各引物(10μM储备液)组合成50μl的总体积。在PCR机器中进行反应：在95℃变性1分钟，随后进行23个以下循环：95℃下30秒、68℃下3分钟，最后以在68℃下延长3分钟作为终止。

人类GPR43 RT-PCR引物对：

正向：5′-CTCTGGTGGCCTGGGTTATGTCCT-3′(SEQ IDNO：3)

反向：5′-CCTGCGCACCACTGAAGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO：4)

小鼠GPR43 RT-PCR引物对：

正向：5′-GTTATCCCGCCGGCCACTGTATG-3′(SEQ ID NO：5)

反向：5′-GCGCACCACGGAGGAGGAGAAG-3′(SEQ ID NO：6)

实例3

鉴别GPR43调节剂

在本实例中，使用筛检方案于黑素细胞中鉴别GPR43调节剂。

1.黑素细胞技术

黑素细胞是在低等脊椎动物体内发现的皮肤细胞。其含有被称为黑素体的着色细胞器。当G蛋白偶合受体(GPCR)活化时，黑素细胞能够使这些黑素体沿微管网络重新分布。这种色素移动的结果是可见的细胞变亮或变暗。在黑素细胞中，由Gi偶合受体活化所引起的胞内cAMP含量降低使得黑素体迁移到细胞中心，从而导致颜色显著变亮。如果Gs偶合受体活化后cAMP含量随后升高，那么黑素体再分散，且细胞再次变暗。由Gq偶合受体活化所引起的二酰基甘油含量的增加也可以诱导这种再分散。此外，所述技术也适用于研究某些受体酪氨酸激酶。黑素细胞的反应在受体活化后数分钟内发生，并且导致简单稳固的颜色改变。使用常规吸光度酶标仪(absorbance microplate reader)或适度视频成像系统(modest video imaging system)可轻易地检测所述反应。与其它皮肤细胞不同，黑素细胞是来源于神经嵴，并且似乎表达信号蛋白(signaling protein)的全长互补序列。具体说来，细胞表达广泛范围的G蛋白且因此能够功能性地表达几乎所有的GPCR。

可利用黑素细胞鉴别与GPCR结合和/或活化GPCR的化合物，包括天然配体。可通过引入能够对特定刺激物起反应而分散或聚集其色素并表达编码GPCR的外源克隆的色素细胞系的测试细胞来进行本方法。可使用例如褪黑激素、MSH或光来设置色素配置的起始状态。随后使测试细胞与化合物接触，并且测定细胞中的色素配置是否自色素配置的起始状态有所改变。由候选化合物(包括但不限于配体)偶合至GPCR而引起的色素细胞分散在培养皿(petri dish)上看起来较暗，而色素细胞聚集看起来较亮。

遵循美国专利第5,462,856号和美国专利第6,051,386号的公开内容中的材料和方法。这些专利的公开内容是以全文引用的方式并入本文中。

用含有小鼠或人类GPR43的编码序列的质粒通过电穿孔转染黑素细胞。将细胞涂在96孔板上。在转染后48小时，用10nM褪黑激素处理各培养板上的半数细胞。褪黑激素活化黑素细胞中的内源Gi偶合受体，并且使它们聚集其色素。将剩余的半数细胞转移到无血清培养基0.7×L-15(Gibco)中。1小时后，无血清培养基中的细胞保持色素分散状态，而经褪黑激素处理的细胞处于色素聚集状态。此时，用来自含有140,000-150,000种有机小分子化合物的专卖化合物文库的不同化合物处理细胞。如果GPR43与化合物结合，那么预期黑素细胞将经历颜色改变，例如这是由于对化合物起反应而引起的色素聚集。

实例4

口服葡萄糖耐受性测试

可于经口投与葡萄糖后测试GPR43调节剂(诸如激动剂、拮抗剂或反向激动剂)对血浆葡萄糖的影响。

举例而言，可使67天大的雄性C57bl/6小鼠禁食18小时，且将其随机分组以接收所选剂量的GPR43调节剂或媒剂(含有80％PEG、10％吐温80(Tween80)和10％乙醇的PET)。经由管饲针(gavage needle)经口传递GPR43调节剂(口服体积100μl)。投与GPR43调节剂或媒剂后30分钟，以3g/kg剂量经口向小鼠投与右旋糖。在若干时间点使用Glucometer Elite XL(Bayer)测定血糖含量。

也可以使用腹膜内传递葡萄糖来测试葡萄糖耐受性。举例而言，禁食18小时后，用100mg/kg的GPR43调节剂或PET媒剂处理68天大的雄性C57B1/6小鼠。投与GPR43调节剂或媒剂后30分钟，以2g/kg剂量经腹膜内向小鼠投与右旋糖。在所选时间点使用Glucometer Elite XL(Bayer)测定血糖含量。

实例5

3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取

在本实例中，使用³H-2-脱氧葡萄糖摄取分析测试GPR43调节剂对脂肪细胞中胰岛素刺激的葡萄糖摄取的影响。

简言之，首先使用标准方案使3T3-L1细胞分化成脂肪细胞(Patel和Lane， Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.96：1279-1284(1999))。随后用含有媒剂或5μM GPR43调节剂的无血清培养基刺激细胞三小时。随后于Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液中洗涤细胞两次，并且在存在或不存在10nM胰岛素的情况下，于Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液中培育20分钟。通过在37℃下将0.05mM(0.5μCi/mol)³H-2-脱氧葡萄糖和0.05mM冷2-脱氧葡萄糖加入细胞中历时5分钟来测量2-脱氧葡萄糖的转运。为终止转运反应，用冰冷的PBS洗涤细胞三次，并将其溶解于1％Triton-X中。通过闪烁计数测定溶解产物中的放射性含量。

实例6

用于确定GPCR活化的分析

可用多种方法评定人类GPCR的活化。下文具有说明性；相信所属领域技术人员将有能力确定那些优选有益于技术人员的需要的技术。

1.膜结合分析：[³⁵S]GTPγS分析：

当G蛋白偶合受体处于其活性状态时，由于配体结合或组成性活化，受体与G蛋白偶合并且刺激GDP释放和随后GTP与G蛋白的结合。G蛋白-受体复合物中的α亚单元充当GTP酶，并且缓慢地将GTP水解成GDP，此时受体通常失活。活化受体继续以GTP交换GDP。可利用不可水解的GTP类似物[³⁵S]GTPγS证实[³⁵S]GTPγS与表达活化受体的膜的结合的增强。使用[³⁵S]GTPγS结合测量活化的优势在于：(a)其一般适用于所有G蛋白偶合受体；(b)其接近膜表面从而使其不太可能提取影响胞内级联的分子。

所述分析利用G蛋白偶合受体刺激[³⁵S]GTPγS与表达相关受体的膜结合的能力。因此，所述分析可用于直接鉴别方法中以筛检内源GPCR和非内源组成性活化GPCR的候选化合物。所述分析为通用分析，并且可用于有关所有G蛋白偶合受体的药物发现中。

将[³⁵S]GTPγS分析物于20mM HEPES和1mM与约20mM之间的MgCl₂(为优化结果，可对所述量进行调节，但优选20mM)(pH7.4)、具有约0.3nM与约1.2nM之间的[³⁵S]GTPγS(为优化结果，可对所述量进行调节，但优选1.2nM)和12.5至75μg膜蛋白(例如表达GPR43的293细胞；为优化结果，可对所述量进行调节)和10μM GDP(为优化结果，可对所述量进行调节)的结合缓冲液中培育1小时。随后加入麦芽凝集素珠粒(25μl；Amersham)并且在室温下再培育混合物30分钟。随后在室温下以1500×g使管离心5分钟，且随后于闪烁计数器中进行计数。

2.腺苷酰基环化酶

可修饰针对基于细胞的分析而设计的Flash Plate^TM腺苷酰基环化酶试剂盒(NewEngland Nuclear；目录号SMP004A)以与粗原生质膜一起使用。Flash Plate的孔中可含有闪烁体涂层，所述涂层还含有识别cAMP的特异性抗体。可通过对放射性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合的直接竞争来量化所述孔中所产生的cAMP。下文是用作有关测量表达受体的全细胞中cAMP含量改变的简要方案。

瞬时转染后大约24小时，采集经转染的细胞。小心抽吸出培养基并丢弃。小心地将10ml PBS加入每一盘细胞中，随后小心抽吸。将1ml Sigma细胞解离缓冲液和3mlPBS加入每一培养板中。将细胞从培养板中吸出，并且将细胞悬浮液收集于50ml圆锥形离心管中。随后在室温下以1,100rpm离心细胞5分钟。小心地将细胞小球再悬浮于适当体积的PBS(每培养板约3ml)中。随后使用血球计对细胞进行计数，并且加入额外的PBS以得到适当数量的细胞(最终体积为每孔约50μl)。

根据制造商的说明书制备cAMP标准品和检测缓冲液(包含1μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP(50μl)的11ml检测缓冲液)并加以保存。新鲜制备分析缓冲液以供筛检，且其含有50μl刺激缓冲液、3μl候选化合物(12μM最终分析浓度)和50μl细胞。将分析缓冲液储存于冰上待用。通过将50μlcAMP标准品加入适当的孔中随后将50μl PBSA加入孔H11和H12中来起始优选在例如96孔板中进行的分析。将50μl刺激缓冲液加入所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针具(pin tool)将DMSO(或所选候选化合物)加入适当孔中，其中具有12μM候选化合物的最终分析浓度和100μl的总分析体积。随后将细胞加入孔中，并在室温下培育60分钟。随后将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合物加入孔中。随后再培育培养板2小时，随后于Wallac MicroBeta闪烁计数器中进行计数。然后由标准cAMP曲线外推每一分析培养板中所含的每孔cAMP值。

3.有关Gi偶合目标GPCR的基于细胞的cAMP分析

TSHR为活化时引起cAMP积累的Gs偶合GPCR。可通过使氨基酸残基623突变(意即，将丙氨酸残基改变成异亮氨酸残基)来组成性活化TSHR。预期Gi偶合受体将抑制腺苷酰基环化酶，且因此降低cAMP产生水平，可由此对cAMP含量激发进行评定。通过使作为“信号增强子”的非内源组成性活化TSHR(TSHR-A623I)(或内源性组成性活性Gs偶合受体)与Gi连接的目标GPCR共转染以建立cAMP的基线含量，来实现用于测量作为Gi偶合受体活化的指标的cAMP产量降低的有效技术。产生内源或非内源型式的Gi偶合受体后，然后使目标GPCR与信号增强子共转染，并且可将所述材料用于筛检。在一些实施例中，优选将这一方法用于直接鉴别Gi偶合受体的候选化合物。应注意，对于Gi偶合GPCR而言，当使用本方法时，目标GPCR的反向激动剂将增加cAMP信号，而激动剂将减少cAMP信号。

第一天时，将板涂成每孔2×10⁴个293细胞。第二天时，制备两个反应管(每一管遵循的比例是对于每一培养板而言)：管A是通过在1.2ml无血清DMEM(IrvineScientific，Irvine，CA)中混合2μg转染到哺乳动物细胞中的每一受体的DNA(共4μgDNA(例如，pCMV载体；具有突变THSR(TSHR-A623I)的pCMV载体；TSHR-A623I和GPCR等))来制备；管B是通过在1.2ml无血清DMEM中混合120μl Lipofectamine(Gibco BRL)来制备。随后通过倒转(数次)使管A和B混合，随后在室温下培育30-45分钟。所述混合物被称为“转染混合物”。用1×PBS洗涤所涂布的293细胞，随后加入10ml无血清DMEM。然后将2.4ml转染混合物加入细胞中，随后在37℃/5％CO₂下培育4小时。然后通过抽吸移除转染混合物，随后加入25ml DMEM/10％胎牛血清。随后在37℃/5％CO₂下培育细胞。24小时培育后，采集细胞并将其用于分析。

设计Flash Plate^TM腺苷酰基环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)以供基于细胞的分析，但视所属领域技术人员的需要可对其进行修饰以与粗原生质膜一起使用。Flash Plate的孔中含有闪烁体涂层，所述涂层还含有识别cAMP的特异性抗体。可通过对放射性cAMP示踪剂与cAMP抗体的结合的直接竞争来量化所述孔中所产生的cAMP。下文是用作有关测量表达所关注的受体的全细胞中cAMP含量改变的简要方案。

根据制造商的说明书制备cAMP标准品和检测缓冲液(包含1μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP(50μl)的11ml检测缓冲液)并加以保存。应新鲜制备分析缓冲液以供筛检，且其含有50μl刺激缓冲液、3μl候选化合物(12μM最终分析浓度)和50μl细胞。将分析缓冲液储存于冰上待用。可通过将50μl cAMP标准品加入适当孔中随后将50μl PBSA加入孔H11和H12中来起始分析。将50μl刺激缓冲液加入所有孔中。使用能够分配3μl化合物溶液的针具将所选化合物(例如TSH)加入适当孔中，其中具有12μM候选化合物的最终分析浓度和100μl的总分析体积。随后将细胞加入孔中，并在室温下培育60分钟。随后将100μl含有示踪剂cAMP的检测混合物加入孔中。随后再培育培养板2小时，随后于Wallac MicroBeta闪烁计数器中进行计数。由每一分析培养板中所含的标准cAMP曲线外推每孔cAMP值。

4.基于报告基因的分析

a.CRE-LUC报告基因分析(Gs相关受体)

以每孔2×10⁴个细胞的密度将293或293T细胞涂布于96孔培养板上，并且根据制造商的说明书于次日使用Lipofectamine试剂(BRL)进行转染。如下制备用于每六孔转染的DNA/脂质混合物：小心地使100μl DMEM中的260ng质粒DNA与100μl DMEM中的2μl脂质混合(260ng质粒DNA是由200ng8×CRE-Luc报告基因质粒、50ng包含内源受体或非内源受体的pCMV或单独pCMV和10ng GPRS表达质粒(pcDNA3中的GPRS(Invitrogen))组成)。如下制备8×CRE-Luc报告基因质粒：通过在pβgal-Basic载体(Clontech)中的BglV-HindIII位点处克隆大鼠生长激素抑制素启动子(-71/+51)来获得载体SRIF-β-gal。通过PCR由腺病毒模板AdpCF126CCRE8获得八(8)个cAMP反应元件的拷贝(参看Suzuki等人， Hum Gene Ther7：1883-1893(1996)，其公开内容以全文引用的方式并入本文中)，并且将其克隆至SRIF-β-gal载体的Kpn-BglV位点处，从而产生8×CRE-β-gal报告基因载体。通过用自pGL3-basic载体(Promega)获得的荧光素酶基因在HindIII-BamHI位点处置换8×CRE-β-gal报告基因载体中的β-半乳糖苷酶基因来产生8×CRE-Luc报告基因质粒。室温下培育30分钟后，用400μl DMEM稀释DNA/脂质混合物，并且将100μl经稀释的混合物加入每一孔中。在细胞培养恒温箱中培育4小时后，将100μl具有10％FCS的DMEM加入每一孔中。次日，用每孔200μl具有10％FCS的DMEM交换经转染细胞。八(8)小时后，用PBS洗涤一次，随后将孔换成每孔100μl无酚红的DMEM。次日，遵循制造商的说明书，使用LucLite^TM报告基因分析试剂盒(Packard)测量荧光素酶活性，且于1450 MicroBeta^TM闪烁和发光计数器(Wallac)上读取。

b.AP1报告基因分析(Gq相关受体)

检测Gq刺激的方法取决于Gq依赖性磷脂酶C使在启动子中含有AP1元件的基因活化的已知特性。遵循上文有关CREB报告基因分析所述的方案，可利用Pathdetect^TMAP-1顺式报告系统(Stratagene，目录号219073)，但是磷酸钙沉淀物的组份为410ngpAP1-Luc、80ng pCMV受体表达质粒和20ng CMV-SEAP。

c.SRF-LUC报告基因分析(Gq相关受体)

一种检测Gq刺激的方法取决于Gq依赖性磷脂酶C使在启动子中含有血清反应因子的基因活化的已知特性。可利用Pathdetect^TM SKF-Luc-报告系统(Stratagene)分析例如COS7细胞中的Gq偶合活性。根据制造商的说明书，使用Mammalian Transfection^TM试剂盒(Stratagene，目录号200285)以系统的质粒组份和编码内源或非内源性GPCR的指定表达质粒转染细胞。简言之，根据制造商的说明书，使410ng SRF-Luc、80ngpCMV受体表达质粒和20ng CMV-SEAP(经分泌的碱性磷酸酶表达质粒；测量经转染细胞的培养基中的碱性磷酸酶活性以控制样本之间的转染效率变化)组合于磷酸钙沉淀物中。将一半沉淀物均等地分布于96孔板中的3个孔上，并且在无血清培养基中的细胞上保持24小时。在最后5小时将细胞与例如1μM候选化合物一起培育。随后溶解细胞，并根据制造商的说明书使用Luclite^TM试剂盒(Packard，目录号6016911)和“Trilux1450 Microbeta”液体闪烁和发光计数器(Wallac)分析荧光素酶活性。可使用GraphPadPrism^TM 2.0a(GraphPad Software Inc.)分析数据。

d.胞内IP3积累分析(Gq相关受体)

第1天时，可将包含所关注的受体(内源或非内源)的细胞涂于24孔板上，通常为每孔1×10⁵个细胞(但可以使这一数量优化)。第2天时，通过首先使每孔50μl无血清DMEM中的25μg DNA与每孔50μl无血清DMEM中的2μl Lipofectamine混合来转染细胞。小心地混合溶液，且在室温下培育15-30分钟。用0.5 mlPBS洗涤细胞，并使400μl无血清培养基与转染培养基混合，且将其加入细胞中。随后在37℃/CO₂下培育细胞3-4小时，且随后移除转染培养基并以每孔1ml常规生长培养基替换。第3天时，以³H-肌醇标记细胞。简言之，移除培养基，并用0.5ml PBS洗涤细胞。随后，每孔加入0.5ml无肌醇/无血清培养基(GIBCO BRL)和每孔0.25μCi³H-肌醇，并且在37℃/5％CO₂下培育细胞16-18小时整夜。第4天时，如果使用含有血清素受体的对照构筑体，那么用0.5ml PBS洗涤细胞，并加入0.45ml含有无肌醇/无血清培养基、10μM帕吉林(pargyline)、10mM氯化锂的分析培养基，或0.4ml分析培养基和50μl10×酮舍林(ketanserin，ket)至10μM的最终浓度。随后在37℃下培育细胞30分钟。随后用0.5mlPBS洗涤细胞，并且每孔加入200μl新制/冰冷的终止溶液(1M KOH；18mM硼酸钠；3.8mM EDTA)。在冰上保持溶液5-10分钟或直到细胞溶解，且接着以200μl新制/冰冷的中和溶液(7.5％HCl)中和。随后将溶解产物转移到1.5ml eppendorf管中，并且每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。涡旋溶液15秒，并将上层相施加至Biorad AG1-X8^TM阴离子交换树脂(100-200目)中。首先，用水以1∶1.25 W/V洗涤树脂，并将0.9ml上层相装载于柱上。用10ml5mM肌醇和10ml5mM硼酸钠/60mM甲酸钠洗涤柱。将三磷酸肌醇洗提到含有10ml闪烁混合液(scintillation cocktail)的闪烁瓶中，所述闪烁混合液含有2ml 0.1M甲酸/1M甲酸铵。通过用10ml 0.1M甲酸/3 M甲酸铵洗涤使柱再生，并用双蒸水冲洗两次，并且在4℃下储存于水中。

实例7

融合蛋白的制备

a.GPCR：Gs融合构筑体

可如下实现对GPCR-G蛋白融合构筑体的设计：基因工程设计大鼠G蛋白Gsα(长形式；Itoh，H等人， Proc.Natl.Acad.Sci.83：3776(1986))的5′和3′端以于其上包括HindIII序列。在确定正确序列(包括侧接HindIII序列)后，通过使用所述载体的HindIII限制性位点进行亚克隆而使完整序列穿梭于pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目录号V795-20)中。在亚克隆到pcDNA3.1(-)中之后，确定Gsα序列的正确定向。随后验证在HindIII序列处含有大鼠Gsα基因的经修饰pcDNA3.1(-)，所述载体现可作为“通用”Gsα蛋白载体使用。pcDNA3.1(-)载体在HindIII位点上游含有多种众所周知的限制性位点，因此有益地提供于Gs蛋白的上游插入所关注的受体的编码序列的能力。可利用这种相同方法产生其它“通用”G蛋白载体，当然，所属领域技术人员已知的其它市面有售或专卖载体也可加以利用-重要标准在于GPCR序列是在G蛋白上游且与G蛋白的GPCR序列同框。

b.Gq(6个氨基酸缺失)/Gi融合构筑体

可如下实现对Gq(del)/Gi融合构筑体的设计：缺失Gαq亚单元的N末端六(6)个氨基酸(氨基酸2至7，具有序列TLESIM(SEQ ID NO：7))且用Gαi蛋白中具有序列DCGLF(SEQ ID NO：9)的相应氨基酸置换具有序列EYNLV(SEQ ID NO：8)的C末端五(5)个氨基酸。使用下述引物和作为模板的质粒63313，可通过PCR获得这一融合构筑体：

5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ ID NO：10)和

5′gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-

3′(SEQ ID NO：11)，

所述质粒63313含有具有血球凝集素标签的小鼠Gαq野生型型式。包括小写形式的核苷酸作为间隔部分。

可利用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)通过下述循环进行扩增，其中步骤2至4重复35次：95℃下2分钟；95℃下20秒；56℃下20秒；72℃下2分钟；和72℃下7分钟。可将PCR产物克隆到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中，并使用ABI BigDye Terminator试剂盒(P.E.Biosystems)测序。可通过两步克隆方法使含有融合构筑体序列的来自TOPO克隆的插入物穿梭于表达载体pcDNA3.1(+)中的HindIII/BamHI位点处。另外参看2002年9月6日作为WO02068600公开的PCT申请案第PCT/US02/05625号，其公开内容以全文引用的方式并入本文中。

实例8

[³⁵S]GTPγS分析

A.膜制备

在一些实施例中，包含用于鉴别候选化合物(例如作为激动剂、反向激动剂或拮抗剂)的所关注的目标GPCR的膜制备如下：

a.材料

“膜刮擦缓冲液(Membrane Scrape Buffer)”包含20mM HEPES和10mM EDTA(pH 7.4)；“膜洗涤缓冲液(Membrane Wash Buffer)”包含20mM HEPES和0.1mMEDTA(pH 7.4)；“结合缓冲液”包含20mM HEPES、100mM NaCl和10mM MgCl₂(pH7.4)。

b.程序

在整个程序中始终将所有材料保持于冰上。首先，自长满的单层细胞中抽吸培养基，随后用10ml冷PBS冲洗，接着进行抽吸。此后，加入5ml膜刮擦缓冲液以刮擦细胞；随后将细胞提取物转移到50ml离心管中(4℃下以20,000rpm离心17分钟)。此后，抽吸出上清液，并将离心块再悬浮于30ml膜洗涤缓冲液中，随后在4℃下以20,000rpm离心17分钟。接着抽吸出上清液，并将离心块再悬浮于结合缓冲液中。随后使用BrinkmanPolytron^TM匀浆器进行均质化(15-20秒冲撞，直到所有材料都呈悬浮液形式)。其在本文中被称为“膜蛋白”。

Bradford蛋白分析

均质化后，使用Bradford蛋白分析测定膜蛋白浓度(可将蛋白稀释到约1.5mg/ml，等分并冷冻(-80℃)以供以后使用；当冷冻时，所使用的方案如下：分析当天，在室温下解冻已冷冻的膜蛋白，随后涡旋，然后用Polytron以12×1,000rpm均质化约5-10秒；应注意，为进行多次制备，应在不同制备的均质化之间彻底清洁匀浆器)。

a.材料

遵循制造商的说明书(Biorad，目录号500-0006)，利用结合缓冲液(根据上文)、Bradford染料试剂、Bradford蛋白标准品。

b.程序

制备双重复管，一只管包括膜且另一只作为对照“空白”。每一管都含有800μl结合缓冲液。此后，将10μl Bradford蛋白标准品(1mg/ml)加入每一管中，且随后将10μl膜蛋白仅加至一个管中(非空白管)。此后，将200μl Bradford染料试剂加入每一管中，随后各自涡旋。五(5)分钟后，将管再涡旋，且将其中的物质转移到比色皿中。使用CECIL 3041分光光度计于595波长下读取比色皿。

鉴别分析

a.材料

GDP缓冲液是由37.5ml结合缓冲液和2mg GDP(Sigma，目录号G-7127)组成，随后在结合缓冲液中进行一系列稀释以获得0.2μM GDP(每一孔中GDP的最终浓度都为0.1μM GDP)；包含候选化合物的每一孔中具有200μl最终体积，其是由100μl GDP缓冲液(最终浓度：0.1μM GDP)、50μl结合缓冲液中的膜蛋白和50μl结合缓冲液中的[³⁵S]GTPγS(0.6 nM)(每10ml结合缓冲液2.5μl[³⁵S]GTPγS)组成。

b.程序

可使用96孔板格式筛检候选化合物(其可在-80℃下冷冻)。短暂地使膜蛋白(或具有排除目标GPCR的表达载体的膜，其作为对照物)均质化直到呈悬浮液形式。使用上文所述的Bradford蛋白分析测定蛋白浓度。于结合缓冲液(最终分析浓度为每孔12.5μg)中将膜蛋白(和对照物)稀释到0.25mg/ml。此后，将100μlGDP缓冲液加入WallacScintistrip^TM(Wallac)的每一孔中。使用5μl针具将5μl候选化合物转移到所述孔中(意即，200μl总分析体积中的5μl为1∶40的比率，使得候选化合物的最终筛检浓度为10μM)。同样，为避免污染，在每次转移步骤后，应在包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×)的三个贮液器中冲洗针具，每次冲洗后都应将过量的液体从针具中摇出，并用纸和无尘纸(kimwipe)干燥。此后，将50μl膜蛋白加入每一孔中(也利用包含膜但无目标GPCR的对照孔)，并在室温下预培育5-10分钟。此后，将50μl结合缓冲液中的[³⁵S]GTPγS(0.6nM)加入每一孔中，随后在室温下于振荡器上培育60分钟(培养板覆盖有箔)。随后，通过在22℃下以4000RPM旋转培养板15分钟来终止分析。用8通道歧管抽吸培养板，并用培养板盖密封。于Wallac1450上使用设置“Prot.#37”对培养板进行读数(根据制造商的说明书)。

实例9

环AMP分析

可通过利用基于环化酶的分析来实现鉴别候选化合物(例如作为激动剂、反向激动剂或拮抗剂)的另一分析方法。除直接鉴别外，还可以利用本分析方法作为独立方法以证实如上述实例所述的[³⁵S]GTPγS方法的结果。

根据以下方案，可将经修饰的Flash Plate^TM腺苷酰基环化酶试剂盒(New EnglandNuclear；目录号SMP004A)用于直接鉴别作为所关注受体的反向激动剂和拮抗剂的候选化合物。

转染后大约3天时采集经转染细胞。通过于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mMMgCl₂的缓冲液中均质化悬浮细胞来制备膜。使用Brinkman Polytron^TM于冰上进行均质化历时大约10秒。在4℃下以49,000×g离心所得匀浆15分钟。随后将所得离心块再悬浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和0.1mM EDTA的缓冲液中，均质化10秒，随后在4℃下以49,000×g离心15分钟。然后将所得离心块储存于-80℃下待用。在直接鉴别筛检当天，于室温下缓慢解冻膜小球，将其再悬浮于含有20mM HEPES(pH7.4)和10mM MgCl₂的缓冲液中以得到0.60mg/ml的最终蛋白浓度(将再悬浮的膜放于冰上待用)。

根据制造商的说明书，制备cAMP标准品和检测缓冲液(包含2μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP(100μl)的11ml检测缓冲液)并加以保存。新鲜制备分析缓冲液以供筛检，且其含有20mM HEPES(pH 7.4)、10 mM MgCl₂、20mM磷酸肌酸(phospocreatine)(Sigma)、0.1单位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；随后将分析缓冲液储存于冰上待用。

将候选化合物连同40μl膜蛋白(每孔30μg)和50μl分析缓冲液加入(例如)96孔板的孔中(每孔3μl；12μM的最终分析浓度)。随后，在轻柔振荡下，于室温下培育所述混合物30分钟。

培育后，将100μl检测缓冲液加入每一孔中，随后培育2-24小时。于WallacMicroBeta^TM读板器中使用“Prot.#31”对培养板进行计数(根据制造商的说明书)。

实例10

测量胞内钙浓度的荧光成像读板器(FLIPR)分析

将来自各别克隆系的经目标受体(实验性)和pCMV(阴性对照)稳定转染的细胞以每孔5.5×10⁴个细胞接种至经聚-D-赖氨酸预处理的具有完全培养基(具有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的DMEM)的96孔板(Becton-Dickinson，#356640)中。由于GPR43与Gαq(一种混杂G蛋白，诸如Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα)偶合，故无需亚单元来引起可检测的钙流。为制备Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培育缓冲液储备液，将1mg Fluo4-AM溶解于467μl DMSO和467μl泊洛尼克酸(Pluoronicacid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到1mM储备液，其可在-20℃下储存一个月。Fluo4-AM为荧光钙指示剂染料。

于洗涤缓冲液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES(pH7.4))中制备候选化合物。

分析时，将培养基从孔中移除，并以100μl的4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培养基(pH 7.4)装载细胞。在37℃/5％CO₂下进行培育60分钟。

培育1小时后，移除Fluo4-AM培育缓冲液，并用100μl洗涤缓冲液洗涤细胞2次。于每一孔中留下100μl洗涤缓冲液。将培养板放回37℃/5％CO₂下恒温箱中培育60分钟。

对FLIPR(荧光成像读板器；Molecular Device)设定程序以于第30秒时加入50μl候选化合物，并且记录由候选化合物所引起的胞内钙浓度([Ca²⁺])瞬时改变，再历时150秒。使用FLIPR软件，使用总荧光改变数来确定激动剂活性。仪器软件使荧光读数标准化以得到零点处的等效初始读数。

尽管上文提供使用经稳定转染的细胞进行的有关激动剂活性的FLIPR分析，但所属领域技术人员将能够容易地对所述分析进行修改以便表征拮抗剂活性。所述所属领域技术人员也将容易地了解，可替代性地使用经瞬时转染的细胞。

实例11

MAP激酶分析

可对MAP激酶(丝裂原活化激酶)进行监测以评估受体活化。可由若干种方法对MAP激酶进行检测。一种方法是基于对磷酸化状态的评估，即未磷酸化状态(非活性)或经磷酸化状态(活性)。经磷酸化的蛋白在SDS-PAGE中具有较慢迁移率，且因此可以使用Western印迹法将其与未经刺激的蛋白相比较。或者，可使用对经磷酸化的蛋白具特异性的抗体(New England Biolabs)，其可用于检测经磷酸化激酶的增加。在任一方法中，细胞都经候选化合物刺激且随后经Laemmli缓冲液提取。将可溶部分施加于SDS-PAGE凝胶上，并且以电泳法将蛋白转移到硝酸纤维素或Immobilin中。以标准Western印迹技术检测免疫反应带。将可见或化学发光信号记录于薄膜上，并且可以通过光密度分析法进行量化。

另一种方法是基于经由磷酸化分析评估MAP激酶活性。用候选化合物刺激细胞，并且制备可溶提取物。在30℃下将提取物与γ-³²P-ATP、ATP再生系统和MAP激酶的特异性底物(诸如由胰岛素调控的经磷酸化的热稳定和酸稳定蛋白或PHAS-I)一起培育10分钟。通过加入H₃PO₄终止反应，并且将样本转移到冰上。将等分试样点渍于保留磷酸化蛋白的Whatman P81色谱纸上。洗涤色谱纸并用液体闪烁计数器对³²P进行计数。或者，将细胞提取物与γ-³²P-ATP、ATP再生系统和通过链亲和素(streptavidin)结合至过滤器载体的生物素标记的髓鞘碱性蛋白一起培育。髓鞘碱性蛋白为活性MAP激酶的底物。在30℃下进行磷酸化反应10分钟。随后，可经由过滤器抽吸提取物，所述过滤器保留经磷酸化的髓鞘碱性蛋白。洗涤过滤器，并通过液体闪烁计数对³²P进行计数。

实例12

受体结合分析

除本文所述的方法外，另一种用于评估候选化合物的方式是通过测定与GPR43受体的结合亲和性。这类分析通常需要GPR43受体的经放射性标记的配体。除使用GPR43受体的已知配体和其放射性标记外，还可以用放射性同位素标记GPR43激动剂化合物，并且将其用于评估候选化合物与GPR43受体的亲和性的分析中。

可在筛检分析中使用经放射性标记的GPR43化合物(诸如GPR43激动剂)以鉴别/评估化合物。一般说来，可以评估新近合成或鉴别的化合物(意即，候选化合物)降低经放射性标记的GPR43激动剂与GPR43受体结合的能力。因此，与经放射性标记的GPR43激动剂竞争结合GPR43受体的能力与候选化合物与GPR43受体的结合亲和性直接相关。

有关测定GPR43受体结合的分析方案：

A.GPR43受体制备

举例而言，可用如本文所述的GPR43瞬时或稳定转染HEK293细胞(人肾细胞，ATCC)。举例而言，可用10μg人类GPR43受体和60μl Lipofectamine(每15cm盘)瞬时转染293细胞，并且随着培养基的改变使其在所述盘中生长24小时(75％融合)。用每盘10ml Hepes-EDTA缓冲液(20mM Hepes+10mM EDTA(pH7.4))移除细胞。随后在Beckman Coulter离心机中以17,000rpm(JA-25.50型转子)离心细胞20分钟。随后将离心块再悬浮于20mM Hepes+1mM EDTA(pH7.4)中，并用50ml Dounce匀浆器进行均质化且再次离心。移除上清液后，将离心块储存于-80℃下直到用于结合分析。当用于分析时，于冰上解冻膜20分钟，且随后加入10ml培育缓冲液(20mM Hepes，1mM MgCl₂，100mM NaCl，pH7.4)。然后涡旋膜以再悬浮粗制膜离心块，并用BrinkmannPT-3100 Polytron匀浆器以设置6进行均质化15秒。使用BRL Bradford蛋白分析测定膜蛋白的浓度。

B.结合分析

对于总体结合而言，将50μl总体积经适当稀释的膜(在含有50 mM Tris HCl(pH7.4)、10 mM MgCl₂和1 mM EDTA的分析缓冲液中进行稀释；5-50μg蛋白)加入96孔聚丙烯微量滴定盘中，随后加入100μl分析缓冲液和50μl经放射性标记的GPR43激动剂。对于非特异性结合而言，加入50μl而非100μl分析缓冲液，并且再加入50μl10μM冷GPR43，随后加入50μl经放射性标记的GPR43激动剂。然后在室温下培育培养板60-120分钟。通过使分析板滤过具有Brandell 96孔板收集器的Microplate DevicesGF/C Unifilter过滤板来终止反应，随后用含有0.9％NaCl的冷50mM Tris HCl(pH 7.4)洗涤。然后密封过滤板底部，将50μl Optiphase Supermix加入每一孔中，密封板顶部，且于Trilux MicroBeta闪烁计数器中对板进行计数。对于化合物竞争研究而言，将100μl经适当稀释的候选化合物加入适当孔中，而非加入100μl分析缓冲液，随后加入50μl经放射性标记的GPR43激动剂。

C.计算

起初分析1μM和0.1μM的候选化合物，且随后分析经选择使得中间剂量引起对经放射性标记的GPR43激动剂结合约50％抑制(意即，IC₅₀)的浓度范围内的候选化合物。在不存在候选化合物的情况下特异性结合(B_o)为总结合(B_T)减去非特异性结合(NSB)的差，且类似地，特异性结合(在候选化合物存在下)(B)为移位结合(displacementbinding)(B_D)减去非特异性结合(NSB)的差。由抑制反应曲线(即B/B_o％比候选化合物浓度的logit-log图)确定IC₅₀。

K_i是通过Cheng和Prustoff转换来计算：

K_i＝IC₅₀/(l+[L]/K_D)，

其中[L]为分析中所使用的经放射性标记的GPR43激动剂的浓度，且K_D为在相同结合条件下独立测定的经放射性标记的GPR43激动剂的解离常数。

实例13

啮齿动物糖尿病模型

已研发与肥胖症和胰岛素抵抗相关的II型糖尿病啮齿动物模型。已研发诸如小鼠db/db和ob/ob[参看Diabetes(1982)31：1-6]和Zucker大鼠fa/fa的遗传模型以了解疾病的病理生理学并测试候选治疗性化合物[Diabetes(1983)32：830-838；Annu Rep Sankyo ResLab(1994)46：1-57]。Jackson Laboratory所研发的纯合动物C57 BL/KsJ-db/db小鼠的特征在于肥胖、高血糖、胰岛素过多和胰岛素抵抗[J Clin Invest(1990)85：962-967]，而杂合动物的特征在于体瘦和血糖量正常。在db/db模型中，小鼠随年龄增长逐渐发展成胰岛素贫乏症(insulinopenia)，即一种当不足以控制糖含量时通常于晚期人类II型糖尿病中观察到的特征。由于这一模型类似于人类II型糖尿病的模型，故对本发明的代谢稳定化合物的活性(包括但不限于降低血浆葡萄糖和甘油三酯)进行测试。Zucker(fa/fa)大鼠的特征在于严重肥胖、胰岛素过多和胰岛素抵抗{Coleman，Diabetes(1982)31：1；EShafrir in Diabetes Mellitus，H Rifkin和D Porte，Jr编辑[Elsevier Science Publishing Co，New York，第4版，(1990)，第299-340页]}，且fa/fa突变可为鼠类db突变的大鼠等效物[Friedman等人，Cell(1992)69：217-220；Truett等人，Proc Natl Acad Sci USA(1991)88：7806]。Tubby(tub/tub)小鼠的特征在于肥胖、中度胰岛素抵抗和胰岛素过多，而无显著的高血糖[Coleman等人，Heredity(1990)81：424]。

本发明涵盖使用本发明的化合物降低上述啮齿动物糖尿病模型、患有II型糖尿病或前文所述的其它优选代谢相关病症或脂质代谢病症的人类或基于其它动物的模型中任一者或全部的胰岛素抵抗和高血糖。可测试血浆葡萄糖和胰岛素含量以及包括(但不限于)血浆游离脂肪酸和甘油三酯的其它因素。

有关本发明化合物的抗高血糖活性的体内分析

在标准实验室条件下，于22℃和50％相对湿度下，圈养遗传性改变的肥胖糖尿病小鼠(db/db)(雄性，7-9周大)(每笼7-9只小鼠)，并让其随意进食Purina啮齿动物食品和水。治疗前，从每一动物的尾静脉收集血液，并使用One Touch Basic葡萄糖监测系统(Lifescan)测定血糖浓度。使用血浆葡萄糖含量介于250至500mg/dl之间的小鼠。每一治疗组都是由经分配使得每一组在研究开始时平均葡萄糖含量都相等的若干只小鼠组成，通过使用异氟烷麻醉(isoflurane anesthesia)插入的微渗透压泵对db/db小鼠给药以对所述小鼠皮下提供本发明的化合物、生理食盐水或不相关的化合物。此后，以一定间隔自尾静脉采血样，并分析血糖浓度。使用Student t检定评估群组之间的显著差异(将本发明的化合物与经生理食盐水治疗者相比较)。

上文是以说明而非限制的方式提供。其它说明性II型糖尿病啮齿动物模型已加以描述[Moller DE，Nature(2001)414：821-7和其中的参考文献；和Reed MJ等人，Diabetes，Obesity and Metabolism(1999)1：75-86和其中的参考文献；其各自的公开内容都是以全文引用的方式并入本文]。

所属领域技术人员将认识到，在不偏离本发明精神的情况下可对本文所述的说明性实例进行多种修改、添加、取代和变化，且因此认为所述修改、添加、取代和变化是处于本发明的保护范围内。上文所参考的所有文献(包括(但不限于)印刷出版物和临时专利申请案和正式专利申请案)都是以全文引用的方式并入本文中。

序列表

<110>艾尼纳制药公司

<120>治疗代谢相关病症的GPR43和其调节剂

<130>82.wol

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>993

<212>DNA

<213>智人

<400>1

atgctgccgg actggaagag ctccttgatc ctcatggctt acatcatcat cttcctcact 60

ggcctccctg ccaacctcct ggccctgcgg gcctttgtgg ggcggatccg ccagccccag 120

cctgcacctg tgcacatcct cctgctgagc ctgacgctgg ccgacctcct cctgctgctg 180

ctgctgccct tcaagatcat cgaggctgcg tcgaacttcc gctggtacct gcccaaggtc 240

gtctgcgccc tcacgagttt tggcttctac agcagcatct actgcagcac gtggctcctg 300

gcgggcatca gcatcgagcg ctacctggga gtggctttcc ccgtgcagta caagctctcc 360

cgccggcctc tgtatggagt gattgcagct ctggtggcct gggttatgtc ctttggtcac 420

tgcaccatcg tgatcatcgt tcaatacttg aacacgactg agcaggtcag aagtggcaat 480

gaaattacct gctacgagaa cttcaccgat aaccagttgg acgtggtgct gcccgtgcgg 540

ctggagctgt gcctggtgct cttcttcatc cccatggcag tcaccatctt ctgctactgg 600

cgttttgtgt ggatcatgct ctcccagccc cttgtggggg cccagaggcg gcgccgagcc 660

gtggggctgg ctgtggtgac gctgctcaat ttcctggtgt gcttcggacc ttacaacgtg 720

tcccacctgg tggggtatca ccagagaaaa agcccctggt ggcggtcaat agccgtggtg 780

ttcagttcac tcaacgccag tctggacccc ctgctcttct atttctcttc ttcagtggtg 840

cgcagggcat ttgggagagg gctgcaggtg ctgcggaatc agggctcctc cctgttggga 900

cgcagaggca aagacacagc agaggggaca aatgaggaca ggggtgtggg tcaaggagaa 960

gggatgccaa gttcggactt cactacagag tag 993

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Leu Pro Asp Trp Lys Ser Ser Leu Ile Leu Met Ala Tyr Ile Ile

1 5 10 15

Ile Phe Leu Thr Gly Leu Pro Ala Asn Leu Leu Ala Leu Arg Ala Phe

20 25 30

Val Gly Arg Ile Arg Gln Pro Gln Pro Ala Pro Val His Ile Leu Leu

35 40 45

Leu Ser Leu Thr Leu Ala Asp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Pro Phe

50 55 60

Lys Ile Ile Glu Ala Ala Ser Asn Phe Arg Trp Tyr Leu Pro Lys Val

65 70 75 80

Val Cys Ala Leu Thr Ser Phe Gly Phe Tyr Ser Ser Ile Tyr Cys Ser

85 90 95

Thr Trp Leu Leu Ala Gly Ile Ser Ile Glu Arg Tyr Leu Gly Val Ala

100 105 110

Phe Pro Val Gln Tyr Lys Leu Ser Arg Arg Pro Leu Tyr Gly Val Ile

115 120 125

Ala Ala Leu Val Ala Trp Val Met Ser Phe Gly His Cys Thr Ile Val

130 135 140

Ile Ile Val Gln Tyr Leu Asn Thr Thr Glu Gln Val Arg Ser Gly Asn

145 150 155 160

Glu Ile Thr Cys Tyr Glu Asn Phe Thr Asp Asn Gln Leu Asp Val Val

165 170 175

Leu Pro Val Arg Leu Glu Leu Cys Leu Val Leu Phe Phe Ile Pro Met

180 185 190

Ala Val Thr Ile Phe Cys Tyr Trp Arg Phe Val Trp Ile Met Leu Ser

195 200 205

Gln Pro Leu Val Gly Ala Gln Arg Arg Arg Arg Ala Val Gly Leu Ala

210 215 220

Val Val Thr Leu Leu Asn Phe Leu Val Cys Phe Gly Pro Tyr Asn Val

225 230 235 240

Ser His Leu Val Gly Tyr His Gln Arg Lys Ser Pro Trp Trp Arg Ser

245 250 255

Ile Ala Val Val Phe Ser Ser Leu Asn Ala Ser Leu Asp Pro Leu Leu

260 265 270

Phe Tyr Phe Ser Ser Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Gly Arg Gly Leu

275 280 285

Gln Val Leu Arg Asn Gln Gly Ser Ser Leu Leu Gly Arg Arg Gly Lys

290 295 300

Asp Thr Ala Glu Gly Thr Asn Glu Asp Arg Gly Val Gly Gln Gly Glu

305 310 315 320

Gly Met Pro Ser Ser Asp Phe Thr Thr Glu

325 330

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>3

ctctggtggc ctgggttatg tcct 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>4

cctgcgcacc actgaagaag agaa 24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>5

gttatcccgc cggccactgt atg 23

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>6

gcgcaccacg gaggaggaga ag 22

<210>7

<211>6

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>肽

<400>7

Thr Leu Glu Ser Ile Met

1 5

<210>8

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>肽

<400>8

Glu Tyr Asn Leu Val

1 5

<210>9

<211>5

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>肽

<400>9

Asp Cys Gly Leu Phe

1 5

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>10

gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag 36

<210>11

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>11

gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg 53

Claims

1.一种用于鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：

a)使候选化合物与GPR43接触，和

b)测定GPR43功能性是否受到调节，

其中对GPR43功能性的调节表明所述候选化合物是代谢稳定化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述GPR43为人类GPR43。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定包含第二信使分析。

4.一种根据权利要求1所述的方法所鉴别的代谢稳定化合物。

5.根据权利要求4所述的化合物，其中所述代谢稳定化合物为GPR43激动剂。

6.根据权利要求4所述的化合物，其中所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂或拮抗剂。

7.一种用于制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物是通过根据权利要求1所述的方法鉴别。

8.一种医药组合物，其包含权利要求4所述的化合物、基本上由权利要求4所述的化合物组成或由权利要求4所述的化合物组成。

9.一种在有需要的个体治疗或预防代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据权利要求8所述的化合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述代谢相关病症为低血糖症、衰老、胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

11.根据权利要求9所述的方法，其另外包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的根据权利要求8所述的化合物的组合。

12.根据权利要求9所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

13.根据权利要求9所述的方法，其中所述个体为人类。

14.一种用于制造药物的方法，所述药物包含用作代谢稳定化合物的根据权利要求8所述的化合物。

15.一种用于制造药物的方法，所述药物包含用于治疗代谢相关病症的根据权利要求8所述的化合物。

16.一种用于鉴别代谢稳定化合物的方法，其包含：

a)使候选化合物与GPR43接触，和

b)测定GPR43功能性是否降低，

其中GPR43功能性的降低表明所述候选化合物是代谢稳定化合物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述GPR43为人类GPR43。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述测定包含第二信使分析。

19.一种根据权利要求16所述的方法所鉴别的代谢稳定化合物。

20.根据权利要求19所述的化合物，其中所述代谢稳定化合物为GPR43反向激动剂。

21.根据权利要求19所述的化合物，其中所述代谢稳定化合物为GPR43拮抗剂。

22.一种用于制备组合物的方法，其包含鉴别代谢稳定化合物，随后使所述化合物与载剂混合，其中所述化合物是通过根据权利要求16所述的方法鉴别。

23.一种医药组合物，其包含权利要求19所述的化合物、基本上由权利要求19所述的化合物组成或由权利要求19所述的化合物组成。

24.一种在有需要的个体治疗或预防代谢相关病症的方法，其包含向所述个体投与有效量的根据权利要求23所述的化合物。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。

27.根据权利要求24所述的方法，其另外包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的根据权利要求23所述的化合物的组合。

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述个体为哺乳动物。

29.根据权利要求24所述的方法，其中所述个体为人类。

30.一种用于制造药物的方法，所述药物包含用作代谢稳定化合物的根据权利要求23所述的化合物。

31.一种用于制造药物的方法，所述药物包含用于治疗代谢相关病症的根据权利要求23所述的化合物。

32.一种用于治疗或预防代谢相关病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43调节剂。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述代谢相关病症为低血糖症或衰老。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述调节剂为激动剂。

35.根据权利要求32所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述调节剂为反向激动剂或拮抗剂。

37.根据权利要求35所述的方法，其另外包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。

38.根据权利要求32所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。

39.一种用于治疗或预防可通过降低GPR43功能来治疗或预防的病症的方法，其包含向有此需要的个体投与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述病症为代谢相关病症。

41.根据权利要求39所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常、糖尿病、高血糖症、高胰岛素血症、高脂血症、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、血脂异常、肥胖症、X综合症、动脉粥样硬化、心脏病、中风、高血压或末梢血管疾病。

42.根据权利要求39所述的方法，其中所述代谢相关病症为胰岛素抵抗、葡萄糖耐受性异常或糖尿病。

43.根据权利要求39所述的方法，其中所述代谢相关病症为II型糖尿病。

44.根据权利要求39所述的方法，其另外包含向所述个体投与有效量的用于治疗糖尿病、血脂病症或肥胖症的药剂与有效量的GPR43反向激动剂或拮抗剂的组合。