CN109722421A - 一种脂肪细胞内源性多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂肪细胞内源性多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还公开了该脂肪细胞内源性多肽在制备治疗或预防肥胖症及其相关疾病的药物方面的应用。该内源性多肽可显著抑制前体脂肪细胞分化和甘油三酯累积以及脂肪细胞标志基因PPARγ、CEBPα、CEBPβ蛋白的表达水平。

Description

一种脂肪细胞内源性多肽及其应用

技术方案

本发明涉及脂肪代谢和多肽领域，涉及一种脂肪细胞内源性多肽及其应 用。

背景技术

肥胖是由于过量脂肪堆积造成的一种慢性营养障碍疾病，正呈现急剧上升和 低龄化的发展趋势。据世界卫生组织(WHO)统计，1975年以来世界肥胖人数已 增长近3倍，儿童和青少年的肥胖人数增加了十倍，已成为21世纪最严重的公 共卫生挑战之一。肥胖危害十分巨大，不仅影响儿童和青少年身体发育和心里健 康，其危害更是持续到成年，而且还是引发2型糖尿病、心血管疾病、高血压等 并发症，更是罹患某些癌症，如子宫内膜癌、乳腺癌、结肠癌等的危险因素。因 此，积极寻找肥胖的治疗手段不仅有助于青少年儿童的身心健康，更能有效预防 远期肥胖相关代谢性疾病的发生，具有较大的社会意义和临床价值。

目前主要以加强运动和控制饮食治疗肥胖，但是多数肥胖患者难以坚持而收 效甚微；手术治疗虽然可以在短期内改善肥胖症状，但存在较大风险，若非重度 肥胖，一般也不予采取。因此通过研究肥胖的发生发展机制，寻找治疗肥胖的干 预靶标，一直是研究者进行药物研发的工作基础。虽然目前已经研制出一些药物 能够获得一定程度的减重效果，如影响消化吸收功能的奥利斯特，调节中枢食欲 系统的食欲抑制剂西布曲明，但是在中枢神经系统和重要器官组织上存在较大的 副作用，因此难以获得患者青睐。

近年来，随着多肽组学的发展，多肽已被证实在血压调控、免疫调节、抗氧 化和抗感染等方面的均具有较强的生物活性。因此，多肽在肥胖治疗方面也受到 密切关注。研究报道表明，母乳糖巨肽(GMP)随饮食摄入可以抵抗肥胖的发生； 母乳来源的三肽VPP可以改善胰岛素抵抗、减少巨噬细胞聚集和炎症因子的释 放；而用于糖尿病治疗的多肽类药物胰岛素和胰高血糖样肽-1的更是获得成功 上市。有报道表明，来源于大鼠脂肪组织的内源性多肽可以促进脂肪细胞对胰岛 素诱导的葡萄糖摄入；脂肪细胞内erythropoietin(EPO)不但能抑制白色脂肪 细胞的分化，而且能促进白色脂肪细胞的棕色化。

同时多肽药物具有活性高、毒副作用小，免疫原性小以及成药高等独特的优 势。因此，从内源性多肽的角度深入寻找影响脂肪细胞分化的新成份将有可能为 肥胖治疗提供新的治疗策略。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种分离的脂肪细胞内源性多肽及其核苷 酸序列；本发明的另一个目的是提供前述多肽在制备抑制脂肪细胞分化和抑制前 体脂肪细胞成脂率药物上的应用；本发明的另一个目的是提供前述多肽在制备减 肥药物上的应用；本发明还有一个目的是提供前述多肽在制备治疗或预防肥胖 症及其相关疾病的药物方面的应用。

技术方案：本发明的脂肪细胞内源性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO： 1所示，具体为Gly-Leu-Ser-Val-Ala-Asp-Leu-Ala-Glu-Ser-Ile-Met-Lys-Asn-Leu(GLSVADLAESIMKNL)。该多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

该多肽具有15个氨基酸，位于人乳酸脱氢酶A链(LDHA)第253位，核 苷酸序列为3’-GGA CTC TCT GTA GCA GAT TTG GCA GAG AGT ATA ATG AAG AAT CTT-5’，等电点(pI)为4.37，分子质量(Mw)为1560.83，较低的 相对分子质量表明该多肽不易被蛋白酶水解。不稳定系数(Instability Index)为 16.51，表明该多肽较为稳定。脂溶指数(AliphaticIndex)和亲水性(Grand Average of Hydropathicity，GRAVY)分别为136.67和0.613。

所述SEQ ID NO：1的多肽可通过生物方法获得，即发酵法、酶解法、基因 工程法；或通过化学合成方法获得，所述化学合成方法包括但不限于固相合成法 和液相合成法以及其他多肽合成方法包括氨基酸的羧内合酸酐法(NCA)和组 合化学法。

本发明的内源性多肽可显著抑制前体脂肪细胞分化和甘油三酯累 积以及脂肪细胞标志基因PPARγ、CEBPα、CEBPβmRNA和蛋白的 表达水平。

本发明内容还包括所述多肽在制备抑制前体脂肪细胞分化药物上的应用。

本发明内容还包括所述多肽在制备抑制前体脂肪细胞成脂率药物上的应用。 发明人发现，随所述多肽浓度的增加，前体脂肪细胞的成脂率下降，并呈现剂量 依赖性，在5μM可以轻微抑制前体脂肪细胞的分化，在10μM～20μM可 以显著抑制前体脂肪细胞分化成脂肪细胞。

本发明内容还包括所述多肽在制备减肥药物上的应用。

本发明内容还包括所述多肽在制备治疗或预防肥胖症及其相关代谢性疾病 如2型糖尿病等的药物方面的应用。

上述多肽在制备药物上的应用时，多肽的来源以固相合成或细胞工程微生 物发酵分离纯化获得的多肽产品，而非从动物脂肪细胞中分离获得的。本发明 所述药物的给药途径包括但不限于口服、经呼吸道、经皮肤黏膜给药的任意一 种或多种方式。

前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的特异化细胞。前体 脂肪细胞的增殖和分化直接影响脂肪细胞的数目和体积。脂肪细胞数目的增多 和体积的增大均会导致肥胖。由于人体内的脂肪细胞数目在成年以后会保持相 对恒定，脂肪细胞体积增大相对于增多对体脂含量及代谢稳态的影响更大，而 体积大小主要取决于前体脂肪细胞的分化程度。甘油三酯是脂肪细胞中主要的能 量储存形式，当能量消耗低于能量摄取时，导致甘油三酯在体内的累积，引起肥 胖。PPARγ、CEBPα和CEBPβ是脂肪细胞的分化标志物，通过检测这些蛋白的 表达水平来判断该内源性多肽对人脂肪细胞的分化情况。

有益效果：相对于现有技术，本发明的优越性在于与小分子药物相比，本 发明的内源性多肽可以使得细胞成脂率降低、可以显著抑制人前体脂肪细胞的分 化，并能显著抑制甘油三酯的含量从而治疗或预防肥胖症。因此该内源性多肽也 有望开发为减肥类药物等。本发明的多肽药物具有活性高、毒副作用小，免疫原 性小以及成药高等优势。

附图说明

图1为内源性多肽对人前体脂肪细胞增殖的影响；

图2油红O染色评估不同浓度内源性多肽对人脂肪细胞分化的影响Scale bar：50μm；

图3甘油三酯检测不同浓度内源性多肽对人脂肪细胞分化的影响；*P<0.05 vs.0μM，**P<0.01vs.0μM；

图4不同浓度内源性多肽对人脂肪细胞分化相关蛋白的影响和灰度分析；

*P<0.05vs.0μM，**P<0.01vs.0μM。

具体实施方式

实施例1

脂肪细胞内源性多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核 苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。该多肽等电点为4.37，分子质量为1560.83， 不稳定系数为16.51，脂溶指数为136.67，亲水性为0.613。

该多肽可利用已知的固相合成方法获得，本实施例及后续实施例所使用的多 肽均为委托上海科肽生物科技有限公司通过固相合成方法获得。多肽用无菌双蒸 水稀释成20mM浓度置于-40℃储存备用。

实施例2脂肪细胞内源性多肽对前体脂肪细胞增值的影响

1、人前体脂肪细胞的培养、处理和分化

人前体脂肪细胞(Human Preadipocytes-visceral，HPA-v)购自美国ScienCell公司。HPA-v用PAM完全培养基，其中包含5％血清，1％PAGS和1％青霉素 -链霉素混合液，置于37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱内培养。

人前体脂肪细胞在T75培养瓶中长至90％密度后，37℃预热的PBS缓冲液 洗去残留培养基，加入2ml胰蛋白酶置于37℃培养箱消化2分钟于显微镜下观 察细胞大部分变圆、脱落，加入3ml PAM完全培养基中和胰蛋白酶的作用，用 移液枪轻轻吹打细胞直至细胞完全脱落，转移至15ml离心管，1000rpm室温 离心3分钟，重悬细胞。

根据细胞密度将重悬的细胞种入12-孔板或6-孔板内，当细胞长满且接触抑 制2天后，加入分化诱导剂进行诱导处理，4天后，将分化诱导剂替换为维持培 养基，每2-3天换液，维持6天。分化诱导剂包含DMEM/F12、100nM胰岛素、 0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、1μM地塞米松、1μM罗格列酮和 1％青霉素-链霉素混合液；维持培养基包含DMEM/F12、10nM胰岛素以及1％ 青霉素-链霉素混合液。

2、人前体脂肪细胞增殖的测定

将处理重悬的细胞通过细胞计数仪(Countess^TM II FL Automated CellCounter，Thermo Fisher)计数后，将细胞以1000个/孔种于96孔板中，加入不 同浓度的多肽(0μM、5μM、10μM、20μM)，分别在处理后24h、48h、72h 采用CCK8检测试剂盒于酶标仪上检测OD值。

人前体脂肪细胞增殖实验显示：不同浓度的内源性多肽对人前体脂肪细胞增 殖无明显影响(见表1和图1)。

表1

3、油红O染色和甘油三酯测定

将HPA-v种于12孔板，在细胞诱导前一天(计为-1天)开始每天加入不 同浓度的内源性多肽(0μM、5μM、10μM、20μM)，直至诱导分化至第4天， 之后每隔2天加一次多肽。在细胞分化至第10天，进行油红O染色和甘油三酯 测定。

油红O染色：

油红O购于美国Sigma-Aldrich公司，以0.3％的浓度溶解于异丙醇后，与双 蒸水以3：2的比例混匀，过滤备用。待染色的细胞经PBS洗涤后，用4％的多 聚甲醛在室温固定30分钟后，PBS洗涤，每孔加入500μl油红O染色液，置于 37℃孵育30分钟后，弃去油红O染色液，以清水洗涤2次后，观察染色情况， 并于显微镜下观察成脂情况。

油红O染色实验显示：随内源性多肽浓度的增加，细胞成脂率降低，并呈 现剂量依赖性(见图2A)，与显微镜下观察结果一致，比例尺(Scale bar)： 50μm(见图2B)。

甘油三酯测定：

1)收集待测样品：采用甘油三酯(组织细胞)酶法测定试剂盒检测。将待 测细胞用PBS洗涤2次后，每孔加入100μl裂解液，室温静置10分钟后，取适 量上清液转移到1.5ml离心管中，70℃加热10分钟，于室温2000rpm离心5分 钟，取上清液进行酶法测定。

2)配制工作溶液：以4:1的比例配制试剂R1和试剂R2，混匀备用。

3)稀释标准品：将4mM甘油标准品用PBS倍比稀释为4000、2000、1000、 500、250、125、62.5、31.25μM，于96孔板中每孔加入10μl标准品稀释液，并 设置0浓度为对照孔。

4)甘油三酯浓度测定：取10μl待测样品分别加入96孔板中，分别在标品 孔和待测样品孔中加入190μl工作溶液，在37℃孵育10分钟，在波长550nm 处测定OD值。

5)余下的裂解液，于室温12,000rpm离心10分钟，取上清液，用BCA法 蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher，USA)进行蛋白定量。

6)计算甘油三酯浓度：根据标准品绘制标准曲线，计算甘油三酯浓度并以 每mg蛋白校正甘油三酯含量。

表2

甘油三酯测定实验显示：甘油三酯含量也同样随内源性多肽浓度的增加而减 少(见图3)。

4、分化相关蛋白Western-Blot检测

将HPA-v种于6孔板，在细胞诱导前一天(计为-1天)开始每天加入不同 浓度的内源性多肽(0μM、5μM、10μM、20μM)，直至诱导分化至第4天， 之后每隔2天加一次多肽。在细胞分化至第7天，收集蛋白。将待测细胞经PBS 洗涤2次后，每孔加入100μl含有蛋白酶抑制剂(cocktail)的RIPA蛋白裂解液， 用细胞刮刮取细胞并转移到1.5ml离心管中，置于冰上裂解20分钟，4℃，12,000 rpm，离心20分钟，取上清。用BCA法蛋白定量试剂盒进行蛋白定量后，同一 批样品取相同蛋白量用4×Loading Buffer制样混匀，于95℃干式恒温器加热5分钟。取30μg蛋白，经SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育后，用ECL试剂盒显示蛋白条带，于多色荧光、化学发光凝胶成像系统(FluorChem M) 显色，蛋白灰度分析通过ImageJ软件分析。

通过蛋白免疫印迹(Western-blot)实验和灰度分析显示：内源性多肽同样 能够显著抑制分化相关蛋白(PPAR、CEBP、CEBP)的表达，参见表3～表5以 及图4。

通过蛋白免疫印迹(Western-blot)实验和灰度分析(柱状图是对WB蛋白 表达量的分析、表3-5是对柱状图的数据化显示；柱状图和表3-5可选择其中一 种方式显示)显示：随着内源性多肽浓度的增加，分化相关蛋白(PPAR、CEBP、 CEBP)的表达水平逐渐降低，并且具有统计学差异(^*P<0.05,^**P<0.01)。

因此，本发明的内源性多肽可以显著抑制人前体脂肪细胞的分化，并能显著 抑制甘油三酯的含量从而治疗或预防肥胖症。因此该内源性多肽也有望开发为减 肥类药物等。

表3

表4

表5

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的， 并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情 况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> 一种脂肪细胞内源性多肽及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 内源性多肽(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Leu Ser Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 内源性多肽(Artificial Sequence)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(45)

<400> 2

gga ctc tct gta gca gat ttg gca gag agt ata atg aag aat ctt 45

Gly Leu Ser Val Ala Asp Leu Ala Glu Ser Ile Met Lys Asn Leu

1 5 10

Claims (6)

1.一种脂肪细胞内源性多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：所述多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.如权利要求1所述的脂肪细胞内源性多肽在制备抑制脂肪细胞分化药物上的应用。

4.如权利要求1所述的脂肪细胞内源性多肽在制备抑制前体脂肪细胞成脂率药物上的应用。

5.如权利要求1所述的脂肪细胞内源性多肽在制备减肥药物上的应用。

6.如权利要求1所述的脂肪细胞内源性多肽在制备治疗或预防肥胖症及其相关疾病的药物方面的应用。