JP5314061B2 - Gタンパク質共役受容体fprl2用のリガンドおよびその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、オーファンGタンパク質共役受容体FPRL2用の天然リガンドおよび使用方法に関する。本発明はさらに、FPRL2に対して作成された抗体に関する。
Gタンパク質共役受容体(GPCR)は細胞内のシグナル伝達を担うタンパク質である。GPCRは通常、7つの貫膜ドメインを有する。リガンドがGPCRの細胞外部分または断片と結合すると、細胞の生物学的または生理学的性質または動態に変化が生じる細胞内でシグナル伝達される。GPCRは、Gタンパク質およびエフェクター(Gタンパク質によって調節される細胞内酵素およびチャネル)とともに、細胞内二次メッセンジャーの状態を細胞外入力と連結するモジュール式シグナル伝達系のコンポーネントである。
本発明の一実施態様は、サンプル中のFPRL2ポリペプチド活性を検出するための方法であって、以下の段階を含む方法である:
a) FPRL2ポリペプチドとHBPポリペプチドの結合を許容する条件下で、FPRL2ポリペプチドを含むサンプルをHBPポリペプチドとインキュベートする段階、および
b) 二次メッセンジャーを検出する段階。
a) FPRL2ポリペプチドとHBPポリペプチドの結合を許容する条件下、FPRL2ポリペプチドを含む第二のサンプルをHBPポリペプチドの不存在下でインキュベートする段階、および
b) 二次メッセンジャーを検出する段階。
(a) HBPポリペプチドとFPRL2ポリペプチドの結合を許容する条件下、候補結合物質の存在または不存在下でFPRL2ポリペプチドをHBPポリペプチドと接触させる段階;および
(b) FPRL2ポリペプチドとHBPポリペプチドの結合を測定する段階:この場合、候補結合物質不存在下での結合と比較して、候補結合物質の存在下で結合が減少すれば、当該候補結合物質をFPRL2ポリペプチドと結合する物質として同定する。
(a) FPRL2ポリペプチドを物質と接触させる段階;
(b) 当該物質の存在下でFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階;および
(c) 当該物質の存在下で測定された活性を、FPRL2ポリペプチドをHBPポリペプチドと接触させる反応で測定された活性と比較する段階:この場合、当該物質の存在下で測定された活性量がHBPポリペプチドによって誘発された量の少なくとも10%であれば、当該物質をFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達を増大させるアゴニストとして同定する。
(a) 当該物質の存在または不存在下でFPRL2ポリペプチドをHBPポリペプチドと接触させる段階;
(b) FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する段階;
(c) FPRL2ポリペプチドおよびHBPポリペプチドを含有するが、当該物質を含まない反応中で測定された活性量を、FPRL2ポリペプチド、HBPポリペプチドおよび当該物質を含有する反応中で測定された活性量と比較する段階:この場合、当該物質不存在下での活性と比較して、この物質の存在下で活性が減少すれば、当該物質をFPRL2ポリペプチドのためのアンタゴニストまたは逆アゴニストとして同定する。
(a) HBPポリペプチドとFPRL2ポリペプチドの結合、または
(b) FPLRL2ポリペプチドと結合したHBPポリペプチドのシグナル伝達活性。
a) FPRL2ポリペプチドを含む組織サンプルをHBPポリペプチドと接触させる段階;
b) HBPポリペプチドと組織サンプルの結合を検出する段階;および
c) 段階(b)で検出された結合を標準と比較する段階:この場合、標準と比較した結合の差を、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
a) FPRL2ポリペプチドを含む組織サンプルをHBPポリペプチドと接触させる段階;
b) 組織サンプル中のFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達活性を検出する段階;および
c) 段階(b)で検出されたシグナル伝達活性を標準と比較する段階:この場合、標準と比較したシグナル伝達活性の差を、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
(a) FPRL2ポリペプチドをエンコードする単離したポリヌクレオチド、HBPポリペプチドおよび、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料、または
(b) FPRL2ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞、HBPポリペプチドおよび、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達を検出するための手段、およびそれら用のパッケージ材料。
本発明は、HBPポリペプチドがオーファンGタンパク質共役受容体FPRL2ポリペプチドの天然リガンドであるという発見に基づき、このリガンドと受容体の結合を薬物のスクリーニング方法において使用する方法に基づいている。既知のリガンドおよびその受容体FPRL2ポリペプチドとの相互作用はまた、受容体活性の調節不全が関与する症状の診断を提供する。本発明はまた、FPRL2ポリペプチドおよび相同配列、その対応するポリヌクレオチドおよび/または、このポリヌクレオチドを発現している組換え細胞を含むキットに関し、この受容体ポリペプチドおよび/またはその対応するポリヌクレオチドのアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストおよび調節化合物を同定するためのキットに関する。このようなキットは、FPRL2ポリペプチド活性に関連する疾患および障害の診断、予防および/または処置に有用である。
a) 既定アッセイの測定で、1つまたはそれ以上のFPRL2ポリペプチド、リガンドまたはmRNAレベルの量が、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少する場合、または;
b) FPRL2ポリペプチドのコード配列中、配列番号1と比較して、少なくとも1つの塩基対変化が検出され、パラグラフa)、c)またはd)で定義されるFPRL2ポリペプチドのリガンド結合またはシグナル伝達活性の変化が生じる場合、または;
c) 既定アッセイの測定で、FPRL2ポリペプチドのリガンド結合活性の量が、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少する場合、または;
d) 既定アッセイの測定で、本明細書中で定義される二次メッセンジャーが、本明細書中で定義される標準と比較して10%またはそれ以上増大または減少する場合。
本発明は、FPRL2ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)に関する(図1に示す)。本発明はまた、FPRL2ポリペプチドをエンコードするヌクレオチド配列およびアミノ酸配列と相同な配列に関する。
本明細書中に記載の任意の配列に関する配列同一性は、いずれか1つまたはそれ以上の配列を別の配列と単純に「肉眼」によって比較(すなわち厳密に比較)し、この別の配列が当該配列(群)に対して、例えば、少なくとも80%の配列同一性を有するかどうかを確かめることによって決定することができる。
本発明に有用な細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞または哺乳類細胞からなる群から選択されるのが好ましい。
I.FPRL2ポリペプチドの活性を調節する物質の同定のためのアッセイ
FPRL2ポリペプチドの活性を調節する物質は、新規に発見されたこの受容体とHBPポリペプチドの相互作用を利用する多数の方法によって同定することができる。例えば、インビトロ、培養細胞上またはインビボでのFPRL2ポリペプチド/HBPポリペプチドの結合の再構成能は、この結合を分裂させる物質の同定のための標的を提供する。結合の分裂に基づくアッセイでは、物質、例えば有機小分子をそのような分子のライブラリまたはコレクションから同定できる。別法では、このようなアッセイにより、天然起源由来のサンプルまたは抽出物中、例えば、植物、真菌または細菌抽出物中、またはヒト組織サンプル(例えば腫瘍組織)中でさえ、物質を同定できる。一側面では、抽出物は変異型核酸、ペプチドまたはポリペプチドのライブラリを発現している細胞から作成することができる。その後、FPRL2ポリペプチド/HBPポリペプチドの結合の調節物質は、結合アッセイまたは、この受容体を介する下流のシグナル伝達を測定する機能アッセイを用いてスクリーニングすることができる。
このアッセイでは、FPRL2ポリペプチド発現細胞、このような細胞由来の膜抽出物、またはFPRL2ポリペプチドを含む固定の脂質膜を標識物質および候補化合物に曝露する。インキュベーション後、反応混合物において、FPRL2ポリペプチド受容体に対する標識物質の特異的結合を測定する。標識物質の結合を妨げるか、あるいは標識物質を置換する化合物は、FPRL2ポリペプチド活性のアゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストであり得る。以後の機能解析はポジティブ化合物に対して行い、この化合物がこれらのいずれのカテゴリーに属するかを決定することができる。
このアッセイでは、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達活性を測定する。
上記(1)に記載されるように、HBPポリペプチドとFPRL2ポリペプチドの結合を阻害する化合物をスクリーニングするために、細胞上で発現されているFPRL2ポリペプチド、または受容体ポリペプチドを含有する単離した膜を、HBPポリペプチドとともに用いることが出来る。この段落では、典型的なリガンドとしてHBPポリペプチド(配列番号18)を用いる。しかし、記載のアッセイにおいて、本明細書中で定義する任意のHBPポリペプチドを使用可能であることが理解されよう。
i.GTPアーゼ/GTP結合アッセイ:
GPCR、例えばFPRL2ポリペプチドに関して、受容体活性の基準は受容体含有細胞膜によるGTPの結合である。引用により本明細書中に包含されるTraynor and Nahorski, 1995, Mol. Pharmacol. 47: 848-854に記載の方法では、標識GTPの結合を検出することによって、膜と共役したGタンパク質を本質的に測定する。GTP結合アッセイでは、この受容体を発現する細胞から単離した膜を、以下の物質を含有するバッファー中でインキュベートする:20 mM HEPES、pH 7.4、100 mM NaCl、および10 mM MgCl2、80 pM 35S-GTPγSおよび3μM GDP。このアッセイ混合物を30℃で60分間インキュベートし、その後、未結合の標識GTPをGF/Bフィルタでろ過して除去する。結合した標識GTPを液体または固体(SPA、以下を参照のこと)シンチレーション計数によって測定する。HBPポリペプチド誘導性FPRL2ポリペプチド活性の調節をアッセイするために、FPRL2ポリペプチド発現細胞から調製した膜をHBPポリペプチドと混合し、FPRL2ポリペプチド活性の候補調節物質の存在および不存在下でGTP結合アッセイを行う。候補調節物質を含有するこの種のアッセイにおいて、シンチレーション計数によって測定される標識GTPの結合が、この調節物質を含まないアッセイと比較して10%またはそれ以上減少すれば、この候補調節物質がFPRL2ポリペプチド活性を阻害することを示すことになる。HBPポリペプチドを用いずに同様のGTP結合アッセイを行い、アゴニストとして作用する化合物を同定することができる。この場合、HBPポリペプチド刺激型GTP結合を標準として用いる。化合物がアゴニストとしてみなされるのは、この化合物が1μMまたはそれ以下で存在する場合に、HBPポリペプチドによって誘導されるGTP結合レベルの少なくとも50、40、30、または好ましくは20%を誘導する場合であり、HBPポリペプチドによって誘導されるレベルと等しいか、あるいはより高いレベルを誘導するのが好ましい。
エクオリンアッセイは、GPCRの活性化によって誘導される細胞内カルシウム放出に対するミトコンドリアアポエクオリンの反応性を利用するものである(Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126;Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508;これらの両刊行物は引用により本明細書中に包含される)。簡単には、FPRL2ポリペプチド発現クローンをトランスフェクトして、ミトコンドリアアポエクオリンおよびGα16を同時発現させる。細胞を5μMセレンテラジンH(Coelenterazine H)(Molecular Probes)と室温で4時間インキュベートし、DMEM−F12培地で洗浄し、濃度0.5×106細胞/mLで再懸濁する。次いで細胞を試験アゴニスト分子と混合し、エクオリンによる発光を照度計で30秒間記録する。結果は相対光単位(Relative Light Units(RLU))として記載する。コントロールは、FPRL2ポリペプチドを発現していない(偽トランスフェクト)細胞から単離した膜を用いるアッセイを含む。その目的は候補化合物の非特異的作用の可能性を排除することである。
アデニル酸シクラーゼ活性に関するアッセイは、Kenimer & Nirenberg, 1981, Mol. Pharmacol. 20: 585-591に記載され、これは引用により本明細書中に包含される。このアッセイは、引用により本明細書中に包含されるSolomon et al., 1974, Anal. Biochem. 58: 541-548に教示されているアッセイの修飾法である。簡単には、100μL反応物は50mM Tris−Hcl(pH7.5)、5mM MgCl2、20mMクレアチンリン酸(2ナトリウム塩)、10単位(タンパク質71μg)のクレアチンホスホキナーゼ、1mM α−32P−ATP(4ナトリウム塩、2μCi)、0.5mMサイクリックAMP、G−3H−標識サイクリックAMP(約10,000cpm)、0.5mM Ro20−1724、0.25%エタノール、および試験対象のタンパク質ホモジネート(すなわち、候補調節物質の存在または不存在下で、HBPポリペプチドで処理されているか、または処理されていない、FPRL2ポリペプチドを発現しているか、または発現していない細胞由来のホモジネート)50−200μgを含有する。反応混合物は一般に、37℃で60分間インキュベートする。インキュベーション後、冷6%トリクロロ酢酸0.9mLを加えて反応混合物から除タンパクする。試験管を1800xgで20分間遠心分離し、各上澄液をDowex AG50W-X4カラムに加える。0.1mMイミダゾール−HCl(pH7.5)4mLを用いてカラム由来のcAMPフラクションを計数用バイアル中へ溶出する。アッセイは望ましくは3回実施すべきであろう。またコントロール反応は、FPRL2ポリペプチドを発現していない細胞由来のタンパク質ホモジネートを用いて実施されよう。
細胞内または細胞外cAMPは、cAMP放射免疫アッセイ(RIA)またはcAMP結合タンパク質を用いて測定する。この測定は、当技術分野で公知の方法にしたがう。例えば、引用により本明細書中に包含されるHorton & Baxendale, 1995, Methods Mol. Biol. 41: 91-105)はcAMP用のRIAを記載している。
リン脂質の分解を活性化する受容体は、リン脂質分解、およびその結果の二次メッセンジャーDAGおよび/またはイノシトール三リン酸(IP3)生産をモニターすることによって、FPRL2ポリペプチドの既知または推定の調節物質の活性を原因とする変化に関してモニターすることができる。これらについての各検出方法は、Ian M. Bird. Totowa, NJ, Humana Press, 1998編集のPhospholipid Signalling Protocolsに記載されている。この刊行物は引用により本明細書中に包含される。また引用により本明細書中に包含されるRudolph et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 11824-11831を参照のこと。この刊行物はホスファチジルイノシトール分解に関するアッセイを記載している。そのアッセイは候補調節物質の存在または不存在下で、HBPポリペプチドで処理されたか、または処理されていないFPRL2ポリペプチド発現細胞または細胞抽出物を用いて実施すべきです。候補調節物質の可能な非特異的作用を排除するために、コントロール反応は偽トランスフェクト細胞またはそれからの抽出物を用いて行う。
成長因子受容体チロシンキナーゼはプロテインキナーゼC(PKC)の活性化が関与する経路を介してシグナルを伝達することができる。このPKCはリン脂質−およびカルシウム−活性化型プロテインキナーゼのファミリーである。PKC活性化は、最終的に、一連のプロトオンコジーン転写因子をコードする遺伝子、例えばc−fos、c−mycおよびc−jun、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、例えばI型コラゲナーゼおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、および接着分子、例えば細胞内接着分子I(ICAMI)の転写を生じさせる。アッセイは、PKCによって誘導される遺伝子産物の増加を検出するように設計し、このアッセイを使用して、PKC活性化、すなわち受容体の活性をモニターすることができる。さらに、PKCを介してシグナルを伝達する受容体の活性は、レポーター遺伝子コンストラクトを使用してモニターすることができ、このコンストラクトは、PKC活性化によって活性化される遺伝子の調節配列によって駆動されるものである。このタイプのレポーター遺伝子に基づくアッセイについては、以下でより詳細に考察する。
=: (紙上cpm)×(トータル105μL/スポットされた85μL)
(アッセイ時間,分)(ATPの比活性cpm/nmol)
MAPキナーゼ活性は、市販されているいくつかのキットのいずれかを用いてアッセイすることができる。このようなキットは例えば、New England Biolabsにより販売されているp38 MAPキナーゼアッセイキット(Cat # 9820)またはPerkin-Elmer Life Sciencesにより販売されているFlashPlateTM MAPキナーゼアッセイである。
受容体、例えばFPRL2ポリペプチドに対するアゴニストの結合によって開始される細胞内シグナル伝達は、細胞内イベントのカスケードを開始させ、最終的に1つまたはそれ以上の遺伝子の転写または翻訳の高速かつ検出可能な変化を生じさせる。したがってこの受容体の活性は、FPRL2活性化を担う調節配列によって駆動されるレポーター遺伝子の発現を検出することによってモニターすることができる。
本発明の細胞、例えばCHO−K1細胞を、5%FCS、抗生物質、アンホテリシン、ピルビン酸ナトリウムおよび400μg/mL G418を含有するイノシトールを含まないDMEM中、10μCi/mL[3H]イノシトールを用いて24時間標識する。この細胞を、以下の組成のクレブスリンガーHepes(KRH)バッファー中で2時間インキュベートする(124mM NaCl、5mM KCl、1.25mM MgSO4、1.45mM CaCl2、1.25mM KH2PO4、25mM Hepes(pH:7.4)および8mMグルコース)。次いでこの細胞に、HBPポリペプチドを30分間チャレンジさせる。氷冷3%過塩素酸溶液を加えてインキュベーションを停止させる。以前(25)に記載されている通り、IPをDowexカラムで抽出分離する。
本発明は、サンプル中の本発明の受容体活性を検出するためのアッセイを提供する。例えばFPRL2ポリペプチドの活性は、FPRL2ポリペプチドを発現している細胞または細胞膜を含むサンプル中で測定することができる。上記のように、この段落ではHBPポリペプチド(配列番号18)を例として用いる。本明細書中で定義される任意のHBPポリペプチドをこれらのアッセイにおいて使用可能であることを理解すべきである。このアッセイは、HBPポリペプチドの存在または不存在下でサンプルをインキュベートし、上記のような二次メッセンジャーアッセイを実施することによって行う。HBPポリペプチドの存在または不存在下で実施した二次メッセンジャーアッセイの結果を比較し、FPRL2ポリペプチド受容体が活性であるかどうかを決定する。HBPポリペプチドの存在下において、本明細書中で定義される既定の二次メッセンジャーの検出レベルが、HBPポリペプチドの不存在下で実施したアッセイでの検出量と比較して10%またはそれ以上増大すれば、FPRL2ポリペプチドの活性を示すことになる。
GPCRを介するシグナル伝達は多数の疾患および障害の病理に関与する。リンパ球系列、脾臓、小腸、肺、心臓の細胞中で発現されるFPRL2ポリペプチドは、免疫プロセス、癌および関連障害または疾患において役割を担うことが可能である。
細胞遊走(cell migration)、癌(cancer)、腫瘍形成および腫瘍転移(development of tumours and tumour metastasis)、炎症性および新生物性過程(inflammatory and neoplastic processes)、傷害および骨治癒(wound and bone healing)および調節成長機能の機能不全(dysfunction of regulatory growth functions)、肥満症(obesity)、摂食障害(anorexia)、過食症(bulimia)、急性心不全(acute heart failure)、低血圧症(hypotension)、高血圧症(hypertension)、尿閉(urinary retention)、骨粗鬆症(osteoporosis)、狭心症(angina pectoris)、、再狭窄(restenosis)、アテローム性動脈硬化症(atherosclerosis)、血栓症(thrombosis)および他の心血管疾患(cardiovascular diseases)、自己免疫(autoimmune)および、平滑筋細胞の過剰増殖を特徴とする疾患(diseases characterized by excessive smooth muscle cell proliferation)、動脈瘤(aneurysms)、平滑筋細胞の喪失または平滑筋細胞増殖の減少を特徴とする疾患(diseases characterized by loss of smooth muscle cells or reduced smooth muscle cell proliferation)、ストローク(stroke)、虚血(ischemia)、潰瘍(ulcers)、アレルギー(allergies)、前立腺肥大症(prostatic hypertrophy)、片頭痛(migraine)、嘔吐(vomiting)、精神病性および神経障害(psychotic and neurological disorders)、例えば不安(anxiety)、統合失調症(schizophrenia)、躁うつ病(manic depression)、うつ病(depression)、せん妄(delirium)、痴呆(dementia)および重度の精神発達障害(severe mental retardation)を含み、変性疾患(degenerative diseases)、神経変性疾患(neurodegenerative diseases)、例えばアルツハイマー病(Alzheimer's disease)またはパーキンソン病(Parkinson's disease)、およびジスキネジア(dyskinasias)、例えばハンチントン病(Huntington's disease)またはジルドラトゥレット症候群(Gilles de la Tourett's syndrome)および他の関連疾患、例えば血栓症(thrombosis)および他の心血管疾患(cardiovascular diseases)を含み、自己免疫(autoimmune)および炎症性疾患(inflammatory diseases)、例えば乾癬(psoriasis)、湿疹(Eczeme)、皮膚の炎症性および栄養性疾患(inflammatory and trophic diseases of skin)、リウマチ様関節炎(rheumatoid arthritis)、強皮症(scleroderma)、ループス(lupus)、多発性筋炎(polymyositis)、皮膚筋炎(dermatomysitis)、クローン病(Crohn's disease)、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)(IBD)、過敏性腸管症候群(Irritable Bowel Syndrome)、潰瘍性大腸炎(Ulcerative Colitis)、喘息(Asthma)、慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)、アレルギー性鼻炎(Allergic Rhinitis)、線維症(Fibromyalgia)、移植臓器拒絶(Organ Transplant Rejection)、移植片対宿主病(Graft versus host disease)、多発性硬化症(Multiple Sclerosis)、急性、虚血性発作(Acute, Ischemic Stroke)、感染症(Infectious diseases)、A型肝炎(Hepatitis A)、B型肝炎(Hepatitis B)、C型肝炎(Hepatitis C)、敗血症(Sepsis)、敗血症性ショック(Septic shock)、慢性気管支炎(Chronic bronchitis)、感染(infections)、例えば細菌性(bacterial)、真菌性(fungal)、原虫性(protozoan)およびウイルス性感染(viral infections)、例えばHIV1およびHIV2による感染(infections caused by HIV1 and HIV2)、および痛み(pain)、癌(cancer)、摂食障害(anorexia)、過食症(bulimia)、喘息(asthma)、急性心不全(acute heart failure)、高血圧症(hypertension)、尿閉(urinary retention)、骨粗鬆症(osteoporosis)、狭心症(angina pectoris)、心筋梗塞(myocardial infarction)、潰瘍(ulcers)、アレルギー(allergies)、良性前立腺肥大症(benign prostatic hypertrophy)、および1型糖尿病(Type 1 Diabetes)、2型糖尿病(Type 2 Diabetes)、骨関節炎(Osteoarthritis)、糖尿病性網膜症(Diabetic Retinopathy)、糖尿病性腎障害(Diabetic Nephropathy)および受胎能機能不全(fertility dysfunctions)、胎児発育障害(foetal developmental disorders)。
FPRL2ポリペプチドのレベルを測定し、標準と比較することができる。その目的は、サンプル中に異常レベルの受容体またはそのリガンドが存在するかどうかを決定することである。これらの存在はいずれも、FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達が調節不全である可能性を示すものである。ポリペプチドのレベルは、例えばこのポリペプチドに特異的な抗体を用いる免疫組織化学によって測定する。FPRL2ポリペプチドの活性を特徴とする疾患または障害を患っていると疑われる個体から単離したサンプルを、FPRL2ポリペプチドに対する抗体と接触させ、当技術分野で既知の通りに(例えば二次抗体と共役した酵素の活性を測定することにより)抗体結合を測定する。
FPRL2ポリペプチドまたはそれをエンコードするmRNAが野生型であるか否かを評価するアッセイを診断に使用することができる。FPRL2ポリペプチドの調節不全を特徴とする疾患または障害をこの様式で診断するため、サンプルから単離したRNAを、FPRL2ポリペプチドのPCR増幅用の鋳型として用いる。増幅配列は次いで、標準的方法を用いて直接シークエンシングするか、あるいはまずベクター内にクローニングした後、シークエンシングする。野生型FPRL2ポリペプチドの配列と比較して1つまたはそれ以上のエンコード対象アミノ酸を変化させる配列の差異があれば、この結果をFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用することができる。コードする配列の変化がサンプル中で同定された場合に、この変異型受容体またはリガンドを発現させ、その活性を野生型FPRL2ポリペプチドの活性と比較することは有用であり得る。他の利点の中にはこのアプローチが常時活性型および無発現変異体を含む新規変異体を提供できる。
FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断はまた、機能アッセイを用いて行うことができる。この場合、組織サンプルから調製した細胞膜または細胞抽出物を本明細書中に記載のFPRL2ポリペプチド活性のアッセイ中に使用する(このようなアッセイは例えば、リガンド結合アッセイ、GTP結合アッセイ、GTPアーゼアッセイ、アデニル酸シクラーゼアッセイ、cAMPアッセイ、アラキドン酸レベル、リン脂質分解、ジアシルグリセロールまたはイノシトール三リン酸アッセイ、PKC活性化アッセイ、またはキナーゼアッセイである)。検出した活性は、健康な個体または罹患した個体の罹患していない部位から採取した標準サンプル中の活性と比較する。別法として、サンプルまたはサンプルの抽出物をFPRL2ポリペプチド発現細胞に適用し、その後FPRL2ポリペプチドのシグナル伝達活性を標準サンプルと比較して測定することができる。これらの任意のアッセイ中で測定される活性に関し、標準の活性と比較して10%またはそれ以上の差異があれば、この結果をFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に利用する。
FPRL2ポリペプチドのリガンドであるHBPポリペプチドの発見が細胞中のFPRL2ポリペプチドポリペプチドの活性を調節する方法を提供する。細胞中のFPRL2ポリペプチド活性は、この細胞に対してFPRL2ポリペプチドポリペプチドの機能を調節する物質をデリバリーすることによって調節する。この調節は、別の調節物質を同定するためのアッセイの部分として培養細胞中で、または、例えば、ヒトを含む動物中で実施することができる。その物質はHBPポリペプチドおよび本明細書中で定義される他のリガンドならびに、本明細書中に記載のスクリーニング法を用いて同定される別の調節物質を含み、例えば、任意のHBPポリペプチドアナログを含むが、これには限定されない。
本発明は、本発明の受容体の調節物質である化合物を提供する。
本発明はFPRL2ポリペプチドに対する抗体を提供する。抗体は当技術分野で既知の標準的プロトコルを用いて作成することができる(例えばAntibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照のこと)。哺乳類、例えばマウス、ハムスター、またはウサギを、このペプチドの免疫原型(例えば、FPRL2ポリペプチドまたは抗体応答の誘発能を有する抗原性断片、または本明細書中上記の融合タンパク質)で免疫することができる。抗体作成用の免疫原は、このポリペプチド(例えば、単離した組換えポリペプチドまたは合成ペプチド)をアジュバントと混合することによって調製する。別法では、FPRL2ポリペプチドまたはペプチドを、より大きな免疫原性タンパク質との融合タンパク質として作成する。ポリペプチドはまた、他のより大きな免疫原性タンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと共有結合により連結可能である。別法では、FPRL2ポリペプチドまたはこれらのタンパク質の断片をエンコードするプラスミドまたはウイルスベクターを用いて、動物中でこのポリペプチドを発現させ、そして免疫応答を引き起こすことができる。これは引用により本明細書中に包含されるCostagliola et al., 2000, J. Clin. Invest. 105:803-811に記載される通りである。抗体を作成する目的では、免疫原は典型的に、実験動物、例えばウサギ、ヒツジ、およびマウスに対して皮内、皮下、または筋肉内投与する。上記で考察した抗体に加えて、遺伝子改変された抗体誘導体、例えば単鎖抗体を作成することができる。
本発明の高処理量スクリーニングキットは、好ましくは1nM〜1μMの濃度範囲の、HBPポリペプチドの存在または不存在下で、本発明の受容体に対する調節化合物、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニストまたはインヒビターの検出を実施するために必要なすべての手段および媒体を含む。このキットは以下の連続段階を実施するための材料を含む。FPRL2ポリペプチド受容体をエンコードするヌクレオチド配列を含み、これを発現している本発明の組換え細胞を、固形支持体、例えばマイクロタイタープレート、より好ましくは96ウェルマイクロタイタープレート上で培養する。この培養は、当業者に周知の方法、特にWO 00/02045に記載の方法にしたがって行う。本発明の調節化合物を、約1nM〜1μMまたはそれ以上の濃度で、適切な濃度(好ましくは1nM〜1μMの範囲)のHBPポリペプチドの存在または不存在下にある特定ウェルの培地に加える。
本発明は、FPRL2ポリペプチド活性の調節物質に関するスクリーニングに有用なキット、ならびにFPRL2ポリペプチドのシグナル伝達の調節不全を特徴とする疾患または障害の診断に有用なキットを提供する。本発明において有用なキットは単離したFPRL2ポリペプチド(例えば、単離した膜上、FPRL2ポリペプチド発現細胞上、またはSPRチップ上の、膜−または細胞−結合型FPRL2ポリペプチドを含む)を含むことができる。キットはFPRL2ポリペプチドに特異的な抗体を含むこともできる。これとは別に、あるいはこれに加えて、キットはFPRL2ポリペプチドを発現するように形質転換された細胞を含有することができる。さらに別の実施態様では、本発明のキットはFPRL2ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを含有することができる。さらに別の実施態様は本発明のキットは以下に記載のFPRL2ポリペプチドの増幅に有用な特異的プライマーを含んでよい。本発明のすべてのキットは、指定の品目または品目の組み合わせおよびそれらのためのパッケージ材料を含む。キットはまた使用のための指示書を含む。
トランスジェニックマウスは、遺伝学的および発生生物学的研究のための、および新規配列の機能決定のための有用なツールを提供する。通常の遺伝子導入方法では、追加コピーの正常または修飾型遺伝子を接合体の雄性前核内に注入し、そしてこれが受容マウスのゲノムDNAに組み込まれる。確立されたトランスジェニック系統において、導入遺伝子はメンデル様式で遺伝する。トランスジェニック動物の作成に有用なコンストラクトは、正常プロモーターまたは誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子、組織発現および制御パターンに関する解析対象のプロモーターの調節下にあるレポーター遺伝子、ならびに、特定の発生結果に関する研究対象である優性突然変異、変異プロモーター、および人工融合遺伝子を含有するコンストラクトを含む。典型的には、10キロベースまたはそれ以下のオーダーのDNA断片を用いてトランスジェニック動物を構築する(Reeves, 1998, New. Anat., 253:19)。トランスジェニック動物は、本発明の1つまたはそれ以上の多型を含有する候補遺伝子を含むコンストラクトを用いて作成可能である。別法では、単一の多型を含有する候補遺伝子を発現するトランスジェニック動物を、別の多型を含有する候補遺伝子を発現する第二のトランスジェニック動物と交雑することができ、子孫の動物において、この2つの多型の混合効果を研究することができる。
本発明は、トランスジェニックのマウス、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ等を含むが、これらに限定されないトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニックブタの作成用プロトコルは、White and Yannoutsos, Current Topics in Complement Research: 64th Forum in Immunology, pp. 88-94;米国特許第5,523,226号;米国特許第5,573,933号;PCT出願WO93/25071;およびPCT出願WO95/04744に見出すことができる。トランスジェニックマウスの作成用プロトコルは、米国特許第5,530,177号に見出すことができる。トランスジェニックラットの作成用プロトコルは、Bader and Ganten, Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996に見出すことができる。トランスジェニックウシの作成用プロトコルは、Transgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc.に見出すことができる。トランスジェニックウサギの作成用プロトコルは、Hammer et al., Nature 315:680-683, 1985およびTaylor and Fan, Frontiers in Bioscience 2:d298-308, 1997に見出すことができる。
i.標準
ノックアウト動物は、相同組換えを用いて遺伝子の欠失を創出する方法によって作成する。この技術は、胚性幹(ES)細胞の発生に基づく。ES細胞は、胚由来であり、培養中で維持される。そして、宿主胚盤胞内に導入された場合に、マウスのすべての組織発生に関与する能力を有する。ノックアウト動物の作成は、ES細胞中の特定の標的遺伝子への相同組換えを導き、これによりこの遺伝子の無効対立遺伝子を作成することによって行う。(ヘテロ接合性またはホモ接合性の子孫において)この無効対立遺伝子の潜在的表現型の結果を解析することができる(Reeves, 上記)。
標的化された相同組換えの方法は、バクテリオファージP1部位特異的リコンビナーゼCreに基づく部位特異的組換え系の開発によって改良されている。バクテリオファージP1由来のCre−loxP部位特異的DNAリコンビナーゼを、トランスジェニックマウスアッセイにおいて用いる。その目的は、指定の組織または発生段階に制限された遺伝子ノックアウトを作成することである。広範囲の遺伝子ノックアウトと対照的に、領域制限された遺伝子の欠失は、表現型が特定の細胞/組織に起因し得る点で有益である(Marth, 1996, Clin. Invest. 97: 1999)。Cre−loxP系では、一方のトランスジェニックマウス系統を操作して、loxP部位が目的の遺伝子の1つまたはそれ以上のエキソンと隣接するようにする。このいわゆる「floxed遺伝子」に関するホモ接合体を第二のトランスジェニックマウスと交雑させる。この第二のトランスジェニックマウスは、特定細胞/組織タイプの転写プロモーターの調節下でCre遺伝子を発現するものである。その後Creタンパク質はloxP認識配列間のDNAを切除し、標的遺伝子の機能を効率的に除去する(Sauer, 1998, Methods, 14:381)。現在、この方法の多数のインビボ実施例が存在し、これには哺乳類組織特異的遺伝子の誘導性不活化(Wagner et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:4323)が含まれる。
特定の遺伝子多型/突然変異がインビボの改変型タンパク質機能の原因であることを検証するために、問題の遺伝子の野生型コピーを導入することによって、この改変型タンパク質機能を「救出」(rescue)することができる。このような目的では、細菌人工染色体(BAC)クローンをトランスジェニックマウスにおいて発現させるインビボ補完を利用することができる。この方法はマウス概日Clock遺伝子の同定に利用されている(Antoch et al., 1997, Cell 89: 655)。
トリプシンはFlow Laboratories(Bioggio, Switzerland)から入手した。培地、G418、胎児ウシ血清(FBS)、制限酵素、Pfu DNAポリメラーゼはStratageneから購入し、Taq DNAポリメラーゼはEurogentec.(Liege, Belgium)から購入した。放射能製品であるミオ−D−[2−3H]イノシトール(17.7Ci/mmol)はAmersham(Ghent, Belgium)から入手した。DowexAG1X8(ギ酸塩またはエステル型)はBio-Rad Laboratories(Richmond, Calif.)から入手した。ATPはSigma Chemical Co.(St. Louis, MO)から入手した。フォルスコリンはCalbiochem(Bierges, Belgium)から購入した。ロリプラムはLaboratories Jacques Logeais(Trappes, France)から提供を受けた。PCDNA3はInvitorgenから入手した発現ベクターである。
典型的には、FPRL2ポリペプチドの調節物質(例えば、本発明の、FPRL2ポリペプチドに関するアゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビター)を投与することによって、患者を以下のように処置することができる。本発明のFPRL2ポリペプチドの調節物質は、摂取、注射、吸入または他の多数の方法により、好ましくは生物学的適合性溶液または製薬的に許容されるデリバリービヒクル中で患者に投与することができる。投与する用量は患者に応じて変化する;「治療的有効用量」は、例えば機能の向上レベル(例えば本明細書中に記載の二次メッセンジャーアッセイで決定されるレベル)によって決定することができる。また当業者は、HBPポリペプチドの結合をモニターすることによって、投与する用量を選択および調節することができる。本発明のFPRL2ポリペプチドの調節物質に関する用量は、毎日、毎週、毎月、毎年または担当医師が適切とみなすところにしたがって、くり返し投与してよい。
本発明は、生理学的適合性担体と混合した本発明のFPRL2ポリペプチド調節物質を含む組成物を提供する。本明細書中で使用する「生理学的適合性担体」とは、生理学的に許容される希釈剤、例えば水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水を表し、さらにアジュバントを含んでよい。アジュバント、例えば不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンは当技術分野で周知の材料である。
実施例1:ヒトFPRL2受容体のクローニング
ヒトFPRL2を以下のようにクローニングした:FPRL2の配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドAS−204は以下のフォワード配列を有するものであった:5'-ACCGGAATTCACCATGGAAACCAACTTCTCC-3'(配列番号14)。これはFPRL2の翻訳開始コドンに対してハイブリッド形成するものであった。オリゴヌクレオチドAS−416は以下の配列を有するものであった:5'-ATCATCTAGAACGCAGGGTAGAAAGAGACAG-3'(配列番号15)。これはFPRL2の翻訳終止コドンの下流に位置する配列と相補的であった。PCRを実施した。この場合、ヒトゲノムDNAを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドAS−204およびAS−416をプライマーとして用いた。条件は以下の通りである:
PCR酵素:Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)。
バッファーは、Stratageneによって酵素とともに供給されたものであり、これに2.5%(v/v)のDMSOを加えた。
サイクルは以下の通りであった:
ヒトFPRL2の組織分布−逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)実験を実施した。この場合、ポリ(A)+ RNA(脊髄、胸腺、膵臓、子宮、胎盤、胃、肺、脾臓、精巣、脳、心臓、腎臓、骨格筋、胎児肝臓、胎児脳、副腎、骨髄)およびトータルRNA(下垂体、小腸、肝臓、卵巣、胎児大動脈、脂肪、単球、リンパ節、Tリンパ球、Bリンパ球、PBMC、PMN、PBL)のパネルを使用した。FPRL2プライマーは5'-CGCACAGTCAACACCATCTG-3'(フォワード)(配列番号16)および5'-AGCTGTTAAAAAAGGCCAAG-3'(リバース)(配列番号17)であり、予想される産物のサイズは717bpであった(図2)。約50ngのポリ(A)+ RNAまたは500ngのトータルRNAをSuperscript II(Invitrogen)で逆転写し、PCRに使用した。PCRはTaqポリメラーゼを用いて以下の条件下で実施した:94℃で5分間変性;94℃で1分間、56℃で1分30秒間、および72℃で45秒間の30サイクル。PCRのアリコート(10μL)を1%アガロースゲル電気泳動によって解析した。
1.ホモジネート
ブタ脾臓350gから精製を実施した。新鮮な器官を購入し、液体窒素中で凍結した。次いで凍結した器官を20%アセトニトリル(ACN)水溶液中で4℃にした。この場合、器官/液体の割合は1/4とした。この混合物を混合し、次いでUltraturaxで減量してホモジネートにした。
ホモジナイズ後、この混合物を10000gで30分間4℃で遠心した。
上澄を液体窒素中で凍結し、−80℃で保存した。
器官50gに相当するアリコート200mLを水0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)中で4倍希釈し、5%ACNの濃度にした。次いで800mLを4.6x150mmのPorosカラムに5mL/分で積載した。このカラムに、5〜70%のグラジエントのACN(0.1%TFAを補充)を6%/分で適用した。フラクション1.25mLを回収し、エクオリンアッセイにおいて機能活性を試験した。HPLCプロファイルに関して2つの活性領域を検出し、対応するフラクションを保存した。
2つの活性領域に対応するフラクションをプールした。このプールを水0.1%TFA中で4倍希釈し、4.6x250mmのC18カラムに1mL/分で積載した。このカラムに、30〜50%の範囲のグラジエントのACNを、0.1%TFAの存在下、1%/分の割合で適用した。フラクション1mLを回収し、機能活性のための試験した。2つの活性領域を検出した。この段階から、2つの領域を別個に処理した。
2回流出を行ったC18由来の第二領域に対応するフラクション(アセトニトリルのパーセンテージが高い方)をプールし、speedvacで濃縮し、最終容量50μLにした。次いでこれを水/30%ACN/0.1%TFAの混合物中で3倍希釈した。この最終容量を、サイズ排除カラムである7.5x300mmのSuperdexペプチドPE(Pharmacia Biotech)に積載した。このカラムは希釈バッファーで平衡化したものであった。0.5mL/分で流出を行い、フラクション0.25mLを回収し、機能活性のために試験した。
1回の段階4由来の活性フラクションをプールし、水0.1%TFA中で4倍希釈した。最終容量(2mL)を2.1x250mmのC4カラムに0.2mL/分で積載した。このカラムに、30〜50%の範囲のグラジエントのACNを、0.1%TFAの存在下、0.3%/分の割合で適用した。吸光度プロファイルにしたがって手動でフラクションを回収し、機能活性に関して試験した。この段階を3回繰り返した。最終活性フラクションのアリコートを1x250mmのC18カラムに積載して、その純度を調べた。次いでこのフラクションを乾燥し、20mM炭酸水素アンモニウム中に再懸濁し、煮沸し、トリプシン(50ng)で一晩消化し、最後に、MALDI−Q−TOF質量分析計で解析した。直接のモノアイソトピックマスフィンガープリンティングによって、以下のペプチドを同定することができた:アセチル-MLGMIKNSLFGSVETWPWQVL(配列番号18)。これはブタHBPの最初の21アミノ酸に相当する(図3)。ヒトHBPの最初の21アミノ酸はブタHBPの最初の21アミノ酸と100%同一である。
FPRL2発現クローンは、CHO−K1細胞をトランスフェクションして、ミトコンドリアアポエクオリンおよびGアルファ16を同時発現させ、限界希釈し、ノーザンブロッティングによって選択することによって得ている。ポジティブクローンを使用して、上記の通り調製したブタ脾臓抽出物を用いるスクリーニングを行った。ミトコンドリアエクオリン細胞内Ca2+放出の発光に基づく機能アッセイ(Stables et al., 1997, Anal. Biochem. 252:115-126;この刊行物は引用により本明細書中に包含される)は、刊行物に記載の通り実施した(Detheux et al., 2000, J. Exp. Med., 192 1501-1508;この刊行物は引用により本明細書中に包含される)。簡単には、5mM EDTA含有PBS中のプレートから細胞を回収し、ペレットにし、DMEM−F12培地中に5x106細胞/mLで再懸濁した。細胞を5μMセレンテラジンH(Molecular Probes)と室温で4時間インキュベートした。次いで細胞をDMEM−F12培地中で洗浄し、0.5x106細胞/mLの濃度で再懸濁した。次いで細胞を試験アゴニストペプチドまたは組織抽出物含有プレートと混合し、Microlumat照度計(Perkin Elmer)を用いて発光を30秒間記録した。結果は相対光単位(RLU)で示す。
HBPのN末端ドメインの潜在的効果を調査するために、発明者らは活性な脾臓フラクション由来の天然ペプチド(このペプチドは配列番号18に示される配列を有する)を精製し、FPRL2受容体およびアポエクオリンを同時発現しているセルラインにおいて細胞内カルシウム放出を引き起こすその能力を試験した。発明者らは、Detheux et al.(2000 J. Exp. Med. 192, 1501-1508)に以前に記載されているエクオリンアッセイを使用している。図4に示す通り、ブタHBPのN末端に相当する21アミノ酸のペプチドは、ナノモル濃度でFPRL2の活性化能を有した(平均EC50は3.6nM)。
FPRL2受容体に対する上記ペプチドの特異性を調査するため、発明者らはFPRファミリーの他の2つのメンバー:FPR受容体およびFPRL1受容体に対するこのペプチドの活性を試験した。図6に示す通り、この21アミノ酸のペプチド(配列番号18)は、ナノモル濃度でFPRL2受容体の活性化能を有した(平均EC50は8.8および8.2nM;注記:この実験では、2つの異なるFPRL2発現クローンを試験した)が、FPRの活性化能を有さず、高濃度でしかFPRL1を活性化しなかった(平均EC50は584nM)。
HTRFキットを用いてcAMP濃度を測定した。このキットは製造元の仕様書にしたがって使用した(HTRF kit, Cis bio International, cat n° 62AM2PEC)。抗生物質を含まない培地中でこの実験前に18時間培養した対数期の中間部にある細胞を、PBS−EDTAで穏やかにフラッシングして剥離し、遠心して回収し、KRH−IBMX(1mM)中に4.2x105細胞/mLの濃度で再懸濁する。
A)材料および方法
ヒトFPRL2、FPRL1およびFPRの発現
ヒトゲノムDNAからヒトコード配列(それぞれ、受け入れ番号AC005946、M84562およびM60626)をPCRによって増幅し、pcDNA3(Invitrogen)およびpEFIN3(Euroscreen)ベクター内にクローニングし、シークエンシングした。pEFIN3コンストラクトをCHO−K1細胞内へFugene6を用いてトランスフェクトした。この細胞はGα16およびアポエクオリンを発現している細胞または発現していない細胞であった。ノーザンブロッティングにより、G418耐性クローンを受容体発現に関して特徴付けした。刊行物(42)に記載の通り、ミトコンドリアエクオリンの発光に基づく機能アッセイを実施した。結果は、相対光単位(RLU)で、または20μM ATPに対する応答のパーセンテージで示した。
凍結されたブタ脾臓(350g)を4容量の氷冷20%CH3CN水溶液中でホモジナイズした。ホモジネートを10,000gで30分間4℃で遠心し、液体窒素中で急速凍結した。上澄のアリコート200mLを0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)中で4倍希釈し、4.6x150mmのPoros R2ビーズカラム(Applied Biosystems)に5mL/分で積載した。0.1%TFA中の5−70%のCH3CNグラジエント(6%/分)を適用した。フラクション1.25mLを回収し、エクオリンアッセイにおいて、FPRL2発現CHO−K1細胞に対する機能活性を試験した。HPLCプロファイルに関して、2つの活性領域(A1およびA2)を検出した。対応するフラクションをプールし、0.1%TFA中で4倍希釈し、4.6x250mmのC18カラム(Vydac)に1mL/分で積載した。このカラムに、0.1%TFA中の30−50%のCH3CNグラジエントを適用した。2つの活性領域を検出し、以後、別個に処理した。2回の流出から得た第一領域(A1、低CH3CN濃度)および第二領域(A2、高CH3CN濃度)に相当する1mLフラクションを減圧濃縮して50μLにした。A1およびA2をそれぞれ30%CH3CN/0.05%TFAおよび30%CH3CN/0.1%TFA中で3倍希釈し、サイズ排除カラム(SEC)(A1:7.8x300mmのTSK−ゲルAlpha-4000(Tosoh Biosep);A2:7.5x300mmのSuperdexペプチドPE(Amersham Pharmacia Biotech))に積載した。これらのカラムには、流速0.5mL/分の希釈溶媒を適用した。1回のSEC由来の活性な0.25mLフラクションを0.1%TFA中で4倍希釈し、2.1x250mmのC4カラム(Vydac)に0.2mL/分で積載し、このカラムに、0.1%TFA中の25−45%(A1)または30−50%(A2)のCH3CNグラジエントを0.3%/分で適用した。吸光度プロファイルにしたがって手動でフラクションを回収した。A1に関して、1回の流出から得た活性フラクションをプールし、0.1%TFA中で5倍希釈し、1x250mmのC18カラム(Vydac)に0.05mL/分で積載した。このカラムに、0.1%TFA中の23−50%のCH3CNグラジエントを0.45%/分で適用した。フラクションを手動で回収した。A2に関して、アリコートを1x250mmのC18カラムに積載して、最終活性フラクションの純度を調べた。異なるプロトコルを用いて、精製を3回繰り返した(すなわちSEC段階を2.1x250mmのC18カラム上の逆相段階と置き換え、このカラムに、イオン対形成物質である0.1%H3PO4中のCH3CNグラジエントを適用した)。SDS/PAGEに付して活性フラクション中のタンパク質濃度を決定した。この決定は、銀染色後にアプロチニンおよびリゾチーム標準と比較して行った。
活性フラクションを減圧乾燥し、20mM炭酸水素アンモニウム中に再懸濁し、5分間100℃に加熱し、トリプシン(50ng)で一晩消化するか、あるいは無傷のままにし、そして固相抽出(C18 ZipTip, Millipore)によって精製した。ペプチドを1.5μLの70%CH3CN/0.1%TFA中で金属MALDI標的上に溶出させ、乾燥し、次いで1.5μLのマトリクス混合物(2mg/mL 2,5−ジヒドロキシ安息香酸および10mg/mL α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸、2mMフコース、5mM酢酸アンモニウム)と混合した。MALDIソースを備えたQ−TOF Ultima Global質量分光計(Micromass)で質量分析による解析を実施し、ウシ血清アルブミン由来トリプシンおよびキモトリプシンペプチドのモノアイソトピック質量を用いて較正した。窒素レーザ(337nmビーム、10Hz)を用いてイオン化を達成し、Vモードリフレクトロン位置で取得を実施した。親イオンの選択後、アルゴン誘発性の断片化によってマイクロシークエンシングを実施した。
アセチル化または非アセチル化MLGMIKNSLFGSVETWPWQVL(HBP[1−21]、本実施例8におけるF2L)、NSLFGSVETWPWQVL(F2L[7−21])、WKYMVM、および
MLWRRKIGPQMTLSHAAG(CCL23のN末端由来のSHAAGペプチド)は、固相Fmocストラテジー(43)を用いて実験室で合成し、あるいはEurogentecのオーダーメイドであった。WKYMVMおよびWKYMVmはPhoenix Pharmaceuticalsから購入し、FMLPはNeosystemから購入した。すべてのペプチドのモノアイソトピック質量および配列は質量分析によって検証した。異なる起源のF2LおよびWKYMVMは同一の性質を示した。高濃度のHBP誘導体ペプチドをDMSO中に溶解し、50℃で10分間加熱した。これはその高い疎水性のためである。50%CH3CN中で中間希釈物を作成し、アッセイバッファー中でさらに40倍希釈して作業用濃度にした。
定量的PCRでは、市販の(Clontech)、または刊行物(44)に記載の通り実験室で調製したヒト血球集団由来のcDNA中、RT−PCRによってFPRL2転写物を検出した。FPRL2用のフォワードプライマーは5'-CTGGCCACACCGTTCTGT-3'であり、リバースプライマーは5'-GGCCATGGTAATGAACACGTT-3'であった。cDNA品質のコントロールとしてGAPDH転写物の増幅を実施した(記載していない)。市販の(ClontechおよびAmbion)、または実験室で調製したヒト組織(DC)由来のトータルまたはポリA+ RNAサンプルにおいて、定量的RT−PCR(TaqMan)を実施し、FPRL2転写物を検出した。FPRL2用のフォワードプライマーは5'-TTACCATGGCCAAGGTCTTTCT-3'であり、リバースプライマーは5'-GCAGACTGTGATGATGGACATAGG-3'であり、プローブは5'FAM-TCCTCCACTTCATTATTGGCTTCAGCGT-3'DABSYLであった。参照ハウスキーピング遺伝子(GAPDH)用のフォーワードプライマーは5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'であり、リバースプライマーは5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'であり、プローブは5'FAM-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'DABSYLであった。プライマーは900nMで使用し、プローブは200nMで使用した。この2つ遺伝子に関して体系的に標準曲線を作成し、各サンプルに関してFPRL2の転写物コピー数をGAPDH転写物コピー数に対してノーマライズした。
BALB/cマウスに100μgのpcDNA3−FPRL2を注射して抗体を作成した。この作成は刊行物(45)に記載の通りである。CHO−K1−FPRL2セルラインに関するFACSによって血清を試験し、免疫マウスを用いて、標準ハイブリドーマ技術によりモノクローナル抗体を作成した。この作成では、NSO骨髄腫セルラインを使用した。マウスmAbアイソタイピングキット(IsoStrip, Boehringer Mannheim)を用いて、選択したハイブリドーマのIgクラスを決定した。フローサイトメトリーを用いて抗体を試験した。このフローサイトメトリーは、0.1%BSA、0.1%アジ化ナトリウム、および二次抗体であるFITC−コンジュゲート型γ鎖特異的ヤギ抗−マウスIgG(Sigma)を含有するPBS中、1μg/mL(CHO−K1細胞に関して)または5μg/mL(一次細胞に関して)の抗−FPRL2抗体またはコントロールIgG2aを用いて実施した。FACScanフロー細胞蛍光測定計(Beckton Dickinson)を用いて10,000細胞の蛍光をアッセイした。Cytoperm/Cytowash(Becton Dickinson)を製造元の指示書にしたがって用いて、細胞質内染色を具体化した。
ホモジニアス時間分解蛍光(HTRF)キット(Cis Bio International)を用いてcAMP濃度を測定した。簡単には、細胞を剥離し、1mM 3−イソブチル−1−メチルキサンチンを含有するクレブスリンガーHepesバッファー中に再懸濁し、10μMフォルスコリンを、単独で、または増加濃度のアゴニストとともに、室温で30分間適用した。cAMP−XL665および抗−cAMPクリプタート、溶解バッファー中で希釈、を連続して加えて反応を停止させた。プレートを室温で60分間インキュベートし、Rubystar蛍光定量計(BMG)で読み取った。665nm/620nmの比から結果を算出し、これをデルタF(%)で示した。デルタF%対cAMP濃度をプロットして検量線を得た。ERK1/2の活性化をウエスタンブロッティングによってアッセイした。このウエスタンブロッティングでは、抗−ホスホ−p42/44モノクローナル抗体(E10, Cell Signaling Technology)を刊行物(46)に記載の通り使用した。エクオリンに基づくアッセイを実施した。このアッセイは一晩の100ng/mL百日咳毒素での前処理を施して、あるいは施さずに実施した。このような百日咳毒素での前処理はこれらの細胞においてATPに対する機能性応答を阻害しないことが示された。FPRL2多型解析では、HEK細胞を空のpcdnaベクターおよび野生型またはAsp338HisFPRL2含有pcdnaベクターで一時的にトランスフェクトした。このトランスフェクションはリン酸カルシウム法を用いて行った。48時間後に細胞を回収し、FACSまたはcAMP実験に使用した。
カルボキシ末端にチロシンを有する修飾型F2Lペプチドは、エクオリンアッセイにおいて、野生型F2Lと同様の効力を示すことが証明された。ペプチド5μgを2mCiの125Iで標識した。この標識には、Iodogen法を使用した。未結合125Iを分離した後、得られたペプチドの比活性が900Ci/mmoleであることを概算した。[125I]−WKYMVm(2200Ci/mmole)はPerkin Elmer Life Sciencesから購入した。FPRL2、FPRL1およびFPRを発現しているCHO−K1細胞を24ウェルプレートに播種した(FPRL2に関してはウェル当たり200,000細胞、他の2受容体に関してはウェル当たり100,000細胞)。翌日、280mMサッカロースおよび、FPRL1およびFPRに関しては、0.1%NaN3を含有するKRHバッファーで細胞を2回洗浄した。飽和結合アッセイでは、細胞を種々の量のF2L−[125I]Tyrとインキュベートし、1μM F2Lを競合物質として用いて非特異的結合を決定した。競合結合アッセイでは、細胞を100,000cpmのF2L−[125I]Tyrまたは10,000cpmの[125I]−WKYMVmおよび競合物質である種々の量のF2Lまたは他のペプチドとインキュベートした。このインキュベーションは、5%BSAを補充したKRHバッファー中、室温で90分間行った。細胞を氷冷バッファーで2回洗浄し、トータル放射能を1M NaOHで回収し、ガンマカウンターで2分間カウントした。
5〜7日間、GM−CSF(800U/mL)およびI1−4(500U/mL)とともに培養したPBMCの接着性フラクションから、またはGM−CSF(50ng/mL)およびIL−13(20ng/mL)とともに培養した単球のパーコール精製物から、単球由来DCを作成した。Ca2+動態アッセイでは、単球単離キットII(Miltenyi Biotec)を用いるネガティブ選択によって単球を得た。F2LおよびFMLPおよびコントロールとして使用したMip1アルファに応答した細胞遊走を、刊行物(48)に記載の48ウェルのマイクロ走化性チャンバー技術を用いて評価した。Ca2+動態アッセイでは、単球由来DCまたは単球(フェノールレッドを含まないが、0.1%BSAおよび1mMプロベネシド(Sigma)を含有するHBSS中、5x105細胞/mL)に4μM Fluo4(Molecular Probes)を、暗所にて20℃で1時間付加した。付加を受けた細胞を2回洗浄し、1〜2x106細胞/mLで再懸濁し、50μLの細胞懸濁液を96ウェルプレート(Viewplate, Packard Bioscience)のウェルごとに分配した。Fluostar蛍光定量計(BMG)において25℃で読み取りを実施した:50μLのリガンド含有培地を注入し、520nmの蛍光を、1〜3分間、毎秒記録した。各条件を3回実施し、各時点での平均蛍光を算出し、注入前5測定の平均値を減算して曲線をノーマライズした。
FPRL2の内因性リガンドであるF2Lペプチド(配列番号18)の単離および同定
発明者らは、スクリーニングアッセイとして、ヒトFPRL2、アポエクオリンおよびGアルファ16を同時発現しているCHO−K1セルラインを開発した。これにより、ヒトリンパ器官抽出物、白血球集団の条件培地、および炎症性体液由来のフラクションを試験することが可能になった。FPRL2発現セルラインに特異的な生物学的活性を、ヒト脾臓由来抽出物の逆相HPLC分画から得たフラクション中で検出した(データは記載していない)。実際上の理由のために、発明者らは、同様の方法で調製したブタ脾臓由来のフラクションを試験し、FPRL2のために特異な活性を含有するプロファイルの2つの領域(活性領域A1およびA2、図13)を同定した。350gのブタ脾臓から出発し、これらの2活性領域を5回(A1)または4回(A2)の連続HPLC段階によって精製して均一にした。このHPLC段階の最初の2回は共通であった(図13)。両活性領域がプロテイナーゼKに対して感受性であることから、ペプチド性であることが示唆された(記載していない)。活性化合物の分子量をサイズ排除クロマトグラフィによって概算したところ、活性領域A1に関しては約6kDであり、活性領域A2に関しては3kDであった。これらに関するピークの吸光度および生物学的活性から、ピークA1中に存在する化合物は、ピークA2の化合物より豊富であるが、より活性が低く表れた。この2フラクションをSDS/PAGEおよび銀染色によって解析した。その目的は、既知量のアプロチニンおよびリゾチームと比較することによって活性ペプチドを概算定量することであった(図15)。エクオリンに基づくフラクションアッセイにおいて同フラクションに関する濃度作用曲線を作成したところ、A2に関して2.32±1.84nM(n=2)、A1に関して200±54nM(n=4)のEC50を概算することができた(それぞれ図15)。両ペプチドを質量分析によって解析した。この解析は、A2に関しては消化なしまたはトリプシン消化後に、A1に関してはトリプシン消化後に行った(図14)。A2に関しては、未消化ペプチドの解析により、アミノ末端アセチル化を伴う、ヒト細胞内ヘム結合タンパク質(HBP、受け入れ番号NM 015987)の最初の21アミノ酸(MW:2478.28ダルトン)と一致するマイクロシークエンス全体を同定することが可能であった(図14)。A1に関してもまた、6ペプチドがHBPと一致した。この6ペプチドのうち4つは図14のBに示す2つの最長トリプシン断片の断片であった。このブタHBPを、変性プライマーを用いる肝臓cDNAからのPCRによってクローニングした。これにより、発明者らはその同定、およびヒト配列との比較において、最初の21アミノ酸の完全保存を確認することができた。この配列は追って、ブタHBP ESTが公共データベースに包含された後に確認した(受け入れ番号AY662687)。A2由来の2トリプシンペプチドは、ブタHBPの190アミノ酸長配列の、アミノ末端ドメイン中の50アミノ酸をカバーするものであった(図14)。発明者らは、証明はできていないが、A1のアミノ末端はA2のアミノ末端と共通であると考える。また、A1のカルボキシ末端は正確に決定されなかった。その原因は、HBPのArg56より後に多数のトリプシン部位が存在するからであった。精製は別プロトコルを使って3回実施し、各事例において質量分析により同ペプチドを同定した。
ヒトFMLP受容体ファミリーの3メンバーの薬理学およびこれらによって活性化されるシグナル伝達経路をCHO−K1細胞において調査した。このCHO−K1細胞はこれらの受容体を、Gアルファ16およびアポエクオリンともに、またはこれらを伴わずに発現している(図16)。実施例8でF2L(FPRL2リガンドの意味で)と称するアセチル化21アミノ酸ペプチドを合成し、エクオリンに基づくアッセイにおいて試験した。この試験は、これらの3つのセルラインに対して、ならびに野生型CHO−K1細胞に対して、およびChemerinRおよび他のGPCRを発現しているCHO−K1細胞に対して行った。合成F2Lペプチドは、脾臓から精製された未変性ペプチドと同様の効力でFPRL2発現細胞を活性化し、ずっと低い効力で、FPRL1およびFPRを活性化する(以下参照)ことが示された。しかし、他のすべての被験セルラインに対しては完全に不活性であった(データは記載していない)。F2Lをまた、cAMP蓄積アッセイにおいて試験した。この試験は、FPRL2を発現しているが、Gアルファ16を発現していないCHO−K1細胞について行った。この合成ペプチドは、フォルスコリンによって促進されたcAMP蓄積を阻害することが見出されたが、単独ではcAMP生産の刺激能を有さなかった。同細胞において、F2Lはまた、低ナノモル濃度で細胞内カルシウム放出を促進し(記載していない)、ピコモル濃度でERK1/2 MAPキナーゼのリン酸化を誘発した(図18)。MAPK活性化の速度論的研究では、15分の時点で最大リン酸化が示された(図18)。カルシウムシグナルは百日咳毒素での前処理によって完全に阻害された。これはFPRL2受容体とGiファミリーのヘテロ三量体Gタンパク質の共役を証明するものであった(図17)。
発明者らは、種々の白血球集団においてRT−PCRによりFPRL2転写物の存在を調査した(図19A)。以前(41)に報告されている通り、FPRL2転写物は単球および未成熟または成熟型の単球由来DCにおいて最も豊富であった。LPS、LPS+IFN−γまたはCD40LによってDCの成熟を3〜24時間誘導したが、FPRL2転写物の発現レベルに検出可能な変化はなかった(図19Aおよび記載していない)。これらは、すべての他の被験細胞集団において、存在しないか、あるいは非常に低いレベルで存在した。多数の組織に対し、DCを参照として用いて定量的RT−PCRを実施した。ほとんどの組織で低レベルの転写物が観察され、高いレベルの転写物はリンパ節、小腸、肺および脂肪組織において観察された(図19B)。
白血球集団に対するF2Lの生物学的機能を調査した。化学誘引に関するFPRおよびFPRL1の役割との類似性および既定のFPRL2分布によって、発明者らは単球および単球由来DCに関するカルシウム動態および走化性の測定に重点を置いた。
エクオリンアッセイ
機能応答の分析は、ヒトFPRL2およびFPRL1発現細胞において、アゴニストまたは精製モノクローナル抗体を加えた後にエクオリンの発光を記録することによって行った。簡単には、5mM EDTA含有PBSでプレートから細胞を回収し、ペレットにし、0.1%ウシ血清アルブミン含有DMEM/F−12培地中に5x106細胞/mLで再懸濁し、5μMセレンテラジンH(molecular probes, Inc. Eugene, OR)と室温で4時間インキュベートし、DMEM/F−12培地中、5x105細胞/mLの濃度で希釈した。次いで、細胞を96ウェルプレート中でリガンドまたは精製モノクローナル抗体と混合した。microlumat Luminometer(EG&G Berthold, マイクロプレート照度計LB 96V)を使用して発光を60秒間記録した。
アッセイにおいて使用する試薬、リガンドおよびモノクローナル抗体(調節物質)。
エクオリン培地(発現細胞のベースライン)。
20μM ATPおよび0.1%トリトン(細胞における最大発光)。
F2Lペプチド(配列番号18):(Migeotte et al. (2005) J. Exp. Med, 201: 83-93)に記載のヒトFPRL2受容体の特異的リガンド。2つの異なるバッチF2L(1)およびF2L(2)を使用している。
ヒューマニン(Humanin)(HN(N))ペプチド(Phoenix Pharmaceuticals, Inc.):(Masataka et al. (2004) Biochemical and Biophysical Research Communications, 324:255-261)に記載されている。このペプチドはFPRL2およびFPRL1のリガンドとして開示されている。
精製モノクローナル抗体(Mab):
1.FPRL2 145C 4F2 1C4
2.FPRL2 422F 2B9 1C11
3.FPRL2 422F 2G3 1A10
4.FPRL2と結合しない非関連抗体(コントロールMab)
抗体はAmershamプロトコルにしたがってプロテインAセファロース4Bビーズで精製した(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)。抗体FPRL2 145C 4F2 1C4、FPRL2 422F 2B9 1C11およびFPRL2 422F 2G3 1A10は、ブダペスト条約の下、BCCM/LMBPプラスミドコレクション, Department of Molecular Biology, Gent University, Technologiepark 927, B-9052, Gent-Zwijnaarde, Belgiumに寄託されている。これらは仮受託番号LMBP 6404CB(FPRL2 145C 4F2 1C4)、LMBP 6405CB(FPRL2 422F 2B9 1C11)、およびLMBP 6406CB(FPRL2 422F 2G3 1A10)を有する。寄託の日付は2005年4月21日(LMBP 6404CB / FPRL2 145C 4F2 1C4)、および2005年4月28日(LMBP 6405CB / FPRL2 422F 2B9 1C11、およびLMBP 6406CB / FPRL2 422F 2G3 1A10)である。
図22および23のグラフは、表2に記載の96ウェルプレートに対応する結果をRLU表示で示す。
F2LペプチドはヒトFPRL2発現細胞(B1−D6)を活性化し、ヒューマニンはヒトFPRL1(データは記載していない)およびFPRL2発現細胞(E1−F6)をいずれも活性化し、これは細胞の機能性を示す。Mab FPRL2 422F 2B9 1C11(G5−G8およびH5−H8)は、明らかに、用量依存様式でのヒトFPRL2発現細胞の活性化能を有する。Mab FPRL2 422F 2G3 1A10(G9−G12およびH9−H12)もまた、これらの細胞の活性化能を有するが、その程度は低い。コントロールMab(F7−F12)はFPRL2発現細胞を活性化しない。試験用Mabパネルでは、ヒトFPRL1発現細胞に関する活性化は観察されていない(データは記載していない)。
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46. Kotani,M., M.Detheux, A.Vandenbogaerde, D.Communi, J.M.Vanderwinden, E.Le Poul, S.Brezillon, R.Tyldesley, N.Suarez-Huerta, F.Vandeput, C.Blanpain, S.N.Schiffmann, G.Vassart, and M.Parmentier. 2001. J.Biol.Chem. 276:34631-34636.
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Claims (4)
- ‐ 配列番号18に記載のポリペプチド、または
‐ 配列番号18の完全長ポリペプチドのホルミルペプチド受容体様受容体2(FPRL2)ポリペプチドへの結合活性およびシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも50%を保持する、配列番号18に記載のアミノ酸配列と少なくとも95%同一性を満たす条件下でアミノ酸が付加されたポリペプチド、
からなるヘム結合タンパク質(HBP)ポリペプチド。 - 請求項1に記載のポリペプチドをコードする核酸。
- ‐ 配列番号18のN末端にアセチル基を有さないアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
‐ 配列番号18のN末端にアセチル基を有さないアミノ酸配列からなるポリペプチドの完全長ポリペプチドのホルミルペプチド受容体様受容体2(FPRL2)ポリペプチドへの結合活性およびシグナル伝達活性化のレベルの少なくとも50%を保持する、配列番号18のN末端にアセチル基を有さないアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも95%同一性を満たす条件下でアミノ酸が付加されたポリペプチド、
からなるヘム結合タンパク質(HBP)ポリペプチド。 - 請求項3に記載のポリペプチドをコードする核酸。
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