JP4360915B2 - Gタンパク質共役受容体gpr43のリガンドおよびその使用 - Google Patents
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Description
a)特定アッセイの測定で、1つまたはそれ以上のGPR43ポリペプチド、リガンドまたはmRNAレベルの量が、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少している試料または;
b)GPR43コード配列中、配列番号1と比較して、少なくとも一組の塩基対変化が検出され、パラグラフa)、c)またはd)で定義されるGPR43リガンド結合またはシグナル伝達活性の変化を生じる試料または;
c)特定アッセイの測定で、GPR43リガンド結合活性の量が、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少している試料または;
d)特定アッセイの測定で、本明細書中で定義されるセカンドメッセンジャーが、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少している試料。
本発明は、GPR43をコードするヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)に関する(図1に示す)。本発明はまた、GPR43をコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と相同な配列に関する。
GPR43は主に好中球で発現され、より低い程度には、単球、マクロファージ、Tリンパ球、ならびに脾臓および骨髄で発現されている。そのmRNAはまた、好酸球および肥満細胞で弱く検出される。その発現は、サイトカインおよびLPS刺激によって高められ、これにより白血球分化および活性化に役割を果たす可能性が示唆される(Senga et al.,2002)。
本明細書中に記載の任意の配列に関する配列同一性は、いずれか1つまたはそれ以上の配列を別の配列とシンプルに「肉眼」比較(すなわち厳密に比較)し、この別の配列がこの配列(群)に対して、例えば、少なくとも80%の配列同一性を有するか否かを確かめることによって決定可能である。
HISTOGRAM−各検索スコアに関するヒストグラムを表示する;デフォルトはイエスである(BLASTマニュアルのパラメータHを参照のこと)。
本発明の有用な細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
I.GPR43の活性を調節する物質の同定に関するアッセイ
GPR43の活性を調節する物質は、新規に発見された、当該受容体とSCFA、例えば酢酸塩またはプロピオン酸塩の相互作用を利用する多数の方法によって同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上またはインビボでのGPR43/プロピオン酸塩結合再構成能は、この結合を分裂させる物質の同定に関する標的を提供する。結合の分裂に基づくアッセイは、物質、例えば有機小分子をそのような分子のライブラリまたはコレクションから同定できる。別法では、このようなアッセイは、天然ソース(起源)由来の試料または抽出物中、例えば、植物、真菌または細菌抽出物中、またはヒト組織試料(例えば腫瘍組織)中でさえ、物質を同定できる。一側面では、抽出物は変異型核酸、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリを発現している細胞から作成できる。その後、GPR43/SCFA結合の調節因子は、結合アッセイまたは、当該受容体を介する下流のシグナル伝達を測定する機能アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
このアッセイでは、GPR43発現細胞、このような細胞由来の膜抽出物、またはGPR43を含む固定化脂質膜が標識物質および候補化合物に曝露される。インキュベート後、反応混合物は、GPR43受容体に対する標識物質の特異的結合を測定される。標識物質の結合を妨げるか、あるいはこれを置換する化合物は、GPR43活性の作用薬、拮抗薬または逆作用薬となり得る。以後の機能分析は陽性化合物に対して行い、この化合物がこれらいずれの部類に属するか決定することができる。
a)作用薬のスクリーニングでは、GPR43発現細胞またはこの細胞から調製される膜が候補化合物とインキュベートされ、GPR43のシグナル伝達活性が測定される。受容体活性を調節する化合物によって誘導される活性は、天然リガンド、酢酸塩またはプロピオン酸塩によって誘導される活性と比較される。作用薬または部分作用薬は、1mM以下の作用薬または部分作用薬が存在する場合に、プロピオン酸の最大活性の少なくとも10%に相当する最大の生物学的活性を有するだろう。これらは酢酸塩またはプロピオン酸塩と少なくとも等しい効力を有するのが好ましい。
上記(1)に記載されるように、細胞上で発現されているGPR43ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離された膜を、プロピオン酸塩とともに用いて、プロピオン酸塩とGPR43の結合を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。この段落では、プロピオン酸塩を典型的なSCFAとして用いる。しかし、本明細書中で定義される任意のSCFAが記載されるアッセイで使用可能であることが理解されよう。
GPCR、例えばGPR43に関して、受容体活性の基準は受容体含有細胞膜によるGTPの結合である。引用により本明細書中に包含されるTraynorおよびNahorski (1995) Mol. Pharmacol. 47: 848-854に記載される方法では、標識GTPの結合を検出することによって、膜と共役したGタンパク質が本質的に測定される。GTP結合アッセイでは、この受容体を発現する細胞から単離された膜が、以下を含有するバッファー中でインキュベートされる:20mMHEPES、pH7.4、100mMNaCl、および10mMMgCl2、80pM 35S-GTPγSおよび3μMGDP。このアッセイ混合物は30℃で60分間インキュベートされ、その後、未結合の標識GTPがGF/Bフィルターでろ過され、除去される。結合した標識GTPが液体シンチレーション計測によって測定される。プロピオン酸塩誘導性GPR43活性の調節をアッセイするために、GPR43ポリペプチド発現細胞から調製された膜が、プロピオン酸塩と混合され、GPR43活性の候補調節因子の存在および不存在下でGTP結合アッセイが行われる。候補調節因子を含有するこの種のアッセイでのシンチレーション計測によって測定される標識GTPの結合が、この調節因子を含まないアッセイと比較して10%またはそれ以上増大すれば、この候補調節因子がGPR43活性を阻害することが示される。プロピオン酸塩を用いずに同様のGTP結合アッセイを行い、作用薬として作用する化合物を同定することができる。この場合、プロピオン酸塩刺激性GTP結合は標準として用いられる。化合物が作用薬とみなされるのは、1μMまたはそれ以下で存在する場合に、プロピオン酸塩によって誘導されるGTP結合レベルの少なくとも50%を誘導する場合であり、プロピオン酸塩によって誘導されるレベルと等しいか、あるいはより高いレベルを誘導するのが好ましい。GTPアーゼ活性は、GPR43ポリペプチド含有膜をγ32P−GTPとインキュベートすることによって測定される。活性GTPアーゼはこの標識を無機リン酸塩として放出し、この無機リン酸塩が、20mMH3PO4中の5%活性炭懸濁液中の遊離の無機リン酸塩の分離、その後のシンチレーション計測によって検出される。コントロールは、GPR43を発現していない(偽トランスフェクト)細胞から単離された膜を用いるアッセイを含み、候補化合物の非特異的作用の可能性が排除される。
エクオリンアッセイは、GPCRの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアアポエクオリンの反応性を利用するものである(Stables et al (1997) Anal. Biochem. 252: 115-126; Detheux et al (2000) J. Exp. Med., 1921501-1508; これらは共に引用により本明細書中に包含される)。簡単には、GPR43発現クローンがトランスフェクトされ、ミトコンドリアアポエクオリンおよびGα16が同時発現される。細胞は5μMコエレンテラジンH(Coelenterazine H)(Molecular Probes)と室温で4時間インキュベートされ、DMEM−F12培養培地で洗浄され、濃度0.5×106細胞/mlで再懸濁される。次いで細胞は試験作用薬分子と混合され、エクオリンによる光放出が照度計で30秒間記録される。結果は相対光単位(Relative Light Units(RLU))として記載される。コントロールは、GPR43を発現していない(偽トランスフェクト)細胞から単離された膜を用いるアッセイを含み、候補化合物の非特異的作用の可能性が排除される。
アデニル酸シクラーゼ活性に関するアッセイは、Kenimer & Nirenberg (1981) Mol. Pharmacol. 20: 585-591に記載され、これは引用により本明細書中に包含される。このアッセイは、引用により本明細書中に包含されるSolomon et al (1974) Anal. Biochem. 58: 541-548)に教示されているアッセイの修飾法である。簡単には、100μL反応物は50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM MgCl2、20mMクレアチンリン酸(2ナトリウム塩)、10ユニット(タンパク質71μg)のクレアチンホスホキナーゼ、1mMα-32P-ATP(テトラナトリウム塩、2μCi)、0.5mM環状AMP、G−3H−標識環状AMP(約10,000cpm)、0.5mMRo20-1724、0.25%エタノール、および試験対象のタンパク質ホモジネート(すなわち、候補調節因子の存在または不存在下、プロピオン酸塩で処理されているか、または処理されていない、GPR43ポリペプチドを発現しているか、または発現していない細胞由来のホモジネート)50-200μgを含有する。反応混合物は一般に、37℃で60分間インキュベートされる。インキュベート後、反応混合物は冷6%トリクロロ酢酸0.9mlの添加により除タンパクされる。試験管は1800xgで20分間遠心分離され、各上澄溶液がDowex AG50W-X4カラムに添加される。カラム由来のcAMP画分は0.1mMイミダゾール−HCl(pH7.5)4mLを用いて計測バイアル中へ溶出される。アッセイは3回行われるべきである。またコントロール反応は、GPR43ポリペプチドを発現していない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて行われるべきである。
細胞内または細胞外cAMPは、当技術分野に広く既知の方法にしたがい、cAMP放射免疫アッセイ(RIA)またはcAMP結合タンパク質を用いて測定される。例えば、引用により本明細書中に包含されるHorton & Baxendale (1995) Methods Mol. Biol. 41: 91-105はcAMPに関するRIAを記載している。
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、およびその結果のセカンドメッセンジャーDAGおよび/またはイノシトール三リン酸(IP3)生産をモニターすることによって、GPR43の既知または推定の調節因子の活性を原因とする変化に関してモニターできる。これらそれぞれの検出方法は、IanM. Bard. Totowa, NJ, Humana Press (1998)編集のPhospholipid Signalling Protocolsに記載され、これは引用により本明細書中に包含される。また引用により本明細書中に包含されるRudolph et al(1999)J.Biol.Chem.274:11824-11831を参照のこと、これはホスファチジルイノシトール分解に関するアッセイを記載している。アッセイは、候補調節因子の存在または不存在下、プロピオン酸塩で処理されたか、または処理されていないGPR43発現細胞または細胞抽出物を用いて行われるべきである。コントロール反応は、偽トランスフェクト細胞またはそれ由来の抽出物を用いて行い、これにより候補調節因子の非特異的作用の可能性が排除される。
成長因子受容体チロシンキナーゼはプロテインキナーゼC(PKC)の活性化が関与する経路を介してシグナルを伝達できる。PKCはリン脂質−およびカルシウム−活性化プロテインキナーゼのファミリーである。PKC活性化は最終的に、一連の原癌遺伝子転写因子をコードする遺伝子、例えばc-fos、c-myc、およびc-jun、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、例えばI型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲン活性化剤阻害剤、および接着分子、例えば細胞内接着分子I(ICAMI)の転写を生じさせる。アッセイは、PKCによって誘導される遺伝子産物の増大を検出するように設計されており、これを用いて、PKC活性化、すなわち受容体活性をモニターできる。さらに、PKCを介してシグナル伝達する受容体の活性は、PKC活性化によって活性化される遺伝子の調節配列により駆動されるレポーター遺伝子コンストラクトの使用を介してモニターできる。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイは以下により詳細に議論されている。
活性ユニット(nmol/分)は:
=(ペーパー上cpm)×(トータル105μl/スポットされた85μl)
/(アッセイ時間、分)(ATPの特異的活性 cpm/nmol)。
MAPキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキットのいずれかを用いてアッセイすることができる。このようなキットは例えば、New England Biolabsにより販売されているp38MAPキナーゼアッセイキット(Cat#9820)またはPerkin-Elmer Life Sciencesにより販売されているFlash PlateTM MAPキナーゼアッセイである。
受容体、例えばGPR43に対する作用薬の結合によって開始される細胞内シグナルは細胞内イベントのカスケードを開始し、最終的に1つまたはそれ以上の遺伝子の転写または翻訳の急速かつ検出可能な変化を生じさせる。したがって受容体の活性は、GPR43活性化に応答する調節配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターできる。
本発明の細胞、例えばCHO-K1細胞は、5% FCS、抗生物質、アンフォテリシン、ピルビン酸ナトリウムおよび400μg/ml G418を含有するイノシトールを含まないDMEM中、10μCi/ml[3H]イノシトールで24時間標識される。細胞は以下の組成のクレブスリンガーHepes(KRH)バッファー中で2時間インキュベートされる(124mMNaCl、5mMKCI、1.25 mM MgSO4、1.45 mM CaCl2、1.25 mM KH2PO4、25mMHepes(pH:7.4)および 8 mMグルコース)。次いでこの細胞は種々のSCFAで30分間惹起される。インキュベートは氷冷3%過塩素酸溶液の添加により停止される。IPは、以前(Communi,D. et al (1995) Circ. Res., 76, 191-198)に記載されているように、Dowexカラムで抽出分離される。
本発明は、試料中の本発明の受容体活性を検出するためのアッセイを提供する。例えばGPR43活性は、GPR43を発現している細胞または細胞膜を含む試料中で測定できる。上記のように、この段落ではプロピオン酸塩が例として用いられる。本明細書中で定義されている任意のSCFAがこれらのアッセイで使用可能であることが理解されよう。当該アッセイは、SCFAの存在または不存在下で試料をインキュベートし、上記のようなセカンドメッセンジャーアッセイを実行することによって行われる。SCFAの存在または不存在下で行われたセカンドメッセンジャーアッセイの結果が比較され、GPR43受容体が活性であるか否か決定される。本明細書中で定義される特定セカンドメッセンジャーの検出レベルが、SCFAの存在下で、SCFAの不存在下で行われたアッセイの検出量と比較して10%またはそれ以上増大すれば、GPR43活性が示される。
GPCRを介するシグナル伝達は多数の疾患および障害の病状に関与する。リンパ球系列、血小板、脾臓、胃、肺ならびに白血病性細胞の細胞内で発現されているGPR43は、免疫プロセス、癌、血栓症および関連障害または疾患において役割を担っている可能性がある。
GPR43レベルを測定し、標準と比較して、試料中に異常レベルの受容体またはそのリガンドが存在するか否かを決定することができる。これらの存在はいずれもGPR43シグナル伝達の調節不全の可能性を示すものである。ポリペプチドレベルは、例えば該ポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫組織化学により測定される。GPR43活性を特徴とする疾患または障害を患っていることが疑われる個体から単離された試料を、GPR43ポリペプチドに対する抗体と接触させ、当技術分野に既知のように(例えば二次抗体共役型酵素の活性を測定することにより)抗体結合が測定される。
GPR43ポリペプチドまたはそれをコードするmRNAが野生型であるか否かを評価するアッセイは診断に使用可能である。GPR43調節不全を特徴とする疾患または障害をこの様式で診断するため、試料から単離されたRNAを、GPR43のPCR増幅用の鋳型として用いる。増幅された配列は次いで、標準的方法を用いて直接配列決定されるか、あるいはまずベクター中にクローニングされた後に配列決定される。野生型GPR43の配列と比較して1つまたはそれ以上のエンコードアミノ酸を変化させる配列内の差異があれば、GPR43シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害と診断することができる。コード配列の変化が試料内で同定される場合に、当該変異型受容体またはリガンドを発現し、その活性を野生型GPR43の活性と比較することが有用であり得る。他の利点には、このアプローチが、常時活性型および無発現変異体を含む新規突然変異体を提供できることがある。
GPR43シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断は機能アッセイを用いて行うことができる。この場合、組織試料から調製された細胞膜または細胞抽出物が、本明細書中に記載されるGPR43活性のアッセイにおいて用いられる(このようなアッセイは例えば、リガンド結合アッセイ、GTP結合アッセイ、GTPアーゼ活性、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMPアッセイ、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロールまたはイノシトール三リン酸アッセイ、PKC活性化アッセイ、またはキナーゼアッセイである)。検出される活性は、健康な個体由来または罹患した個体の罹患していない部位由来の標準試料中の活性と比較される。別法として、試料または試料の抽出物をGPR43発現細胞に適用し、その後GPR43シグナル伝達活性を標準試料と比較して測定することができる。これらのいずれかのアッセイで測定される活性に関し、標準の活性と比較して10%またはそれ以上の差異があれば、GPR43シグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害と診断される。
プロピオン酸塩がGPR43のリガンドとして発見されたことにより、細胞内のGPR43ポリペプチド活性を調節する方法が提供される。細胞内のGPR43活性は、この細胞に対してGPR43ポリペプチドの機能を調節する物質を供給することによって調節される。この調節は、別の調節物質を同定するためのアッセイの部分として、培養細胞内で、または、例えばヒトを含む動物内で行うことができる。物質には、プロピオン酸塩および本明細書中で定義される他のSCFAならびに、本明細書中に記載されるスクリーニング方法を用いて同定される別の調節因子、例えば任意のプロピオン酸塩アナログが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の受容体の調節因子である化合物を提供する。
候補調節因子は短鎖脂肪酸またはカルボン酸であるのが好ましい。
本発明はGPR43に対する抗体を提供する。抗体は当技術分野に既知の標準的プロトコルを用いて作成できる(例えばAntibodies: A Laboratory Manual,HarlowおよびLane編集(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照のこと)。哺乳類、例えばマウス、ハムスター、またはウサギをこのペプチドの免疫原性型(例えば、GPR43ポリペプチドまたは抗体応答を誘導する抗原性断片、または本明細書中上記の融合タンパク質)で免疫することができる。抗体を生じさせるための免疫原は、このポリペプチド(例えば単離された組換えポリペプチドまたは合成ペプチド)をアジュバントと混合することによって調製される。別法では、GPR43ポリペプチドまたはペプチドは、より大きな免疫原性タンパク質に対する融合タンパク質として作成される。またポリペプチドは、他のより大きな免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと共有結合により連結可能である。別法では、引用により本明細書中に包含されるCostagliola et al (2000) J. Clin. Invest. 105: 803-811に記載されるように、GPR43ポリペプチドまたはこれらのタンパク質の断片をコードするプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、動物内でポリペプチドを発現させ、免疫応答を引き起こすことができる。抗体を生じさせるため、免疫原は典型的に、実験動物、例えばウサギ、ヒツジ、およびマウスに皮内、皮下、または筋肉内投与される。上に議論されている抗体に加えて、遺伝子改変された抗体の誘導体、例えば単一鎖抗体を作成できる。
本発明の高処理量スクリーニングキットは、好ましくは1μMから1mM濃度範囲のプロピオン酸の存在下、本発明の受容体に対する調節因子化合物、例えば作用薬、拮抗薬、逆作用薬または阻害剤を検出するために必要なすべての手段および媒体を含む。このキットは以下の連続工程を行うための材料を含む。GPR43受容体をコードするヌクレオチド配列を含み、発現している本発明の組換え細胞の培養は、固形支持体、例えばマイクロプレート、より好ましくは96ウェルマイクロタイタープレート上で、当業者に周知の方法、特にWO00/02045に記載される方法にしたがって行われる。本発明の調節因子化合物は、約1μMから1mMまたはそれ以上の濃度で、適当な濃度(好ましくは1μMから1μMの範囲)のプロピオン酸が存在する特定のウェルの培養培地に加えられる。
本発明はGPR43活性の調節因子に関するスクリーニングに有用なキット、ならびにGPR43シグナル伝達の調節不全と特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットを提供する。本発明の有用なキットには、単離されたGPR43ポリペプチド(例えば単離された膜上、GPR43発現細胞上、またはSPRチップ上の、膜または細胞結合型GPR43ポリペプチドを含む)を含ませることができる。キットはGPR43に特異的な抗体を含むこともできる。これとは別に、あるいはこれに加えて、キットはGPR43ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞を含有することができる。さらなる態様では、本発明のキットはGPR43ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有することができる。さらに別の態様では、本発明のキットは以下に記載されるGPR43の増幅に有用な特異的プライマーを含んでもよい。本発明のすべてのキットは特定の品目または品目組み合わせ、およびそれらのためのパッケージ材料を含む。キットはまた、使用に関する指示書を含むことができる。
トランスジェニックマウスは遺伝学および発生生物学的研究のため、および新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。通常のトランスジェネシスの方法では、追加コピーの正常または修飾遺伝子が接合体の雄性前核に注入され、これが受容マウスのゲノムDNAに組み込まれることになる。確立したトランスジェニック系統内では導入遺伝子はメンデル様式で遺伝する。トランスジェニック動物の作成に有用なコンストラクトは、正常プロモーターまたは誘導性プロモーター調節下の遺伝子、組織発現および調節パターンに関する分析対象であるプロモーター調節下のレポーター遺伝子、ならびに優性突然変異、変異プロモーター、および特異的発生効果に関して調査される人工融合遺伝子を含有するコンストラクトを含む。典型的には、10キロベースまたはそれ以下のオーダーのDNA断片がトランスジェニック動物の構築に用いられる(Reeves (1998) New. Anat., 253: 19)。トランスジェニック動物は、本発明の1つまたはそれ以上の多型性を含有する候補遺伝子を含むコンストラクトを用いて作成可能である。別法では、単一の多型性を含有する候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、異なる多型性を含有する候補遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交雑することができ、2つの多型性の混合効果を子孫の動物で研究することができる。
本発明は、これらに限定されないがトランスジェニックのマウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、等を含むトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニックブタの作成プロトコルはWhiteおよびYannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp.88-94; 米国特許第5,523,226号;米国特許第5,573,933号:PCT出願WO93/25071;およびPCT出願WO95/04744中に見出せる。トランスジェニックマウスの作成プロトコルは米国特許第5,530,177号中に見出せる。トランスジェニックラットの作成プロトコルはBaderおよびGanten (1996) Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3: S81-S87中に見出せる。トランスジェニックウシの作成プロトコルはTransgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, Carl A. Pinkert編, Academic Press, Inc.中に見出せる。トランスジェニックウサギの作成プロトコルはHammerら (1985) Nature 315: 680-683およびTaylorおよびFan (1997) Frontiers in Bioscience 2: d298- 308中に見出せる。
i.標準
ノックアウト動物は相同組換えにより遺伝子欠失を作成する方法によって作成できる。この技術は、胚性幹(ES)細胞の開発に基づくものである。このES細胞は胚由来であり、培養中に維持され、宿主胚盤胞に導入された場合にマウスのすべての組織発生に関与する能力を有するものである。ノックアウト動物の作成は、ES細胞内の特定の標的遺伝子に対する相同組換えを導き、これによりこの遺伝子の無効対立遺伝子を作成することによって行われる。(ヘテロ接合性またはホモ接合性子孫において)当該無効対立遺伝子の潜在的表現型の結果を分析することができる(Reeves,上記)。
標的化された相同組換えの方法は、バクテリオファージP1部位特異的リコンビナーゼCreに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良された。バクテリオファージP1由来のCre-loxP部位特異的DNAリコンビナーゼはトランスジェニックマウスアッセイにおいて用いられ、規定の組織または発生段階に制限された遺伝子ノックアウトが作成される。広範囲の遺伝子ノックアウトと対照的に、領域制限された遺伝子の欠失は、表現型を特定の細胞/組織に起因させることができる点で有益である(Marth (1996) Clin. Invest. 97: 1999)。Cre-loxP系では、一方のトランスジェニックマウス系統は、loxP部位が目的の遺伝子の1つまたはそれ以上のエキソンに隣接するように操作される。これに関するホモ接合体、いわゆる「floxed遺伝子」は、細胞/組織型転写プロモーターの調節下でCre遺伝子を発現する第二のトランスジェニックマウスと交雑される。その後Creタンパク質はloxP認識配列間のDNAを切除し、標的遺伝子機能を効果的に除去する(Sauer (1998) Methods, 14: 381)。現在、この方法の多数のインビボ実施例が存在し、これには哺乳類組織特異的遺伝子の誘導性不活化(Wagnerら (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4323)が含まれる。
改変されたタンパク質のインビボ機能が特定の遺伝的多型性/突然変異に帰することを証明するために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することにより、改変されたタンパク質機能を「救出」することができる。トランスジェニックマウスで発現された細菌人工染色体(BAC)クローンを用いるインビボ補完はこれらの目的のために使用可能である。この方法はマウス概日時計遺伝子の同定に使用された(Antoch et al (1997) Cell 89: 655)。
トリプシンはFlow Laboratories (Bioggio, Switzerland)製品である。培養培地、G418、胎児ウシ血清(FBS)、制限酵素、プラチナ(Platinum)PfxおよびTaqDNAポリメラーゼはLife Technologies, Inc. (Merelbeke, Belgium)から購入した。放射能製品ミオ-D-[2-3H]イノシトール(17.7Ci/mmol)はAmersham(Ghent,Belgium)製品である。Dowex AG1X8(ギ酸塩型)はBio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.)製品である。ATP、プロピオン酸塩、酢酸塩、ギ酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、ベータ−ヒドロキシ酪酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩および他のカルボン酸はSigma Chemical Co.(St. Louis, MO)から得た。フォルスコリンはCalbiochem (Bierges, Belgium)から購入した。ロリプラムはLaboratories Jacques Logeais (Trappes,France)から得た。pEFIN5はEuroscreen (Brussels, Belgium)により開発された発現ベクターである。二重リン酸化(Thr202およびTyr204)型Erk1およびErk2に特異的なモノクローナル抗体はNew England Biolabs (Beverly, MA)から得た。
典型的に患者は、GPR43の調節因子(例えば、本発明のGPR43作用薬、拮抗薬または阻害剤)を投与することによって以下のように処置することができる。本発明のGPR43の調節因子は、摂取、注射、吸入または他の多数の方法により、好ましくは生物学的適合性溶液または製薬的に許容されるデリバリーベヒクル中で患者に投与することができる。投与用量は患者に応じて変化する;「治療的有効量」は、例えば機能を高めるレベル(例えば本明細書中に記載のセカンドメッセンジャーアッセイで決定されるレベル)によって決定することができる。プロピオン酸塩結合のモニタリングにより、当業者は投与用量を選択および調節可能である。本発明のGPR43調節因子の用量は、毎日、毎週、毎月、毎年、または担当医師が適当と考えるところにしたがってくり返し投与される。
本発明は、生理適合性担体と混合された本発明のGPR43調節因子を含む組成物を提供する。本明細書中で用いる用語「生理適合性担体」とは、生理的に許容される希釈剤、例えば水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水を意味し、さらにアジュバントを含むことができる。アジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンは当技術分野に周知の材料である。
本発明は、PMNおよび関連細胞を本発明の短鎖脂肪酸分子と接触させることにより、インビトロまたはインビボでこれらの細胞の走化性を調節する方法を提供する。免疫細胞の感染部位(または抗原提示部位)への遊走は、種々の疾患状態で生じる一般的なプロセスである。本発明は部分的に、GPR43が短鎖脂肪酸、例えば酢酸塩およびプロピオン酸塩に関する受容体として機能すること、およびこのようなSCFAに応答してPMN走化性の媒介を担うことの発見に基づくものである。したがって本発明は、共通の作用機構として、PMN細胞の遊走現象を共有する疾患状態の調節および/または処置のための機構を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の望ましくない遊走を特徴とする疾患状態、例えば自己免疫疾患を、そのような疾患の患者に、GPR43のシグナル伝達活性を阻害するか、あるいはこの受容体の活性化をブロックする物質(例えばGPR43受容体に特異的に結合する抗体)を投与することによって調節および/または処置することができることを提供する。また本発明は、不十分な免疫細胞遊走を特徴とする疾患状態または、免疫応答の刺激によって排除されなければならない病原体によって引き起こされる疾患を、その調節または処置を必要としている患者に、これらに限定されないが酢酸塩および/またはプロピオン酸塩を含む、GPR43受容体の作用薬を投与することによって調節または処置することができることを提供する。本発明の方法によって調節および/または処置することができる具体的な疾患は以下に示すものである。しかし本発明はこれらの特定疾患に制限されず、異常、または不十分な免疫細胞遊走を特徴とする他の疾患状態の処置に有用であり得る。したがって本明細書中で用いる「PMN走化性関連疾患」とは、可溶性走化性因子の方向または逆方向へのPMN細胞の遊走を一要素として含む疾患を意味する。「PMN走化性関連疾患」は、例えば、炎症性疾患、自己免疫疾患、IBD(炎症性腸疾患)、肝硬変、歯周病、および当業者に既知の、少なくとも部分的にPMN細胞の可溶性走化性因子方向または逆方向への遊走によって媒介される他の疾患であり得る。また「PMN走化性関連疾患」とは、病原体の感染から生じるか、または個体内の内因性病原体が異常増殖することによる病理学的状態を意味し得る。
共生植物相の生成物は、粘膜障壁障害または粘膜損傷の存在下で炎症を促進することがあり(Chadwick & Anderson, 1990)、これにより炎症性腸疾患(IBD)における粘膜免疫系の活性化が生じる(Chadwick et al.,2002)。IBDは小腸および大腸のいずれかまたは両者に影響し得る。クローン病および潰瘍性大腸炎は最もよく知られている型のIBDである。IBDの主な病理組織学的特徴は、罹患した腸における急性および慢性炎症性細胞の浸潤である。これらの免疫細胞は腸細胞を認識し、破壊することができ、これにより典型的な免疫機構がIBD病因に関与する(Perlmann & Broberger, 1963)。さらに、免疫細胞は形態学的、臨床的および内視鏡的に明確な炎症の証拠を伴わずに腸に広く浸潤することができる(Fiocchi, 1998)。また単球細胞はすべての段階のIBDに関与すると考えられ、IBD病態生理学におけるその重要性が強調されている(Fiocchi, 1998)。さらに、活性化Tリンパ球は器官培養中で粘膜損傷を誘導し(MacDonald & Spencer, 1988)、PMNは炎症および組織損傷の増幅に重要な役割を果たし(Fiocchi,1998)、IBD患者の炎症性結腸粘膜には顕著な好中球浸潤が伴う。全身性循環から粘膜間質腔へ遊走した後、好中球は活性化を受け、活性酸素中間体およびさらなるケモカインを生産し、炎症性応答の保持ならびに最終的な粘膜損傷を引き起こすことができる。好中球浸潤はIBDを伴う深刻な炎症性の腸に不可分の要因であるため、好中球遊走および活性化を阻害する治療戦略の開発は非常に望まれる目標である。実際、好中球遊走応答の阻害剤であるシクロスポリンAを用いる処置では、好中球およびTリンパ球が原因の炎症を減少させることによってIBD患者の炎症が改善された(Ina et al.,2002)。正常植物相が何らかの形で生理学的炎症の調節因子として機能するという概念は、Duchmannらの観察結果により強化された(Duchmann et al.,1995 & 1996)。彼らは、IBD患者由来の粘膜性であるが末梢血性でない単核細胞が、自己の腸内細菌に対して曝露されると増殖することを示した。結腸環境での因子の生産はPMNによる反応性酸素種の生産を著しく増大させる。これらの因子のうち、SCFAは腸内の複合炭水化物の嫌気的発酵によって生産され(Pouteauら(1996)Topping & Clifton, 2001-Eftimiadi et al.(1987))、主に以下の配分の酢酸塩、プロピオン酸塩および酪酸塩である:酢酸塩(60%)、プロピオン酸塩(25%)および酪酸塩(15%)。結腸管腔のトータル濃度は約70−100mMである(Sellin, 1999)。酪酸塩を除く、プロピオン酸塩および酢酸塩は好中球機能の強力な調節因子であり(Nakao et al.,1992)、我々は酢酸塩およびプロピオン酸塩がGPR43に対して作用薬として作用し、好中球活性を調節することを示した。したがってGPR43の拮抗薬は好中球活性化およびIBDにおける炎症を減少させ得る。
GPR43は白血球上で発現されている。GPR43のリガンドである、プロピオン酸塩および酢酸塩は、多形核細胞ならびにTリンパ球および単球を調節している(Eftimiadi et al.,1991; Nakao et al.,1992;Curi et al.,1993)。しかし、百日咳毒素およびプロテインキナーゼCの活性化剤/阻害剤を用いる実験によってGPCR機構が示唆されたかもしれないが、これらの作用はいずれも特定のGタンパク質共役受容体(GPCR)の刺激と結び付けられていなかった。Brunkhorst et al.(1992)は、少なくともプロピオン酸塩および酢酸塩に関して、一連のPMN活性化イベント、例えば細胞骨格F−アクチン改変、PMN極性化(polarization)、F−アクチン局在化、細胞質pHの周期的変動、細胞形態に対する作用のGPCR機構を提案した。本発明は、GPR43のリガンドが、これらに限定されないが炎症性疾患、病原体感染、リンパ腫および白血病を含む、種々の病状において白血球活性を調節するために使用可能であることを提供する。
歯周病は、歯肉溝への複合グラム陰性菌感染の結果であり、これは好中球応答の欠損と関連する。見込みのある治療アプローチの1つは好中球応答を高める生物学的応答の調節因子を使用することである。種々の歯周および根管の病原体、例えばバクテロイド種は大量の短鎖脂肪酸(SCFA)を生産することができる。したがって、本発明が提供するGPR43リガンドは、好中球応答を調節し、歯周病の症状を減少させるのに有用であり得る。
ほとんどのエタノールは、主にアルコール脱水素酵素(alcohol deshydrogenase, ADH)およびアルデヒド脱水素酵素(aldehy dedeshydrogenase, ALDH)によって触媒されるアルデヒドおよび酢酸塩への酸化によって排除される。アルコールは、肝代謝により、まずアセトアルデヒドに、次いで酢酸塩に、そして最終的に二酸化炭素および水になり、ほとんど完全に身体から排除される。当該代謝はミカエリス・メンテン動態学によって最もうまく説明可能な経時的除去にしたがうものである。(Fujimiya et al (2000) Alcohol ClinExp Res 24: 16S-20S; LiおよびBosron (1986) Ann Emerg Med 15:997-1004を参照のこと)。エタノール用量の約60%−75%が酢酸塩に変換される(Siler SQ, Neese RA,Hellerstein MK(1999) Am J Clin Nutr 70 (5): 928-36)。酢酸塩はヘッドスペース・ガス・クロマトグラフィーによりヒト血液中および尿中で評価でき(Tsukamoto et al.,Nihon Arukoru Yakubutsu Igakkai Zasshi 19983: 200-9)、アルコール摂取、大量飲酒、代謝耐性、乱用、慢性アルコール症およびアルコール禁断の重篤性に関するマーカーを示す(Pronko et al(1997) Alcohol 32: 761-8; Korri et al (1985) Alcohol Clin Exp Res 9: 468-71; Nuutinen et al (1985) Alcohol 2: 623-6)。 エタノール摂取後、酢酸塩は57mg/mLに増大する(Lundquist (1962) Nature N°4815, p579)。
PMN走化性は、本発明にしたがって、S. Boydenによって1962年に最初に開発された手法によってインビトロ測定することができる(S.Boyden (1962) J. Exp. Med. 115: pp.453-466を参照のこと)。簡単には、この手法ではPMN細胞懸濁液および化学物質を2つの別々の区画に配置する。これらの区画はポリカーボネートフィルターで分離されている。PMNは例えば哺乳類の末梢血から調製することができる。あらかじめ決められた時間の後、フィルターを取り除き、細胞懸濁液含有区画側のフィルター表面の細胞を注意して取り除く。次いでフィルター上の残留細胞を固定し、染色する。ハイパワーの顕微鏡を用いてフィルターを検査し、フィルターの下面(すなわちフィルターの化学物質含有区画側)に現れた細胞の数を手動で計測する。正の走化性応答は、フィルターを通って化学物質含有区画側へ遊走または「クロール」した細胞によって示される。時間がかかるので、典型的にはフィルター全体が検査されることはない。そのかわり、代表試料領域が検査され、計測される。本発明では、走化性因子が存在しない場合と比較して、走化性因子が区画内に存在する場合に、走化性因子含有区画に接したフィルター表面に少なくとも10%多数のPMN細胞が存在すれば、「PMN走化性」が生じたとされる。
クローニング、配列決定およびアライメント
特異的オリゴヌクレオチドプライマーをGPR43ヒト受容体の配列に基づいて合成した:センスプライマー5'-GCGGAATTCACCATGCTGCCGGACTGGAAGAG-3'(配列番号6)およびアンチセンスプライマー5'-CTAGTCTAGACTGCTACTCTGTAGTGAAGTC-3'(配列番号7)。3つの異なる脾臓cDNAに対し、プラチナPfxDNAポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行った。増幅条件は以下であった:94℃、15秒;50℃、30秒;68℃、2分で35サイクル。増幅により、GPR43遺伝子の完全コード配列を含有する1キロベースの断片を得た。次いでこのコード配列をpcDNA3(Invitrogen)発現ベクターのEcoRIおよびXbaI部位間にサブクローニングし、BigDyeターミネーターサイクル配列決定キット(BigDyeTerminatorcyclesequencingkit, Applied Biosystems, Warrington, Great Britain)を用い、3つのcDNAのそれぞれに関して両鎖に対する配列決定を行った。
GPR43ヒト受容体の組織分布
いくつかのヒト組織中のGPR43 mRNAをRT-PCRによって増幅した(図3)。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)実験はポリA+ RNAのパネル(Clontech)を用いて行った。GPR43プライマーは以下のものであった:GPR43センスプライマー(5'-ACTGGAAGAGCTCCTTGATC-3';配列番号8)およびGPR43アンチセンスプライマー(5'-CAAGTATTGAACGATGATC-3';配列番号9)。増幅DNAバンドの予想サイズは439bpであった。アルドラーゼコード配列に基づく2つの合成プライマーをコントロールとして用いて、予想サイズ443bpの生成物を製造した:アルドラーゼセンスプライマー5'-GGCAAGGGCATCCTGGCTGC-3'(配列番号10)およびアルドラーゼアンチセンスリバース5'-TAACGGGCCAGAACATTGGCATT-3'(配列番号11)。SuperscriptII(LifeTechnologies,Inc.,Merelbeke, Belgium)を用いてポリA+RNA約75ngを逆転写し、これをPCR用に用いた。PCRはTaqポリメラーゼを用いて以下の条件下で行った:94℃で3分変性し、94℃で1分、58℃で2分および72℃で2分で38サイクル。PCR反応物の一定量(10μL)を1%アガロースゲル電気泳動によって分析した。
GPR43リガンドに関するスクリーニング
10%胎児ウシ血清、100ユニット/mlペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを補った栄養混合ハムF12培地(Nutrient Mixture HAM's F12 medium)でCHO-K1細胞(ATCCCRL-9618(Bethesda, MD, USA))を培養した。Fugene6(RocheDiagnostics, Mannheim,Germany)を用いてヒトGPR43をコードするバイシストロン性プラスミドをCHO-K1細胞内にトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、250μg/mlゼオシン(zeocin)を用いて個々のクローンを選択し、GPR43ポジティブクローンをノーザンブロッティングによって確認した。Gタンパク質共役受容体の天然リガンド250個を濃度1−100μMで含有する参照小分子ライブラリを用いるスクリーニングにポジティブクローンを用いた。酢酸塩を用いて特異的活性を取得し、用量応答曲線によって確認した。同一細胞を用いてさらに関連化合物を試験した。
hGPR43発現CHO-K1細胞に対するSCFAの活性
炭素数1から4の範囲のSCFAを、ヒトGPR43を安定発現するCHO-K1細胞において、フォルスコリンで刺激されたアデニル酸シクラーゼ活性の阻害能に関して試験した。
膜に基づく機能アッセイにおけるSCFA活性の分析
膜に基づく機能試験において酢酸の活性を試験した。このアッセイでは、ヒトGPR43を発現するCHO-K1細胞由来の膜調製物でGTPγ[35S]結合の蓄積をモニターした(図6)。酢酸塩の効力は、cAMPレベルをモニターする細胞に基づく機能アッセイで観察された効力と匹敵した。この膜に基づくアッセイを用いて試験されたSCFAの効力の序列は保存されていた。すなわち、このアッセイはC2>C3>C4>>C1を示した。C4およびC1はヒト受容体を部分的に活性化し、その最大応答は酢酸塩およびプロピオン酸塩を用いて観察された最大応答と比較して最も低かった(データは示していない)。
セカンドメッセンジャー蓄積によって測定されるGPR43の活性に対するSCFAの作用
SCFAはヒトGPR43を安定発現しているCHO-K1細胞においてイノシトールリン酸の生産を刺激することが可能であった(図9)。使用するSCFAに関わらず、刺激前にPTX前処理することによってこの活性化はわずかに影響を受けた。したがってヒトGPR43の共役は二重であり、これには上記Gi共役に加えてGqタンパク質の活性化が関与する(図10)。
GPR43に対して活性なSCFAの化学式および活性
活性化合物の化学式は図12に示す。活性化合物の構造活性相関(SRA)は、構造上密に関連する化合物(ケトン、アルコールおよびアルデヒト)が不活性であることを考慮すると、カルボン酸部分が活性に必要とされることを示した。この部分は、線状または非線状の、2−3Cに関して最適活性を有する1−6炭素原子を含む炭素鎖の先端で分岐されている部分である。第二のカルボン酸部分は炭素鎖の長さに関わらすシグナルを消失させることが、シュウ酸塩(C2)、マロン酸塩(C3)、コハク酸塩(C4)、アスパラギン酸塩(C4)、グルタミン酸塩(C5)または3カルボン酸部分を有するクエン酸塩で観察された。
プロピオン酸塩および酢酸塩はヒト好中球の細胞内カルシウム流動(mobilization)を誘導できる。
以下の実験を行い、酢酸塩およびプロピオン酸塩を用いてヒト多形核(PMN)白血球を活性化できるか否かを試験した。これはPMNを主に含有する末梢血細胞中でこの受容体が強力に発現されていることに基づくものである。活性化は、細胞膜受容体を酢酸およびプロピオン酸塩で刺激した後に内部プールから結集される細胞内カルシウムを定量することによって測定した。
SCFAによって誘導される走化性:好中球に対するカルシウムおよび走化性アッセイ
以前に記載されるように、健康なボランティアの軟膜から末梢血単核細胞を精製した(Struyf S, De Meester I, Scharpe S,Lenaerts JP, Menten P, Wang JM, Proost P, Van Damme J. ,Eur J Immunol (1998) Apr; 28 (4):1262-71)。細胞内カルシウム測定では、室温で30分間Fura-2AM(Molecular Probes)を細胞に取り込ませた。LS50B分光蛍光光度計(Perkin Elmer)によってカルシウム流量をモニターした。これは125μMプロベネシドを含有するバッファー中最終細胞濃度106細胞/mlで、記載(Grynkiewicz G,Poenie M,TsienRY.,J Biol Chem (1985) Mar 25; 260(6): 3440-50)にしたがって行った。48ウェル容器中、3μm(メッシュサイズ)のポリカーボネートフィルター膜(Neuroprobes,Inc.)を用いて走化性を評価した。この結果を走化性指数として表わす(図17)。
健康なドナーから新たに単離した末梢血好中球を、酢酸ナトリウムおよびプロピオン酸ナトリウムに対するその走化性応答に関して試験した。両SCFAは典型的な鐘形用量応答曲線を示し、最適濃度は10−3Mであった(図17)。我々は、SCFAが好中球に対して走化性を誘導することを結論する。好中球走化性におけるSCFAの効力は、fMLPの効力より低く、fMLPは10−8Mで依然完全に活性であった。さらにまた、fMLPの効力はSCFAの効力より高く、fMLPの最大走化性指数が平均で少なくとも3倍高かった(データは示していない)。
前記実施例は、本発明の作成および実行の際に発明者らにより行われ、考慮された実験を示している。これらの実施例は、発明の実施について当技術分野に公開し、ならびにその有用性を示す両目的を果たす技術の開示を含むものと考える。当業者であれば、本明細書中に開示されている技術および態様は好ましい態様のみであり、多数の同等な一般的方法および技術を用いて同一の結果を得ることができることを理解するだろう。
Claims (18)
- GPR43に結合する物質を同定する方法であって:
(a)短鎖脂肪酸とGPR43ポリペプチドの結合を許容する条件下で候補結合物質の存在または不存在下でGPR43ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程;および
(b)GPR43ポリペプチドと短鎖脂肪酸の結合を測定する工程であって、候補結合物質存在下の結合が、候補結合物質不存在下の結合と比較して減少すれば、該候補結合物質がGPR43に結合する物質として同定される工程;
を含む方法。 - GPR43のシグナル伝達活性を増大させる物質を同定する方法であって:
(a)GPR43ポリペプチドを候補物質と接触させる工程;
(b)候補物質存在下でGPR43ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;および
(c)候補物質存在下で測定されるシグナル伝達活性を、GPR43ポリペプチドと短鎖脂肪酸を接触させる反応で測定されるシグナル伝達活性と比較する工程であって、候補物質存在下で測定される活性量が、短鎖脂肪酸によって誘導される量の少なくとも10%であれば、該候補物質がGPR43のシグナル伝達活性を増大させる物質として同定される工程;
を含む方法。 - GPR43のシグナル伝達活性を減少させる物質を同定する方法であって:
(a)該物質の存在または不存在下でGPR43ポリペプチドを短鎖脂肪酸と接触させる工程;
(b)GPR43ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程;および
(c)該物質不存在下でGPR43および短鎖脂肪酸を含有する反応において測定される活性量を、該物質存在下でGPR43および短鎖脂肪酸を含有する反応において測定される活性量と比較する工程であって、該物質存在下のシグナル伝達活性が、該物質不存在下のシグナル伝達活性と比較して減少すれば、該物質がGPR43の拮抗薬であることが示される工程;
を含む方法。 - 短鎖脂肪酸が検出可能に標識されている、請求項1に記載の方法。
- 短鎖脂肪酸が、放射性同位体、フルオロフォア、蛍光消光剤、酵素、およびアフィニティータグからなる群から選択される部分で検出可能に標識されている、請求項4に記載の方法。
- 接触がGPR43ポリペプチド発現細胞内またはその表面で行われる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 接触がGPR43ポリペプチドを含有するウイルス誘導性出芽膜内またはその表面で行われる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 接触が合成リポソーム内またはその表面で行われる、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 接触がGPR43ポリペプチド発現細胞由来の膜画分を用いて行われる、請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。
- 物質が、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはその抗原結合断片、脂質、炭水化物、核酸、および有機小分子からなる群から選択される、請求項1から9のいずれか1項に記載の方法。
- 測定が、標識置換、表面プラスモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光消光、および蛍光偏光からなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項1から10のいずれか1項に記載の方法。
- GPR43ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する工程がセカンドメッセンジャーのレベル変化を検出することを含む、請求項2、3および6から11のいずれか1項に記載の方法。
- シグナル伝達活性を測定する工程が、グアニンヌクレオチド結合または交換、アデニル酸シクラーゼ活性、cAMP、プロテインキナーゼC活性、ホスファチジルイノシトール分解、ジアシルグリセロール、イノシトール三リン酸、細胞内カルシウム、アラキノイド酸、MAPキナーゼ活性、チロシンキナーゼ活性、またはレポーター遺伝子発現の測定を含む、請求項2、3および6から11のいずれか1項に記載の方法。
- シグナル伝達活性の測定がエクオリンに基づくアッセイの使用を含む、請求項13に記載の方法。
- 短鎖脂肪酸またはその塩が線状である、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 短鎖脂肪酸またはその塩が分岐状である、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 短鎖脂肪酸またはその塩の1つまたはそれ以上の非カルボニル炭素が非炭素含有置換基で置換されている、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 短鎖脂肪酸塩が、酪酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、吉草酸ナトリウムおよびギ酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
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